Efeito do treinamento físico combinado com laser de baixa potência em monoartrite experimental

Texto

(1)UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO. MARCELO DE PAULA A. SILVA. Efeito do treinamento físico combinado com laser de baixa potência em monoartrite experimental. São Paulo 2015 1.

(2) MARCELO DE PAULA A. SILVA. Efeito do treinamento físico combinado com laser de baixa potência em monoartrite experimental. TESE apresentada a Universidade Nove de Julho – UNINOVE como requisito para obtenção do título de Doutorado em Ciências da Reabilitação.. Orientação: Profa. Dra. Stella Regina Zamuner, PhD. Coorientação: Profa. Dra. Kátia De Angelis, PhD.. São Paulo 2015 2.

(3) Silva, Marcelo de Paula A. Efeito do treinamento físico combinado com laser de baixa potência em monoartrite experimental. / Marcelo de Paula A. Silva. 2015. 105 f. Tese (doutorado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo, 2015. Orientador (a): Profa. Dra. Stella Regina Zamuner. 1. Monoartrite. 2. Laser de baixa potência e treinamento físico. I. Zamuner, Stella Regina. II. Titulo CDU 615.8. 3.

(4) 4.

(5) A sabedoria é a coisa principal; adquire pois a sabedoria, emprega tudo o que possuis na aquisição de entendimento. Provérbios 4(todo):7. 5.

(6) DEDICATORIA. Á Jesus Cristo. Á meu Pai Gilberto Alves da Silva; minha Mãe Julia Barbosa Queiroz da Silva; minhas irmãs Jeanne Paola, Nicole Kerolin, Carolie Keterin e meu irmão Gil Polarah. Meus sobrinhos Yam Di Luca, Luan e minha sobrinha Maria Elloyse.. 6.

(7) AGRADECIMENTO. A minha orientadora Profa. Dra. STELLA REGINA ZAMUNER que admiro a cada dia mais por sua disponibilidade em me ensinar, trocar saberes, sonhos e projetos. Eterna gratidão por ter me escolhido!. A minha coorientadora Profa. Dra. KATIA DE ANGELIS por sua excelência na velocidade e acumulo de conhecimentos. Especial agradecimento pela confiança, ensinamentos e auxílio acadêmico.. A minha coorientadora Profa. Dra. IRIS CALLADO SANCHES pelo gratificante aprendizado, expertises, dicas e apoio enriquecendo incomensuravelmente minha trajetória.. Aos que compuseram as bancas de qualificação e defesa norteando minha caminhada com suas arguições, incentivando-me a reflexões contínuas: Prof. Dr. José Antonio, Prof. Dr. Rodolfo de Paula, Prof. Dr. Paulo de Tarso, Profa. Dra. Ivani Credidio Trombetta, Profa. Dra. Maria Claudia Irigoyen, Profa. Dra. Maricilia Silva Costa, Prof. Dr. Danilo Sales Bocalini e Profa. Dra. Cristina Maria Fernandes.. Ao Reitor Prof. Eduardo Storópoli da Universidade Nove de Julho e respectivos colaboradores empenhados na qualidade do crescimento acadêmico á manutenção da infraestrutura da instituição.. Aos Professores Doutores do programa de pós graduação em Ciências da Reabilitação, que em suas aulas professaram conhecimentos que me auxiliam em meu caminhar profissional: Profa. Dra. Cláudia Santos Oliveira, Profa. Dra. Daniela Aparecida Biasotto Gonzalez, Prof. Dr. Dirceu Costa, Profa. Dra. Fernanda de Cordoba Lanza, Prof. Dr. João Carlos Ferrari Corrêa, 7.

(8) Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes, Profa. Dra. Luciana Maria Malosá Sampaio, Prof. Dr. Luis Vicente Franco de Oliveira, Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari, Profa. Dra. Regiane Albertini de Carvalho, Profa. Dra. Simone Dal Corso, Prof. Dr. Andrey Jorge Serra e Prof. Dr. Humberto Dellê. Assim como, a todos que oportunamente escutei e dialoguei. Aos parceiros de pesquisa e troca de experiências: Profa. Dra. Christiane Malfitano, Profa. Dra. Janaina Brito, Profa. Dra. Martha Manchini, Profa. Ms. Nathalia Bernardes, Profa. Ms. Daniele Dias, Prof. Ms Filipe Conti, Prof. Ms. Guilherme Lemos, Profa. Ms. Renata Kely da Palma, Profa. Ms. Morgana, Prof. Ms. Fernando Alves, Profa. Ms. Sarah Freitas e Profa. Camila. Laboratório de Fisiologia Translacional – UNINOVE. Aos parceiros de bancada e congressos: Profa. Dra. Nikele Andrade, Profa. Ms. Eliadna Silva, Profa. Ms. Camila Silva, Prof. Ms. Agnelo Alves, Profa. Ms. Luciana Silva, Prof. Ms. Adriano Santos e aos que me auxiliaram no Laboratório de Pesquisa – UNINOVE.. Aos companheiros de iniciação cientifica: Erico Gemignani, Daniel Munhoz, Larissa Hirata, Stefano Fonseca e Welbert Oliveira, agradeço a vocês.... Aos parceiros de encontros, que em gestos singulares me auxiliaram: Prof. Marcio José Figueira Chaves (valeu por tudo), Ligia Barbosa, Kamila Santos Cerrados, Camila Camarão, Juliana Ribeiro, Luciana Dandara, Samara Vezzaro, Angela Santos, Rodrigo Barros, Karem Viegas, Simone Moraes, Carla Duarte... Vossas ajudas me foram muito importante.. A CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior e ao O Programa de Suporte à Pós-Graduação de Instituições de Ensino Particulares/ PROSUP, pelo suporte financeiro e estímulo a buscar o conhecimento.. Á DEUS! Por Ele, para Ele tudo o que sou e serei. Sempre!. Efeito do treinamento físico combinado com laser de baixa potência em monoartrite experimental 8.

(9) A monoartrite (MA) é causada por inflamação monoarticular e representa considerável problema de saúde pública em todo o mundo. Para avaliação desta patologia utilizou-se dois protocolos (P1 e P2). Em P1 foi avaliado o efeito da terapia a laser de baixa potência (LBP) no influxo de células inflamatórias, a liberação de mediadores inflamatórios, as metaloproteinases (MMPs) e o processo de reparação intra-articular. Em P2 ocorreu associação do treinamento físico (TF) e o LBP para avaliarmos alterações sistêmicas utilizando a variabilidade da frequência cardíaca (VFC) e as alterações articulares locais em modelo experimental de monoartrite induzida com zymosan. Em ambos os protocolos utilizou-se Ratos Wistar machos (220-280 g) que receberam injeção intra-articular de zymosan (1 mg / 50 mL de uma solução salina estéril) no joelho direito. Em P1 os ratos foram irradiados imediatamente, 1 h, e 2 h após a administração de zymosan com LBP (660 nm, 10 mW, 2,5 J / cm2, 10 s). No grupo de controlo positivo, os animais foram injetados com a dexametasona (fármacos anti-inflamatórios) 1 h antes da administração de zymosan. Em P2 os ratos foram adaptados à esteira (10 min/d, 5 d e 0,3 km/h), 48 h após ocorreu a administração de zymosan seguindo da continuidade do TF moderado e LBP (660 nm, 5 mW, 2,5 J/cm2, 20s, 0.04 cm2, 0.1 w/cm2) duas vezes por semana, sempre antes do TF, durante 4 semanas.Os resultados demonstraram que em P1 o tratamento com o LBP inibiu significativamente o influxo de leucócitos, a libertação de IL-1 e IL-6 e também a atividade de metaloproteinase 2 e 9. Em P2 ocorreu a mensuração da pressão arterial (PA) e variabilidade da frequência cardíaca (VFC). Ratos treinados apresentaram menor peso corporal, aumento da velocidade máxima de corrida e menor frequência cardíaca em comparação com os grupos sedentários. Além disso, ratos submetidos a TF mostraram um aumento de Intervalo de Pulso (IP) e diminuição na Banda de Baixa Frequência (BF) e Variância da Pressão Arterial Sistólica (VAR PAS) em relação ao grupo sedentário com MA. Os ratos submetidos a TF associado ao LBP também mostraram uma diminuição na (BF) e na Razão da Banda de Alta Frequência / Baixa Frequência (AF / BF), um aumento de VAR PAS, Variância RR (VAR-RR) e AF em relação ao grupo sedentário com MA. Além destes ocorreu melhora na capacidade funcional e uma diminuição de influxo leucocitário na cavidade articular. A análise histológica mostrou uma histoarquitetura preservada da membrana sinovial e uma redução do deposito de colágeno nos grupos com TF e associação TF e LBP em comparação ao grupo sedentário com MA. TF e LBP causaram uma redução na liberação de IL-1β no líquido sinovial e membrana sinovial. Além disso, a IL-10 foi aumentada no grupo com associação de TF e LBP. A terapia com LBP foi eficaz na redução do processo inflamatório e inibe a ativação de proteases (gelatinase), sugerindo menor degradação do tecido de colágeno no modelo experimental. Além disso, na MA ocorre um desequilíbrio do sistema simpático, o que sugere um envolvimento autonômico precoce. Um programa de TF moderado associado ao LBP pode exercer efeitos benéficos no balanço autonômico cardiovascular e melhora da capacidade funcional. Quanto aos efeitos deletérios nos joelhos dos ratos. Associação de TF e LBP foi eficaz na proteção da articulação em modelo experimental de monoartrite, levando a uma melhora na regulação de citocinas inflamatórias e melhor organização histoarquitetura intra articular. Palavras chaves: Monoartrite, laser de baixa Potência e Treinamento Físico.. Effect of physical training combined with low level laser therapy in an experimental monoarthritis 9.

(10) Monoarthritis (MA) is caused by single-joint inflammation and represents a considerable public health problem worldwide. To evaluate this pathology two protocols were used (P1 and P2). In P1, the effects of low level laser therapy (LLLT) in the influx of inflammatory cells, the release of inflammatory mediators, metalloproteinases (MMPs) and the process of intra-articular repair, were evaluated. In P2 the combination of exercise training (ET) and the LLLT were used to evaluate systemic changes using the heart rate variability (HRV) and local joint changes in experimental model of monoarthritis induced by zymosan. In both protocols male Wistar rats (220-280 g) was used. Rats received intra-articular injection of zymosan (1 mg / 50 mL of sterile saline) into the right knee. P1 rats were irradiated immediately, 1 hour and 2 hr after zymosan administration with LLLT (660 nm, 10 mW, 2,5 J / cm2, 10 s). In the positive control group, rats were injected with Dexamethasone (antiinflammatory agents) 1 hr before zymosan.administration. P2 rats were adapted to the treadmill (10 min / d 0.3 5 km / h) after 48 h the zymosan was administrated and the moderate ET and LLLT (660 nm, 5 mW, 2,5 J/cm2, 20s, 0.04 cm2, 0.1 w/cm2) was applied. The LLLT was applied twice a week, always before TF, during 4 weeks. Our results demonstrated that in P1 LLLT treatment significantly inhibited the influx of leukocytes, release of IL-1 and IL-6 and also metalloproteinase activity 2 to 9. In P2 the measurement of arterial pressure (AP) and heart rate variability (HRV) was measured. Trained rats had lower body weight, increased maximum speed racing and lower heart rate compared to the sedentary groups. Furthermore, ET rats showed an increase in pulse interval (PI) and decrease in the low frequency band (LF) and the systolic arterial pressure variance (VAR SAP) compared to sedentary group MA. ET associated with LLLT also showed a decrease in (LF) and Reason of Band High Frequency / Low Frequency (HF/LF), increase VAR SAP, variance RR (VAR-RR) e HF. compared to the sedentary group with MA. In addition, there was an improvement in functional capacity and a decrease of leukocyte influx in the joint cavity. Histological analysis showed a histoarchitecture preserved the synovial membrane and a reduction in collagen deposit in the groups with ET and ET associated and LLLT compared to the sedentary group with MA. ET and LLLT caused a reduction in the release of IL-1β in synovial fluid and synovial membrane. Furthermore, IL-10 was increased in the group association of ET and LLLT. LLLT was effective in reducing inflammation and inhibits activation of proteases (gelatinase), suggesting less degradation of collagen tissue in an experimental model. In MA occurs an imbalance of the sympathetic system, suggesting an early autonomic involvement. A moderate ET program associated with LLLT may have beneficial effects on the cardiovascular autonomic balance and improved functional capacity. With regard to deleterious effects in the rat knee, ET and LLLT association was effective in protecting the joint in an experimental model of monoarthritis, leading to an improvement in the regulation of inflammatory cytokines and better intra articular histoarchitecture organization. Keywords: monoarthritis, low level laser and Exercise Training.. SUMÁRIO. 10.

(11) Lista de Tabelas ............................................................................................................. xii. Lista de Quadros .......................................................................................................... xii. Lista. de. Figuras xiii. ............................................................................................................... Lista. de. Abreviaturas xiv. ...................................................................................................... 1.. Contextualização 16. ......................................................................................................... 1.1.. Monoartrite 17. ............................................................................................................... 1.2. Zymosan e Inflamação ......................................................................................... 18. 1.3. Treinamento Físico .............................................................................................. 19. 1.4. Variabilidade da Frequência Cardíaca ..................................................................... 20. 1.5.. Laser. de. Baixa. Potência 22. ........................................................................................... 2. Objetivos .............................................................................................................. 26. 3. Resultados ........................................................................................................... 28. 4. Artigo 1 (Publicado) ............................................................................................ 28. 5. Artigo 2 ............................................................................................................... 48. 6. Artigo 3 ............................................................................................................... 63. 7. Considerações finais ........................................................................................... 95. REFERÊNCIAS ANEXOS (Ata de Aprovação, Comitê de Ética, Currículo resumido, Artigo 1). 11.

(12) LISTA DE TABELAS. Artigo 2 Table 1. Body weight and Maximal Exercise Test (MET) …………………………….. 64. Table 2. Hemodynamic Assessments. 65. ................................................................................ Table 3. Autonomic variables at after 35 days of induction arthritis. 66. ……………………. Artigo 3 Table 1. Maximal Exercise Test (MET). 87. ………………………………………………….. LISTA DE QUADROS. Quadro 1. Índices estatísticos, no domínio do tempo da VFC. .......................................... 20 Quadro 2. Fórmulas matemáticas para cálculos de parâmetros do LBP. .......................... 22. 12.

(13) LISTA DE FIGURAS xii Artigo 1 Figure 1 - LLLT effect on leukocyte influx into the joint cavity induced by zymosan ….. 44. Figure 2 - Effect of LLLT on the release of IL-1β and IL-6 into the joint cavity ………... 45. Figure 3 - Histological demonstration of the collagen fibers of the synovium …………... 46. Figure 4 - Effect of LLLT on MMP-2 and 9 activities on joint lavage …………………... 47. Artigo 2 Figure 1 - Time course line showing the treatment protocol the experimental procedures. 63. Artigo 3 Figure 1 - Time course line showing the 4 weeks of the experimental procedures …….. 88. Figure 2 - Effect of ET and LLLT on leukocyte influx into the joint cavity in monoarthritis rats ……………………………………………………………………….. 89. Figure 3 - Histological demonstration of the synovium ………………………………... 90. Figure 4 - Histological demonstration of the fiber collagen ……………………………. 91. Figure 5 - Collagen formation in longitudinal histological sections of rat knee …….... 92. 13.

(14) Figure 6 - Effect of ET and LLLT on the release of IL-1β in joint cavity of monoarthritis rats ……………………………………………………………………….... 93. Figure 7 - Effect of ET and LLLT on the release of IL-10 in joint cavity of monoaarthritis rats ………………………………………………………………………... 94. LISTA DE ABREVIATURAS A ACR ACSM AF ANOVA AR ATP BF Bpm Ca CD CDC Cm COBEA COX-2 DCV De Dp EGFr EPAC Hz i.p. InGaAlP IL INF- δ J. xiii Area American College of Rheumathology American College of Sports Medicine Banda de Alta frequência Análise de variância Artrite Reumatóide Adenosine trifosfato Banda de Baixa frequência Batidas por minute Cálcio Compact disco Centers for Disease Controland Prevention Centímetros Colégio Brasileiro de Experimentação Animal Ciclo – oxigenase – 2 Doença Cárdio Vascular Densidade de energia Densidade de potência Fator de Crescimento de Epiderme Exercise and Physical Activity Conference Hertz Intraperitoneal Indio – Galio – Alumínio - Fósforo Interleucina Interferon gama Joule 14.

(15) K Kg Laser LBP M MEC MFC Mg MmHg MMP Mn Mw Na NF KB Nm NO NSAIDs PAD PAS PBS PGE 2 Pmn R ROS RR S SNA T TEM TGF- β TLRs TNF- α USA VFC VO2 VPAS W C MA MAT MATL ZY Λ. Potássio Kilo grama Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Laser de baixa potência Média Matriz Extracelular Media da Frequência Cardíaca Miligrama Milímetro de Mercúrio Metaloproteinases Morfonucleadas Mili watts Sódio Fator Nuclear de Cadeia Leve Kappa potenciador de células ativadas B Nanômetro Oxído Nítrico Drogas Anti-inflamatórias não Esteroides Pressão Arterial Diastólica Pressão Arterial Sistólica Tampão Fosfato Salina Prostaglandina E xiv Polimorfonucleadas Erro padrão estimado Espécies Reativas de Oxigênio Rate Rate Salina Sitema Nervoso Autônomo Tempo Teste de Esforço Máximo Fator de Crescimento Beta Toll-like Receptores Fator de Necrose Tumoral Alfa United State America Variabilidade da Frequência Cardíaca Volume de Oxigênio Variância da Pressão Arterial Watts Controle Monoartrite Monoartrite + treinamento físico Monoartrite + treinamento físico + laser de baixa potência Zymosan Lambda. 15.

(16) 1. CONTEXTUALIZAÇÃO xv A monoartrite é uma patologia com caráter inflamatório que acomete uma única articulação. Está associada a fatores genéticos, obesidade, estresse biomecânico e trauma. Seu diagnóstico se divide em inflamatório e não inflamatório. Afeta milhões de pessoas ao redor do mundo [1, 2], situação que requer desenvolvimento de estudos e ações terapêuticas eficazes. A monoartrite experimental se torna uma fonte de pesquisas, que contribui para a avaliação e intervenção. Estudos mimetizam a inflamação articular utilizando o zymosan (ZY), um polissacarídeo obtido da parede celular de levedura [3, 4], o qual induz influxo leucocitário com presença de células morfomononucleadas (Mn) e polimorfonucleadas (PMN), citoquinas, interleucinas e ação de metaloproteinases [5], situação similar em pacientes. Na ação terapêutica ao tratamento da inflamação articular, o laser em baixa potência (LBP), sugere ações anti-inflamatórias e condroprotetoras [6], além de não ser invasivo. Sistemáticas pesquisas com LBP mostram atenuação à dor crônica em articulação comprometida [7] através de analgesia, aumento da microcirculação [8], regeneração de 16.

(17) colágeno, proliferação de fibroblastos [9], de células osteoprogenitoras, osteoblastos e regeneração óssea [10]. Outra terapia não invasiva é o treinamento físico com evidências em contribuir ao remodelamento do tecido cartilaginoso, desde que não seja de alta intensidade, pois isto é fator importante para a prevenção e ou promoção da artrite [11, 12]. O papel do treinamento físico e sua intensidade nos constituintes da articulação são complexos e influenciam de diferentes formas as vias de sinalização na expressão gênica dos constituintes intra articular [13]. Diminuir a terapêutica farmacológica e cirurgias [14, 15], aumentar as possibilidades de terapias não invasivas é indicação do Colégio Americano de Reumatologia, que recomenda exercícios de alongamentos, resistidos e aeróbicos [16]. Há estudos experimentais demonstrando que o LBP contribui para o tratamento não invasivo de doenças reumatólogicas [17].. 1.1.. MONOARTRITE. Na MA doença debilitante 50% dos casos são auto limitante. A MA mostra alteração do perfil inflamatório envolvendo uma única articulação. Pode ser classificada em aguda, subaguda e crônica, dependendo do tempo e da evolução dos processos fisiológicos [18]. A avaliação clínica atenta-se aos sintomas de dor, edema, redução de movimento (principalmente pela manhã), fragilidade e inflamação articular. É considerada uma das principais doenças de incapacidade funcional na população idosa [19]. As doenças reumáticas são caracterizadas por inflamações localizadas e sistêmicas de etiologia ainda com muitas lacunas devendo ter abordagem multidisciplinar [20]. As ações multifatoriais da inflamação local na articulação e interações com os tecidos adjacentes ao progredirem causam efeitos deletérios aos tecidos [21].. 17.

(18) A expectativa e qualidade de vida da população, que sofre de inflamação articular são dependentes de fatores genéticos e acesso a terapias multiprofissionais, sendo três vezes mais frequentes na mulher do que no homem. 30 a 50 % das mortes em pacientes com doenças reumáticas crônicas de longo prazo são decorrentes de complicações cardiovasculares ou doença cardiovascular (DCV) [22]. Neste sentido em 1945 FLETCHER e LEWIS-FANNIG, encontraram hipertensão em 45% de pacientes com inflamação articular, auxiliando a correlacionar desordens músculo esqueléticas, reumatologia e DCV [23].. 1.2. ZYMOSAN E INFLAMAÇÃO. β-glucanos são polissacarídeos presentes em fungo a exemplo o Saccharomyces cerevisiae. Sendo o Zymosan, que é principalmente composto de β-glucanos, um preparado insolúvel encontrado nas paredes celulares daquele fungo. Interiorizado ao organismo os βglucanos liga-se a Dectina-1 e aos toll-like receptores (TLRs), componentes da função imune inata orgânica, estes intermedeiam ativação de espécies reativas de oxigênio (ROS), do NF-kB e posterior secreção de citocinas inflamatórias [24]. O Zymosan é utilizado em modelos inflamatórios exercendo ação sobre células endoteliais, osteoclastos, linfócitos, neutrófilos e macrófagos. Caracterizando influxo de células [25]. A inflamação induzida por Zymosan desencadeia uma série de eventos tais como ativação de citocinas, quimiocinas, angiogênese, sinovite, e degradação da cartilagem [3]. Citocinas pró inflamatórias como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF- α), o Interferon gama (INF- δ) e as Interleucinas (IL) IL1, IL2, IL3, IL6, IL8, IL12 e 1L18, bem como as citocinas antiinflamatórias como Fator de crescimento beta (TGF- β) e as Interleucinas. 18.

(19) (IL) IL4 e IL10 (ou antagonistas das citocinas) agem por controlar o processo [26, 27]. Outra conseqüência do processo inflamatório é na matriz extracelular (MEC), que esta em constante remodelamento e com a presença de inflamação ocorre alterações na produção e remodelamento das fibras de colágeno [28, 29].. 1.3. TREINAMENTO FISICO. A monoartrite, inflamação articular é desencadeada por diversos fatores sendo alguns podendo receber influências diretas do treinamento físico, como intensidade alta e fatores endógenos e exógenos [30]. Não obstante o sedentarismo contribui para efeitos deletérios músculo esquelético como a hipotrofia, assim também como a imobilização articular leva a distrofia [31] que acarretam a degradação articular. Evidências com diferentes abordagens consideram o treinamento físico personalizado aos que sofrem de processos inflamatórios articulares, coadjuvante na modulação da dor [32] outras abordam o estilo de vida somado a treinamento físico moderado e recreação, como prevenção a artroplastia de joelho [33]. As recomendações ao tratamento de pacientes acometidos de inflamação articular incluem terapias multimodais, indicando combinação de ações terapêuticas aliadas à educação dos pacientes, treinamento físico, dieta e estilo de vida saudável [34]. Neste sentido, o Centers for Disease Controland Prevention (CDC- USA) e o American College of Sports Medicine (ACSM), tem associado à diminuição da dor, habilidade funcional e ao tratamento de inflamação articular a prática regular de treinamento físico com intensidade moderada de esforço percebido e ou monitorada em unidades metabólica [35]. Em 2002 Exercise and. 19.

(20) Physical Activity Conference (EPAC) recomendou ás pessoas acometidas de inflamação articular o treinamento físico moderado de 3 vezes por semana, somando 30 minutos ao dia. Quanto ao tipo de treinamento físico recomenda-se o alongamento, resistido e o aeróbico, fortalecido por consenso de evidências científicas apontadas pelo American College of Rheumathology (ACR) [36], recomendações estas que promovem, também, alterações cardiovasculares que contribuem a qualidade de vida, contudo há indagações a respeito de considerar o impacto articular causado durante o treinamento físico aeróbico mesmo moderado. Na MA diagnósticos diferenciais incluem progressão dos efeitos deletérios a poliartrite. Nas doenças reumatologicas o perfil inflamatórios em longo prazo tendem a comprometer o sistema cardiovasular, logo desordens musculoesqueléticas e genéticas decursam ao surgimento de doenças cárdicas incluindo pericardite [37, 38, 39].. 1.4. VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA. Ferramentas de observação da Variabilidade da Frequência Cardíaca (VFC) apontam a capacidade dos sistemas cardiovascular e sistema nervoso autônomo (SNA) em responder a estímulos fisiológicos múltiplos e ambientais como o estresse mental, alterações hemodinâmicas e metabólicas, sono, ortotastismo, respiração e treinamento físico, bem como em compensar desordens induzidas por patologias [40, 41]. Em linhas gerais a VFC descreve as oscilações das batidas do coração (intervalos R-R) no decorrer do tempo, podendo aferir as influencias do SNA sobre o nódulo sinusal, Cronologicamente em 1965 a VFC teve uma maior atenção a partir das observações de HON e LEE durante o sofrimento fetal, algum tempo depois, no ano de 1977, WOLF et al. mostraram que uma menor VFC aumenta o risco de morte após o infarto agudo do miocárdio (IAM) e em 1987, KLEIGER et al. confirmaram que a VFC é um importante e independente. 20.

(21) preditor de mortalidade após IAM. Logo, alta VFC significa adaptabilidade, caracterizando mecanismos SNA eficientes. Uma crescente atenção a VFC na historia, que atualmente persiste. De posse destas informações, pode-se avaliar qualitativamente a VFC e inferir uma serie de diagnósticos. Grupos de estudiosos [40] copilaram diversos dados unificando-os e com isto desenvolveu-se programas computacionais e recomendações técnicas em saúde, que auxiliam a uma avaliação quantitativa com acurácia específica e abrangente, as quais culminaram com estratégias de mensuração da VFC, contribuindo a pratica clínica de diagnósticos em saúde, bem como na pesquisa científica. Método Domínio do Tempo calcula a dispersão das oscilações da média da frequência cardíaca por um período prolongado, (Quad. 1). Método Domínio da Frequência avalia a densidade espectral das oscilações cardíacas através da observação de bandas de frequência, sendo as mais utilizadas as Banda de Alta Frequência (AF / 0,2 a 0,4 Hz) e a Banda de Baixa Frequência (BF / 0,02 a 0,07 Hz). Quadro 1. Índices estatísticos, no domínio do tempo da VFC.. Sigla. Descrição Desvio padrão de todos os intervalos de pulsos normais gravados em um. SDNN* intervalo de tempo, expresso em ms; Representa o desvio padrão das médias dos intervalos de pulsos normais, a SDANN cada 5 minutos, em um intervalo de tempo, expresso em ms; É a média do desvio padrão dos intervalos de pulsos normais a cada 5 SDNNi minutos, expresso em ms; É a raiz quadrada da média do quadrado das diferenças entre intervalos de RMSSD pulsos normais adjacentes, em um intervalo de tempo, expresso em ms; Representa a porcentagem dos intervalos de pulsos adjacentes com pNN50 diferença de duração maior que 50 ms.. 21.

(22) * (NN) Intervalo Normal – Normal, ou ciclos cardíacos de cada registro do complexo QRS o qual representa a despolarização ventricular, resultante da despolarização do nó sinusal.. Existem também os métodos não lineares que estão presente em todos os seres vivos. Métodos de avaliação da VFC, que se destacam, dentre vários, são a teoria do caos e o mapa de retorno tridimensional, porém a necessidade de validações [42]. 1.5. LASER DE BAIXA POTÊNCIA. O LASER, Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation ou amplificação da luz por emissão estimulada de radiação originalmente descrito em 1960, por THEODORE MAIMAN, sobe a forma de um laser de rubi que era utilizado, inicialmente, em alta potencia por conta da intensidade. Sua aplicação na saúde se fazia e faz como ativação de agentes fotodinâmicos, em cirurgias (bisturi a laser) e terapias ablativas. Em 1967 MESTERS et al reportou os efeitos do laser de baixa potência atérmico (LBP) em experimentos com camundongos [43, 44] a este tipo de laser nos deteremos. O laser em sua gênese é gerado, após excitação do átomo que produz radiação eletromagnética. O feixe de luz do LBP é coerente (ondas do feixe em fase), monocromática (comprimento de onda uniforme) e colimada (ondas do feixe paralelas); praticamente não existe dispersão ou espalhamento deste feixe de luz, diferente de uma luz proveniente de uma lâmpada. De 1960 a 2013, cinco décadas se passaram e cada vez mais o laser ganha espaço na área da saúde com ações em cicatrização de tecidos, condições inflamatórias, modulação de processos regenerativos, anfigênese e proliferação de células tronco [43]. Na medicina moderna e suas múltiplas especialidades destaca-se a utilização do laser na dermatologia, oftalmologia, cardiologia e neurologia. Assim, como também na odontologia, fisioterapia, estética e demais áreas correlatas da saúde ou não, a exemplo a impressão gráfica,. 22.

(23) leitura de CD e máquinas laser de gravação em insumos (canetas, plásticos especiais, acrílicos, etc). A fotomedicina ganha status através da utilização criativa da “bioestimulação a laser” e ou “terapia laser de baixa potencia”, em tratamento de patologias. Situação com o referendo de avaliações, intervenções e reflexões, que se somam em produções intelectuais [45]. Nestas, aspectos importantes são apontados como à indicação minuciosa de local de aplicação e parâmetros utilizados [7, 46], procedimentos necessários a melhor reprodutibilidade de métodos e resultados. A este contexto as formulas necessárias ao cálculo (Quad. 2). Quadro 2. Formulas matemáticas para alguns parâmetros do LBP.. De (J/cm2) = P . t / A De = densidade de energia (dose ou fluência) em (J/cm2) J = joule P = potencia (W) t = tempo (seg) A = area (cm2) tamanho do ponto ou largura do feixe. Dp = P / A Dp = densidade de potencia em (W/cm2) P = potencia (W) A = area (cm2) tamanho do ponto ou largura do feixe. (Quando a ponteira do laser toca a área irradiada). E=P/t E = Energia (J) P = potencia (W) t = tempo (seg) A = π . r2 A = área (cm) π = pi r = raio Aos aspectos acima mencionados, inclui pontos chaves de intervenção com o LBP, sendo eles: •. O material em estado gasoso utilizado no Laser de emissão continua;. •. Comprimento de onda, sendo seu símbolo o λ (lambda) e unidade de mensuração o nm. (nanômetro);. 23.

(24) •. O contato versus o não contato do equipamento na área de aplicação;. •. Periodicidade no tratamento;. •. O tipo de lesão e ou desordem musculoesquelética, bem como orgânica. Aliado a este contexto estudos tem demonstrado uma ação positiva na cicatrização de. feridas em ambiente clínico, porém não há uma compreensão total dos mecanismos de ação, no que se refere a dosimetria, efeitos microbiológicos e “janela terapêutica” [47]. Contudo cabe a necessidade de padronização dos parâmetros dosimétricos da fototerapia, a exemplo, fluência de energia, energia total, irradiação, pois na literatura muitas vezes estas nomenclaturas se misturam. Outras variáveis são o comprimento de onda, tamanho do feixe, tempo e duração da aplicação, ponto (s) da aplicação e suas organizações. Em específico no tratamento em reumatologia há décadas, o LBP é considerado moderadamente favorável aos efeitos clínicos em doenças reumáticas. Sendo aplicação em baixa potencia (1 a 500 mW), comprimento de onda espectro vermelho ou próximo ao infravermelho (600 – 1.000 nm) e irradiação entre 0.001 e 5 W/cm2, contribui a regeneração tecidual, redução de inflamação e alivio a dor, através dos mecanismos fotoquímicos, já seus efeitos térmicos são irrelevantes [48]. Os efeitos do LBP decorrem primeiramente de mecanismos fotoquímicos, sendo que os fótons da radiação eletromagnética são absorvidos por moléculas fotoacptoras ou cromóforas. Secundariamente ocorre indução por fotofisiologia em processos celulares e terciariamente ocorre uma cascata de sinalização e respostas biológica. A mitocôndria é descrita na literatura com uma célula cromófora e tendo em sua cadeia respiratória propriedade de afinidade a luz monocromática sendo assim considerado um nível biológico primário da ação do LBP [49]. O LBP é promissor ao tratamento em reumatologia, a literatura aponta moderada eficácia durante o tratamento clinico na analgesia e mobilidade articular [48] situação esta. 24.

(25) reforçada por estudo histológico mostrando que na inflamação o LBP mostra ação positiva na modulação da resposta inflamatória tanto inicial, quanto tardia [18]. Ainda, estudos desvelam uma ação do LBP na inflamação articular experimental em inibir a formação do edema, analgesia e incapacidade articular [50] sugerindo uma ação antiinflamatória e clinicamente relevante. O LBP apresenta diminuição na modulação de mediadores inflamatórios como o TNFα, ciclo-oxigenase (COX-2) e prostaglandina E (PGE2) e redução de edema [51] estes presentes no processo inflamatório articular local e participante dos efeitos decorrente da inflação. O modelo experimental com Zymosan induz a inflamação articular através do acionamento do sistema imune inato é bastante utilizado em pesquisa correlacionando fármacos e LBP, sendo desvelada eficácia ao tratamento, porém com a necessidade constante de comparar as alterações dosimétricas e os efeitos biomoleculares [52, 51]. Pesquisas suscitam uma constante preocupação com as recomendações ao tratamento com LBP aos que sofrem com doenças reumáticas [53]. Outra situação ainda não esta consolidada na literatura são os parâmetros, frequência do tratamento, fluência de energia e energia entregue no tratamento com LBP.. 2. OBJETIVOS. 25.

(26) 2.1. OBJETIVO GERAL O objetivo geral deste estudo visa compreender e comparar os efeitos do laser de baixa potência combinado com treinamento físico em artrite experimental. OBJETIVO ESPECÍFICO ARTIGO 1: Avaliar o efeito da terapia a laser de baixa potência na artrite aguda induzida por zimosan de joelho de rato, no que se refere: . Influxo de células inflamatórias;. . Liberação de mediadores pró-inflamatórios;. . Ação das metaloproteinases (MMPs);. . Processo de reparo da cartilagem na cavidade articular. ARTIGO 2: Estudar o efeito do laser de baixa potência combinado com treinamento físico, na ação. sistêmica, após a indução da artrite de joelho, no que se refere: . A capacidade funcional;. . Alteração de peso;. . A Variabilidade da Frequência Cardíaca;. . Efeitos Hemodinâmicos;. . Efeitos Autonômicos. ARTIGO 3 Estudar o efeito do laser de baixa potência combinado com treinamento físico, na ação. local, após indução da artrite de joelho, no que se refere: . A degradação da cavidade articular;. . Ao recrutamento Leucocitário;. . Á liberação de Citocinas IL-1b e IL-10. 26.

(27) . Avaliação histológica da articulação do joelho.. RESULTADOS. 27.

(28) ARTIGO 1. Protective Effect of Low Level Laser therapy (LLLT) on Acute Zymosan-Induced Arthritis Fernando Pereira Carlos1, Marcelo de Paula Alves da Silva1, Eliadna de Lemos Vasconcelos Silva Melo1, Maricilia Silva Costa2, Stella Regina Zamuner*1. 1. Universidade Nove de Julho, Rua Vergueiro, 234, São Paulo, SP, Brazil.. 2. Institute of Research and Development, University of Vale do Paraíba, São José dos Campos,. SP, Brazil. Running title: LLLT IN ZYMOSAN-INDUCED ARTHRITIS Corresponding author: Stella Regina Zamuner, PhD Adress: Rua Vergueiro, 234, Bairro Liberdade, CEP 01504-000 Phone: 55-11 33859222 E-mail: stella.rz@uninove.br or stellazamuner@hotmail.com. ABSTRACT. 28.

(29) The aim of this study was to evaluate the effect of low level laser therapy on acute zymosaninduced arthritis, with respect to the laser action on inflammatory cells influx, release of proinflammatory mediators, metalloproteinases (MMPs) activity into the joint cavity and the cartilage repair process. Arthritis was induced in male Wistar rats (250–280 g) by intra-articular injection of zymosan (1mg/50 mL of a sterile saline solution) into one rear knee joint. Animals were irradiated immediately, 1 h, and 2 h after zymosan administration with a semiconductor laser InGaAIP (660 nm, 10 mW, 2.5 J /cm2, 10 s). In the positive control group, animals were injected with the anti-inflammatory drug dexamethasone 1 h prior to the zymosan administration. Treatment with laser significantly inhibited leukocytes influx, the release of IL1 and IL-6 and also the activity of metalloproteinase-2 and 9, into the joint cavity. In conclusion, laser therapy was effective in reducing inflammation to sites of injury and inhibit activation of proteases (gelatinase) suggesting less degradation of collagen tissue in experimental model of acute arthritis.. Keywords: inflammation, arthritis, LLLT, cytokines, MMP. 29.

(30) INTRODUCTION Arthritis is a musculoskeletal disorder that affects great part of the population [1] it affects people of all ages, but the problem of degenerative diseases of bones and joints is very likely to increase considerably as the population ages [2]. Clinical symptoms are characterized by pain, reduced range of movement, tenderness, and inflammation. The pathological processes involved in arthritis induce to a complete joint destruction [3]. One of the main factors that lead to joint destruction is the infiltration of inflammatory cells. Polymorphonuclear leukocytes (neutrophils) infiltration into inflamed tissues is a hallmark of acute inflammation. These cells are predominant in the synovial exudates of a variety of inflammatory arthropathies including rheumatoid arthritis [4]. Additionally, neutrophil influx is always associated to the severity of the clinical picture in joint diseases (5). The mobilization of these cells is mainly mediated by cytokines (IL-1β, IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF), interferon- (INF-), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor- (TGF-) and nitric oxide (NO) [6-8]. Furthermore, elevated levels of pro-inflammatory cytokines have direct implications for increased secretion of proteolytic enzymes (e.g. matrixmetalloproteinases-MMPs) from stromal cells of the synovium and from chondrocytes which, in turn, play a major role in eliciting cartilage damage [9]. Drug and non-drug treatments are used to relieve pain and/or swelling in patients with arthritis. Non-steroidal anti-inflammatory agents (NSAIDs) and selective cyclooxygenase (COX-2) inhibitors are commonly used as analgesic and anti-inflammatory agents in a number of pathologies [10]. Although, the use of NSAIDs is limited due to the high incidence of cardiovascular and gastrointestinal problems, it is widely used for inflammatory diseases such as knee arthritis [11]. Likewise, TNF inhibitor therapy is often used to treat arthritis, but this treatment is related with side effects on the systemic immune system [3]. These considerations have prompted the search for alternative non-drug treatments for arthritis.. 30.

(31) Low-level laser therapy (LLLT) has been used clinically and experimentally to treat a wide variety of pathology conditions including musculoskeletal pathologies associated with joint disease [12]. Even though LLLT has been used to treat several clinical conditions and has also been studied in many animal models and in cell culture systems, its mechanisms are still incompletely understood. We recently demonstrated that LLLT, in two wavelengths (685 nm and 830 nm) was effective in reducing edema formation, vascular permeability, and hyperalgesia in zymosaninduced arthritis [11]. Therefore, the purpose of this study was to evaluate the mechanisms of the effects of laser therapy in acute arthritis, induced by zymosan in the rat knee, with special focus on inflammatory cells influx, the release of pro-inflammatory mediators and metalloproteinase activity into the joint cavity.. MATERIAL AND METHODS Laboratory animals The experimental protocol was approved by our local ethics committee (protocol number 0025/2011) that follows the guidelines of the Brazilian College of Animal Experimentation. A total of 40 male Wistar rat were used for the study. Rats weighting 250280 g were housed in cages with free access to standard laboratory diet and drinking water. Animals were kept in a 12:12-hour light-dark cycle at a temperature-controlled room (26ºC). All experiments were designed to minimize animal suffering and to use the minimum number of them associated with valid statistical evaluation. Zymosan-induced acute inflammation in knee joint Rats received an intra-articular (i.a.) injection of 1 mg zymosan (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA ), dissolved in 50 L of a sterile saline solution, into one rear 31.

(32) knee (stifle) joint. The procedure was done under anesthesia, using a mix of ketamine 80 mg/kg (Hospira, Inc.; Lake Forest, IL, USA), xylazine 20 mg/kg (Lloyd, Inc.; Shenandoah, IA, USA) intramuscularly. Light sources, doses and treatment. A low level laser InGaIP (aluminum gallium indium phosphide; MMOptics, Ltda, São Carlos, SP. Brazil), operating continuous way in 660 nm wavelengths was used through the whole experiment to irradiate the animals. The laser parameters were: 10 mW of power, 10 s irradiation time and irradiated area of 0.04 cm2; which corresponds to a laser dose of 2.5 J/cm2. The optical power of the laser was calibrated using a Newport Multifunction Optical Meter (model 1835C). That laser dose, low enough to avoid any thermal effect, was chosen on the basis of previous studies from our laboratory that had shown a beneficial effect of the low level laser on the inflammatory process [11]. The rats were randomly divided into four groups with five animals per group. Saline group: rats received an i.a. injection of saline; Zymosan group: rats received an i.a. injection of zymosan (1mg/kg); Laser group: rats received an i.a. injection of zymosan and a laser treatment in 660 nm; Dexamethasone group: rats received an i.a. injection of zymosan and was treated with dexamethasone (0,4 mg/kg; i.p.) as an anti-inflammatory positive control (Sigma Chemical Company), one hour before the zymosan injection. Animals of the laser group were irradiated at times: 0, 1 and 2 h after induction of inflammation [11]. At the end of each protocol, the animals in the respective groups were sacrificed in CO2 atmosphere.. Evaluation of leukocyte influx The leukocytes recruited into the joint cavity were measured after induction of the inflammatory reaction, as described above. After 6 hours of zymosan, saline or dexamethasone. 32.

(33) injection, animals were sacrificed. Dissection was performed from the knees with the removal of tibial-patello femoral ligament to expose the outer surface of the synovial membrane. Joint lavage was collected from the cavity of the knee joint after two injections totaling 400 µL of phosphate-buffered saline, pH 7,2 (PBS), containing 5 UI/mL heparin. Aliquots of the washes were used to determine total cell counts in a Neubauer chamber after dilution in Turk solution (0.2% crystal violet dye in 30% acetic acid). Differential leukocyte counts were performed on stained Instant Prov.. Quantification of IL-1 and IL-6 concentrations Sinovium washes were collected 6 h after i.p. injection of zymosan (1 mg/kg) or sterile saline, as described above. After centrifugation, the supernatants were used for determination of IL-1 and IL-6 levels by a specific EIA. Briefly, 96-well plates were coated with 50 mL of the first capture monoclonal antibody anti-IL-1 (2 mg/mL) or anti-IL-6 (2.5 mg/mL) and incubated for 18 h in the case of IL-1 or 2 h for IL-6 at 37°C. Following this period, 200 mL of blocking buffer, containing 5% bovine serum albumin (BSA) in PBS/Tween 20, were added to the wells and the plates were incubated for 2 h at 37 °C for IL-1 and overnight at 4 °C for IL-6. After washing, 50 mL of either samples or standards were dispensed into each well and the plates incubated for 2 h at 37 °C. Wells were washed, and bound IL-1 or IL-6 was detected by the addition of the biotinylated monoclonal antibodies anti-IL-1 (5 mg/mL, 50 ml/well) or anti-IL6 (5 mg/mL, 50 mL/well), respectively. After incubation and washing, 50 mL of streptavidin– peroxidase, in the case of IL-1, or avidin–phosphatase, in the case of IL-6, were added, followed by incubation and addition of the substrate (50 mL/mL of s-phenylenediamine in the case of IL-1 or 200 mL/mL r-nitrophenylphosphate in the case of IL-6). Absorbances at 450 nm were recorded and concentrations of IL-1 and IL-6 were estimated from standard curves prepared with recombinant IL-1 or IL-6.. 33.

(34) Zymography For the enzymatic assay, aliquots with 3 μl of supernatant from sinovium washes were subjected to electrophoresis under non-reducing (100V a 4oC) polyacrylamide SDS gels (8%) prepared with 1 mg/mL gelatin. After electrophoresis, gels were washed twice for 15 min each with 2.5% Triton X-100 to eliminate SDS. Gels were then incubated overnight at 37ºC in substrate buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 5 mM CaCl2, and 0.02% NaN3). Gels were then stained for 30 min with 0.05% Coomassie blue R-250 in acetic acid:methanol:water (1:4:5) and distained in the same solution. All gels were prepared and run at the same time. The bands were quantified by densitometry analyzed by public domain software Image J.. Histological procedures At 6 hours after the induction of arthritis, the synovia was collected and submitted to the classic histological method for embedment in paraffin: dehydration in increasing concentrations of alcohol; clearing with xylol in order to allow the penetration of paraffin; impregnation in paraffin baths and insertion in molds; cross-sectional cuts to a thickness of five micrometers; and mounting. The material was stained with hematoxylin and eosin for the determination of inflammatory cells in the injury site in each treatment and Picrosirius red stain for the verification of collagen fibers. To quantify the collagen fibers, the slices were observed in a polarized light microscope Olympus coupled to an Olympus brand video camera. The images were digitized and standardized and then analyzed through the Imag J software. Statistical Analysis Results are expressed as mean SEM. Differences among groups were analyzed by oneway analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test. Values of probability lower than. 34.

(35) 5% ( p<0.05) were considered significant.. RESULTS. Effect of LLLT on leukocyte influx. The leukocyte influx into the joint cavity was evaluated 6 h after injection of zymosan (1 mg/kg). Treatment with laser after zymosan injection significantly (p< 0,05) inhibited 3. leukocytes influx at 6 hour. The LLLT causes an accumulation of 451±131 x 10 /mL leukocytes in the joint cavity, which was significantly different from that of zymosan alone (2.156  504 x 103/mL) (Fig. 1A). Also, administration of dexamethasone significantly inhibited the influx of leukocytes (513  80 x 103/mL), which was not different from LLLT. A differential cell count showed that cells present in the joint cavity were predominantly polymorphonuclear leukocytes (PMN), mainly neutrophils. The LLLT induced a statistically significant reduction on the number of PMN (Zymosan: 1,457  347 x 103/mL; LLLT: 564  245 x 103/mL) and mononuclear cells (MN) ((Zymosan: 598  150 x 103/mL; LLLT: 178  73 x 103/mL) (Fig 1B and C). The administration of dexamethasone (4 mg/Kg), significantly inhibited, the influx of PMN (412  115 x 103/mL) and MN (126.6  24 x 103/mL) (Fig. 1B and C). Effect of LLLT on the release of IL-1β and IL-6. The concentrations of IL-1β and IL-6 were assessed in cell-free joint exudates 6 hours after zymosan injection or sterile saline. LLLT significantly reduced the release of IL-1β (Fig. 2A) and IL-6 (Fig. 2B) into the joint cavity, showing the same effect of dexamethasone. Histopathologic analysis of the synovium Figure 3A shows the histological section of the synovia of control animal injected with saline, presenting integrity of the collagen fiber. Histological section of the animal that received. 35.

(36) zymosan (Zy) injection showing intense alteration in collagen fibers where we observe the presence of areas with non-aligned fibers (arrow) and areas without collagen (star). LLLT shows a better organization of the collagen fibers with similar appearance compared to dexamethasone treatment. The percentage of collagen fibers in different groups was 76±6%, 31±10%, 68 ±16% and 71±11% in control, zymosan, LLLT and dexamethasone group, respectively, demonstrating that the amount of collagen fibers in LLLT group is significantly higher than the zymosan group (Fig. 3B).. Effect of LLLT on matrix metalloproteinase activity LLLT effect on MMP-2 and MMP-9 activity was examined in the supernatant of synovial lavage collected 6 and 12 hours after zymosan injection. The laser treatment significantly decreased the release of MMP-9, both within 6 and 12 h after zymosan injection. The supernatant collected at 12 h showed more intense band than those of supernatant collected 6 h after induction of inflammation (Fig. 4A and B). There was no statistical difference between the laser and dexamethasone treatment used in this study. Figure 4C and 4D shows that the laser treatment applied after the injection of zymosan significantly reduced MMP-2 activity, similarly to dexamethasone, at 6 and 12 h after treatment. DISCUSSION Arthritic inflammation is a serious health problem that affects a large number of people worldwide. LLLT was introduced as an alternative noninvasive treatment for arthritis about 20 years ago, but its effectiveness remains controversial. Moreover, the mechanisms involved in the anti-inflammatory effect of LLLT are not yet established. Therefore, the knowledge of the underlying mechanisms involved in the anti-inflammatory effect of laser treatment could lead to the improvement of effective of a noninvasive therapy. In this study, we investigated the use of LLLT on zymosan-induced arthritis, focusing on the acute phase.. 36.

(37) The effects of LLLT were evaluated in cell migration into the rat knee joint. It is noteworthy that most studies evaluate the cell influx in the synovia, whereas we did in joint lavage. Moreover, the cells in the synovia of arthritis induced by zymosan are predominantly lymphomononuclear while polymorphonuclear is the predominant cells in joint lavage [13]. To verify that the laser was able to reduce the leukocytes influx into the joint cavity, this effect was evaluate at 6 h after zymosan injection, period in which the peak of neutrophils influx into the joint cavity occurred [13]. Our results clearly demonstrated that the laser radiation decreases the migration of neutrophis in the sixth hour of inflammation, when applied immediately, 1 st and 2nd h after the induction of inflammatory arthritis, in the rat knee. Similar results were described in the literature [14]. In another experimental model, it was observed a reduction of leukocyte influx in the initial phase of carrageenan-induced pleurisy in rats after three applications of LLLT 660 nm [15]. Similar data were found by Amano et al. [16] who treated 14 patients with knee arthritis and used the laser treatment. Also, we observed a better organization of collagen structure in the laser-treated group. Thereby demonstrating the effect of biostimulation with LLLT on membrane repair process. The influx of inflammatory cells is an important factor that determines the course of arthritis. Moreover, it is observed that the production of inflammatory cytokines such as IL-1β and IL-6 are responsible for the disease progression and chronicity of the process. The literature states that these cytokines can modulate the expression of metalloproteinase which is involved in regulating the balance between cell and matrix, and when there is an unbalanced expression of these enzymes the destruction of articular cartilage occurs. IL-1 is a dominant cytokine in stimulating MMP expression by chondrocytes in experimental arthritis [17]. Also, several authors [18, 19], reported that IL-6, involved in the pathophysiology of arthritis also enhances production of osteoclasts. In the experimental model used in this study, the expression of IL-6 and IL-1 β had decreased after laser treatment, showing the same extent of reduction of. 37.

(38) dexamethasone treatment. The reduction of this cytokine may suggest decreased activity of MMP and/or osteoclasts production that causes cartilage and bone destruction. The same results were found by Pallota et al., [14] showing a decreased in IL-1 and IL-6 after treatment with LLLT. A number of studies have demonstrated that MMPs are important mediators in inflammatory and connective tissue diseases such as arthritis [20-22]. Of considerable importance in arthritis are the gelatinase subfamily of MMPs, consisting of MMP-2 (gelatinase A) and MMP-9 (gelatinase B). MMPs degrade various extracellular matrix proteins by breaking them into their specific peptide bonds and are expressed in various cell types and tissues, including vascular smooth muscle cells, endothelial cells, fibroblasts and inflammatory cells [23]. Also, MMPs and cytokines (IL-1, IL-6 and TNF-α) are responsible for the inflammatory signals that occur in the breakdown of cartilage [24]. In the present study LLLT significantly decrease the activity of MMP 2 and 9 after zymosan injection, suggesting less degradation of collagen tissue. Conclusion Collectively, the observations outlined above support the statement that the antiinflammatory effects of the LLLT tested in this study provide protective effects, countering effectively the degradation of the joint cartilage network.. Acknowledgement - Financial support: Brazilian Council of Research—CNPq (Process No. 475083/2011-3).. 38.

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(42) Figure 1 - LLLT effect on leukocyte influx into the joint cavity induced by zymosan. Rats were injected with zymosan (1 mg/kg) and treated with laser. Another group was pretreated with dexamethasone (0,4 mg/kg). Rats were killed after six hour and inflammatory exudates were withdrawn the joint cavity. Total leukocytes (A), polymorphonuclear (PMN) (B) and mononuclear (MN) (C). LLLT was applied immediately, 1ª e 2ª hour after zymosan injection. Results are presented as mean  SEM (n=5). #p< 0,05 compared to saline and *p< 0,05 compared to zymosan group (ANOVA). Figure 2 - Effect of LLLT on the release of IL-1β and IL-6 into the joint cavity. The animals were injected with zymosan i.a. (1 mg/kg) or saline (control). The concentrations of IL-1β (A) and IL-6 (B) were measured by ELISA in joint lavage fluid collected 6 h after injection of zymosan. LLLT was applied immediately, 1ª e 2ª hour after zymosan injection. Results are presented as mean  SEM (n=5). #p< 0,05 compared to saline and *p< 0,05 compared to zymosan group (ANOVA). Figure 3 - Histological demonstration of the collagen fibers of the synovium. Representative histological sections (picrossirius red under polarized light, 40x objective) of the synovium. In (A) synovium of animals injected with saline presenting normal appearance of collagen fiber, synovium of animals injected with zymosan showing disorganization of the collagen fibers, synovium treated with laser and synovium treated with dexamethasone showing a better organization of collagen fibers. In (B) quantification of collagen fibers in the synoviun. Results are presented as mean  SEM (n=5). #p< 0,05 compared to saline and *p< 0,05 compared to zymosan group (ANOVA). Objective 40x. Figure 4 - Effect of LLLT on MMP-2 and 9 activities on joint lavage. Joint lavage was collected 6 and 12 h after induction of inflammation and laser treatment as described in material and methods. (A and C) Representative electrophoresis from three independent experiment. (B. 42.

(43) and D) Densitometric analysis of joint samples intensity. # p<0.05 compared to saline and * p<0.05 compared to zymosan group (ANOVA).. 43.

(44) FIGURE 1. A. Cells x 10 3/mL. 3000. Total. Saline Zy Zy + LLLT Zy + Dexa. #. 2000. 1000. *. *. 0. B. PMN. Cells x 10 3/mL. 3000. #. 2000. 1000. *. *. 0. C. MN. Cells x 10 3/mL. 3000. 2000. 1000. #. *. *. 0. 6h. 44.

(45) FIGURE 2. A ng IL-1 /0.1 mL. 4. # 3 2. *. 1. *. 0. Saline. Zy. Zy + LLLT. Zy + Dexa. B. ng/IL-6/ 0.1 mL. 1.5. # 1.0. *. 0.5. * 0.0. Saline. Zy. Zy + LLLT. Zy + Dexa. 45.

(46) FIGURE 3. A. B B Collagen fibers (%). 100. *. 75. *. 50. # 25 0. Saline. Zy. Zy + LLLT. Zy + Dexa. 46.

(47) FIGURE 4. B. MMP-9 Saline. Gelatinolytic activity (arbitrary units). 4000. Zy Zy +LLLT Zy + Dexa. #. 3000 #. *. #. *. 2000 #. 1000. #. #. *. *. 0. 12. 6. Time (h). D. Saline Zy Zy + LLLT Zy + Dexa. MMP-2. Densitometric analysis (Arbitrary Units). 2000 1500. # 1000. #. #. *. *. #. *. #. *. 500 0. 6. 12 Time (h). 47.

(48) ARTIGO 2. Exercise training associated with low level laser therapy decreases Sympathetic overactivity in experimental model of acute monarthritis in rat. Marcelo de Paula Silva MS 2, Iris Callado Sanches PhD 1, Felipe Fernandes Conti MS 1, Katia De Angelis PhD 1, Stella Regina Zamuner PhD 2. 1 Laboratory of Translational Physiology – Universidade Nove de Julho 2 Laboratory of Cell Biology – Universdade Nove de Julho Author address: Stella R. Zamuner, PhD Post Graduation Program Sciences Rehabilitation UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO – UNINOVE/SP Rua Vergueiro, 234, Bairro Liberdade, Cep:01504-000, São Paulo, Brasil. Email: stella.rz@uninove.br. 48.

(49) ABSTRACT. Background & objectives: It has been shown that the inflammatory process causes autonomic changes in arthritis. The aim of this study was to evaluate the association of nompharmacological therapies of exercise training (ET) and low-level laser therapy (LLLT) on the inflammatory process and its influence on autonomic and cardiovascular regulation in the experimental model of monoarthritis in rats. Methods and Results: Thirty male Wistar rats were divided into: control (C); monoarthritis (MA); MA + exercise training (MAT) and MAT + low level laser (MATL). Monoarthritis was induced by intra-articular injection of zymosan (1 mg dissolved in 50 μl of a sterile saline solution) into one rear knee joint. Moderate-intensity ET was performed on a treadmill for 4 weeks and LLLT at 660 nm in a dose of 2.5 J/cm2 was applied twice a week. Arterial pressure (AP) and heart rate variability (HRV) were measured. Trained rats presented lower body weight, an increase in the maximum speed of running and lower heart rate compared to the other groups. Furthermore, rats underwent to ET showed an increase of PI and a decrease in LF and VAR SAP compared to MA group. Rats subjected to ET associated a LLLT also showed a decrease in the LF and HF/LF and an increase of VAR SAP, VAR-RR and HF compared to MA group. Conclusion: Acute monoarthritis caused an imbalance of the sympathetic system, which suggests an early autonomous involvement. A moderate exercise program associated with LLLT can significantly exert beneficial effects on arthritic rats. These benefits were related to the cardiovascular autonomic balance and improvement of functional capacity.. Keywords: monoarthritis, exercise training, low-level laser therapy, autonomic function.. 49.

(50) INTRODUCTION. Cardiovascular dysfunction (CD) has been documented in rheumatoid arthritis (RA) as an important predictor of mortality and survival [1], indeed, the mortality and morbidity of RA patients is attributed more to its cardiovascular complications rather than the disease itself [2, 3, 4, 5]. In addition, literature shows that the cardiovascular risk in RA is related to the systemic inflammatory burden as well as an increased prevalence of traditional risk factors [7, 8]. Currently therapeutic strategies for the treatment of arthritis include pharmacologic and non-pharmacologic management and ultimately surgery [9]. The anti-inflammatory drugs (corticosteroids and non-steroidal) are the most widely pharmacological treatment used in arthritis. Although these anti-inflammatory drugs are commonly used to treat inflammation associates with arthritis, it is often ineffective and may cause high incidence of adverse and unwanted dangerous side effects in the gastrointestinal tract, which limit their use [10]. Nonpharmacological treatments involve physiotherapy, aerobic and strength training exercises, weight loss, wearing braces and orthoses and so on. Indeed, exercise training (ET) has been recommended for managing of arthritis as a non-pharmacological therapy that has led to improvements in function and arthritis symptoms [11, 12, 13, 14]. In this regard, studies have shown that the regular practice of physical exercise attenuates the inflammatory response, joint pain and swelling, thereby contributing to restoration of range of motion, muscle strength and improves cardiovascular conditions [15, 16]. It is recommended that adults with arthritis do moderate physical activity associated with muscle strengthening activities [17]. Another non-pharmacological treatment is low-level laser therapy (LLLT) that is growing as an alternative to many medical conditions that require relief from pain and inflammation [18]. Photobioestimulation with LLLT have been proposed to treat arthritis based on the literature that shows a reduction of inflammatory cell in fluid of synovial washing and a 50.

(51) decrease in inflammatory citokines such as IL-1 and IL-6 and TNF-a [19, 9], angiogenesis stimulation and reduction in the formation of fibrosis [20]. Also, we have shown that LLLT can reduce hyperalgesia in a model of zymosan-induced arthritis [21]. Although arthritis predominantly affects the synovial joints it also leads to extraarticular manifestations. In this regard, impressively increasing number of investigators have reported on potential determinants of increased cardiovascular (CV) diseases in patients with rheumatoid arthritis (RA) [1]. A recent review confirmed that the CV risk in RA is increased to a similar magnitude to that seen in type 2 diabetes [7]. Also, it has been demonstrate that elevations in circulating pro-inflammatory cytokines increases sympathetic activity [22, 23], reduce cardiovagal baroreflex sensitivity [24] and reduce heart rate variability (HRV)-derived indices of cardiac parasympathetic activity. Then, using a model of acute articular inflammation, the monoarthritis (MA) induced by zymosan injection in the knee joint, we investigated the effect of the inflammatory process and its influence on autonomic and cardiovascular regulation in an acute arthritis. In order to evaluate autonomic and cardiovascular alterations, we used direct measurements of blood pressure measurements for 30 min to the HRV for hemodynamic and autonomic functions analysised. We also tested the hypothesis that exercise training combined with low level laser therapy causes changes in hemodynamic and autonomic function.. MATERIAL AND METHODS 51.