Alta velocidade de aquisição de
dados e alto desempenho quantitativo
na determinação simultânea de
micotoxinas, corantes ilegais e
pesticidas em especiarias
Nota de aplicação
Autores
Mark Sartain, Thomas Glauner, Behrooz Zekavat e Anabel Fandino
Alimentos
Introdução
As especiarias são utilizadas desde a antiguidade para aromatizar e colorir alimentos. Há muitos alertas de países da Europa sobre a segurança das especiarias em relação a diferentes grupos de contaminantes, o que aumentou a necessidade de realizar screening simultâneo e a quantificação de pesticidas, micotoxinas e corantes usando um método multirresíduo simples. Os principais desafios são as matrizes complexas, o grande número de analitos, a diversidade de classes de compostos e a faixa de concentração que deve ser coberta na análise.
Esta nota de aplicação avalia um espectrômetro de massas triplo quadrupolo com funil de íons operado com MRM dinâmico e mudança de polaridade rápida para quantificar com precisão um amplo conjunto de analitos em nível de traços. Também avaliamos um software e um firmware modificado para otimizar os tempos de atraso entre MRM, permitindo dados de alta qualidade em tempos de espera menores que 0,5 ms. A sensibilidade extraordinária obtida usando o LC/MS triplo quadrupolo Agilent 6495B permite quantificar com exatidão e precisão pesticidas, micotoxinas e corantes com altos graus de diluição da amostra, permitindo a redução de efeitos da matriz e o aumento da robustez do método.
Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA, EUA
Parte experimental
Preparo de amostras
A pimenta-do-reino e a páprica foram compradas em uma mercearia local e extraídas de acordo com o protocolo QuEChERS EN 15662 usando kits QuEChERS Agilent BondElut (p/n 5982-6650). Os extratos foram limpados com o kit de Remoção avançada de matriz Agilent—Lipídios dSPE QuEChERS (p/n 5982-1010), seguida de uma etapa de polimento (p/n 5982-0102). Os extratos finais foram adicionados a 2 ppb (10 µg/kg) com a mistura abrangente de pesticidas Agilent (p/n 5190-0551) e padrões de micotoxinas e corantes. Os extratos adicionados foram diluídos a 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 com acetonitrila.Design do método
O Software Agilent MassHunter Optimizer foi usado para otimizar as transições MRM de cinco micotoxinas e nove corantes. Pelo menos duas transições MRM por composto e as condições de MS correspondentes também foram retiradas do Kit de aplicação de LC/MS MRM triggered de pesticidas Agilent. A análise foi realizada com ionização eletrospray positiva e negativa em MRM dinâmico (dMRM) ou tMRM em uma única corrida analítica. Os principais parâmetros de UHPLC e dMRM MS são mostrados na tabela de condições do instrumento
Resultados e discussão
Avaliação de tempos de atraso
otimizados entre MRM
Um método MRM foi desenvolvido visando a 100 transições representando 53 pesticidas para avaliar um software e firmware modificado que otimiza os tempos de atraso entre MRM. A Figura 1 mostra os cromatogramas de MRM sobrepostos de dois pesticidas em quatro tempos de espera diferentes, demonstrando a importância de usar tempos de atraso entre MRM corretos para manter o sinal de íons em tempo de espera curtos.
Sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity II
Coluna Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2,1 × 150 mm, 1,8 µm
(p/n 959759-902)
Temperatura da coluna 40 °C
Volume de injeção 2 μL
Fase móvel A) Formiato de amônio 5 mM + ácido fórmico 0,1 %
B) Formiato de amônio 5 mM + ácido fórmico 0,1% em metanol
Vazão 0,4 mL/min
Gradiente 95 %A espera de 0,5 minuto, a 40 %B em 3,5 minutos, a 98 %B em 17
minutos, espera de 3 minutos, menos de 5 %B em 0,1 minuto Espera de 0,9 minuto, desligamento em 21 minutos Tempo posterior de 2 minutos
Espectrômetros de massas triplo quadrupolo Agilent 6495B
Fonte de íons Agilent Jet Stream ESI
Polaridade Comutação positiva a negativa
Temperatura do gás 120 °C
Gás de secagem (nitrogênio) 17 L/min
Gás nebulizador (nitrogênio) 30 psi
Gás de impulsão (nitrogênio) 300 °C
Fluxo do gás de impulsão 12 L/min
Voltagem do capilar 3.500/–3.500V
Voltagem do nozzle 300/-500 V
RF de alta/baixa pressão iFunnel 150/60V
Tipo de varredura MRM dinâmico (dMRM)
Resolução Q1/Q2 Unidade (0,7 amu)
Delta EMV 200 V
Voltagem de aceleração da cela 3–7 V
Número total de MRMs 542 (positivo 530, negativo 12)
Figura 1. Cromatogramas de MRM sobrepostos de metobromuron e tribenuron-metil (100 ppb) em tempos de espera de 5,0, 2,0, 1,0 e 0,5 ms usando tempos de atraso otimizados entre MRM.
0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 8,6 8,7 8,8 8,9 9,0 9,1 9,2 9,3 9,4 9,5 9,6 9,7 9,8 Metobromuron Área do pico a 0,5 ms = 0,94 Área do pico a 5,0 ms 259,0 → 179,0 396,0 → 155,1 Tribenuron-metílico ─ 5,0 ms 2,0 ms 1,0 ms 0,5 ms ─ ─ ─ ×106 Co ntagen s
Tempo de aquisição (min)
Área do pico a 0,5 ms = 0,80 Área do pico a 5,0 ms
Desenvolvimento de métodos e
desempenho
Um método MRM foi desenvolvido com novas transições otimizadas para compostos de micotoxina e corantes de interesse. Em seguida, a nova transição do composto e os dados de RT observados foram usados para atualizar um método de segmentação de dMRM com mais de 250 pesticidas.
A combinação de UHPLC com um espectrômetro de massas triplo quadrupolo 6495B otimizado permitiu a quantificação da maioria dos analitos em um limite de quantificação mais baixo (LLOQ) de 10% dos seus níveis máximos de resíduo permitidos (MRLs). A precisão e a exatidão das medições foram avaliadas em 13 concentrações padrão variando de um LLOQ de 2 ppt ao limite superior de quantificação (ULOQ) de 100 ppb, e foram calculadas a partir de cinco replicatas de injeção em cada nível. A excelente precisão do ensaio (RSD% < 20 % no LLOQ e <15 % no restante dos níveis), assim como a exatidão média (80–125 % no LLOQ e 85–115 % no restante dos níveis) foram obtidas. Os coeficientes de correlação (R2) das curvas
de calibração eram maiores do que 0,99.
Figura 3. Exemplos da faixa linear e da linearidade obtida com o método dMRM final. As tabelas fornecem LLOQs e limites de detecção do instrumento (IDLs) das toxinas e dos corantes.
Figura 2. Cromatogramas de MRM sobrepostos de micotoxinas e corantes (A). Cromatogramas de MRM sobrepostos de uma mistura de 10 ppb de padrões adquiridos com o método dMRM final visando a 267 compostos totais (B). 0 2 4 6 253 Pesticidas 0,2 0,4 0,6 0,8 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 MRM A B Método dMRM final 5 Micotoxinas 9 Corantes 5 Micotoxinas 9 Corantes ×102 ×105 Co ntagen sC on ta gen s (% )
Tempo de aquisição (min) Tempo de aquisição (min)
Resposta y = 103,153461*x + 23,614258 R2 = 0,99814145 Concentration (pg/mL) 10 100 1,000 Micotoxina Aflatoxina G2 5 ppt–100 ppb
Tipo: Linear, Origem:Ignorar, Peso: 1/x
A
Pesticida monocrotofós 2 ppt–100 ppb
Tipo: Linear, Origem:Ignorar, Peso: 1/x
B 10,000 100,000 Concentração (pg/mL) 10 100 1,000 10,000 100,000 Resposta 0,0001 0,001 0,01 0,1 0,0001 0,001 0,01 0,1 y = 38,853317*x + 76,262541 R2 = 0,99779842 ×107 ×107
Micotoxina LLOQ (ppt) IDL (ppt)
Aflatoxina B1 10 3,7
Aflatoxina B2 20 2,2
Aflatoxina G1 5 2,3
Aflatoxina G2 5 2,6
Ocratoxina A 500 274,5
Corante LLOQ (ppt) IDL (ppt)
Amarelo de dimetilo 50 7,9 Laranja II 1.000 733,5 Rodamina B 500 294,1 Sudan I 50 24,0 Sudan II 50 8,8 Sudan III 500 158,8 Sudan laranja G 500 190,5 Sudan vermelho 7B 50 11,6 Sudan vermelho G 100 24,1
Redução dos efeitos da matriz por
diluição de extratos
A capacidade de diluir extratos de amostras complexos para minimizar os efeitos da matriz permite uma quantificação mais precisa, além de reduzir a contaminação do sistema LC/MS e, consequentemente, aumentar a robustez A Tabela 1 mostra o efeito benéfico da diluição, em que as recuperações de composto na pimenta-do-reino aumentam à medida que a amostra é ainda mais diluída.
As especiarias são matrizes de alimentos desafiadoras, uma vez que sua natureza complexa resulta em efeitos de supressão de íons significativos. Os efeitos da matriz foram reforçados pela nossa incapacidade de utilizar a limpeza de SPE dispersiva convencional para remover interferências de compostos da matriz, devido a perdas observadas de compostos de corantes. No entanto, a diluição de extratos foi essencial para reduzir a supressão, e a comparação mostrada na Figura 4 demonstra que o grau de diluição necessário varia consideravelmente entre os tipos de especiarias.
A pimenta-do-reino foi identificada como a matriz de especiaria mais desafiadora que analisamos. A Figura 5 mostra que uma diluição 1:100 do extrato em acetonitrila foi necessária para obter recuperações aceitáveis para mais de 90% dos compostos. A sensibilidade inata do sistema LC/MS 6495B permitiu a análise do nível de diluição 1:100 da pimenta-do-reino e ainda manteve a capacidade de detectar a maioria dos compostos com um RSD maior que 20% da área.
Tabela 1. Recuperações de alguns compostos calculadas para diferentes razões de diluição com base em uma calibração de solvente. As células sombreadas em verde estão em conformidade com os requisitos da SANCO/12571/ 2013.
Analito Sem diluição Diluição 1:5 Diluição 1:10 Diluição 1:20 Diluição 1:50 Diluição 1:100
Acetamiprida 47,1 ± 3,7 88,5 ± 2,3 94,6 ± 3 99,2 ± 6,8 104,5 ± 6,4 116,7 ± 5,9 Aflatoxina B1 31,1 ± 0,9 80 ± 1,3 90 ± 3,8 92,1 ± 7,7 110,2 ± 8,8 112 ± 3,4 Buprofezina 4,1 ± 0,3 16,6 ± 1,1 32,1 ± 1,2 47,3 ± 5,8 84,6 ± 9 109,8 ± 9,9 Clorantraniliprol 8,2 ± 0,7 31,1 ± 1,1 50,9 ± 5,2 65,5 ± 10,9 94,2 ± 10,2 101,9 ± 20,4 Lenacil 16,9 ± 1,8 57,7 ± 5,9 75,7 ± 5,4 82,4 ± 3,6 97,5 ± 9,2 106,9 ± 11,5 Metomil 24,9 ± 1,9 51,3 ± 3,5 65,3 ± 6,5 77,1 ± 7,5 107,3 ± 10,7 113,3 ± 14,6 Profenofós 2,6 ± 0,3 12,5 ± 0,6 20,4 ± 2,1 34,2 ± 1,7 59 ± 8,3 88,5 ± 15,5 Propamocarbe 105,9 ± 8 102,4 ± 3,4 101 ± 3 100,2 ± 2,8 114,5 ± 3,4 111,5 ± 6,8 Proquinazida 11,4 ± 0,6 42,8 ± 0,9 57,9 ± 1 68,3 ± 3,9 96 ± 11,6 111,3 ± 6,8 Sudan vermelho 7B 19,8 ± 2,5 57,4 ± 4,2 61 ± 6,9 70,5 ± 2,4 84 ± 5 81,5 ± 7,2 0 20 40 60 80 100 120 Sem diluição 1 a 5 1 a 10 1 a 20 1 a 50 1 a 100 Número de pesticidas Páprica Pimenta-do-reino
Figura 4. Recuperações aceitáveis (70–120 %) para 194 compostos foram comparadas para diluições de extrato de páprica e pimenta-do-reino.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 <10 % 10–30 % 30–70 % 70–120 % >120 % Número de pesticidas Sem diluição 1 a 5 1 a 10 1 a 20 1 a 50 1 a 100 Aprovado pelas especificações da SANCO
Figura 5. Histograma de recuperações para pesticidas, micotoxinas e corantes adicionados em pimenta-do-reino a 2 ppb (10 µg/kg) e diluídos com acetonitrila. Duzentos e cinco compostos demonstraram forte supressão de íons e recuperações muito melhores foram observadas após a diluição.
de acordo com a presença de uma transição primária única. O espectro total do composto foi comparado com uma biblioteca espectral criada a partir de padrões puros. Esses mesmos dados também foram usados para quantificação. Nos exemplos mostrados na Figura 6, a Ocratoxina A e a Aflatoxina B1 foram calculadas a 28 µg/kg e 8,1 µg/kg no extrato de páprica diluído a 1:20.
Confirmação com MRM triggered
(tMRM)
Ao avaliar efeitos da matriz com o método dMRM, encontramos mais de 20 pesticidas e micotoxinas presentes no extrato em branco de páprica (sem a adição de padrões). Para confirmar esses compostos nessa amostra de controle, aplicamos um método tMRM em que até seis transições foram adquiridas
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 11,70 11,65 11,7 11,75 11,8 11,85 11,2 11,4 11,6 11,8 12,0 -0,20 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 Razão = 48,9 (101,5 %) 150 200 250 300 350 400 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 239,2 239,2 192,9 192,9 136,9 404,1
Coincidência com a biblioteca = 100,0
7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 -0,5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Razão = 87,1 (98,6 %) 180 200 220 240 260 280 300 Contagens Contagens -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 285,0 285,0 241,2 241,2 213,0 184,9 269,9 213,0 184,9 269,9 313,1
Coincidência com a biblioteca = 98,7 Ocratoxina A Aflatoxina B1 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 7,64 7,60 7,65 7,70 7,75 7,80 A B ×104 ×104 ×103 ×103
Figura 6. Dados de MRM triggered para Ocratoxina A (A) e Aflatoxina B1 (B) em extrato de páprica, exibindo cromatogramas de compostos, detalhes do qualificador e correspondência com a biblioteca de referência (da esquerda para a direta).
www.agilent.com
Somente para uso em pesquisas. Não devem ser usados em procedimentos de diagnóstico.
Essas informações estão sujeitas a alterações sem aviso prévio. © Agilent Technologies, Inc., 2016
Publicado nos EUA, 15 de dezembro de 2016 5991-7300PTBR
Conclusões
• Os tempos de atraso otimizados entre MRM permitiram o uso de tempo de espera de MRM menores do que 0,5 ms com o mínimo de perda de sinal de analito. • Os compostos de micotoxina e
de corantes foram incorporados em um método de pesticida de UHPLC/MS/MS para a determinação de mais de 260 compostos.
• A sensibilidade aprimorada obtida usando o sistema LC/MS Agilent 6495B permitiu a quantificação precisa e exata de compostos com graus muito altos de diluição de extrato de especiarias, a redução de efeitos da matriz e o aumento da robustez do método.
• O valor de aquisição do MRM triggered para a confirmação de compostos de micotoxina em especiarias foi demonstrado.
