BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ PHƢỢNG
NGHIÊN CỨU D NG QU TR NH
BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMINOID
TỪ NGUỒN CURCUMINOID CHIẾT XUẤT
TRONG NƢỚC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ PHƢỢNG
NGHIÊN CỨU D NG QU TR NH
BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMINOID
TỪ NGUỒN CURCUMINOID CHIẾT XUẤT
TRONG NƢỚC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THU C
MÃ S : 60720402
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện
LỜI CẢM ƠN
Trải qua hai năm học cao học đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các thầy giáo, cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa học và Luận văn Thạc sỹ Dƣợc học của mình.
Với tất cả sự kính trọng, trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn Giang, DS. Nguyễn Thị Vân và CN. Phan Tiến Thành đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học và thực hiện Luận văn.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dƣợc, cũng nhƣ các thầy cô trong trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô của Phòng Sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt hai năm học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học.
Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2014
Học viên
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ... 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CURCUMINOID ... 2 1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất ... 2 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý ... 6 1.1.3. Phƣơng pháp tách hỗn hợp curcuminoid ... 10 1.2. TỔNG QUAN VỀ TETRAHYDROCURCUMINOID ... 11 1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất ... 11 1.2.2. Nguồn gốc tetrahydrocurcumin ... 12 1.2.3. Tác dụng dƣợc lý ... 12 1.2.4. Tổng quan về các phƣơng pháp bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid ... 14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 18
2.1. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ... 18
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu ... 18
2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu ... 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 20
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20
2.3.1. Phƣơng pháp tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid ... 20
2.3.2. Bán tổng hợp hóa học: ... 20
2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết ... 21
2.3.4. Xác định cấu trúc sản phẩm ... 21
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 22
3.1. TÁCH CÁC CURCUMIN I, II, III TỪ HỖN HỢP CURCUMINOID ... 22
3.2. KHỬ HÓA TỪNG CURCUMINOID THÀNH PHẦN ... 26
3.2.1. Khử hóa curcumin I (curcumin) ... 26
3.2.2. Khử hóa curcumin II (DMC) ... 34
3.3. KHỬ HÓA HỖN HỢP CURCUMINOID ... 41
3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ... 46
3.4.1. Xác định cấu trúc curcumin I (curcumin) ... 46
3.4.2. Xác định cấu trúc curcumin II (DMC) ... 48
3.4.3. Xác định cấu trúc THC I (THC) ... 50
3.4.4. Xác định cấu trúc THC II ... 53
3.5. THỬ TÁC DỤNG CH NG OXY HÓA CỦA CÁC CHẤT BÁN TỔNG HỢP ĐƢỢC ... 54 Chƣơng 4: BÀN LUẬN ... 56 4.1. Về phƣơng pháp tách từng thành phần từ hỗn hợp curcuminoid ... 56 4.2.Về phản ứng khử hóa từng curcuminoid thành phần ... 56 4.3. Về phản ứng khử hóa curcuminoid hỗn hợp ... 58 4.4. Về xác định cấu trúc ... 59 4.5. Về tác dụng sinh học ... 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 64 1. Kết luận ………. 64 2. Kiến nghị ………..64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AcOH Acid acetic
AOM Azoxymethan
APPH 2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid
BDMC Bisdemethoxycurcumin
13C-NMR 13C - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13C) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DMC Demethoxycurcumin DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị carbon EtOH Ethanol H Giờ HHC Hexahydrocurcumin
HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus)
1H-NMR 1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High-performance liquid chromatography)
Hpƣ Hiệu suất phản ứng
EC50 Nồng độ tại đó có tác dụng với 50% đối tƣợng thử (Effective concentration at 50%)
IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low – density lipoprotein)
MeOH Methanol
MS Phổ khối lƣợng (Mass spectrometry) OD Mật độ quang (Optical density)
OHC Octahydrocurcumin
P Áp suất
Rf Hệ số lƣu giữ (Retension factor)
SKLM Sắc ký lớp mỏng
sp, SP Sản phẩm
TBA Acid 2-thiobarbituric
THC Tetrahydrocurcumin
Tonc Nhiệt độ nóng chảy
T Thời gian
TLTK Tài liệu tham khảo
V Thể tích
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của các curcuminoid ... 2
Bảng 1.2. Một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid... 12
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu... 18
Bảng 2.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu ... 19
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh đến quá trình kết tinh curcuminoid ... 23
Bảng 3.2. Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96% ... 24
Bảng 3.3. Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 .... 25
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C .. 27
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C .. 28
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/acid ... 30
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl ... 31
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl .... 31
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là H2/Pd/C ... 35
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là H2/Pd/C .... 36
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là Zn/acid ... 38
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là Zn/HCl ... 39
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin II đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ Curcumin II với tác nhân khử là Zn/HCl ... 40 Bảng 3.14. Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 ... 43 Bảng 3.15. Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat... 45 Bảng 3.16. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của curcumin ... 47 Bảng 3.17. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của curcumin . 47 Bảng 3.18. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của curcumin ... 48 Bảng 3.19. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của DMC ... 48 Bảng 3.20. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC ... 49 Bảng 3.21. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC ... 49 Bảng 3.22. Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của THC (khử thành phần) ... 50 Bảng 3.23. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (khử thành phần) .... 51 Bảng 3.24. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (khử thành phần)... 51 Bảng 3.25. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (tách từ khử hỗn hợp) ... 52 Bảng 3.26. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (tách từ khử hỗn hợp) ... 52 Bảng 3.27. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC II ... 53 Bảng 3.28. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của THC II ... 53 Bảng 3.29. Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tƣ do của các mẫu thử theo phƣơng pháp DPPH ... 55
DANH MỤC CÁC H NH VẼ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcuminoid ... 2
Hình 1.2. Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin ... 3
Hình 1.3. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcumin trong dung dịch ... 3
Hình 1.4. Dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch... 4
Hình1.5. Sự phân hủy curcumin trong môi trƣờng kiềm ... 5
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcuminoid ... 11
Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pd/C ... 15
Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pt/C ... 15
Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng khử hóa các curcuminoid tạo thành các tetrahydrocurcuminoid tƣơng ứng dùng xúc tác Zn-NiCl2 sử dụng kĩ thuật siêu âm trong dung môi EtOH-H2O ... 16
Hình 3.1. Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid ... 22
Hình 3.2. SKLM của các curcuminoid thành phần ... 26
Hình 3.3. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H2/Pd/C ... 26
Hình 3.4. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân Zn/H+ ... 29
Hình 3.5. SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 ... 33
Hình 3.6. SKLM của THC trên hệ dung môi AcOEt: n-hexan = 7:3 ... 33
Hình 3.7. Sơ đồ phản ứng khử hóa DMC với tác nhân H2/Pd/C ... 34
Hình 3.8. Sơ đồ phản ứng khử hóa DMC với tác nhân Zn/H+ ... 37
Hình 3.9. SKLM của THC II trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 ... 41
Hình 3.10. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân H2/Pd/C ... 42
Hình 3.11. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân Zn/H+... 43
Hình 3.12. SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 ... 46
Hình 3.13. SKLM của THC II trên hệ dung môiCH2Cl2: MeOH = 20:1 ... 46
Hình 3.14. Cấu trúc enol và liên kết hydro của phân tử curcumin I ... 60
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xa xƣa, củ nghệ đã đƣợc sử dụng phổ biến ở một số nƣớc châu Á nhƣ một thứ gia vị chính giúp điều hƣơng, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm. Không những thế, nghệ còn đƣợc biết đến nhƣ một loại thuốc quý dùng để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thƣơng,… và đặc biệt dùng để chữa các bệnh có liên quan đến dạ dày. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngƣời ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid – tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ nhƣng là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ. Bên cạnh đó, khi xu hƣớng của thế giới ngày càng ƣa chuộng những sản phẩm từ thiên nhiên, việc phát triển những hoạt chất có nguồn gốc thảo dƣợc ngày càng trở thành mối quan tâm lớn đối với ngành Dƣợc Việt Nam, trong đó có nhóm chất màu curcuminoid.
Curcuminoid là tên gọi chung của các chất mang khung diarylheptadien đƣợc phân lập từ thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), bao gồm curcumin I (curcumin), curcumin II (demethoxycurcumin), curcumin III (bisdemethoxycurcumin) và một số chất khác. Các curcuminoid đƣợc nghiên cứu và chứng minh với các tác dụng dƣợc lý nhƣ: chống lại quá trình đông máu, chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thƣ...[2][8][9][27]. Tuy nhiên, các curcuminoid có màu vàng và rất khó rửa sạch, nên nhu cầu sử dụng của các curcuminoid bị hạn chế, đặc biệt trong mỹ phẩm. Sản phẩm khử hóa của curcuminoid là tetrahydrocurcuminoid có những ƣu điểm là không màu nên đƣợc sử dụng rộng rãi hơn trong mỹ phẩm. Mặt khác tetrahydrocurcumin còn đƣợc chứng minh có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa tốt hơn curcumin [18][19][22][24][25].
Chính vì thế, việc nghiên cứu khử hóa curcuminoid thành tetrahydrocurcuminoid là một hƣớng có triển vọng trong mỹ phẩm và dƣợc phẩm. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ nguồn curcuminoid chiết xuất trong nước”
Với những mục tiêu sau:
án tổng hợp tetrahydrocurcuminoid ở quy mô phòng thí nghiệm; Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp đƣợc.
2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CURCUMINOID
1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất
Cấu trúc hóa học:
Nhóm chất màu curcuminoid là hỗn hợp của 3 chất - thành phần quan trọng nhất của củ nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.1.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcuminoid Tính chất vật lý:
Một số tính chất vật lý của 3 chất có trong curcuminoid thể hiện ở bảng 1.1. [4] Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của các curcuminoid Curcumin I (Curcumin) (1) 1,7-Bis-(4-hydroxy -3-methoxyphenyl)- hepta-1,6-dien-3,5-dion Curcumin II (Desmethoxy-curcumin) (2) 1-(4-hydroxyphenyl)-7- (4-hydroxy-3- methoxyphenyl)hepta-1,6-dien-3,5-dion Curcumin III (Bisdesmethoxy- curcumin) (3) 1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl) -hepta-1,6-dien-3,5-dion CTPT C21H20O 6 C20H18O5 C19H16O4 PTL 368 338 308 Dạng thù hình Tinh thể hình kim, màu vàng.
Tinh thể hình kim, màu vàng cam.
Tinh thể hình kim, màu vàng cam tím.
Điểm chảy
(oC)
183 172 222
3
Tính chất hóa học:
Tính chất của nhóm polyphenol: - Tan trong dung dịch kiềm.
- Tác dụng với các tác nhân oxy hóa: nhóm –OH hoạt hóa nhân thơm, làm nhân thơm nhạy cảm đối với các tác nhân oxy hóa, nên curcumin rất dễ bị oxy hóa [1].
- Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: với Fe3+ tạo phức màu xanh đen, với thiếc (Sn), kẽm (Zn), đồng (Cu), canxi (Ca), magnesi (Mg) tạo hợp chất có màu từ vàng cam đến nâu đen.
Tính chất của nhóm diceton:
Trong môi trƣờng acid acetic, curcumin dễ phản ứng với các hợp chất có cấu trúc kiềm (Y-NH2) nhƣ hydroxylamin (Y = -OH), hoặc phenylhydrazin (Y = C6H5 -NH-) tạo sản phẩm lần lƣợt là bis(3-methoxy-4-hydroxylstiryl)isoxazol và 3,5-bis(3-methoxy-4-hydroxylstiryl)-1-phenylpirazol. Các sản phẩm này đều có hoạt tính kháng nấm và chống oxy hóa tốt [3].
Hình 1.2. Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin
Hiện tƣợng hỗ biến:
Curcumin và các dẫn chất tồn tại trong dung dịch ở dạng cân bằng hỗ biến của dạng diceton đối xứng và dạng ceto – enol đƣợc ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử. (Hình 1.4) [13].
4
Trong dung dịch nƣớc, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dƣới dạng diceton; ngƣợc lại, ở pH > 8, dạng enol chiếm ƣu thế hơn 27. Tùy theo từng dung môi thích hợp, có thể có trên 95% curcumin tồn tại ở dạng enol [13].
Ảnh hƣởng của pH tới dạng tồn tại của curcuminoid trong dung dịch nƣớc (Hình 1.4) [13].
Động học của phản ứng thủy phân curcumin trong dung dịch nƣớc trong khoảng pH = 1 – 11 đã đƣợc nghiên cứu bằng phƣơng pháp HPLC.
- Ở pH < 1, dung dịch nƣớc của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion H4A+. - Ở khoảng pH = 1 – 7, curcumin rất ít tan trong nƣớc. Ở khoảng pH này, dung dịch nƣớc của curcumin có màu vàng và tồn tại chủ yếu ở dạng trung tính H3A.
- Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-, HA2- và A3- lần lƣợt tƣơng ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0.
5
Độ ổn định:
Curcumin tƣơng đối ổn định ở pH acid, nhƣng nhanh chóng bị phân hủy ở pH>7. Các sản phẩm phân hủy curcumin ở pH = 7 – 10 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC. Các sản phẩm tạo thành ban đầu là acid ferulic và feruloylmethan, ngoài ra còn có các sản phẩm ngƣng tụ. Sau đó feruloylmethan nhanh chóng bị chuyển màu (chủ yếu là từ vàng đến vàng nâu) rồi bị phân hủy thành vanillin và aceton (Hình 1.5) [13].
Hình1.5. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm
Đặc biệt, curcumin không bền dƣới tác dụng của ánh sáng, nhất là trong dung dịch. Sau khi chiếu bức xạ quang học, các sản phẩm đƣợc xác định giống nhƣ các sản phẩm phân hủy là acid ferulic, acid vanillic và vanillin [13].
Sản phẩm ngƣng tụ
6 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý
Curcuminoid có rất nhiều tác dụng đã đƣợc chứng minh, có lợi cho việc phòng và điều trị bệnh. Một số tác dụng nổi bật là:
- Tác dụng chống oxy hóa:
Peroxynitrit (ONOO-) là chất trung gian có tính độc tế bào đƣợc tạo ra bởi phản ứng giữa anion superoxid (O2
-) và oxyd nitric (NO-). Các diarylheptanoid, curcumin I, curcumin II, curcumin III là những hoạt chất đƣợc phân lập từ Curcuma longa, có tác dụng quét peroxynitrit. Các hợp chất trên đã thể hiện hoạt tính quét peroxynitrit với IC50 lần lƣợt là 4,0; 6,4 và 29,7 μm [2].
Trong các nghiên cứu về sự bảo vệ quá trình peroxy hóa lipid, curcumin đã thể hiện sự ức chế mạnh (18 – 80%). Tùy thuộc liều dùng mà quá trình peroxy hóa lipid bị ức chế. Quá trình này gây bởi Fe-NTA (ferric nitrilotriacetat) và H2O2 đƣợc đo bằng sự hình thành malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học trong các vi thể thận [2].
Theo nghiên cứu của Khopde và các cộng sự, tác dụng chống oxi hóa của curcuminoid gấp ít nhất 10 lần các chất chống oxy hóa khác thậm chí cả vitamin E [16].
- Bảo vệ tế bào thần kinh:
Bệnh Alzheimer (sa sút trí tuệ, giảm trí nhớ, rối loạn chức năng ở tuổi già) bắt nguồn từ sự tích tụ tinh bột (Abeta), tổn thƣơng do chứng viêm và sự oxy hóa protein ở vỏ não, đƣợc chữa trị bằng việc sử dụng chất chống viêm và chống oxy hóa. Curcumin trong nghệ vàng có hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa mạnh có thể ngăn chặn những tổn thƣơng nói trên gây ra ở vùng chất xám trên vỏ não. In vitro, curcumin ức chế sự tích tụ Abeta 42 tốt hơn Ibuprofen và Naproxen, ngăn chặn sự hình thành chất oligomer Abeta 42. Khi nuôi chuột nhắt trƣởng thành Tg2576, sự tích tụ tinh bột đã hoàn chỉnh, ở các mảnh đánh dấu curcumin thấy giảm mức độ tích tụ tinh bột làm giảm gánh nặng cho mảnh. Nhƣ vậy curcumin đã trực tiếp liên kết những loại s-amyloid nhỏ để bao vây sự tích tụ và hình thành xơ in vitro và in vivo. Cơ chế tác dụng của curcumin là làm giảm sự tích tụ tinh bột và chống oxy hóa protein tế bào não. Curcumin có thể dễ dàng liên kết với các kim loại oxy hóa- khử sắt và đồng, các
7
kim loại này tập trung trên vỏ não, có khả năng gây ngƣng kết tinh bột và oxy hóa protein. Ngoài ra có thể ngăn chặn tổn thƣơng viêm bằng cách ngăn ngừa sự cảm ứng kim loại của NF- kappaB. Những dữ liệu trên cho thấy curcumin đã phá vỡ sự kết tụ các thành phần của mảng có hiệu quả, đồng thời ngăn chặn đƣợc tổn thƣơng do viêm và oxy hóa-khử protein trên vỏ não. Vì thế curcumin từ nghệ vàng hoàn toàn có thể sử dụng trên lâm sàng để dự phòng và điều trị bệnh Alzheimer [2].
- Tác dụng chống viêm
Curcuminoid có hoạt tính chống viêm cao. Curcuminoid làm bất hoạt các enzym tham gia vào phản ứng viêm, thông qua cơ chế chủ yếu là ức chế receptor NF-κ [2].
Jayaraj Ravindran và đồng nghiệp (2010) đã chứng minh Bisdesmethoxycurcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn curcumin (ức chế receptor NF-κ ). Khi cho tiến hành so sánh tác dụng chống viêm với curcumin, hispolon, hispolon methyl ether, dehydroxy hispolon, hydroxy hispolon, methoxy hispolon methyl ether, và methoxy hispolon, (hispolon có cấu trúc tƣơng tự curcumin nhƣng thiếu một nhân thơm, có tác dụng chống viêm) nhận thấy tác dụng chống viêm nhƣ sau: Bisdesmethoxycurcumin = Hispolon > hispolon methyl ether > hydroxy hispolon > Curcumin > methoxy hispolon methyl ether > methoxy hispolon > dehydroxy hispolon. Điều này cho thấy việc thay thế 1 nhóm methoxy cho 1 nhóm hydroxy tại vị trí metha ở vòng phenyl của curcumin tăng cƣờng đáng kể tác dụng chống viêm [14][31].
- Bảo vệ dạ dày, chống viêm loét dạ dày- tá tràng
Cao nƣớc hoặc cao methanol nghệ vàng cho thỏ uống, làm giảm tiết dịch vị và tăng lƣợng chất nhầy. Cho chuột cống trắng uống cao nghệ, làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày, tá tràng.
Nghệ kích thích sản sinh chất nhầy ở thành ruột của chuột. Cho bệnh nhân uống bột nghệ ngày 4 lần, trong 7 ngày thấy có hiệu quả tốt với rối loạn tiêu hóa do acid, do đầy hơi và do mất trƣơng lực cơ.
Các proteinase kim loại cơ bản (MMP - matrix metalloproteinase) đóng vai trò quan trọng trong điều tiết dịch vị và làm lành vết thƣơng sau viêm. Curcumin đẩy nhanh quá trình làm lành vết loét và bảo vệ vết loét thông qua việc ức chế hoạt tính
8
MMP- 9 và kích thích hoạt tính MMP- 2. Nhóm S. Swarnakar đã nghiên cứu tác dụng của curcumin từ nghệ vàng trên mô hình loét dạ dày gây bởi indomethacin. Kết quả cho thấy curcumin chống loét mạnh với loét dạ dày cấp tính bằng cách dự phòng sự suy kiệt glutathion, chống peroxy hóa lipid, tái tạo lớp biểu mô nhằm chống lại sự bào mòn bề mặt thành dạ dày do các tổn thƣơng gây ra trong khoang dạ dày. Sử dụng curcumin tùy theo liều qua đƣờng uống hay đƣờng tiêm phúc mạc đều có thể ngăn chặn viêm loét dạ dày tá tràng [2][29].
Helicobacter pylori là vi khuẩn gây viêm loét trên tế bào biểu mô thành dạ dày. Tế bào biểu mô nhiễm vi khuẩn này dẫn tới sự hoạt hóa yếu tố sao chép NF- kappaB gây cảm ứng gen cytokin/chemokin- là gen kích thích gây viêm, đáp ứng gen động tế bào (sự phát tán tế bào). Curcumin ức chế sự hoạt hóa NF- kappaB và sự phát tán tế bào, do đó hạn chế quá trình tạo kháng nguyên gây viêm và ngăn chặn đƣợc sự phát triển của vi khuẩn. Vì vậy, curumin rất có tiềm năng trong điều trị viêm loét dạ dày khởi phát từ Helicobacter pylori [2].
- Phòng và điều trị ung thư
Curcuminoid ngăn chặn biến đổi, khởi phát u, phát triển u, xâm lấn, hình thành mạch và di căn. Nghiên cứu in vivo cho thấy curcumin ức chế chất gây ung thƣ da, ruột già, ruột kết, gan ở chuột, động vật có vú, ức chế sinh sôi tế bào u gồm tế bào bạch cầu ,T, ung thƣ biểu mô ruột kết, biểu bì, vú.
Có những báo cáo về sự tác động của curcuminoid đối với sự tăng sinh tế bào MCF7 (dòng tế bào gây ung thƣ tuyến vú của con ngƣời). Theo đó desmethoxycurcunin là chất ức chế mạnh nhất MCF-7, tiếp theo đó là curcumin và bisdesmethoxycurcumin [28].
Curcumin là chất gây độc tế bào theo cơ chế diệt các tế bào ác tính, vô hiệu hóa tế bào ung thƣ và ngăn chặn hình thành tế bào ung thƣ mới mà không làm ảnh hƣởng đến các tế bào lành tính. Trong khi đó, nhiều thuốc khi diệt tế bào ác tính cũng diệt luôn tế bào lành tính, làm cơ thể suy kiệt. Những thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy không có giới hạn liều dùng độc tính khi dùng những liều tới 10 gam/ngày. Do đó, curcumin hiện nay đƣợc nghiên cứu sử dụng phổ biến trong các chế phẩm ngăn chặn sự khởi phát, phát triển và di căn của khối u [21].
9
Curcumin có khả năng loại bỏ gốc tự do, ức chế các loại men và hoạt tính của một số chất gây đột biến tế bào có khả năng dẫn đến ung thƣ trong đồ uống hay thức ăn đƣợc chế biến và bảo quản không đảm bảo chất lƣợng, giúp cơ thể ngăn ngừa ung thƣ một cách tích cực. Một số thử nghiệm in vitro và in vivo phát hiện thấy curcumin có khả năng ức chế hoạt tính gây ung thƣ của các chất này [2][6][21].
- Dùng ngoài: kháng khuẩn, chống nấm, chóng lành vết thương và liền sẹo
Trong điều trị bỏng, kem nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ tổ chức hoại tử bỏng, có tác dụng tái tạo tổ chức và liền sẹo. Cao nghệ chiết với cloroform 10% đƣợc dùng tại chỗ vùng bệnh nấm, tốt với các bệnh nấm da.
Nghệ có tác dụng kháng khuẩn nhờ một số thành phần hóa học nhƣ: Curcumin I có tác dụng ức chế in vitro sự phát triển một số loài vi khuẩn mà trong đó điển hình là trực khuẩn lao Salmonella paratyphi. Chất ar- tumeron từ tinh dầu và dịch chiết n-hexan từ lá nghệ diệt ấu trùng muỗi Aedesaegyti [2].
Trong quá trình làm lành vết thƣơng có vai trò quan trọng của sự giải phóng chậm các chất chống oxy hóa và sự hỗ trợ tái tạo mô của collagen. Một số nghiên cứu tạo liên kết giữa curcumin và collagen cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của curcumin có hiệu quả trong việc quét sạch các gốc tự do gây viêm loét, kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của collagen đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thƣơng ở mô [2].
- Hỗ trợ chức năng gan, mật
Curcumin cho chuột cống trắng ăn, có tác dụng kích thích hoạt tính men arylhydroxylase là men phụ thuộc vào cytocrom P450 của ty lạp thể trong tế bào gan, giúp giải độc và bảo vệ tế bào gan, chống viêm nhiễm, hoại tử, giúp tế bào gan hồi phục. A. Raysid đã chứng minh, curcumin tạo ra tác dụng động học đối với mật. Với 20mg curcumin có khả năng làm co ngắn túi mật 29% khi quan sát trong 2 giờ. Do đó curcumin có tiềm năng trong điều trị dự phòng sự hình thành sỏi trong túi mật, có thể dùng trên lâm sàng để thúc đẩy dòng mật hoặc đẩy dạng bùn mật trong túi mật ra ngoài. Ngoài việc làm tăng lƣu lƣợng mật, curcumin còn làm tăng lƣợng cholesterol và acid mật do mật tiết ra [26].
10
Curcumin từ nghệ vàng có tác dụng kháng virus, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan , C. Đặc biệt, curcumin đã đƣợc nghiên cứu về tác dụng ức chế integrase HIV- 1, ức chế protease HIV- 1 và HIV- 2 để triển khai các chất chống HIV, “chặt đứt” một trong tám mắt xích của quá trình nhiễm HIV [26].
Curcumin chiết từ nghệ có tác dụng ức chế sự tan hồng cầu gây bởi hydrogen peroxyd ở nồng độ thấp nhƣng không ức chế ở nồng độ cao, không có tác dụng làm giảm số lƣợng bạch cầu đa nhân trung tính với nồng độ thử nghiệm [7.
1.1.3. Phƣơng pháp tách hỗn hợp curcuminoid:
Năm 2002, Guaddadarangavvanahally K. Jayaprakasha và cộng sự đã tách ba thành phần trong hỗn hợp curcuminoid bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, hệ dung môi sử dụng là benzene và ethyl acetat với độ phân cực tăng dần. Curcumin thu đƣợc với hệ dung môi benzene : EtOAc (82:18 tt/tt), trong khi DMC và DMC thu đƣợc tƣơng ứng với hệ dung môi benzene : EtOAc (70:30 tt/tt) và (58:42 tt/tt). Các phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký đƣợc cô chân không và kết tinh lại. Hiệu suất tách tƣơng ứng của các chất curcumin, DMC và BDMC là 2,2; 4,46 và 3,4% [11.
Năm 2003, Vajragupta O. và cộng sự đã tách hỗn hợp curcuminoid thu các thành phần đơn lẻ bằng phƣơng pháp sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CHCl3 : MeOH : AcOH (98 : 5 : 2), bột curcumin đƣợc hòa tan trong aceton. Theo phƣơng pháp này, curcumin đƣợc rửa giải trƣớc, sau đó là hỗn hợp curcumin với DMC, tiếp theo là BDMC tinh khiết. DMC tiếp tục đƣợc tách lần thứ hai bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 : MeOH (95:5) [33].
Năm 2005, L. Pe´ret-Almeida và cộng sự đã cải tiến phƣơng pháp tách các curcuminoid. Trong một vài nghiên cứu trƣớc đây, các tác giả thực hiện tách các curcuminoid bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. Pha tĩnh đƣợc sử dụng hầu hết là silica gel 60G với các hệ dung môi khác nhau bao gồm benzen, ethyl acetat, ethanol, cloroform, acid acetic, n-hexan và methanol trong sắc ký lớp mỏng và benzen, nƣớc, toluen, và ethyl acetate trong sắc ký cột. Tuy nhiên, do độ phân giải kém chỉ thu đƣợc curcumin có hàm lƣợng 80%. Hơn nữa không tách đƣợc demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin.
11
Trong nghiên cứu này, các tác giả đã thực hiện tách từng curcuminoid ra khỏi hỗn hợp nhƣ sau:
a. Kết tinh curcumin:
Việc kết tinh curcumin đƣợc thực hiện bằng cách hòa tan mẫu trong methanol ở 60oC. Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm từ từ nƣớc cất, hỗn hợp đƣợc giữ ở 5oC trong 2h. Tinh thể curcumin đƣợc tách ra khỏi dung dịch ban đầu bằng cách lọc.
b. Tách các chất bằng sắc ký cột:
Dung dịch sau khi kết tinh đƣợc cất quay, sau đó hòa tan trong aceton, rồi đem chạy sắc ký cột. Hệ dung môi sử dụng là CH2Cl2 : MeOH (99:1) [23].
1.2. TỔNG QUAN VỀ TETRAHYDROCURCUMINOID
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất
Tetrahydrocurcuminoid có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.6.
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcuminoid
Cấu tạo và một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid thể hiện ở bảng
12 Bảng 1.2. Một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid THC I (Tetrahydro- curcumin) [1,7-Bis-(4-hydroxy- 3-methoxyphenyl)-hepta-3,5-dion] THC II (Desmethoxy-tetrahydrocurcumin) [1-(4-hydroxyphenyl)-7- (4-hydroxy-3- methoxyphenyl)hepta-3,5-dion] THC III (Bisdesmethoxy- tetrahydrocurcumin) [1,7-Bis- (4-hydroxyphenyl) -hepta-3,5-dion] CTPT C21H24O 6 C20H12O5 C19H20O4 PTL 372 342 312 Dạng thù hình Bột kết tinh trắng, không mùi, không vị Chất bán rắn – Chất
nhày không màu Tinh thể không màu Điểm chảy
(0C) 95 - 97 101 - 102
1.2.2. Nguồn gốc tetrahydrocurcumin:
Các nghiên cứu cho thấy, trong cơ thể tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, và octahydrocurcumin là những chất chuyển hóa của curcumin ở đƣờng tiêu hóa. Hexahydrocurcumin tìm thấy ở mô gan cả chuột cái và chuột đực, trong khi đó ở chuột đực hình thành octahydrocurcumin nhiều hơn là THC, còn ở chuột cái THC lại đƣợc hình thành nhiều hơn so với octahydrocurcumin [12].
1.2.3. Tác dụng dƣợc lý
1.2.3.1. Tác dụng chống viêm:
Curcumin và 4 chất tổng hợp tƣơng tự đƣợc nghiên cứu. Hoạt lực chống viêm của curcumin, các dẫn xuất của curcumin và phenylbutazon đƣợc thiết lập theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
13
Khi so sánh curcumin và các dẫn xuất của nó trong các mô hình viêm cấp và bán cấp thì các dẫn chất của curcumin có tác dụng làm giảm viêm cấp tốt hơn curcumin [22].
1.2.3.2. Tác dụng chống oxy hóa:
Hoạt tính chống oxy hóa của THC đã đƣợc nghiên cứu cả trên in vivo và in vitro. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng THC có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn curcumin, các curcuminoid khác và vitamin E [22][25].
Poorichaya S. và cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxy hóa của curcumin cùng các dẫn xuất của nó đối với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và chỉ ra rằng THC thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH cao nhất với giá trị IC50 = 18,7 µM. Hoạt tính này giảm dần theo thứ tự: THC > HHC = OHC > curcumin > DMC > BDMC. Nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng THC có khả năng ức chế mạnh nhất đối với AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid) - một tác nhân gây ra quá trình peroxy hóa lipid. Lý giải cho những điều này, các tác giả cho rằng chính sự có mặt của nhóm methoxyphenyl và đặc biệt là sự hydro hóa hệ nối đôi liên hợp trong mạch carbon trung tâm đã làm tăng hoạt tính của curcumin lên một cách đáng kể [24].
Một nghiên cứu in vitro so sánh tác dụng chống oxy hóa của tetrahydrocurcumin và các curcuminoid khác đã đƣợc thực hiện trên tế bào hồng cầu thỏ và gan chuột, sử dụng acid linoleic là chất nền trong hệ ethanol/nƣớc, đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp thiocyanat và phƣơng pháp TBA. Kết quả cho thấy rằng tetrahydrocurcumin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong tất cả các curcuminoid [19][22].
Tác dụng ức chế của curcumin và tetrahydrocurcumin đối với quá trình peroxy hóa lipid trên màng hồng cầu gây bởi tert-butylhydroperoxid đã đƣợc nghiên cứu gần đây. Kết quả đã chứng minh rằng THC cho thấy hiệu quả tốt hơn curcumin. Các tác giả kết luận rằng, THC có khả năng dọn các gốc tự do nhƣ tert-butoxyl và peroxyl một cách triệt để [19].
Giải thích về cơ chế tác dụng và đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn của THC so với curcumin, các tác giả cho rằng THC là chất chuyển hóa chính của curcumin ở đƣờng tiêu hóa. Họ cho rằng THC đóng vai trò quan trọng trong cơ chế chống oxy hóa
14
của curcumin trong cơ thể, khi mà curcumin đƣợc chuyển hóa thành THC. Nhóm phenolic đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn đầu của quá trình chống oxy hóa bằng THC. Mặt khác, nhóm β-diceton cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa của THC, bởi vì sự phân cắt liên kết C–C trong khung β-diceton đƣợc quan sát thấy trong quá trình chống oxy hóa. Nhƣ vậy, nhóm β-diceton đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn sau của quá trình chống oxy hóa [19][22].
1.2.3.3. Tác dụng trên tế bào ung thư:
Nghiên cứu chứng minh rằng THC có tác dụng mạnh hơn curcumin trong việc ức chế sự phát triển tụ điểm ẩn khác thƣờng ACF (aberrant crypt foci) và sự tăng nhanh tế bào. THC phù hợp trong việc sử dụng để chống lại tác nhân gây ung thƣ trong cơ thể cũng nhƣ curcumin [18][34].
1.2.4. Tổng quan về các phƣơng pháp bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid
1.2.4.1. Phương pháp của Uehara và cộng sự (1987)
Các tác giả đã tiến hành hydro hóa curcumin trong hệ dung môi ethyl acetat/ acid acetic ở 50oC và 3,3 at trên xúc tác PtO2. Sau phản ứng, cất loại dung môi thu đƣợc cặn gôm màu vàng. Hòa tan cặn trong iso propanol nóng và để kết tinh qua đêm ở 2 – 4oC. Lọc, rửa chất rắn tạo thành, tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetat đã thu đƣợc tinh thể THC màu trắng, to
nc 98 – 99oC với hiệu suất 30% [32].
1.2.4.2. Phương pháp của Junko Ishida và cộng sự (2002)
Các hợp chất curcumin I (1), curcumin II (2), curcumin III (3) thu đƣợc bằng sắc ký cột (silica gel, CHCl3 – MeOH) từ curcumin, trong đó 2 và 3 chiếm một tỷ lệ nhỏ [15].
Hydro hóa 1 với Pd/C thu đƣợc 4, 5, 6 [15]. Dung dịch 1 trong MeOH đƣợc khử hóa trong 4 h ở nhiệt độ phòng, 1 atm với xúc tác Pd/C 10%. Sơ đồ phản ứng nhƣ trên hình 1.7.
15
Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pd/C
1.2.4.3. Phương pháp của Su-Lin Lee và cộng sự (2005)
Từ curcumin 1, nhiều sản phẩm khử 4, 5, 6 đƣợc mô tả trong tài liệu. Những điều kiện khác nhau của xúc tác Pt/C trong phản ứng hydro hóa cũng đƣợc xem xét. Hiệu suất tối ƣu của hexahydrocurcumin 5 từ 1 là 30% và octahydrocurcumin 6 là 91,8 % dƣới áp suất cao và thời gian phản ứng dài. Mặc dù 5 và 6 có thể thu đƣợc từ 3 bằng phản ứng khử hóa với NaBH4, nhƣng hiệu suất rất thấp [30]. Sơ đồ phản ứng đƣợc thể hiện trên hình 1.8.
Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pt/C
16
1.2.4.4. Phương pháp của Trần Khắc V và cộng sự (2011)
Việc tổng hợp các tetrahydrocurcuminoid đƣợc mô tả ở sơ đồ dƣới đây. Các curcuminoid nguyên liệu phản ứng 1, 2 và 3 đƣợc phân lập từ hỗn hợp ba thành phần curcumin I (1), curcumin II (2) và curcumin III (3) đƣợc chiết xuất từ củ nghệ vàng (Curcuma Longa L.). Hỗn hợp gồm ba thành phần trên đƣợc sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải diclorometan : methanol tăng dần từ CH2Cl2 : MeOH (100 : 0 đến 90 : 10) thu đƣợc curcumin I, II, III. Các tetrahydrocurcuminoid đƣợc điều chế chủ yếu từ phản ứng khử hóa nối đôi liên hợp 1,3-diceton sử dụng xúc tác Pd/C trong dung môi ƣa nƣớc [5] (xem hình 1.9).
Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng khử hóa các curcuminoid tạo thành các
tetrahydrocurcuminoid tương ứng dùng xúc tác Zn-NiCl2 sử dụng kĩ thuật siêu âm trong dung môi EtOH-H2O
Ở sơ đồ trên, các curcuminoid (1, 2, và 3) đƣợc hòa tan trong hệ dung môi (ethanol : nƣớc), sau đó hòa tan muối NiCl2 và cuối cùng bột kẽm đƣợc cho vào từ từ đồng thời tiến hành siêu âm. Theo d i quá trình phản ứng cho thấy, trong khoảng 30 phút đầu, khí hydro mới sinh thoát ra mạnh và sau khoảng thời gian này các curcuminoid dần dần bị mất màu, chuyển hóa thành các tetrahydrocurcuminoid. Quá trình chuyển hóa đƣợc kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, hệ dung môi n-hexan : ethylacetat. Để tránh bột kẽm nhanh bị ngộ độc bề mặt vì nhiều lý do dẫn đến mất hoạt tính xúc tác, lƣợng kẽm đƣợc cho vào thành nhiều đợt trong khoảng thời gian 30 phút. Quá trình khử hóa các curcuminoid thành các tetrahydrocurcuminoid cao nhất là 82% đối với curcumin trong thời gian 2 giờ với tỷ lệ mol của curcumin : Zn : NiCl2 là 1 : 6 : 1,5. Cấu trúc của sản phẩm đƣợc kh ng định bởi phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và
17
13C-NMR. Cơ chế chính xác của quá trình khử hóa này vẫn chƣa r . Tuy nhiên các công bố chỉ ra vai trò quan trọng của NiCl2 trong việc hoạt hóa bột kẽm để giải phóng hydro mới sinh dƣới tác dụng của năng lƣợng siêu âm, còn sự có mặt của nƣớc giúp hòa tan tốt hơn muối NiCl2 [5].
18
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT Ị
Đề tài sử dụng một số nguyên liệu, hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dƣợc, Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Nguyên liệu curcuminoid đƣợc lấy từ Công ty cổ phần dƣợc phẩm Bắc Ninh, có thành phần curcumin I 62,1%.
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu và hóa chất Nguồn gốc
1 Acid acetic Merck
2 Acid hydrocloric Trung Quốc
3 Acid sulfuric Trung Quốc
4 Dicloromethan Trung Quốc
5 Diethyl ether Trung Quốc
6 Ethanol 96% Trung Quốc
7 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc
8 Ethyl acetat Trung Quốc
9 n-Hexan Trung Quốc
10 Kẽm bột Trung Quốc
11 Methanol Trung Quốc
12 Natri carbonat Trung Quốc
13 Natri sulfat Trung Quốc
14 Nƣớc cất Việt Nam
15 Palladium -carbon 5% Sigma-Aldrich
16 Silicagel 60 GF254 Merck
19 2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu
Bảng 2.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu
STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Bản mỏng silicagel GF254 Đức
2 Bình chiết 250 mL Đức
3 Bình cầu 1 cổ, 2 cổ, 3 cổ 50mL, 100mL, 250mL Đức
4 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc
5 Bình sắc ký Trung Quốc
6 Cân kỹ thuật Sartorius P 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sĩ
7 Cốc có mỏ 100mL Đức
8 Cột sắc ký Đức
9 Giấy lọc Việt Nam
10 Đĩa petri Trung Quốc
11 Máy cấy quay chân không Buchi B480 Thụy Sĩ
12 Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt Mỹ
13 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer (Viện Hóa
học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mỹ
14
Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1
H-NMR) Bruker AV-500 (Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Mỹ
15 Máy đo phổ khối lƣợng Varian 320 Ms (Viện Hóa học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mỹ
16 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức
17 Máy sấy đèn hồng ngoại Đức
18 Máy sinh khí nitơ Đức
19 Máy sinh khí hydro Đức
20 ng đong 25mL, 50mL, 100mL Trung Quốc
21 ng nghiệm Trung Quốc
20
23 Quả bóp cao su Đức
24 Tủ sấy Memmert Đức
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
-
Tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid.-
Bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ curcuminoid theo sơ đồ sau:
Tiến hành phản ứng khử hóa curcuminoid với hai tác nhân khử khác nhau là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trƣờng acid.
-
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợpvà đo nhiệt độ nóng chảy.
-
Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp đƣợc bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR),phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
-
Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm bán tổng hợp đƣợc bằng phƣơng pháp DPPH.2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid
- Dùng phương pháp kết tinh phân đoạn - Dùng sắc ký cột với hệ dung môi thích hợp
2.3.2. Bán tổng hợp hóa học:
Bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ curcuminoid bằng phản ứng khử hóa sử dụng các tác nhân khử hóa khác nhau:
- Dùng khí hydro với xúc tác Pd/C 5 %. - Dùng kim loại trong môi trƣờng acid.
21 2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu đƣợc bằng phƣơng pháp SKLM và phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy.
SKLM: Tính giá trị hệ số lƣu giữ Rf
Dung môi hòa tan: ethanol
Hệ dung môi chạy sắc ký: Dicloromethan : Methanol = 20:1
2.3.4. ác định cấu trúc sản phẩm
Phổ hồng ngoại(IR) Phổ khối lƣợng (MS)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), Phổ cộng hƣởng từ carbon (13 C-NMR)
2.3.5. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp đƣợc
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phƣơng pháp DPPH) đƣợc thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viên hàn lâm khoa học & công nghệ Việt Nam.
22
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. TÁCH CÁC CURCUMIN I, II, III TỪ HỖN HỢP CURCUMINOID
Dùng phƣơng pháp tách thích hợp thu đƣợc từng thành phần riêng biệt: Curcumin I, Curcumin II, Curcumin III. Sơ đồ tách đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid Cách tiến hành
Bột curcuminoid có thành phần curcumin I (62,1 %), curcumin II (24,6%), và curcumin III (8,3%) đầu tiên đƣợc kết tinh lại 3 lần trong dung môi thích hợp, các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Hòa tan hoàn toàn 3,00 g curcuminoid trong 250 ml dung môi ở 60oC, sau đó để kết tinh.
- Tinh thể kết tinh đƣợc lọc hút chân không, rửa, kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng SKLM.
- Dịch lọc kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, cất quay chân không đến kiệt thu sản phẩm thô. Tiếp tục đem kết tinh lại lần 2,3 tƣơng tự nhƣ lần 1.
H A TAN ĐỂ KẾT TINH - Curcuminoid - Dung môi LỌC S C K CỘT Dicloromethan : Methanol (20:1) CURCUMIN II
CURCUMIN I CURCUMIN III
23
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của dung môi dùng kết tinh đến quá trình kết tinh.
Tiến hành khảo sát với 2 dung môi là EtOH 96% và MeOH. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh đến quá trình kết tinh curcuminoid
STT Dung môi kết tinh Nhiệt độ kết tinh (oC) Thời gian kết tinh (h) KL curcumin I (g) Tonc (oC) 1 MeOH to phòng 24 1,08 182 – 184 2 EtOH 96% to phòng 24 1,02 182 – 184 Nhận xét:
- Với hai dung môi sử dụng là EtOH 96% và MeOH, khi để kết tinh để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24h, tinh thể thu đƣợc là curcumin I với nhiệt độ nóng chảy phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của curcumin I trong các tài liệu đã đƣợc công bố..
- Dung môi sử dụng là MeOH cho khối lƣợng tinh thể curcumin I nhiều hơn, nhƣng không đáng kể, mặt khác MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH 96%.
Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH 96% có nhiều ƣu điểm hơn, do đó EtOH 96% đƣợc chọn làm dung môi kết tinh, kết tinh tại nhiệt độ phòng trong 24h.
Sau khi chọn đƣợc các điều kiện kết tinh thích hợp, tiến hành kết tinh 3 lần, lọc, rửa, sấy, cân định lƣợng thu đƣợc tinh thể curcumin I. Kết quả kết tinh đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
24
Bảng 3.2. Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96%
Lần kết tinh Vdung môi (ml) KL tinh thể (g) Hiệu suất (%)
1 250 1.02
2 150 0,26
3 50 0,08
Tổng: 1,36 73,12
Nƣớc cái cuối cùng là hỗn hợp curcuminoid ba thành phần, trong đó curcumin II và III đã đƣợc làm giàu, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1 để thu lấy từng curcuminoid từng thành phần.
Các bƣớc tiến hành sắc ký cột:
ƣớc 1: Chuẩn bị
- Cân 100,00 g silicagel, ngâm trong pha động trong khoảng 30 phút.
- Cột rửa sạch, sấy khô, lót đáy cột bằng bông, cố định cột sắc ký song song, th ng góc với trục của giá đỡ.
ƣớc 2: Nhồi cột
- Cho dung môi đến khoảng nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silicagel vào cột cho đến hết lƣợng silicagel cần nhồi, đồng thời gõ nhẹ để nén các lớp silicagel. Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silicagel để tránh hiện tƣợng khô cột.
- Đặt một miếng giấy lọc lên trên bề mặt lớp silicagel.
ƣớc 3: Đƣa chất phân tích vào cột
- Hòa tan mẫu vào một lƣợng tối thiểu dung môi pha động.
- Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mực giấy lọc, rồi nạp hết dung dịch chất phân tích vào cột.
ƣớc 4: Triển khai sắc ký cột
- Cho dung môi rửa giải chạy qua cột, hứng các phân đoạn có thể tích khoảng 40 ml.
- Các phân đoạn đƣợc cất quay chân không để loại bớt dung môi, sau đó kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1.
25
ƣớc 5: Thu hồi các phân đoạn
- Các phân đoạn có Rf giống nhau đƣợc gộp lại, cất quay chân không, sấy khô và cân định lƣợng.
Kết quả tách đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1
Phân đoạn Tổng thể tích
(ml) Thành phần Khối lƣợng (g)
1 - 18 720 Curcumin I 0,46
19 - 22 160 Curcumin I, Curcumin II 0,13
23 - 45 880 Curcumin II 0,61
46 - 52 280 Curcumin II, Curcumin III 0,29
53 - 55 120 Curcumin III 0,04
Nhận xét:
- Nƣớc cái thu đƣợc sau khi kết tinh hỗn hợp curcuminoid, đem chạy sắc ký cột, thu đƣợc các curcumin thành phần, trong đó chủ yếu là curcumin I (0,46 g), curcumin II (0,61 g), còn curcumin III thu đƣợc một lƣợng rất nhỏ (0,04 g).
Kiểm tra độ tinh khiết của các curcuminoid thành phần:
Các curcuminoid thành phần sau khi tách, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển dicloromethan : methanol (20:1). Kết quả cho thấy các chất thử đều cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ (Hình 3.1). Trong đó Rf curcumin I = 0,8 ; Rf curcumin II = 0,46 và Rf curcumin III = 0,34.
26
Hình 3.2. SKLM của các curcuminoid thành phần
3.2. KHỬ HÓA TỪNG CURCUMINOID THÀNH PHẦN
Chúng tôi đã thực hiện phản ứng khử hóa với hai tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trƣờng acid.
3.2.1. Khử hóa curcumin I (curcumin)
3.2.1.1. Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% Sơ đồ phản ứng: đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H2/Pd/C
Tiến hành phản ứng:
Hoạt hóa xúc tác: Cho xúc tác Pd/C 5% vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm 20 ml dung môi, khuấy từ ở nhiệt độ khoảng 0-5oC trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng. Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) trong 100 ml dung môi, cho dung dịch thu đƣợc vào bình phản ứng trên. Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trong quá
27
trình phản ứng ở áp suất khí quyển. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 để xác định thời gian phản ứng thích hợp.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
Hỗn hợp phản ứng đem lọc hút chân không để loại bỏ xúc tác. Dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 50oC. Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1. Các bƣớc tiến hành sắc ký cột tƣơng tự nhƣ phần 3.1.
Khảo sát phản ứng:
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng, bao gồm dung môi phản ứng và tỷ lệ khối lƣợng xúc tác so với curcumin.
a. Khảo sát dung môi phản ứng
Tiến hành khảo sát với 3 dung môi là MeOH, EtOH tuyệt đối và EtOH 96%. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C
TT Dung môi phản ứng Tỷ lệ KL xt/curcumin (%) KL sp (g) Hpƣ (%) T o nc (oC) 1 MeOH 10 0,65 64,33 95.0 – 98,0
2 EtOH tuyệt đối 10 0,62 61,36 95,0 – 98,0
3 EtOH 96% 10 0,59 58,39 95,0 – 98,5
Nhận xét:
- Với cả ba dung môi sử dụng, nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thu đƣợc đều phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm dự kiến (Tonc,THC = 95,0 – 97,0oC [18]).
- Dung môi là EtOH 96% cho hiệu suất phản ứng thấp nhất (58,39%). Khi sử dụng dung môi là EtOH tuyệt đối cho hiệu suất phản ứng cao hơn (61,36%).
- Dung môi là MeOH cho hiệu suất phản ứng cao nhất (64,33%). Tuy nhiên, MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH.
28
Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH có nhiều ƣu điểm hơn, do đó EtOH tuyệt đối đƣợc chọn làm dung môi cho các phản ứng khảo sát tiếp theo.
b. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng Sau khi chọn đƣợc dung môi thích hợp cho phản ứng là EtOH tuyệt đối, tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng. Tiến hành khảo sát với các tỷ lệ khối lƣợng xúc tác là 2%, 5%, 8% và 10% so với curcumin .
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C TT KL curcumin (g) KL xt (g) Tỷ lệ KL xt/curcumin (%) tpƣ (h) KL sp(g) Hpƣ (%) T o nc (oC) 1 1,00 0,02 2 24 0,57 56,41 95,0–98,0 2 1,00 0,05 5 18 0,66 65,32 95,0–98,0 3 1,00 0,08 8 15 0,63 62,35 96,0–98,5 4 1,00 0,10 10 12 0,62 61,36 96,0–98,0 Nhận xét:
- Nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm thu đƣợc từ các thí nghiệm khảo sát các tỷ lệ xúc tác khác nhau không có sự chênh lệch đáng kể.
- Khi tăng tỷ lệ xúc tác thì thời gian phản ứng giảm, hiệu suất phản ứng cũng thay đổi. Với tỷ lệ xúc tác là 2%, thời gian phản ứng là 24h, hiệu suất phản ứng là thấp nhất (56,41%). Hiệu suất phản ứng đạt đƣợc cao nhất là 65,32% khi tỷ lệ xúc tác là 5%, thời gian phản ứng là 18h. Tiếp tục tăng tỷ lệ xúc tác thì hiệu suất phản ứng giảm.
Từ các dữ liệu trên, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ xúc tác là 5%, với thời gian phản ứng là 18h.
Từ các kết quả khảo sát trên đã thấy rằng, điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% là:
- Dung môi: Ethanol tuyệt đối - Tỷ lệ khối lƣợng xt/curcumin: 5%
29
- Thời gian phản ứng: 18h.
3.2.1.2. Phản ứng khử hóa với tác nhân kẽm trong môi trường acid Sơ đổ phản ứng: đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân Zn/H+
Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml. Sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng, thêm acid vào bình phản ứng.
Cân bột kẽm, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt trong thời gian khoảng 30 phút. Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, duy trì pH acid trong suốt quá trình phản ứng. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3 để xác định thời gian phản ứng thích hợp, so sánh với THC tinh khiết thu đƣợc ở phản ứng khử hóa với tác nhân H2/Pd/C.
Xử lý hỗn hợp phản ứng - Lọc loại chất rắn, thu dịch lọc.
- Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH trung tính, lọc loại tủa.
- Dịch lọc đem cất loại bớt một phần dung môi, sau đó đem chiết với dicloromethan: Lần 1 chiết với 30ml dicloromethan, thêm 20ml nƣớc cất. Lần 2 và 3, mỗi lần 30ml dicloromethan.
- Lớp dung môi hữu cơ đƣợc gộp lại, thêm 5,00g Na2SO4 khan, lắc đều, để yên khoảng 1h để loại nƣớc. Sau đó lọc, dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 40oC.
30
- Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat thay đổi từ 50:0 đến 1:1. Cách tiến hành sắc ký cột tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục 3.1.
Khảo sát phản ứng
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng, bao gồm acid phản ứng, nồng độ acid và tỷ lệ mol Zn/curcumin.
a. Khảo sát acid
Tiến hành khảo sát với 3 acid là: acid acetic băng, acid hydrocloric 20% và acid sulfuric 10%.
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/acid
TT Acid V acid (ml) KL kẽm (g) tpƣ (h) KL sp (g) Hpƣ (%) Tonc (oC) Ghi chú 1 Acid acetic băng 15 5 4 0 0 Không xuất hiện vết THC 2 Acid hydrocloric 20% 5 5 4 0,58 57,40 95,0-98,0 3 Acid sulfuric 10% 5 5 4 0,50 49,49 95,0-98,5 Nhận xét:
- Khi thực hiện phản ứng với acid acetic, kiểm tra hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3 và so sánh với THC thu đƣợc ở phản ứng khử hóa với xúc tác H2/Pd/C thì trong hỗn hợp phản ứng không thấy xuất hiện vết THC.
- Thực hiện phản ứng với acid hydrocloric (H=57,40%) cho hiệu suất phản ứng cao hơn khi sử dụng acid sulfuric (H=49,49%).
Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi chọn acid hydrocloric để thực hiện các phản ứng khảo sát tiếp theo.
31
b. Khảo sát nồng độ acid HCl
Sau khi chọn đƣợc acid thích hợp cho phản ứng là acid hydrocloric, tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng. Tiến hành khảo sát với dung dịch acid hydrocloric ở 4 nồng độ: 5%, 10%, 20% và acid đặc (khoảng 37%).
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl
TT Nồng độ acid (% m/V) V acid (ml) KL kẽm (g) tpƣ (h) KL sp (g) Hpƣ (%) T o nc (oC) 1 5 20 5 7 0,38 37,61 95,0–98,0 2 10 10 5 6 0,45 44,54 95,5–97,0 3 20 5 5 4 0,58 57,40 95,0–98,0 4 Acid đặc 3 5 3,5 0,55 54,43 95,0–98,0 Nhận xét
- Nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm thu đƣợc từ các thí nghiệm khác nhau không có sự chênh lệch đáng kể.
- Với dung dịch HCl 5%, hiệu suất phản ứng thu đƣợc thấp nhất (37,61%)
- Khi tăng dần nồng độ acid thì hiệu suất phản ứng tăng lên, đến nồng độ 20% thì hiệu suất phản ứng cao nhất (57,40%). Tiếp tục tăng đến acid HCl đặc (nồng độ khoảng 37%) thì hiệu suất phản ứng lại giảm (54,43%).
Từ kết quả khảo sát trên, dung dịch HCl 20% đƣợc lựa chọn để thực hiện các phản ứng khảo sát tiếp theo.
c. Khảo sát tỷ lệ mol kẽm và curcumin
Sau khi lựa chọn đƣợc điều kiện thích cho phản ứng là acid hydrocloric 20%, chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa số mol kẽm và số mol curcumin đến hiệu suất phản ứng. Tiến hành khảo sát với các tỷ lệ mol Zn/curcumin lần lƣợt là 6/1, 12/1, 18/1, 24/1 và 28/1.
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl
