FATÔRES QUE IN F LU E M N A D E TE R M IN A Ç ÃO DOS VALÕ R E S PROTEICOS DO SÔRO E P LA S M A

D E P A R T A M E N T O D E P A T O L O G I A E C L I N I C A M É D I C A S (2.® C A D E I R A ) D ire to r: P ro f. D r. P a u lo de C a r v a lh o P e re ira FA TÔ R E S QUE IN F L U E M N A D E T E R M IN A Ç Ã O DOS V A L Õ R E S PR O TE IC O S DO SÔRO E P L A S M A (F A C TO R S IN F L U E N C IN G T H E D E T E R M IN A T IO N OF T H E P R O T E IC V A L U E S OF BLOOD SERU M A N D P L A S M A ) Le o n a r d o Mi r a n d a d e Ar a c j o * P ro f. A ssistente E d c a r d o H a r r y B I I i f í E L “ P a u l o de C a r v a l h o P e r e i r a ' P ro f. Assistente D o u to r P ro f. T it u la r Ca r i.o s Ed u a r d o Re i c h m a n n ' Jo s é Lu i z D ’An g e l i n o **** In stru to r M éd ic o V e te rin á rio

Vários são os processos de determinação das proteínas e suas frações como também, dos lipídeos totais do sóro e plasma sangüí­ neo; assim sendo, podemos supor que os resultados obtidos não se­ jam semelhantes. Esta disparidade pode resultar da conservação ou da qualidade da amostra (plasma ou sôro). Em se tratando, especificamente do plasma, as variações observadas podem depen­ der do anticoagulante empregado. A fo ra isto, temos variações de­ vidas aos métodos ou técnicas empregadas nos doseamentos.

Em vista disto julgamos ser chegado o momento de se estabe­ lecerem normas que padronizem o material e os métodos usados nas análises bioquímicas dos constituintes orgânicos, devendo de­ terminar fatores que permitam a comparabilidade dos resultados obtidos pelos diferentes métodos.

Ho w e (1921) padroniza o fracionamento protéico sangüíneo

substituindo, definitivamente o uso de sulfato de amónia pelo sulfa­ to de sódio, tendo seus resultados confirmados por Re i n e k” e col.

(1939).

• Assistente de P a to lo g ia e C lín ica M éd ic a s de R u m in an te s da F a c u ld a d e de M edicin a V e te rin á r ia e Zootecn ia d a U SP.

** P ro f. A ssistente D ou to r de P a to lo g ia e C lín ica M éd ic a s de R u m in an te s d a F a ­ culdade de M ed icin a V e te rin á r ia e Z ootecn ia d a U SP.

« • « P ro f. T it u la r de P a to lo g ia e C lin ica M éd ic a s de R um in an te s da F a c u ld a d e de M ed icin a V e te rin á ria e Z o o tecn ia d a U S P .

510 Rev. Fac. Med. Vet. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2, 1970

T a y l c r o K e y s

(1943)

fa z e n d o um estu do c o m p a r a tiv o do fr a -

c io n a m e n to p r o te ic o do sô ro p o r m e io s e le t r o fo r é tic o s e pelo su lfa ­ to de sódio, v e r ific a r a m qu e o so b re n a d a n les a p re sen ta 5 ,2 'y m ais

d e n itr o g ê n io d o q u e a in d ica d a p ela a n á lise elet r o fo r é tic a . P e t e r -

m a n n e col.

(1947)

c o n firm a m êstes resu ltados, o b serva n d o qu e o

t e o r d e a lb u m in a nas d o sa gen s fe ita s p elo m é to d o de H o w e é m a io r d o q u e a q u êle o b tid o pela e le tr o fo r e s e , pois, p elo fr a c io n a m e n to sa­

lin o, a fr a ç ã o a lb u m in a pode in c lu ir as fr a ç õ e s a lfa 1 e a lfa 2 glo -

bulinas.

M a jg o r (1947) observa não haver equivalências no fraciona­ mento salino e eletroforético, a não ser quando se faz a precipita­ ção das globulinas com solução de sulfato de sódio a 26,8

g (

<.

G o r n a l l e col.

(1949)

a d a p ta m a re a ç ã o do b iu re to p a ra e s ti­

m a r as fr a ç õ e s p r o lé ic a s do s ô ro sep ara d a s p elo m é to d o de H o w e

m o d ific a d o p o r KiN G SLEY

(1942)

no q u al as g lo b u lin a s são p r e c i­

p ita d a s p o r u m a solu çã o de s u lfa to d e só d io a 22,6 g ' t ou pelo

s u lfito de sód io a

21,0

g ' r . P o n s

Muzzo (1951),

acon selh a uma

m o d ific a ç ã o d o m é to d o de G o r n a l l e co l,

(1949)

a u m en tan d o a

c o n c e n tra ç ã o d e s u lfito d e só d io p a ra

26,9

g'/r,

pois J a g e r e col.

(1950)

e P o p p e r e col.

(1950)

e n c o n tra r a m v a lo r e s d e albu m in a sem elh a n tes a os o b tid o s pela e le tr o fo r e s e .

Os efeitos de conservação do sôro sangüíneo para posteriores dosagens de proteínas, foram estudados per Gc r n a l l e col. (1949), Ko p p e En g i.e r t (1961), We h m e y e r (1954) e Bir g e l e cols. (1963 64), não tendo sido salientados óbices a esta conservação du­ rante 7 dias em geladeira.

A in te r fe r ê n c ia d e o u tro s fa t o r e s na d o sa gem d e p ro teín a s nos

líq u id o s o rg â n ic o s te m sido pou co estudada. G o r n a l l e col.

(1949)

sa lien ta m qu.e o íon a m ó n io é f a t o r de d istú rb io na rea çã o d o b iru e to , não a co n selh a n d o p o r isso o uso d e o x a la to de a m ó n io c o m o a n tico a g u la n te.

Go r n a l l e col. (1949) fazendo a separação das globulinas pre­ cipitadas da fração líquida contendo a albumina pelo uso de éter sulfúrico, dizem introduzir no resultado um êrro de 3 f f devido a di­ luição da albumina. Visando eliminar esta causa de êrro Ba c il a e col. (1962) recomendam a separação das frações protéicas através filtração com papel de filtro Whatmann 42.

Tendo em vista a deficiência do conhecimento dos inúmeros fatores que interferem nas dosagens bioquímicas de constituintes do sangue de ruminantes, estudam-se no presente trabalho, a influên­

cia da qualidade das amostras sangüíneas (sôro ou plasma) como também a interferência dos anticoagulantes nas determinações de proteínas e lipídeos totais: é feito um estudo das variações que ocorrem quando a separação das globulinas precipitadas se faz

Rev. Kac. Med. Vet. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2, 1970 511

pela adição de éter sulfúrico ou pela filtração em papel Whatmann 42; além disto, compara-se o resultado obtido para a fração albu­ mina no sôro de caprinos, pelo método de Go r n a l l e col. (1949) com os obtidos através eletroforese.

M A T E R IA L E MÉTODOS

O presente experimento foi realizado com amostras sangüíneas dos principais ruminantes domésticos criados no Brasil (bovinos, ovinos e caprinos).

Visando verifica r a influência dos anticoagulantes sôbre algu­ mas dosagens realizadas no plasma sangüíneo colheu-se o sangue por punctura da jugular, sendo o mesmo recebido em frascos con­ tendo os seguintes anticoagulantes: etileno diamina tetracética di- -sódico (E D T A ) (1 mg do sal para 1 ml de sangue); oxalato de sódio (1,5 mg do sal a 1,5% para 1 ml de sangue). Êste anticoa­ gulante, em outro grupo de amostras, foi utilizado na mesma pro­ porção, após evaporar-se a água de dissolução; oxalato de potássio

(2 mg do sal por ml de sangue); citrato de sódio (7,6 mg do sal para 1 ml de sangue) ; mistura de H eller e Paul, como recomenda Kr a c k e (1934), na proporção de 2,4 mg de oxalato de amónio e 1,6 mg de oxalato de potássio para 1 ml de sangue.

Para obtenção do sôro, o sangue era colhido utilizando-se a técnica usual, e a separação feita após a ocorrência de retração de coágulo.

Nas amostras obtidas fez-se a determinação de seus teôres de proteína total, albumina, globulinas e cálculo da relação albumi­ na globulinas através o método de Go r n a l l, já utilizado por Bir g e l (1967). A dosagem de gama globulina foi realizada pelo método de Fr a t t i n i, já utilizado por Bir g e l (1967). Os lipídeos totais fo ­ ram determinados através o método de Ku n k e l e col., já utilizado por Ar a ú j o (1967).

Para evidenciar-se a influência da concentração da solução pré­ cipitante das globulinas no fracionamento salino das proteínas, fez- -se a precipitação desta fração protéica usando-se soluções de sulfi­ to de sódio a 21, 24 e 27 g% e sulfato de sódio a 22,6 g '/ .

Procurando verificar a influência do método de separação das globulinas fez-se esta separação ou pela edição de 3ml de éter sul­ fúrico e centrifugação ou através filtração em papel de filtro W h at­ mann 42. Fazendo-se a determinação da albumina no primeiro têrço filtrado e na porção final dêste filtrado, observou-se o poder de retenção protéica do papel de filtro. Considerou-se para cálculo de proporcionalidade, o resultado obtido na fração final do filtrado como 100%.

612 Rev. Fac. Med. Vet. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2, 1970

A comparação dos resultados obtidos por eletroforese do sôro sangüíneo de caprinos, feita em papel de filtro Whatmann n" 1, em aparelho Elphor, utilizando-se tampão de veronal acetato de p H 8,6 e fôrça iônica 0,08, seguindo, em linhas gerais, o método de Gr a s s m a n e Ha n n i n g (1954), serviu de base para comparar os re­ sultados da albumina e gamaglobulina, obtidos nas mesmas amos­ tras, respectivamente pelo método de Go r n a l l e col. e Fr a t t i n i, como recomenda Bir g e l (1967).

R E SU LTA D O S

Nas diferentes tabelas apresentadas, comparam-se os teôres lipoprotéicos obtidos através fracionamento salino ou eletroforético no sôro e em plasma sangüíneo de ruminantes.

D I S C U S S Ã O

A influência do uso de anticoagulantes nas amostras sangüí­ neas destinadas a dosagem das proteínas plasmáticas foi salientada por Go r n a l l e cols. (1949). Pelo delineamento proposto a esta pesquisa, reafirma-se a observação dos citados autores, verificando que o teôr de proteínas do sôro se identifica àquêle do plasma obti­ do de amostras contendo oxalato de sódio (sêco) e E D TA .

O maior valor obtido no plasma se deve evidentemente ao seu conteúdo em fibrinogênio. A taxa de proteína total foi menor nas amostras colhidas com anticoagulantes líquidos, apesar da corre­ ção de volume e diluição estabelecida. A diferença observada nas amostras em que se usou o anticoagulante de He l l e r e Pa u l, se deve provàvelmente ao íon amónio, como já salientou Go r n a l l e col. (1949), que interfere na reação de biureto.

Os teôres de albumina no plasma, qualquer que seja o anticoa­ gulante empregado, são menores do que os observados no respec­ tivo sôro; a única explicação que se tem para êste fato se liga a al­ terações da precipitação das frações protéicas pelas soluções sali­ nas empregadas.

A fração globulina, por ser obtida no método de Go r n a l l e col. (1949) por método indireto, não serve para considerações mais profundas, e as variações dos resultados obtidos se relaciona ao que já salientamos para proteína total e albumina.

Os resultados obtidos nas dosagens de lipídeos totais e gama globulina, no plasma sangüíneo de ruminantes foram maiores do que aquêles observados no sôro. O fato, para lipídeos totais, já foi salientado por Bi r g e l e col. (1964) porém não evidenciado ain­ da para a fração gama globulina. A diferença observada de

for-T A B E L A I — In flu ê n c ia dos a n tic o a g u la n te s s ô b re os t e ô r e s d e p r o t e ín a t o ta l (e m g p o r 100 m l) d o p la s m a d e ru m in a n te s ( V a l o r o b tid o no s ô ro fo i c o n s id e ra d o 1 0 0 % ). P L A S M A 0 E spécie A n im a l Sôro E d ta O x a la to de sódio líqu ido O x a la to de sód io sêco O x a la to de potássio liquido Líq u id o de H e lle r e P a u l C itra to de sódio M edia 7,46 7.03 7.36 7,53 7.43 7.1 — 7.9 7,16 > o V ariaçfto 6,9 — 8,1 7,2 — S.O 7.0 7,7 7,1 — 8,1 7,1 — 7.7 7.63 6,6 — 7,9 /O 100 102.3 98,6 100,9 99,6 102,3 95,9 1 V 3 M éd ia 5,86 6,06 5,76 6,06 5,70 6.16 5,40 * u ' ; S V a ria ç ã o 4.6 — 7.2 4,7 — 7.3 4.0 — (i.7 4.9 — 7,0 4.7 — 7,3 4.6 — 7,3 2.9 — 7,3 CJ • * i % 100 103.4 98,2 103,4 97.2 105,1 92,1 M édia 6.6 6,46 5,73 6,36 6,43 6.8 5,73 Q V a ria ç ã o 6,0 — 7.0 6,3 — 6,7 5,4 — 6,3 6.2 — 6.6 6.1 — 6.8 6.2 — 7,6 5,2 — 6.0 /O 100 97.S 86,8 96,4 97,5 103.0 86,8 M édia 6.64 6,72 6,28 6,65 6.50 6,86 6,09 ‘O V a ria ç ã o 4,6 — 8,1 4,7 — 8,0 4.0 — 7,7 4,9 — 8,1 4.7 — 7,7 4,6 — 7.9 2,9 — 7,9 % 100 101,2 94,5 100.1 97,9 103,3 91,7 * Q u a n d o se usou a n tic o a g u la n te em s o lu ç ã o , a t a x a p r o t é le a e n c o n t r a d a fo i c o r r ig id a p r o p o r c io n a lm e n te . R ev. Fac. M o d . V et . S . P a u lo — Vol. 8 fa s e . 2, 19 70 5 1 3

TABELA II — Influência dos anticoagulantes sóbre os teores de albumina (em g por 100 mi) do plasma de ruminantes (Valor obtido no sôro foi considerado 100%).

* Quando se usou anticoagulante em solução, a taxa proteica encontrada foi corrigida proporcionalmente.

51 4 Rev. F a e . M e d . Vet. S . P a u lo — Vo!. 8 fa s e . 2, 1 0 7 0 P L A S M A * Espécie A n im a l Sôro E d ta O x a la to de sódio liqu ido O x a la to de sódio sêeo O x a la t o de Po tássio liqu id o L iq u id o de H e lle r e P a u l C itra to de sódio M éd ia 2.53 2,33 2,3 2,3 2,27 2,7 1,87 C V a ria ç ã o 3.8 — 3,0 1,6 — 2.9 1,4 — 3,1 1.8 — 2,8 1,5 — 3,0 1.7 — 2.9 1,6 — 2,6 O % 100 92,9 90,1 90.9 89,7 106,7 72,1 « M éd ia 3.03 2,66 3,23 2.76 3.2 2,77 2,8 V a r ia ç ã o 2,1 — 4.0 1,3 — 3,8 2,8 — 3,9 1.6 — 4,0 2.8 — 3,8 1,6 — 4,0 1,6 — 3,8

u

% 100 87,8 106,5 91,1 105,2 91,4 90,2 ctf > M édia 3.6 2,93 2.66 2.96 2,87 3.07 2,53 V a ria ç ã o 3,3 — 4,0 2.5 — 3.2 2,2 3.0 2.5 — 3,4 2,3 — 3,2 2,5 — 3,5 1,9 — 3.2 0 % 100 81*4 73,9 82,2 79,7 85,2 70,2 M édia 3,05 2.64 2,73 2.6S 2,7S 2.84 2,40 cS — !? *■* V a ria ç ã o 1,8 — 4,0 1,3 — 3,8 1,4 — 3.9 1,6 — 4,0 1,5 — 3,8 1,6 — 4,0 1.6 — 3,8 2 ä % 100 86,5 89,4 87,9 91,1 93,1 78,6

T A B E L A I I I — In flu ê n c ia d os a n tic o a g u la n te s s ô b re os t e ô r e s d e g lo b u lin a s (e m g 100 m l ) d o p la s m a d e ru m in a n te s ( V a l o r o b tid o n o s ô ro fo i c o n s id e ra d o 1 0 0 % ). P L A S M A * Espécie A n im a l Sôro E d ta O x a la to de sódio líqu id o O x a la to de sódio sêco O x a la to de P otássio liqu ido L iq u id o de H e lle r e P a u l C itra to de sódio B o v in a M éd ia V a ria ç ã o % 4,9 4,4 — 5,3 100 5,3 4,8 — 5,6 108,1 5,1 4,3 — 5,6 104,0 5.2 4,6 — 5,8 106,1 5,2 4,7 — 5,2 106,1 5.3 5,0 — 5,4 106,1 4.9 4,0 — 5,5 100 C a p r in a M éd ia V a ria ç ã o % 2,8 1,8 — 4,2 100 3,4 2,4 — 4,4 121,4 2,5 1.2 — 3,7 89,3 3,3 2.3 — 4,3 117,8 2,5 1,3 — 4,3 89,3 3,4 2,6 — 4,6 121,4 2.6 1.3 — 4,3 92,8 O v in a M édia V a ria ç ã o % 3.0 2,5 — 3,7 100 3,5 3,1 — 4,2 116,6 3,1 2,6 — 3,3 103,3 3,4 2,9 — 4,1 113,3 3,6 3.0 — 4,1 120,0 3,7 3,0 — 4,1 123,3 3,2 2,7 — 4,1 106,6 M é d ia g e r a l M éd ia V a ria ç ã o % 3,6 1,8 — 5,3 100 4,1 2,4 — 5,6 113,9 3,6 1.2 — 5.6 100,0 3,9 2,3 — 5,8 108,3 3,8 1,3 — 5,2 105,5 3,8 2,6 — 5,4 105.5 3,6 1,3 — 5,5 100,0 * Q u a n d o se usou a n t ic o a g u la n t e e m s o lu ç ã o , a t a x a p r o t é lc a e n c o n t r a d a f o i c o r r ig id a p r o p o r c io n a lm e n te . R ev. F a c . M e d . Vet. S . P a u lo — Vol . 8 fa s e . 2, 19 70 5 1 5

T A B E L A I V — In flu ê n c ia do s a n tic o a g u la n te s sô b re os t e ô r e s d e lip íd e o s (e m m g '” ) d o p la s m a d e ru m in a n te s ( V a lo r o b tid o no sô ro fo i c o n s id e ra d o lO O íí ). P L A S M A » Espécie A n im a l Sôro E d ta O x a la to de sódio líqu ido O x a la to de sódio sêco O x a la to de Po tássio liqu ide L íq u id o de H e lle r e P a u l C itra to de sódio V a ria ç ã o 413 829 846 834 798 851 610 M édia 377 — 476 791 — 856 806 — 894 789 — 857 791 _ 879 805 — 895 388 — 786 % 100 200,7 204,8 201.9 190,7 206,0 147,6 M éd ia 406 705 702 678 642 637 554 -r V a ria ç ã o 357 — 4 17 641 — 745 659 — 737 612 — 714 569 — 735 480 — 738 488 — 600 % 100 170,3 172,9 166,8 158,1 157,1 136,4 M éd ia 337 653 614 541 584 588 498 V a ria ç ã o 308 — 380 644 — 661 602 — 622 476 — 573 579 — 595 538 — 637 468 — 522 % 100 193,7 182,1 160,5 173,2 174,4 148,0 M édia 385 729 727 684 675 692 554

1 2

V a ria ç ã o 308 — 476 641 — 856 602 — S94 476 — S57 579 — 879 480 — 895 388 — 786 2 “ % 100 189,3 188,8 177,7 175,3 179,7 143,8 * Q u a n d o se usou a n t ic o a g u la n t e em s o lu ç ã o , a t a x a p r o t é ic a e n c o n t r a d a fo i c o r r ig id a p r o p o r c io n a lm e n te . 51 6 Rev. Fa c . M e d . V et. S . P a u lo - V ol . 8 fa s e . 2, 1 9 7 0

T A B E L A V — I n flu ê n c ia cios a n t ic o a g u la n t e s sô b re os t e ô r c s d e g a m a g lo b u lin a (e m g p o r 100 m l ) d o p la s m a d e ru m in a n te s ( V a l o r o b tid o no s ô ro fo i c o n s id e ra d o 1 0 0 cf i >. • Q u a n d o se usou a n t ic o a g u la n t e em s o lu ç ã o , a t a x a p r o t é ic a e n c o n tr a d a fo i c o r r ig id a p r o p o r c io n a lm e n te . Rev. F a c . M e d . Ve t. S . P a u lo Vo l. 8 fa s e . 2, 19 70 5 1 7 P L A S M A 0 O x a la to O x a la to O x a la t o L iq u id o de C itra to Espécie

g era l E dta de sódio de sódio do Potássio H e lle r e de A n im a l

liqu id '» sêeo liquido P a u l sódio

2,00 1.57 2,17 1.97 2.37 2.07 2.23 c V a ria ç ã o 1,8 2.1 1,8 — 2.0 2.1 — 2,3 1,8 — 2,1 1.9 — 2,2 1.9 — 2,2 2.0 — 2.5 c*0 100 78,5 108,5 98,5 118,5 103.5 111.5 ctf M édia 1,83 1,83 2,03 1.9 1,83 2.2 1.9 T. V a ria ç ã o 1,7 — 1.9 1.7 — 1,9 2.0 — 2,1 1.9 — 1.9 1,8 — 1.9 1.9 — 2.7 1.8 2.1 U * 100 100 110.9 103,9 100 120.3 103,8 M édia 1,66 1,53 1,63 1,7 1.77 1,77 1,67 ci c _{V a ria ç ã o} 1.6 — 1,8 1.5 — 1.6 1.4 — 1.8 1,6 — 1,8 1.6 — 1.9 1.6 — 1.9 1.4 — 1,8 O % 100 92,1 98,1 102,4 106,6 106.6 100,6 M éd ia 1,83 1,65 1,98 1,86 1.99 2,01 1.93 a d •c 73 «o sl/ V a ria ç ã o 1,6 — 2.1 1.5 — 2.0 1.4 — 2.3 1,6 — 2.1 1.6 — 2,2 1.6 — 2.7 1.4 — 2.5 c/c 100 90,1 108,1 101,6 108,7 109,8 105,4

T A B E L A V I — In flu ê n c ia d as difere n tes concentrações de su lfito de sódio e s u lfa to de sódio a 22,6% sôbre os teôres de a lb u m in a (e m g por 100 m l ) do sôro de rum inantes.

Espécie A n im a l

S u lfito do Sódio 27% Su lfito de Sódio 24% S u lfito de Sódio 21% S u lfa to de Sódio 22,6%

1» F i l ­ trado 29 F i l­ trado ftter S u l­ f ú r e o l f F i l­ tra d o 2v F il­ tra d o É ter S u l­ furic o 1« F i l­ trado 2 " F il­ tra d o fite r S u l-fú r ir o 2« F i l ­ trad o É te r S u l-fú ric o M éd ia 2.0 2.2 2,1 2,3 2,6 2.4 2,3 2.4 2.2 2,5 2,7 2,5 c V a ria ç ã o 1,3-2,7 1,8-2,8 1.5-2.8 1.8-2,8 2.2-3,1 1,7-3,0 2.0-2.8 2,1-2,8 2,0-2,6 1,9-3,0 2,4-3,0 2,1-3,0 X % 90,9 100 95,4 88,4 100 92,3 95,8 100 91,6 92,5 100 92,5 M édia 2.5 2.6 2,4 3.1 3,0 3,0 3,5 3,2 3.0 3,9 3,8 3,8 b V a ria ç ã o 23-2,6 2,3-3.2 2,3-3,2 2,5-3,5 2,8-3,5 2,8-3,2 3,0-4,0 2,8-3,6 2.9-3,0 3,5-4,5 3,5-4.0 3,3-4,4 CJ _{% 96,1 100 92,3 103,3 100 100 109,3 100 93,7 102.6 100 100} cd c M éd ia 2.9 2,9 2,9 3,5 3,5 3,5 3.6 3,5 3.5 3,9 3,9 3,6 V a ria ç ã o 2,5-3,3 2.8-3.0 2,8-3,0 2,8-3,8 3,3-3,8 3,0-3,8 2,9-4,0 2,8-3,8 2.8-3,8 3,3-4,3 3,3-4,3 3,3-3,8 O % 100 100 100 100 100 100 102,2 100 100 100 100 92,3 « ,— 'S u o % M éd ia 2,5 2,6 2,5 3.0 3,0 3.0 3.1 3,0 -i.9 3,4 3,5 3,3 V a ria ç ã o 1,3-3,3 1,8-3.2 1,5-3,0 1,8-3,8 2,2-3,8 1,7-3,8 2,0-4,0 2,1-3,8 2.0-3 S 1,9-4,5 2,4-4.3 2,1-4,4 95,6 100 95,9 97,2 100 97,4 102,4 100 Ytb.l 98,4 100 94,9 51 8 Rev. F a c . M e d . Vet. S . P a u lo — Vo l. 8 fa s e . 2, 1 9 7 0

T A B E L A V I I — I n flu ê n c ia d a s d ife r e n t e s c o n c e n tr a ç õ e s d e s u lfit o d e s ó d io e d o s u lfa t o d e só d io a 22,6% só b re os t e ô r e s d e g lo b u -lin a s (e m g p o r 100 m l) d o s ô ro d e ru m in a n te s .

Espécie

Animal

Sulfito de Sódio 27%

Sulfito de Sódio 24%

Sulfito de Sódio 21 %

Sulfato de Sódio 22,6%

1« Fil­

trado

2» Fil-

trado

_furloo

f 7

u "

1« Fil­

trado

„

Éter

2» Fil-

„ ,

.

j

Sul_

trado

_furico

.. .

1« Fil­

trado

2v Fil­

trado

Êter

Sul-fúrieo

1* Fil­

trado

2> Fil­

trado

Êter

Sul-fúrico

a

o

ffl

Média

Variação

%

5.7

5,2-6,3

106,3

5,5

5,5

5,1-5,8 5,1-6,1

100

100

5,4

4,8-5,9

108,0

5,0

5.2

4,5-5,5 4,6-6,0

100

104,0

4,7

4,2-5,0

102,1

4,6

4,2-5,0

100

4,8

4,4-5,0

104,3

4,6

3.6-5.2

109.5

4,2

3.4-4,9

100

4,5

3,6-5,0

107.1

d

Média

3,3

3,1

3,3

3,1

3,2

3,3

2,6

2,7

3,1

2,7

2,9

2.8

B

_n

a

_cd

Variação

3.0-3.9 2,1-3,9 3,0-3,9

2,8-3,8 2,5-4,3 2,5-4,2 2,2-3,2 2,5-3,1 2,4-3,7

2,4-3,3 2,5-3,3 2,5-3,5

U

%

106,4

100

106,4

96,8

100

103,1

96,2

100

114,8

93,1

100

96,5

Média

3,0

3,0

3,0

2,6

2,5

2,5

2.5

2,6

2.6

1.9

1.9

1,8

c

_Variação

_{2,8-3,1 2,8-3,1 2,8-3,1}

_{2,3-3,0 1,8-3,0 í 2,3-3,0}

1

2,3-2,6 2,5-2,6 2,5-2,6

1,8-2,0 1.5-2,3 2,0-2,5

°

_%

₁₀₀

₁₀₀

₁₀₀

104

100 i 100

96.1

100

100

100

100

94,7

Média

4,0

3,9

3,9

3,7

3,6

3,7

3,3

3,3

3,5

3.1

3,0

3,0

cã —

3 2

<1 o

Variação

3,0-5,7 3,0-5,5 3,0-5,5 2.6-5,4 2,5-5,0 2,5-5,2 2,5-4,7 2.6-4,6 2.6-4.8

1,9-4,6 1,9-4,2 1,9-442

S M

%

104,2

100

103,1

102,9

100

102,4

98,1

100

106.4

100,9

100

99,4

Rev. F a c . M e d . Vet. S . P a u lo — Vo l. 8 fa s e . 2, 19 70 5 1 9

520 Rev. Fac. Med. Vet. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2, 1970

T A B E L A V I U — T e ô re s de a lb u m in a e g a m a g lo b u lin a (em g por 100 m l ) o btidas por electroforese, c o m p aran d o -se os v a lo re s obtidos com os m éto­ dos de G o rn a ll e F ra ttln i, em 30 am ostras. A m o stra n» a l b u m i n a g % G A M A G L O B U L I N A g % E le ctro fo re se G o rn al e cols. S u lfito a 27 cc E lectroforese F rattin i = = _ = 1 1.61 1,4 2,78 1.7 2 2.25 2,0 2,25 1.4 3 1.86 1.8 2,72 1.6 4 2.24 1,9 2,61 1.7 5 1.98 2,2 2.09 1,4 6 2.96 3.0 1,69 1,1 7 1,95 1,6 2.78 1.6 S 1.82 1,4 2,41 1,6 9 2.31 2.0 2,38 1,4 10 2,00 1,8 3,32 1.6 11 1,94 1,9 2,72 1,6 12 1,70 1.4 3.90 2.2 13 2.49 2,3 2,18 1.2 14 1.59 1,1 3,81 1,9 15 1,18 1,8 3,78 2,0 16 2.13 1,!) 2,82 1.4 17 1,68 1,4 2,27 1,5 18 2.12 2,0 4,83 2,0 19 2.26 2,1 3,87 1,9 20 1,92 1,7 5,54 1.9 21 1.97 1,8 5,0(5 2.0 22 2.07 2,0 2,99 1.7 23 2.07 1.6 4,40 1.9 24 2.16 1.9 4,48 2.3 25 2.32 2.2 3,02 1.9 26 1,89 1.6 4.61 2.2 27 1,62 1,6 3,41 2.0 28 2.22 1.5 4.63 2.4 25) 1.72 1,5 4,90 2.2 30 1.89 1,9 4,66 M édia 1,96 1.81 3,43 1.62 V a ria ç ã o 1,18-2,96 1.1-2,2 1,69-5,54 1.1-2,4 D ife re n ç a a b so lu ta — 0,15 — 1.81 E m % — 7,65% — 52.77%

Rev. Fac. Med. Vet. S. Paulo Vol. 8 fase. 2. 1970 521

ma mais acentuada para os lipídeos totais talvez se relacione a modificações de turvação determinadas pelos anticoagulantes. Sen­ do os métodos de Ku n k e l e col e Fr a t t i n i, métodos turbidimétri- cos, qualquer modificação na turvação dos elementos citados pode alterar de forma variável os resultados obtidos.

Go r n a l l e cols. (1949), quando estabeleceram seu método de fraeionamento e doseamento de proteínas sangüíneas, salientaram a importância do método de separação das globulinas para a deter­ minação da albumina e evidenciaram que a separação pelo éter sulfúrico introduz êrro de 3 f/í no processo, devido a diluição da albumina.

Pelo planejamento proposto a êste experimento poude-se v eri­ ficar que qualquer que seja a solução salina usada, e independente­ mente da sua concentração, os resultados obtidos no filtrado inicial, que contém a fração albumina ou na amostra separada pelo éter sulfúrico, são 2 a 5'}'< menores do que o obtido no filtrado final.

O m e n o r t e ô r de a lb u m in a o b tid o na a m o s tra cu ja s g lo b u lin a s

fo r a m sep ara d a s pelo é t e r s u lfú ric o , é cau sada p o r dilu içã o , co m o

já sa lien tou Go r n a l l e col. (1 9 4 9 ). A m e n o r t a x a o b s e rv a d a no

filtr a d o in icia l, p r o v à v e lm e n te se d e v e a n ão s a tu ra çã o rá p id a do papel de filt r o W h a tm a n n 42, d e m o d o q u e p a rte da a lb u m in a é r e ­ tid a pelo m esm o e só a p a r t ir d e sua sa tu ra çã o, o b tid a após f ilt r a r a p ro x im a d a m e n te 5 m l, d e ix a r á d e r e t e r esta fr a ç ã o p ro té ic a .

Ta y l o r e Ke y s (1943), Pe t e r m a n n e col. (1947), Ma j o o r (1947), já evidenciaram diserepâncias observadas entre os resulta­ dos obtidos no fraeionamento eletroforético e salino das proteínas. Devido a êste fato Ma j o o r (1947), Ja g e r e col. (1950) e Po p p e r e col. (1950), recomendam a precipitação das globulinas com solu­ ções salinas a 26,8 g'/t. Pelo que evidenciaram os autores cita­ dos, podemos deduzir que a comparabilidade dos resultados obtidos no fraeionamento protéico, só poderá ser feita se estabelecida defi­ nitivamente a influência da concentração dos precipitantes. O sul­ fito de sódio a 27 g rí, determina precipitação intensa das globulinas e os resultados assim obtidos foram 13% menores do que aquêles verificados nas frações precipitadas com êstes sal em concentra­ ções mais baixas, a 21 e 24 g% .

Quando se faz a precipitação das globulinas com o sulfato de sódio a 22,6r; , a diferença é mais evidente; o resultado da fração de albumina assim obtida é aproximadamente 24% maior do que o verificado quando a precipitação é feita com o sulfito de sódio a 27 g r/ (. Êste maior resultado, obtido a partir da precipitação com sulfato de sódio, segundo Ma j o o r (1947) se deve a inclusão das frações alfa, e alfa2 globulinas na fração albumina.

Evidentemente, no doseamento das globulinas precipitadas por soluções salinas em diferentes concentrações, os resultados foram

522 Rev. Fae. Med. Vet. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2. 1970

inversos, obtendo-se maiores teôres nas frações precipitadas com soluções mais concentradas.

Uma vez estabelecido que para dosagem da fração albumina do sôro sangüíneo de ruminantes, deve-se precipitar as globulinas com soluções de sulfito de sódio a 27%, comparamos os resultados assim obtidos para a fração albumina pelo fracionamento salino com os verificados pelo fracionamento do sôro sangüíneo de capri­ nos. Os resultados foram comparáveis, sendo no fracionamento eletroforético 7,65% maiores do que os obtidos através meios quí­ micos. Os resultados são semelhantes aos obtidos por Ma.joor (1947), Ja g e r e col. (1950) e Po p p e r e col. (1950), em outras es­ pécies.

Os valores obtidos pelo método turbidimétrico de Fr a t t i n i para os teôres de gama globulina do sôro de caprinos, não podem ser comparados àqueles obtidos pela eletroforese, pois êstes são 52,77% maiores do que aquêles obtidos pelo método turbidimétri­ co.

CONCLUSÕES

Osresultados obtidos para as diferentes frações protéicas do sangue de ruminantes e as comparações efetuadas entre a influên­ cia do uso de diferentes anticoagulantes nos permitem as seguintes conclusões:

1 — O teôr de proteínas séricas é idêntico àquêle do plasma obti­ do de amostras contendo oxalato de sódio (sêco) e o E D TA.

2 — A taxa de proteína total foi menor nas amostras colhidas com anticoagulantes líquidos, apesar da correção de volume e da diluição estabelecida.

3 — A diferença observada nas amostras em que se usou o anti-coagulante de He l l e r e Pa u l, provàvelmente é devida ao uso do oxalato de amónio, pois como salienta Go r n a l l e col. (1949) o íon amónio é fator de distúrbio na reação do biureto.

4 — Os teôres de albumina plasmática, qualquer que seja o anti-coagulante empregado, são menores do que os teôres séri- cos, talvez isto aconteça devido a alterações da precipitação das frações protéicas pelas soluções salinas empregadas.

5 — Os resultados obtidos nas dosagens de lipídeos totais e gama globulina no plasma sangüíneo de ruminantes foram maio­

Rev. Fae. Med. Vot. S. Paulo - Vol. 8 fase. 2, 1970 523

6 — Qualquer que seja a solução salina usada, e independente­ mente da sua concentração, os resultados obtidos no filtrado inicial, que contém a fração albumina ou na amostra sepa­ rada pelo éter sulfúrico, são 2 a 5% menores do que o obtido no filtrado final.

7 — O sulfito de sódio a 27 g%;, determina precipitação intensa das globulinas e os resultados obtidos foram 13% menores do que aqueles verificados nas frações precipitadas com êste sal em concentrações baixas, a 21 e 24 g% .

8 — N a precipitação das globulinas pelo sulfato de sódio a 22,6 g% a fração albumina é aproximadamente 24% m aior do que aquela obtida quando a precipitação é feita com o sul­ fito de sódio a 27% ; logicamente os resultados para as glo­ bulinas serão inversos, sendo maiores os teõres nas frações precipitadas com soluções mais concentradas.

9 — O fracionamento eletroforético permite a obtenção de um teôr protéico 7,65% m aior do que o obtido pelo fraciona­ mento salino.

10 — O fra c io n a m e n to e le t r o fo r é t ic o a p re sen ta te õ re s de ga m a glo b u lin a 52,77% m a io r do qu e o o b tid o p elo m é to d o tu rb i-

d im é tr ic o d e Fr a t t i n i, sendo p o rta n to p r e fe r ív e l p a ra essa

d osagem .

RESUM O

Os A A estudam a influência de anticoagulantes nas amostras sangüíneas para a dosagem das proteínas plasmáticas e suas fra ­ ções, usando oxalato de sódio em solução e sêco, oxalato de potás­ sio em solução, líquido de He l l e r e Pa u l, citrato de sódio e etileno diamina tetracética di-sódico (E D T A ).

Estudam a influência dos mesmos anticoagulantes na determ i­ nação dos teõres de lipídeos totais e gama globulina.

É focalizada a influência das diferentes concentrações de sul­ fito de sódio e sulfato de sódio usadas no fracionamento das pro­ teínas, assim como a separação das globulinas nas concentrações de 21% , 24% e 27%. e sulfato de sódio a 22,6%.

Comparam os resultados obtidos na dosagem de albumina fe i­ ta por eletroforese e pelo método de Go r n a l l e col., assim como a dosagem de gama globulina obtida pela eletroforese e pelo método turbidimétrico de Fr a t t i n i.

Apresentam 8 tabelas com os resultados de suas observações, discutem êsses resultados e apresentam suas conclusões.

524 Rev. Fac. Med. Vel. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2, 1970

A G R A D E C IM E N T O S

Agradecemos aos Profs. Drs. Sylvio F erri e Luiz Octávio Me­ deiros, da Disciplina de Histologia e Em briologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da U sP, pela valiosa colaboração nas dosagens de proteínas e suas frações através o método eletro- forético em papel.

S U M M A R Y

The authors study the influence of anticoagulants in blood samples taken fo r dosage o f plasmatic proteins and their fractions, using sodium oxalate, in dry form and in solution, potassium oxa­ late in solution, He l l e r and Pa u l’s liquid, sodium citrate and E D TA .

They study the influence of the same anticoagulants listed abo­ ve in the determination o f the total lipidic content and gamma-glo- bulin.

The influence o f different concentrations o f sodium sulphite and sodium sulphate used in the fractionization of proteins in em­ phasized, as well as the separation o f globulins by filtration or by sulphuric ehter. The authors used sodium sulphite in the concen­ trations of 2 1 /r, 24%, 27% and sodium sulphate at 22,6%.

They compare the results obtained in the dosage of albumin done by electrophoresis and by the method o f Go r n a l l et al., as well as the dosage o f gamma-globulin obtained by electrophoresis and by the Fr a t t i n i’s trubidimetric method.

The authors present 8 tables with the results of their observa­ tions, discuss these results and present their conclusions.

R E F E R fiN C IA S B IB L IO G R Á F IC A S

ARAUJO, L. M. — Contribuição à hematologia dos caprinos ( Capra hire us), criados no Estado de São Paulo. Determinação dos teôres séricos de lipí­ deos totais em caprinos normais. Influências de fatores raciais, alimen­ tares, etários e sexuais. Tese (M . S.) Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo. 1967.

B A C IL A , M. e col. — Técnicas atualizadas de bioquímica clinica. Curitiba., Conselho de Pesquisas da Universidade do Paraná, 1962.

B1RGEL, E. H.; P E R E IR A . P. C. & LA M O U N IE R , R. D. — Notas sôbre a conservação de plasma e sôro de bovinos para posterior dosagem de pro­ teína total, albumina, globulinas e cálculo da relação albumina/globulinas.

Rev. Fac. Med. vet., S. Paulo, 7:264-287, 1963/64.

B1RGEL, E. H.; P E R E IR A , P. C.; A M A R A L . V. & M O RAES BARROS, H. Diferenças observadas entre a taxa de lipídeos totais do plasrria e do sôro de bovinos. A rq. Inst. biol., S. Paulo, 32:17-20, 1964.

Rev. Fac. Med. Vet. S. Paulo — Vol. 8 fase. 2, 1970 525

B IRG EL, E. H. — Contribuição ã hematologia de caprinos ( Capra hircus), criados no Estado do São Paulo. Determinação dos teôres de proteínas séricas e plasmáticas em cabras normais. Influências de fatores raciais, alimentares e etários. Tese (M . S.), Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo, 1967.

G O RN ALL, A. G.; B AR D A W IL L , C. J. & D AVID . M. M. — Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. biol. Chem. 117:751-761, 1949.

GRASSM ANN. W. & H A N N IN G , K. — In Cramer, F., editor: Paper chroma­ tography. N ew York, The Macmillan Company, 1954.

HOWE, P. E. The use of Sodium Sulfate as the Globulin Precipitant in the determination o f Protein in Blood. J. biol. Chem,., //.9:93-107, 1921. HOW E, P. E. — The determination o f protein in blood. A micro method.

J. biol. Client., b9:109-113, 1921.

JAGER e col. — J. Lab. Clin. Med., 35:76, 1950 — cit. PO N S MUZZO, J. — 1951.

K IN G S LE Y , G. R. — J. Lab. Clin. Med., 27:840, 1942 — cit. G O R N A LL. A. G.; B A R D A W IL L , C. J. & D A V ID . M. M „ 1949.

K O PP, Chi. & E N G L E R T , H. K. — Die Proteinfraktionen des Rinder — und Schweineserums in Abhängigkeit von Entnahmezeit und Aufbewahrungs­ temperatur. Rerl. Münch, tierärztl. Wschr., Berlin, 7/t (4) :61-64, 1961. KR Ä C K E R , R. — Doenças do sangue e atlas de hematologia. Rio de Janeiro,

Editora Guanabara, 1943.

MAJOOR, C. L. H. — The possibility of detecting individual proteins in blood serum by diferentiation o f solubility curves in concentrate sodium sulfate solutions. II. Comparison of solubility curves with results o f electro­ phoresis experiments. J. biol. Chem. /69:583-594, 1947.

P E T E R M A N N , M. L.; YOUNG. V. F. & HOGNESS, K. R. — A comparison of the H owe and the electrophoretic methods for the determination of plas­ ma albumin. biol. Chem. /6.9:379-387, 1947.

PONS MUZZO, J. — Las proteinas del suero en los animales domésticos. II. Proteinem ia del carnero, caballo y perro. Rev. Fac. Med. vet., Lima, 6:171-183, 1951.

P O P P E R e col. — Am. J. Clin. Path., 20:530. 1950 — cit. PO N S MUZZO, J. — 1951.

R E IN E K E , E. P.; P E TE R S O N , V. E. & TU R N E R , C. W. — The partition of the serum globulins of the dairy goat. J. biol. Chem. 128(l ) : l - 7 , 1939. TA Y LO R , H. L. & KEYS, A. - Fractionation of normal serum proteins by the

electrophoretic and sodium sulfate methods. J. biol. Chem., U S :379-381, 1943.

W E H M E Y E R , P. — Concentration of Plasma Proteins in the Ox: I. individual diferences. Nord. Vet. Med., 6:717-736, 1954.