ESCOLA SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SANTA CASA DE MISERICÓRDIA DE VITÓRIA – EMESCAM
GABRIELA SOUZA DO NASCIMENTO MARTINS
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE HELICOBACTER PYLORI EM
PACIENTES COM COLECISTITE
VITÓRIA 2016
GABRIELA SOUZA DO NASCIMENTO MARTINS
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE HELICOBACTER PYLORI EM PACIENTES COM COLECISTITE
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória como requisito parcial para obtenção do grau de médico.
Orientadora: Dra. Flavia Imbroisi Valle Errera
VITÓRIA 2016
GABRIELA SOUZA DO NASCIMENTO MARTINS
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE HELICOBACTER PYLORI EM PACIENTES COM COLECISTITE
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória como requisito parcial para obtenção do grau de médico.
Dedico à minha família pelo apoio e torcida, ao meu esposo pelo companheirismo, e aos professores e colegas por fazerem parte desta caminhada.
AGRADECIMENTOS
Orientadora: Flavia Imbroisi Valle Errera. Alunas do PIVIC: Vitoria Sampaio Cunha e Mariana Dutra Costa.
Pesquisadores colaboradores: Dr. Edson Ricardo Loureiro e Drª. Luciene Lage da Motta. Iara e colaboradores do Laboratório de
Genética do Centro de Pesquisas da EMESCAM.
Ao Dr. Luiz Gonzaga Vaz Coelho e a Msc. Karine Sampaio Lima do instituto alfa de gastroenterologia.
À Dra. Sony Ito do SVO.
Residentes e funcionários do HSCMV. Laboratório Multiusuário de Análises Biomoleculares – UFES
RESUMO
Introdução: Helicobacter pylori é classificado como carcinógeno tipo I. Trabalhos
recentes demonstraram a presença de H. pylori na bile e vesícula biliar de pacientes com câncer de vesícula biliar e colecistite crônica. Objetivos: Caracterizar o perfil clínico-epidemiológico de pacientes operados por colecistite; Descrever os achados histopatológicos da vesícula biliar; Identificação molecular de H. pylori na bile.
Materiais e Métodos: Amostras de bile foram coletada da vesícula biliar de quarenta
pacientes submetidos a colecistectomia laparoscópica / aberta. Amostras biliares de 12 cadáveres foram estudadas como controles. O DNA foi extraído e realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR), específica para H. pylori. A avaliação histopatológica seguiu como definições das alterações patológicas na colecistite crônica. Resultados: A média de idade dos pacientes foi de 48,53 (18,31) anos, alta prevalência de mulheres e maior índice de massa corporal e / ou obesidade. O DNA de H. pylori foi detectado por PCR em 6 pacientes (15%) e em um dos 12 controles. Foram observadas lesões da vesícula biliar: atrofia da mucosa, metaplasia, infiltração linfóide e achados como hemorragia e fibrose. Conclusão: A correlação deste perfil, associada à identificação molecular de H. pylori e achados histopatológicos, em pacientes operados por colecistite podem corroborar com outros estudos que sugerem a relação entre infecção por H. pylori e doenças biliares, além de doenças gástricas. Poderia contribuir com novas perspectivas terapêuticas.
ABSTRACT
Introduction: Helicobacter pylori is classified as a type I carcinogen. Recent work
demonstrated the presence of H. pylori in bile and gallbladder of patients with gallbladder cancer and chronic cholecystitis. Aims: To characterize the clinical-epidemiological profile of patients operated by cholecystitis; Describe the histopathological findings of the gallbladder; Molecular identification of H. pylori in bile. Materials and Methods: Bile samples were collected from the gallbladder of forty patients undergoing laparoscopic/open cholecystectomy. Bile samples from 12 cadavers were studied as controls. DNA was extracted and polymerase chain reaction (PCR), specific to H. pylori was performed. Histopathological evaluation followed as definitions of pathological changes in chronic cholecystitis. Results: The mean age of patients was 48.53 (18.31) years, high prevalence of women and higher body mass index and/or obesity were observed. H. pylori DNA was detected by PCR analysis in 6 patients (15%) and in one of the 12 controls. Gallblader mucosal lesions were observed: mucosal atrophy, metaplasia, lymphoid infiltration and findings such as hemorrhage and fibrosis. Conclusion: The correlation of this profile,
associated with the molecular identification of H. pylori and histopathological findings, in patients operated by cholecystitis can corroborate with other studies that suggest the relation between H. pylori infection and biliary diseases, in addition to gastric diseases. It could contribute with new therapeutic perspectives.
Lista de tabelas
Tabela 1 – Descrição dos primers utilizados para o diagnóstico de H. pylori ... 15 Tabela 2 – Condições da Reação em Cadeia da Polimerase ... 16 Tabela 3 – Descrição do perfil das amostras ... 17 Tabela 4 – Principais sintomas e doenças associadas na colecistite e a presença de H. pylori na bile ... 20 Tabela 5 – Alterações histopatológicas na colecistite e a presença de H. pylori na bile ... 22
Lista de gráficos
Gráfico 1 – Situação nutricional de pacientes colecistectomizados e a presença de H. pylori na bile ... 20 Gráfico 2 – Hábitos de vida de pacientes colecistectomizados e a presença de H. pylori na bile ... 21 Gráfico 3 – Consumo de café por pacientes colecistectomizados e a presença de H. pylori na bile ... 21
Lista de figuras
Figura 1 – Gel de agarose 0,8% ... 18
Figura 2 – Gel de agarose 0,8% ... 18
Figura 3 – Gel de poliacrilamida 8% ... 19
Figura 4 – Gel de poliacrilamida 8% ... 19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 11
2 MÉTODOS ... 14
2.1 BANCO DE DADOS ... 14
2.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ... 14
2.3 PADRONIZAÇÃO DAS TÉCNICAS MOLECULARES DE GENOTIPAGEM ... 14
2.3.1 Isolamento de DNA... 15 2.3.2 Reações de PCR ... 15 2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 16 3 RESULTADOS ... 17 4 DISCUSSÃO ... 24 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 29 REFERÊNCIAS ... 30 APÊNDICES ... 33
APÊNDICE A – PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP... 34
APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 35
APÊNDICE C – FICHA CLÍNICA ... 36
11
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
O Helicobacter pylori é um bacilo Gram negativo, classificado como um carcinógeno tipo 1, infecta o estômago humano e provoca gastrite, úlcera péptica e câncer gástrico. A baixa condição socioeconômica, maior densidade de moradia, baixo nível educacional, baixas condições de saneamento básico e fatores dietéticos estão associados à presença desta bactéria, além de fatores como gênero, grupos sanguíneos, genótipos HLA1 e secreção ácida.1
A prevalência da infecção pelo H. pylori varia amplamente entre as nações. Nos países em desenvolvimento a taxa de infecção é de aproximadamente 80% da população até 20 anos de idade. Em contraste, a taxa é tão baixa quanto 10-20% nos países desenvolvidos, atribuída a melhores condições de higiene e padrões socioeconômicos.2 No Brasil, a infecção pela bactéria varia de 30%, 78% e 82%, nas faixas etárias de 6-8, 10-19 anos e adultos, respectivamente.3
Em uma meta-análise, dados mostraram uma tendência de maior presença de H. pylori em pacientes com colelitíase que o grupo controle e esta tendência foi significativa nas regiões em desenvolvimento com maior prevalência desta bactéria.2 É geralmente aceito que essas bactérias desempenham um papel importante na formação de cálculos pigmentares, mas os mecanismos exatos envolvidos permanecem obscuros. Glicuronidases produzidas por algumas enterobactérias podem desconjugar bilirrubina e resultar na precipitação de bilirrubinato de cálcio e formação de cálculos. Espécies de Helicobacter também podem interagir com a bile através da produção de enzimas hidrolíticas, inflamação crônica e proteínas de nucleação, como imunoglobulinas, atuando como corpo estranho. As bactérias nos cálculos biliares de colesterol puros e mistos foram localizadas no centro do cálculo, o que sugere que elas facilitam a formação de núcleo e a possível precipitação de colesterol. 4,5
Foi demonstrado que o H. pylori pode danificar as células epiteliais da vesícula biliar humana in vitro, e pode ser o fator chave que leva à clínica da colecistite. A adição
12
de sobrenadantes de H. pylori resultou em uma rápida diminuição na divisão celular, movimento e adesividade de células epiteliais na vesícula biliar humana.6
A colecistite é a condição cirúrgica mais prevalente afetando populações em países industrializados. Ao invés de uma única entidade clínica, colecistite é uma classe de estados de doença relacionados com diferentes causas, gravidade e evolução.7 Colelitíase, coledocolitíase, colangite esclerosante primária e disfunção do esfíncter de Oddi são os principais distúrbios do trato biliar e há associações com infecções bacterianas, porém ainda não há correlação com alterações no padrão histopatológico da vesícula biliar. A identificação das espécies de Helicobacter tem importância epidemiológica. Uma vez ligado na patogênese de doenças da vesícula biliar, esse conhecimento vai ajudar na prevenção da infecção e na erradicação.8,9 Os mecanismos patogênicos prováveis dos bacilos causando colecistolitíase e até tumores da vesícula biliar estão sendo minuciosamente estudados onde a doença é muito comum a fim de confirmar se o Helicobacter spp, é um organismo saprofítico ou está realmente causando as doenças da vesícula biliar.8,10
Os testes diagnósticos para detectar a infecção pelo H. pylori incluem métodos endoscópicos e não endoscópicos. Podem ser diretos (cultura, demonstração microscópica do microorganismo) ou indiretos (usando urease, antígenos fecais, ou uma reação por anticorpos como marcador da doença). A PCR é considerada sensível e específica na identificação do Helicobacter pylori, porém ainda não normalizada e considerada experimental, apresentou sensibilidade e especificidade de 100%, enquanto o teste da urease e exame histológico tiveram sensibilidade de 93% e 81% respectivamente e especificidade de 100% em ambas. A acurácia foi de 95% no exame histológico, 98% no teste da urease, e 100% na PCR.3,11
No Brasil, associação entre colecistite e a presença de DNA de Helicobacter na vesícula biliar foi observada em metade de amostras de tecido da vesícula biliar e em 23,3% de amostras de bile de 28 pacientes e, o H. pylori foi consistentemente detectado apenas quando um método de PCR foi utilizado.12
São poucos os estudos de prevalência do gênero Helicobacter, e suas espécies no trato biliar, principalmente no Brasil. Apesar de não ter seu papel totalmente
13
esclarecido na fisiopatologia de doenças biliares, sua participação nos mecanismos de inflamação da vesícula e formação de cálculos está sendo proposto e estudado. Assim, estudos de levantamento da presença da bactéria em diversas populações para entendimento das condições, como litíase biliar e colecistite crônica, também são necessários bem como sua provável parcela de contribuição nestes processos conferindo fator de risco. Dessa forma, propostas de tratamentos conservadores como a erradicação da bactéria poderiam preceder a colecistectomia que hoje é a terapêutica indicada.
Este trabalho tem como objetivo principal a identificação molecular do H. pylori na bile de pacientes colecistectomizados. Como objetivos específicos podem ser citados: 1) Correlação de dados clínicos com a presença da bactéria 2) Comparação dos achados histopatológicos nas vesículas com e sem a infecção.
14
2 MÉTODOS
Foram incluídos no estudo 40 pacientes que realizaram colecistectomia eletiva por videolaparoscopia e laparoscopia no Hospital Santa Casa de Misericórdia de Vitória, no período de 07/10/2014 a 24/04/2015, aceitaram participar do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). O grupo controle foi composto por 12 amostras de material biológico (bile) coletado em serviço de verificação de óbitos – SVO, oriundo de necropsias que não apresentavam comprometimento de vesícula biliar, sem litíase e histórico de doenças biliares.
2.1 BANCO DE DADOS
Um banco de dados com informações clínicas foi elaborado a partir de entrevista com os pacientes segundo modelo de ficha elaborada pelos pesquisadores (ANEXO B). Informações sobre as amostras do grupo controle foram obtidas dos formulários de óbito do SVO.
2.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
A avaliação histopatológica seguiu as definições das alterações patológicas na colecistite crônica13, realizada por única patologista, sem que esta soubesse os resultados da análise molecular.
2.3 PADRONIZAÇÃO DAS TÉCNICAS MOLECULARES DE GENOTIPAGEM
Durante a colecistectomia cerca de 2,0 ml de bile foram coletados a partir da vesícula biliar através de punção com agulha 40x12 e armazenadas em tubo estéril seco a -20ºC em ultrafreezer até a extração do DNA.
15
2.3.1 Isolamento de DNA
O DNA da bile foi preparado a partir de uma amostra de acordo com protocolo em resumo: 1 mL de bile misturado com 1 ml de fenol tamponado, pH 8,0; vortexado e centrifugado a 9000 rpm durante 10 minutos. A fase aquosa transferida para um tubo contendo uma quantidade igual de mistura de fenol e clorofórmio 1:1, vortexado, e centrifugado. Este segundo passo foi repetido até a solução de bile estar límpida. O DNA foi precipitado com acetato de sódio à 90 ° C overnight e recuperado com etanol.14 O DNA foi em seguida quantificado no espectofotômetro NanoDrop® no Laboratório Multiusuário de Análises Biomoleculares CCS/UFES (LABIOM).
A viabilidade do DNA das amostras foi testada em eletroforese em gel de agarose 0,8% e, visualizadas por excitação com luz UV.
2.3.2 Reações de PCR
Cada amostra foi submetida a três reações de PCR realizadas com pares de primers (tabela 1) e em condições de temperatura especificas (tabela 2) para identificação da bactéria.15 Em cada reação um controle positivo contendo amostras positivas de DNA de H. pylori, cedidas pelo Instituto Alfa de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas em Belo Horizonte e, um controle negativo, água ultra pura estéril, foram incluídos na reação.
Tabela 1 – Descrição dos primers utilizados para o diagnóstico do H. pylori
*pb pares de base
16
Tabela 2 – Condições da Reação em Cadeia da Polimerase
Fonte: LUSCENTI & GATTI, 2008.
2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Análise descritiva foi feita a partir do banco de dados clínico e do estudo das características histopatológicas. A base de dados foi organizada no software Excel e realizada estatística descritiva. Os dados foram apresentados por meio de médias, medianas e percentuais.
17
3 RESULTADOS
Foram obtidas 40 amostras de pacientes com colecistite diagnosticada e submetidos à cirurgia eletiva considerados casos. No grupo controle foram incluídas 12 amostras (tabela 3).
Tabela 3. Descrição do perfil das amostras
Casos Controles
Mulheres 87,50% (N=35) 58,33%(N=7) Brancos e pardos 82,5% (N=33) 83,34% (N=10) Média de idade 48,53 (±18,31) 60,67 (±18,86)
Fonte: próprio autor.
A concentração de DNA extraído das amostras variou entre 2,40 a 4007,50 ng/µL. A média foi de 266,56 ng/µL próximo aos valores das amostras positivas cedidas pelo instituto alfa de gastroenterologia, considerando também que essas últimas são extraídas do corpo e antro gástrico tendo concentrações de DNA 143,0 ng/µL e 80,80 ng/µL respectivamente. Nas amostras do grupo controle a concentração de DNA extraído foi de -95,80 a 752,70 ng/µL.
Dos 40 pacientes colecistectomizados, 11 amostras de DNA se mostraram íntegras, apresentando banda na eletroforese em Agarose 0,8% e, uma amostra do grupo controle. As moléculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso molecular através do gel de agarose. A coloração foi feita com brometo de etídeo. Esse corante se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), fluoresce em vermelho alaranjado (590nm). Com este método pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra (Fig. 1 e Fig. 2).
18
Figura 1 - Gel de agarose 0,8%. Observa-se nos poços 3, 4 e 7 a presença de DNA por emissão de luz U.V. através da coloração com brometo de etídio
Fonte: próprio autor.
Figura 2 - Gel de agarose 0,8%. Observa-se nos poços 1 e 10 da primeira linha, e nos poços 1 e 6 da segunda linha, a presença de DNA por emissão de luz U.V. através da coloração com brometo de etídio. As amostras da segunda linha apresentam degradação do DNA
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Todas as amostras foram submetidas às 3 reações de PCR e, em todas as reações foram observados os controles positivos e negativos (figura 3).
Figura 3 – Gel de poliacrilamida 8% corado com AgNO3 0,1%. Onde 1, 3 e 5 referem-se a
amplificação dos primers: H5/H6, HPX/HPX1 e H3/H4, respectivamente. E 2, 4 e 6 aos controles negativos sem amostra de DNA. M refere-se ao marcador de 100pb
Fonte: próprio autor.
Dos pacientes colecistectomizados que apresentaram DNA íntegro, foi identificado a H. pylori com a amplificação dos primers HPX/HPX1 em 6/11 (15%) e, uma amostra do grupo controle.
Figura 4 – Gel de poliacrilamida 8% corado com AgNO3 0,1%. Amplificação dos primers HPX/HPX1,
onde 1, 2 e 5 são amostras positivas. CP é o controle positivo e CN o controle negativo. M refere-se ao marcador de 150 pb e 4 à amostra conhecida de 200 pb
20
A comparação das características clínicas e patológicas com a presença da H. pylori na bile estão apresentadas a seguir no gráfico 1 e tabela 4.
Gráfico 1- Situação nutricional de pacientes colecistectomizados e a presença de H. pylori na bile
0,00% 50,00% 33,33% 0,00% 16,67% 0,00% 0,00% 40,00% 40,00% 20,00% 33,33% 33,33% 15,38% 10,26% 7,69%
Peso Normal Acima do Peso Obesidade Obesidade II (Severa)
Obesidade III (Mórbida) H.pylori positivo (N=6) H.pylori negativo (N=5) Amostra total (N=40)
Fonte: próprio autor.
Tabela 4 - Principais sintomas e doenças associadas na colecistite e a presença de H. pylori na bile
Perda de Apetite 5 83,33 1 16,67 2 40,00 3 60,00 16 40,00 24 60,00 Regurgitação Ácida 4 66,67 2 33,33 4 80,00 1 20,00 22 55,00 18 45,00 Azia 6 100,00 0 0,00 3 60,00 2 40,00 25 62,50 15 37,50 Gastrite 2 33,33 4 66,67 2 40,00 3 60,00 15 37,50 25 62,50 Úlcera Gástrica 0 0,00 6 100,00 0 0,00 5 100,00 0 0,00 40 100,00 Úlcera Duodenal 0 0,00 6 100,00 0 0,00 5 100,00 0 0,00 40 100,00 DRGE* 1 16,67 5 83,33 2 40,00 3 60,00 9 22,50 31 77,50 VHB** 0 0,00 6 100,00 2 40,00 3 60,00 4 10,00 36 90,00 Amostra total sim n% não n% sim n% H. pylori negativo H. pylori positivo
não n% sim n% não n%
*
DRGE Doença do refluxo gastroesofágico. **VHB vírus da hepatite B. Fonte: próprio autor.
Dor abdominal foi agrupada em ausente 3/40 (7,50%), forte 28/40 (70%) e não forte 9/40 (22,50%), e não houve grande diferença entre H. pylori positivos 4/6 (66,67%) e negativos 3/5 (60%).
Em relação às comorbidades, os pacientes apresentaram no geral hipertensão 13/40 (32,50%), esteatose 6/40 (15%), dislipidemia 8/40 (20%) e diabetes 7/40 (17,50%). Nenhuma das amostras com H. pylori identificada apresentou diabetes e em relação
21
às outras doenças tiveram 33,33%, 16,67% e 16,67% história de hipertensão, esteatose e dislipidemia, respectivamente.
Relataram ter feito tratamento para erradicação da bactéria previamente 3/40 (7,50%) dos pacientes colecistectomizados, sendo 2 deles positivos para H. pylori na bile. Sobre o uso de inibidor de bomba de prótons, relataram já ter feito uso 23/40 (57,50%) 3/6 (50%) da amostra total e os positivos para a presença da bactéria na bile. A história familiar para colecistite foi relatada por mais da metade dos pacientes. Maior percentual para alcoolismo e tabagismo foi encontrado entre os pacientes H. pylori positivos na bile e, menor para prática de exercício físico (Gráficos 2).
Gráfico 2 - Hábitos de vida de pacientes colecistectomizados e a presença de H. pylori na bile
50,00% 33,33% 16,67% 40,00% 20,00% 40,00% 35,00% 15,00% 30,00%
Álcool Fumo Exercício
H.pylori positivo (N=6) H.pylori negativo (N=5) Amostra total (N=40)
Fonte: próprio autor.
O consumo de café está representado no gráfico 3.
Gráfico 3 - Consumo de café por pacientes colecistectomizados e a presença de H. pylori na bile
50,00% 16,67% 33,33% 0,00% 40,00% 40,00% 20,00% 0,00% 50,00% 25,00% 15,00% 10,00% 1 a 2 3 a 5 mais de 5 Não
H.pylori positivo (N=6) H.pylori negativo (N=5) Amostra total (N=40)
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No estudo histopatológico, uma amostra positiva para H. pylori não teve a peça cirúrgica disponível para análise. Infiltrado inflamatório mononuclear severo foi um achado em amostra positiva para H. pylori na bile. Todas as amostras negativas para a bactéria tiveram fibrose grau leve (tabela 5). Duas amostras apresentaram metaplasia gástrica, tendo uma delas apresentado também metaplasia intestinal, porém estas amostras não apresentaram DNA íntegro para avaliação de infecção (Figura 5). Colesterolose foi encontrado em três amostras.
Tabela 5 - Alterações histopatológicas na colecistite e a presença de H. pylori na bile
n % n % n % n % n % n % n % n % n %
Infiltrado inflamatório mononuclear 2 40,00 3 60,00 18 46,15 2 40,00 2 40,00 18 46,15 1 20,00 0 0,00 3 7,69
Grau de Fibrose 4 80,00 5 100,00 31 79,49 1 20,00 0 0,00 8 20,51
Espessura da camada muscular 4 80,00 5 100,00 30 78,95 1 20,00 0 0,00 8 21,05 Deposição de tecido adiposo 4 80,00 5 100,00 31 79,49 1 20,00 0 0,00 8 20,51
n % n % n % n % n % n % n % n % n % Grau de hiperplasia 3 60,00 5 100,00 30 76,92 0 0,00 0 0,00 2 5,13 2 40,00 0 0,00 7 17,95 n % n % n % n % n % n % n % n % n % Atrofia de mucosa 1 20,00 3 60,00 11 28,21 4 80,00 2 40,00 27 69,23 0 0,00 0 0,00 1 2,56 Folículos linfóides 0 0,00 0 0,00 8 20,51 5 100,00 5 100,00 31 79,49 Hemorragia 3 60,00 0 0,00 6 15,38 2 40,00 5 100,00 33 84,62
Amostra total H.pylori + H.pylori - Amostra total H.pylori + H.pylori - Amostra total H.pylori + H.pylori
-H.pylori + -H.pylori - Amostra total H.pylori + H.pylori - Amostra total
Severo
Focal
Focal Não
Difuso
H.pylori + H.pylori - Amostra total
H.pylori + H.pylori - Amostra total H.pylori + H.pylori - Amostra total H.pylori + H.pylori - Amostra total
Nenhum
Sim
Leve Moderado
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Figura 5 – Achados histopatológicos
A Atrofia de mucosa B Hiperplasia com displasia baixo grau C Metaplasia gástrica D Hemorragia
(setas) e folículos linfoides (circulado) E Metaplasia intestinal com células caliciformes (setas) F Metaplasia intestinal.
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4 DISCUSSÃO
Em análises uni e multivariadas, a presença de colelitíase foi positivamente associada com idade avançada, sexo feminino, e a presença de DNA de Helicobacter na vesícula biliar em estudo no Brasil.7 A população feminina representou 87,50% (N=35) de nossa amostra e a média de idade foi de 48,53 anos próxima ao estudo citado que foi de 51,5 anos.
Na literatura, há relatos positivos e negativos sobre a associação da infecção por H. pylori e maior índice de massa corporal e / ou obesidade. A obesidade não foi associada à infecção pela bactéria, embora a erradicação da mesma tenha levado a um aumento significativo do peso corporal.16 Mais da metade (66,67%) dos pacientes se encontravam acima do peso em nosso estudo e, as amostras H. pylori negativas e positivas tiveram representatividade aproximadas entre os níveis de obesidade. Para definir a prevalência e fatores de risco de lesões polipóides da vesícula biliar em uma população saudável, foram comparados: sobrepeso, síndrome metabólica, glicemia de jejum, hepatite B crônica, hepatite C crônica, colesterol total, triglicerídeo, colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL), infecção gástrica por H. pylori e, presença de pólipos de cólon para aqueles que foram submetidos a procedimentos de colonoscopia. Na análise univariada, o status de sobrepeso, síndrome metabólica e infecção gástrica por H. pylori foram considerados fatores de risco. Na análise multivariada, apenas a infecção gástrica por H. pylori foi um fator de risco independente para a presença de cálculos e lesões polipóides na vesícula biliar.17 Pacientes com infecção pelo H. pylori na mucosa da vesícula biliar, em comparação com pacientes sem infecção, tiveram maior prevalência de sintomas de regurgitação ácida, mais histórias de gastrite crônica e úlcera duodenal.18 Comparação entre grupos positivos e negativos para H. pylori na colecistite crônica achou as seguintes características: dor abdominal leve 65,67% e 57,53%; perda de apetite 17,91% e 10,81%; azia 29,85% e 19,31%; respectivamente.2 Em nossa amostra cerca de 30% dos pacientes apresentaram gastrite e mais da metade dos pacientes relataram regurgitação ácida, porém nenhum histórico de úlceras gástricas ou duodenais.
25
Uma taxa de prevalência de Helicobacter pylori em pacientes diabéticos maior do que nos indivíduos controle em quase todas as faixas etárias, atingindo significância em pacientes não insulino-dependentes e insulino-dependentes foi encontrada.19 Pacientes diabéticos em nosso estudo representaram 20,59% (N=7) da amostra, todos eles eram não insulino-dependentes, valor muito acima da prevelência nacional que é cerca de 7,6 %,20 porém em nenhum foi encontrado H. pylori na bile, assim como os 11,76% (N=4) pacientes que relataram infecção pregressa pelo vírus da hepatite B (VHB). DNA de H. pylori nos fragmentos hepáticos associou-se à infecção prévia ou atual pelo VHB. É possível que fatores inerentes à infecção pelo VHB, provavelmente, dependentes da relação entre hospedeiro e vírus, contribuam para que bactérias presentes no estômago se estabeleçam no fígado de seres humanos. É provável que a interação entre vírus e H. pylori modifique o curso natural das infecções causadas por esses agentes.21
A infecção pelo H.pylori teve associação entre o consumo de álcool e nenhuma relação com tabagismo ou consumo de café.22 Para outro autor nem o tabagismo nem o consumo de álcool foram associados à presença de H. pylori na bile.14 Um maior percentual de tabagistas e consumidores de álcool foi observado em pacientes com H. pylori positivo na bile, além de maior consumo de café no presente estudo. Em análise histológica de padrões inflamatórios crônicos da vesícula biliar, com o objetivo de propor critérios diagnósticos para relatar colecistite, estudo no qual baseamos nossa ficha histopatológica, hiperplasia epitelial foi observada em 69,6% de tipo focal e 30,3% do tipo difuso. Hiperplasia em geral apresentou correlação positiva com inflamação crônica. As amostras positivas para H. pylori na bile apresentaram hiperplasia focal de 40%, as amostras no total apresentaram hiperplasia difusa de 5,13% e focal de 17,95% e, amostras negativas não apresentaram nenhum grau de hiperplasia. A fibrose foi observada em todos os casos, assim como no nosso estudo, com 26% e 79,49% leve, 62% e 20,51% Moderada, 12% e 0% severa, respectivamente. Foi relatada correlação positiva do grau moderado com inflamação crônica grave. Todas as amostras negativas para H. pylori na bile apresentaram grau de fibrose leve. Ainda comparando os trabalhos, o grau de infiltrado mononuclear inflamatório foi leve em 28% e 46,15%, moderada em 57% e 46,15% e severo em 15% e 7,69% dos casos.13
26
Os achados histopatológicos encontrados em estudo brasileiro com 68 pacientes com colecisitite, comparados com o presente estudo são de 100% e 20% de atrofia de mucosa; aumento da espessura da camada muscular leve 16,2% e 80%; aumento da espessura da camada muscular moderado 43% e 20%; hemorragia 17,6% e 60%; respectivamente. Foram encontrados cálculos de colesterol 36,8%, mistos 32,3% e pigmentados em 30,9%,9 em contraste com apenas uma amostra com cálculos de colesterol e uma com cálculos mistos do nosso trabalho. Também se achou significância em relação a hiperplasia de mucosa, metaplasia/displasia de mucosa e infiltração linfoide quando comparados os grupos com e sem presença de H. pylori na parede da vesícula biliar, considerando tais lesões da mucosa agravantes e potencialmente pré-cancerosas.23
Utilizando a reação específica de PCR para Helicobacter e a eletroforese de agarose, foi detectado DNA desse bacilo em 7 de 100 de amostras de vesícula biliar de pacientes com colecistite. Houve 4/50 (8%) e 3/50 (6%) amostras positivas para Helicobacter spp. entre pacientes com colecistite aguda e crônica, respectivamente. Nenhuma das amostras do controle foi positiva para a bactéria. Seis amostras mostraram 98-99% de similaridade de seqüência com H. pullorum e uma com H. pylori. Em casos com metaplasia, em seis dos 39, em comparação com nenhum dos 61 sem metaplasia, foi encontrado H. pullorum. A diferença foi estatisticamente significante. 24 No presente trabalho duas amostas apresentaram metaplasia, porém não apresentaram DNA íntegro para reação de PCR ser efetiva.
Fazendo detecção prévia de positividades para anticorpos (IgG) contra H. pylori no soro e posteriormente nas fezes ou bile, a mucosa da vesícula biliar foi examinada para detecção do gene da urease A por PCR. Dos 95 pacientes, 75 (79%) foram positivos para anticorpos H. pylori. Pacientes foram positivos com antígenos de H. pylori em 26 (34,7%) na bile e 21 (28%) em amostras de fezes. Dentre estes 47 pacientes, a PCR foi positiva em 29 (62%) indivíduos e, H. pylori não pôde ser detectado entre os pacientes estudados por meio de coloração de Gram ou cultura.25 Desde os primórdios da utilização da reação em cadeia da polimerase para detecção do H. pylori na mucosa gástrica, se apontou vantagens e desvantagens deste método. A PCR detectou H. pylori em sete amostras de biópsia que continham a bactéria cultivável, além de sete amostras consideradas negativas por cultura,
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coloração por Gram, e o teste da urease, refletindo a elevada sensibilidade deste método mesmo com baixo número de células não viáveis ou viáveis que estavam abaixo dos níveis de detecção dos testes de diagnóstico de rotina. Além disso, a amplificação do fragmento da urease com 411pb se mostrou 100% específica nas 50 cepas de H. pylori testadas, mas não foi detectada em outras espécies bacterianas. Contudo, uma grande desvantagem da PCR é a sua extrema sensibilidade, o que pode conduzir a reações de falso positivo devido principalmente a contaminação da amostra pelo produto de PCR.26
Os resultados de PCR detectaram DNA de H. pylori em 15 (22%) de 68 amostras mas não foram isoladas bactérias em cultura, obtidos de diferentes amostras de vesícula biliar. Foi relatada a possibilidade das amostras que se tornaram negativas serem devido à presença de poucas bactérias, efeito inibitório do meio biliar ou necessidade de certos requisitos que devem ser adotados. 27 Nossas amostras apresentaram concentração de DNA satisfatória na maioria dos casos, porém com baixa intergridade para que a reação de PCR pudesse ser efetiva. Além das dificuldades citadas, a extração de DNA com kits específicos e uso de recursos que impeçam a degradação poderiam contribuir para o maior sucesso neste processo. Outros estudos apontam a falta de associação entre infecção pelo Helicobacter pylori e doenças biliares: Após estudar 102 amostras de bile nenhuma mostrou crescimento em meio de cultura, mas a presença de DNA do gênero Helicobacter foi detectada em 3,92% delas. Todas as amostras positivas pertenciam a espécies H. pylori.28 Não houve crescimento de colônias de Helicobacter pylori com culturas a partir de 60 amostras biliares, mesmo após prolongada incubação por até 2 semanas em condições microaerófilas. A conversão de bactérias helicoidais viáveis em cocos não viáveis em um ambiente adverso rico em bile e, possivelmente o número de bactérias é muito reduzido pela inibição do ambiente desfavorável que existe no meio biliar.29
A fim de identificar Helicobacter em cálculos biliares de 33 pacientes com doença biliar, amostras de cálculos biliares e de bile foram submetidas a testes rápidos de urease, cultura e PCR. Grupo controle com 40 amostras biliares autopsiadas com patologia normal também foi estudado. O DNA de H. pylori foi detectado por PCR em 18,1% dos cálculos e 12,1% de amostras biliares. Os testes rápidos de urease e
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cultura foram negativos para todas as amostras. A PCR foi negativa no grupo controle e, concluiu-se que para esclarecer o papel clínico do Helicobacter em doenças da vesícula biliar, estudos que utilizam testes precisos em grupos maiores de pacientes são necessários para determinar se este microorganismo é um espectador inocente ou participante ativo na formação de cálculos biliares.30 Em pacientes colecistectomizados, 58 cálculos biliares, 48 amostras de bile e 46 amostras de mucosa da vesícula biliar foram obtidos e submetidos a PCR utilizando primers específicos de H. pylori e outras bactérias. Como resultado, a taxa positiva de Helicobacter foi de 4/58 (6,8%) em amostras de cálculos biliares, 6/48 (12,5%) em amostras de bile e 5/46 (10,8%) em amostras obtidas da mucosa da vesícula biliar.31 Estes estudos apresentam prevalência aproximada da encontrada em nossa pesquisa que foi de 6/40 (15%) de amostras positivas para o H. pylori na bile.
Limitações do presente estudo incluem o pequeno número amostral, dificuldade em obter DNA em concentração adequada para realização da PCR e, possível presença de espécies do gênero Helicobacter que não o H. pylori.
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5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O levantamento do perfil clínico-epidemiológico tem importância na promoção de saúde para vigilância de fatores de risco e complicações relacionadas. A correlação desse perfil, juntamente com a identificação molecular do H. pylori e achados histopatológicos, nos pacientes operados por colecistite podem corroborar com demais estudos que sugerem a relação entre a infecção pela bactéria e doenças biliares, além das gástricas, podendo contribuir com novas perspectivas terapêuticas que não a colecistectomia que é o tratamento indicado atualmente.
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REFERÊNCIAS
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32
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APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que, eu _, CPF e RG concordo em participar do projeto piloto “Prevalência de infecção por Helicobacter pylori em pacientes operados por colecistite crônica”. Nesse projeto pretendemos buscar uma melhor compreensão dos fatores relacionados a colecistite crônica. Fui informado que esse estudo é independente do meu tratamento no hospital, que não receberei nenhum pagamento por minha participação, que devo manter todas as recomendações médicas e que será realizada uma coleta de 5ml de sangue, como ocorre em qualquer exame laboratorial de rotina, e que a mesma será realizada com material estéril e descartável. O sangue coletado será utilizado para dosagens laboratoriais e estudo do meu material genético-DNA. Informo que também doarei material biológico (bile, pedaço da vesícula) retirado durante minha cirurgia de vesícula. Autorizo a utilização dos materiais biológicos coletados, das informações obtidas na entrevista e nos exames laboratoriais, para os objetivos desse e de outros projetos sobre problemas na vesícula e para a ampla divulgação científica. Tenho a liberdade de cancelar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem que isso traga prejuízo ao meu atendimento e tratamento. Me foi dada a garantia de não ser identificado (a) e que todos os dados referentes a mim serão confidenciais, podendo ser acessados por mim e pelos pesquisadores envolvidos a qualquer tempo.
Por este documento, tomo parte voluntariamente do presente estudo.
Local: _Data:
Assinatura do paciente
Assinatura do entrevistador Assinatura do pesquisador responsável
Pesquisadora responsável: Flavia Imbroisi Valle Errera Tel:3334-3595/3340-1353
Comitê de ética em Pesquisa da EMESCAM: 3334-3586 email: comite.ética@emescam.br Av. Nossa Senhora da Penha, 2190 - Prédio do Centro de Pesquisa da EMESCAM
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APÊNDICE C – FICHA CLÍNICA
. Data de nascimento / / Idade 2. Gênero ( )F ( )M
3. ( ) branco ( ) negro ( ) mulato ( ) índio ( ) outros 4. Peso Altura_ IMC HDA 5. Dor abdominal ( ) leve ( ) moderada ( ) forte
6. Cólica biliar ( ) não ( ) sim 7. Perda do apetite ( ) não ( ) sim 8. Regurgitação ácida ( ) não ( ) sim 9. Azia ( ) não ( ) sim História de outras doenças gastrointestinais crônicas
10.Gastrite ( ) não ( ) sim 11.Úlcera gástrica ( ) não ( ) sim 12.Úlcera duodenal ( ) não ( ) sim 13.Esofagite de refluxo ( ) não ( ) sim
14.Enterite crônica ( ) não ( ) sim Infecção atual ou passada pelo VHB ( ) sim ( ) não Fumo: ( )não
( )sim ( )ex- fumante 1 ano ( )5 anos cigarros por dia Álcool: ( )não
( )sim ( )socialmente ( )todos os dias OBS: Café: ( )não
( )sim ( )1-2 xícaras ( )3-5 xícaras ( )mais de 5 xíc. Exercício: ( )não
( )sim ( )às vezes ( )3x semana ou mais Obesidade: ( )não ( )sim Operada: ( )N ( )S Quando? Hipertensão ( )não ( )sim Duração:_
Diabetes ( ) não ( )Tipo I ( )Tipo II ( )Outros Doença hepática: ( )Esteatose Outras:
Dislipidemia: ( )Não ( )Sim Comorbidades:
( ) Cardiovasculares ( ) Angina ( ) Infarto ( ) AVC
( ) Trombose ( ) Renais ( ) Neurológicas ( ) Artrite
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Outras doenças:_______________________________________ Outras cirurgias: ( )cesárea ( )G ( )P ( )A Medicação:
Já fez tratamento para erradicação de H. pylori? ( )não ( )sim Quando: Uso de inibidor da bomba de prótons? ( )Não ( )Sim Duração:_
HF Mãe Pai Irmãos
Obesidade Diabetes Hipertensão Dislipidemias Doença Cardiovascular Tireoideopatias Câncer Asma Cefaléia Gastrite Úlcera gástrica/duodenal Colecistite
Diagnóstico ultrassonográfico no pré-operatório: 1. Litíase biliar ( ) sim ( ) não
2. Número de cálculos ( ) único ( ) múltiplos 3. Lesão polipóide ( ) única ( ) múltiplas
4. Espessamento da parede da vesícula biliar ( ) sim ( ) não 5. Atrofia da vesícula ( ) sim ( ) não
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APÊNDICE D – FICHA HISTOPATOLÓGICA
Definições das alterações patológicas na colecistite crônica Infiltrado inflamatório mononuclear
( ) Leve Difuso, <= 10 células inflamatórias em HPF* em qualquer camada ( ) Moderado Difuso, entre 11 e 30 células HPF
( ) Severo Difuso, >= 31 células por HPF ou folicular
Grau de fibrose
( ) Leve Deposição irregular de colágeno em <= 20% de material ( ) Moderada Deposição irregular de colágeno em 21% a 70% de material ( ) Grave Colágeno irregular ou fibroplasia lamelar em >= 71% de material
Espessura da camada muscular
( ) Leve Menos de 1/3 de toda a espessura
( ) Moderado 1/3 a 2/3 da parede
( ) Severo Mais de 2/3 da espessura da parede
Deposição de tecido adiposo
( ) Leve 10% do material
( ) Moderada 11 a 60% do material
( ) Grave > 60% do material
Grau de hyperplasia
( ) Difusa >= 70% das secções inteiras
( ) Focal < 70% das secções inteiras
Grau de dysplasia
( ) Baixo grau Assemelham adenomas tubulares do cólon sem metaplasia intestinal ( ) Alto grau Núcleos marcadamente polimórficos e/ou nucléolos proeminentes
Metaplasia
( ) Piloro Estruturas semelhantes às glândulas do piloro na lâmina própria ( ) Intestinal Células caliciformes e enterócitos
( ) Superfície gástrica As células epiteliais da mucosa da vesícula biliar substituídas por células cilíndricas altas com mucina abundante e núcleo localizado na base *campo de maior concentração
39 ( ) Atrofia da mucosa ( ) Folículos Linfóides ( ) Adenomiose ( ) Hemorragia ( ) Cálculos de colesterol ( ) ÚNICO ( )MÚLTIPLOS ( ) Cálculos pigmentares ( ) ÚNICO ( )MÚLTIPLOS ( ) Cálculos mistos ( ) ÚNICO ( )MÚLTIPLOS
