UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
TONE VANDER MARCILIO
CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DE WFDC1/ps20 E DE SUA ISOFORMA Δ3 EM DIFERENTES TECIDOS
CHARACTERIZATION OF WFDC1/ps20 AND ITS Δ3 ISOFORM EXPRESSION IN DIFFERENT TISSUES
CAMPINAS 2020
TONE VANDER MARCILIO
CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DE WFDC1/ps20 E DE SUA ISOFORMA Δ3 EM DIFERENTES TECIDOS
CHARACTERIZATION OF WFDC1/ps20 AND ITS Δ3 ISOFORM EXPRESSION IN DIFFERENT TISSUES
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e Estrutural, na Área de Biologia Celular.
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Cellular in Structural Biology, in the area of Cellular Biology.
Orientador: HERNANDES FAUSTINO DE CARVALHO
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO TONE VANDER MARCILIO E ORIENTADA PELO HERNANDES FAUSTINO DE CARVALHO.
CAMPINAS 2020
Campinas, 11 de agosto de 2020
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Hernandes Faustino de Carvalho (Orientador)
Profª. Drª. Aline Mara dos Santos
Prof. Dr. Manoel Francisco Biancardi
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia.
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais Ronaldo Fernandes Marcilio e Regina Lúcia Marcilio, meus irmãos Taize e Josivan e, também, à minha esposa Bárbara Maduro, pelo apoio e incentivo.
AGRADECIMENTOS
Ao professor e orientador Dr. Hernandes Faustino de Carvalho pelos ensinamentos acadêmico e pessoal, pela paciência e confiança em mim depositada.
Aos professores Edson Rosa Pimentel, Luciana Bolsoni e Murilo Geraldo Vieira por participarem como membros da Banca Examinadora desta Qualificação.
Aos professores Aline Mara dos Santos, Manoel Francisco Biancardi, Murilo Vieira Geraldo e Sílvia Borges Pimentel de Oliveira por participarem como membros da Banca Examinadora desta Defesa.
Ao apoio técnico cedido por James Dallan, Leandro Cardoso, Mariana Baratti e Vitor Pelegati.
Aos colegas do HCLab, Antônio Félix, Daniel Andrés, Francisco Breno, Isabella Barbutti, James Dallan, Leandro Cardoso, Maraysa Mello, Mariana Baratti, Rony Nunes e Vitor Pelegati pelos momentos de aprendizado e descontração.
Aos colegas, Caio Cesar, Camila Oliveira, Jhonne Torres, Letícia Alves, Marcus Vinicius, Maria Gabriela, Melina Oliveira, Natalia Santos e Ricardo Neves por compartilhar este período de convivência com vocês.
Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INCT-INFABiC), por disponibilizar o uso do microscópio confocal LSM880 Axio Observer 7.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
E, finalmente, ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais (IFSULDEMINAS) – campus Inconfidentes pelas concessões de horário especial e afastamento integral.
RESUMO
A próstata é uma glândula composta por tecido epitelial circundado em componentes de tecido estromal. Os principais tipos de células no estroma prostático incluem fibroblastos, miofibroblastos e células muscular lisa. Esta última é o principal componente do estroma prostático, sendo as responsáveis pela contração da glândula durante a ejaculação e, além disso, criam um ambiente propício para a manutenção do epitélio em situações normal e patológica. A proteína estromal da próstata ps20 é sintetizada como produto da expressão do gene WFDC1 em células musculares lisas da próstata. Ela atua como reguladora de crescimento, mediadora das interações entre estroma-epitélio e é importante para a manutenção da homeostase tecidual. Neste trabalho foram selecionados alguns órgãos de camundongos adultos como pulmão, estômago, cólon, bexiga, próstata e ovário, posteriormente submetidos a três ensaios distintos para identificar e caracterizar a expressão do gene WFDC1/ps20 em níveis de mRNA e proteína. No ensaio de PCR, todas as amostras apresentaram o mRNA para isoforma W e para a Δ3, sendo que apenas nas amostras de próstata e ovário esta última não foi detectada. Para a detecção da proteína por Western blot as duas isoformas apresentaram múltiplas espécies com massas moleculares distintas e acima do que é conhecido para a ps20. Sugerimos que este resultado esteja relacionado à atividade da enzima dependente de cálcio, transglutaminase 2 (TG2), responsável pelo crosslink entre duas ou mais proteínas. E, ainda, amostras de estômago para a isoforma Δ3, foi detectada uma banda resolvida na altura de 17 kDa. Aqui sugerimos um evento de clivagem da extremidade C-teminal da ps20 Δ3 pela ação da enzima catepisina L. Na imunofluorescência as imagens exibiram a presença das duas isoformas da proteína estromal da próstata (ps20) nos órgãos analisados, no entanto, a expressão da isoforma Δ3 parece estar reduzida comparada à isoforma W, sugerindo que os tecidos analisados expressam mais a isoforma W. Em imagens obtidas no ensaio de imunofluorescência foi detectada a isoforma Δ3 em núcleo de células uroteliais da bexiga e em células epiteliais e estromais da próstata, caracterizando um dado novo relacionado à localização desta isoforma da proteína.
ABSTRACT
The prostate is a gland composed of epithelial tissue circled into stromal tissue components. The main types of cells in the prostatic stroma include fibroblasts, myofibroblasts and smooth muscle cells. The smooth muscle cells are the main components of the prostatic stroma, being responsible for the contraction of the gland during ejaculation and, furthermore, create a favorable environment for the maintenance of the epithelium in normal and pathological situations. The prostate stromal protein ps20 is synthesized as a product of the expression of the WFDC1 gene in smooth prostate muscle cells. It acts as a growth regulator, mediator of the stroma-epithelium interaction and it is important for the maintenance of the tissue homeostasis. In this work, we selected some organs of adult mice such as lung, stomach, colon, bladder, prostate and ovary, which were subsequently subjected to three different tests to identify and characterize the expression of the WFDC1 / ps20 gene in the levels of mRNA and protein. In the PCR assay, all samples presented the mRNA for the W and Δ3 isoforms, however, in the prostate and ovary samples the isoform Δ3 was not detected. For the detection of the protein by Western blot, the two isoforms presented multiple species with different molecular masses and above what is known for ps20. We suggest that this result is related to the activity of the calcium-dependent enzyme, transglutaminase 2 (TG2), responsible for the crosslink between two or more proteins. In addition, stomach samples it was detected a band of 17 kDa for the Δ3 isoform, suggesting an event of cleavage of its C-terminal end by the action of the enzyme cathepsin L (CL). Immunofluorescence images showed the presence of the two isoforms of the stromal prostate protein (ps20) in the analyzed organs. However, the expression of the Δ3 isoform seems to be reduced compared to the W isoform, suggesting that the analyzed tissues express more the isoform W. In addition, the Δ3 isoform was detected in the nucleus of urothelial cells of the bladder and in the epithelial and stromal cells of the prostate; this nuclear expression of this isoform was not characterized before.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores obtidos pela quantificação e qualidade do RNA total extraído das amostras.
Tabela 2 – Reagentes utilizados para etapa de amplificação de DNA.
Tabela 3 – Etapas e ciclos correspondentes à amplificação de DNA em termociclador.
Tabela 4 – Reagentes utilizados na composição do gel de corrida.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
aa – aminoácidos A – Ampére
APS – Ammonium Persulfate AR – Receptor de andrógeno
BPH – Benign Prostatic Hiperplasia BSA – Bovine Serum Albumin cDNA – DNA complementar
CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CL – Catepsina L
CML – Células Musculares Lisas
CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal CO2 – dióxodo de carbono
Crosslink – Ligação cruzada
DAPI – 4’, 6’-diamino-2-phenylindole DEPC – Diethyl pyrocarbonate
DU-145 – Linhagem celular humana derivada de adenocarcinoma prostático HCl – Ácido clorídrico
IgA – Imunoglobulina A IgG – Imunoglobulina G
INFABiC – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica Aplicada à Biologia Celular
MEC – Matriz Extracelular
NCBI – National Center for Biotechnology Information
NBT-II – lihagem celular de rato derivada de tumor em bexiga urinária pb – par de base
PCa – Câncer de próstata
PC3 – linhagem celular humana derivada de adenocarcinoma prostático PBS – Phosphate Buffered Saline
ps20 – proteína estromal da próstata
RN nº 37 – Resolução Normativa para diretriz da prática de eutanásia RNAm – RNA mensageiro
RPM – rotação por minuto
rps20FL – ps20 recombinante de comprimento total
rps20TR – ps20 recombinante truncada (ausência de 28 aminoácidos) SLPI – antileucoproteinase: inibidor de protease secretora de leucócitos SDS – Sodium Dodecyl Sulfate
TEMED – Tetramethylethylenediamine TG2 – transglutaminase 2
UFRGS – Universidade Federal de Rio Grande do Sul W – isoforma completa da proteína ps20
WAP – Way Protein Acidic WB – Western blot
WFDC1 – WAP four-dissulfide core domain 1 [ ] – Concentração
Δ3 – isoforma da proteína ps20 com ausência de 28 aminoácidos causada pela deleção do exon 3
ANEXOS
Anexo I – Certificado de Autorização para uso de animais na pesquisa (CEUA).
Anexo II – Material suplementar: Western blot realizado em amostras de lisados proteicos extraídas de linhagens celulares humanas PC3 e DU-145.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ...14
OBJETIVO ...20
MATERIAIS E MÉTODOS ...21
1. Polymerase Chain Reaction (PCR) ...21
1.1 Extração, precipitação, solubilização e quantificação de RNA ...21
1.2 Transcrição reversa ...23
1.3 Desenhando primer ...23
1.4 Amplificação ...24
1.5 Eletroforese e revelação ...25
2. Western Blot (WB) ...25
2.1 Extração e quantificação de proteínas ...25
2.2 Eletroforese e transferência ...27 2.3 Imunobloting e revelação ...28 3. Imunofluorescência (IF) ...30 RESULTADOS ...32 DISCUSSÃO ...40 CONCLUSÃO ...44 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...45 ANEXOS ...48
Anexo I - Certificado para autorização de uso de animais nesta pesquisa ....48
Anexo II - Material suplementar: Western blot realizado em amostras de lisados proteicos extraídas de linhagens celulares humanas PC3 e DU-145 ...49
14
INTRODUÇÃO
A próstata é uma glândula acessória do aparelho reprodutor masculino, sua principal função é secretar componentes constituintes do sêmen, proporcionando um nicho adequado à sobrevivência dos espermatozoides no trato genital feminino e, ainda, fornecer elementos que estimulam sua mobilidade. A glândula prostática também faz parte do sistema imune de mucosas, com função baseada na secreção de imunoglobulinas IgA e IgG (SILVA et al., 2017)
A estrutura normal de uma próstata adulta é composta, segundo McNeal e Hospital (2001), por três zonas distintas (Figura 1): (i) zona central: região prostática que circunda o ducto ejaculatório da vesícula seminal e é composta por uma porção glandular; (ii) zona periférica: representa aproximadamente 70% do volume prostático total, região composta por glândulas secretoras. Esta região tem grande interesse da medicina por estar relacionada às origens de adenocarcinoma prostático e (iii) zona de transição: representa apenas 5% do volume prostático. No entanto, é a zona exclusiva onde ocorre a hiperplasia prostática benigna (BPH).
Figura 1. Diagrama esquemático da anatomia zonal prostática humana. Cada zona abriga seções distintas da uretra prostática. A zona central recobre o ductal ejaculatório que se origina na vesicular seminal. A zona periférica abriga a uretra peniana descendente e a zona de transição abriga a uretra de transição composta por bexiga descendente e seções uretrais da próstata. O verumontanum é a junção entre o ducto ejaculatório e a uretra prostática (MCNEAL; HOSPITAL, 2001).
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A próstata é uma glândula composta por tecido epitelial incorporado em componentes de tecido estromal. Os principais tipos de células no estroma da próstata incluem fibroblastos, miofibroblastos e células musculares lisas. Essas células estromais secretam fatores de crescimento, produzem componentes da matriz extracelular (MEC), expressam receptor de andrógeno (AR), receptor de estrogênio, receptor adrenérgico e outros. Os fibroblastos sintetizam vimentina e laminina, enquanto as células musculares lisas sintetizam desmina, α-actina, calponina, caldesmina, miosina, esmotelina e distrofina. Já os miofibroblastos caracteristicamente sintetizam o pró-colágeno 1 (BERRY; MAITLAND; COLLINS, 2008).
As células musculares lisas (CML) da próstata são os principais componentes do estroma prostático, atuando como responsáveis pela contração da glândula durante a ejaculação (THOMSON; CUNHA; MARKER, 2008). Elas também desempenham outras funções importantes, criando um ambiente propício para a manutenção do epitélio, tanto em situações normais como patológicas. As CML representam cerca de 22% do volume total da próstata humana, com predomínio maior ao redor dos ductos, onde se encontram em intimo contato com a lâmina basal das células epiteliais (SHAPIRO; HARTANTO; LEPOR, 1992).
Além de sintetizarem as proteínas mencionadas acima, as CML também expressam outros genes importantes na manutenção da morfofisiologia prostática como por exemplo, o gene WFDC1 (WAP four-dissulfite core domain 1). O gene WFDC1 humano encontra-se no braço maior do cromossomo 16, em uma região de perda frequente de heterozigosidade em cânceres, incluindo o câncer de próstata (NORDLING; VIHKO, 2005), o câncer de pulmão e o carcinoma hepatocelular (LARSEN et al., 2000). Este gene possui 7 exons e, quando expresso, resulta na síntese da ps20, uma proteína de 220 aminoácidos (aa) com uma sequência específica de resíduos de cisteína nas posições 66 - 78 - 83 - 89 - 95 - 96 - 100 e 104 (Figura 2) onde são estabelecidas quatro pontes dissulfeto entre elas (BOUCHARD et al., 2006).
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Figura 2. Sequência de aminoácidos da ps20 humana. Realces em vermelho representam os oito aminoácidos cisteína os quais darão origens às pontes dissulfeto (BOUCHARD et al., 2006). Adaptado de GeneRunner.
A proteína acídica do soro (WAP) ps20 (prostate stromal, 20 kDa) foi identificada em 1987 como um componente secretado pelo mesênquima urogenital de rato capaz de inibir o crescimento de células NBT-II de carcinoma de bexiga in vitro (ROWLEY; TINDALL, 1987). Em outros ensaios semelhantes, Rowley e colaboradores (1995) identificaram que o mesmo componente anteriormente citado inibiu o crescimento da linhagem celular PC3 derivada de carcinoma prostático. Estes autores sugeriram que a ps20 pode atuar como um componente da MEC, ou como uma proteína envolvida na adesão célula-célula ou célula-matriz, inibindo, assim, a proliferação e a diferenciação celular in vitro. Em ensaios de imunohistoquímica foi observado por Larsen e demais autores (1998) uma grande concentração de ps20 no estroma da próstata de ratos adultos em relação a outros tecidos.
Também inseridas no grupo das proteínas WAP estão a elafina (inibidor específico de elastase) e SLPI (inibidor de protease secretada por leucócitos – antileucoproteinase) que, juntamente à ps20, são proteínas de secreção e possuem fisiologia pleiotrópica. Além do seu papel de inibidoras de proteases, a antileucoproteinase e a elafina possuem funções antibacterianas, antifúngicas, antivirais, anti-inflamatórias e imunomoduladoras (SCOTT; TAGGART, 2011).
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Segundo Ressler e colaboradores (2014), camundongos knockout para o gene WFDC1 apresentaram respostas inflamatória mais rápida quando infectados por vírus H1N1 e no fechamento de feridas em comparação aos animais selvagens. Eles também cultivaram as células extraídas dos camundongos knockout e selvagem e as submeteram ao teste de ferida in vitro, no qual obtiveram o mesmo resultado. Porém, neste último caso, as células dos animais knockout exibiram adesões significativamente aumentadas à fibronectina e laminina em relação às células extraídas de animais selvagens. Com isso, os autores sugeriram que em níveis elevado ou basal de WFDC1/ps20 há uma sustentação da homeostase geral em adultos, enquanto a expressão ou atividade sub-regulada de WFDC1/ps20 induz uma mudança permissiva para uma biologia de reparo. Propuseram ainda que, em situações normais, a homeostase após o reparo pode ser associada à expressão ou atividade retomada de WFDC1/ps20 a um estado de biologia normal. Assim, a ps20 atua como um regulador fundamental de diversas respostas inflamatórias e reparadoras de feridas, com funções atribuídas relacionadas ao controle do comportamento de células, organização da MEC e angiogênese. No entanto, os mecanismos moleculares da atividade da ps20, incluindo suas interações com células e outras moléculas ainda não foram completamente elucidados. Com base na similaridade com outras proteínas WAP, uma possível atividade inibidora de serina protease foi atribuída à ps20, mas ainda não há comprovação científica indicando essa função.
Algumas pesquisas têm demostrado que a expressão de WFDC1 e, consequentemente, a síntese de ps20, são consideravelmente variáveis em condições anormais, como é o caso em PCA. McAlhany e colaboradores (2004) apontaram que a progressão do câncer prostático é caracterizada pela perda da expressão de WFDC1/ps20 no estroma, com um ganho da sua expressão no epitélio prostático, sugerindo uma progressão do fenótipo tumoral mais agressivo no epitélio. Eles apontaram que tal característica da ps20 é atribuída a um potencial marcador biológico na determinação da progressão e do desenvolvimento da doença. E ainda, o grupo de McAlhany (2003) realizou um estudo com modelo xenográfico para o PCA e revelou que a ps20 contribui na angiogênese e tumorigênese, além de atuar na estabilização da MEC e da neovascularização tumoral, associada à mudança da interação célula-matriz, resultando em crescente migração celular.
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Com o propósito de investigar polimorfismos relacionados ao desenvolvimento neoplásico e alterações na expressão gênica, Watson e demais autores (2004), através de análise molecular do gene WFDC1, realizada em 21 pacientes e cinco linhagens celulares positivas para o PCA, concluíram que não há associações entre polimorfismos nesse gene e a formação de tumores e, que o nível de expressão do WFDC1/ps20 é reduzido quando comparado ao subcompartimento estromal da próstata normal, onde ele é altamente expresso. Este grupo de pesquisadores também alegou que, quando um tumor de próstata se desenvolve, o estroma normal é substituído por um estroma reativo composto por miofibroblastos e fibroblastos que não mais expressam WFDC1 e, ainda, eles concluíram que tanto nas amostras não tumoral quanto nas amostras derivadas de PCA, foram encontrados transcritos menores, cujo sequenciamento demonstrou não possuírem a região codificada correspondente ao exon 3 que, quando traduzida, resulta em uma deleção de 28 aa na proteína final. Neste caso, o RNAm do gene WFDC1 apresenta apenas 6 exons e a proteína possui um número total de 192 aa, sendo chamada de isoforma Δ3 da ps20 (Figura 3). A ps20 humana pode ser sintetizada apresentando duas isoformas, a W (~ 27 kDa) e a Δ3 (~ 22 kDa) (HICKMAN, et al. 2016).
Figura 3. Esquema demonstrando as etapas da expressão do gene WFDC1/ps20, splicings constitutivo e alternativo e as duas isoformas da ps20.
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A isoforma Δ3 da ps20 é resultado de um evento que ocorre no processamento do transcrito primário (RNAm precursor), chamado de splicing alternativo (à direita inferior da Figura 3). Gilbert (1978) propôs pela primeira vez o conceito de splicing alternativo, que é responsável pela discrepância entre o número de genes codificadores de proteínas e o número total de proteínas sintetizadas. O splicing alternativo é um mecanismo essencial para aumentar a complexidade da expressão gênica, porém, os mecanismos que selecionam as diferentes formas de splicing alternativo em cada situação são poucos conhecidos.
Considerando que WFDC1/ps20 é pouco caracterizado e que a isoforma Δ3 foi descrita, até o momento, apenas na próstata humana, julgamos relevante investigar a possibilidade de que outros órgãos como pulmão, estômago, cólon, bexiga, próstata e ovário de camundongos adultos também expressem WFDC1/ps20.
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OBJETIVOS
Geral
Investigar em diferentes órgãos de camundongos adultos se há expressão de WFDC1/ps20.
Específico
Caracterizar a expressão de WFDC1/ps20, inclusive da isoforma Δ3 em níveis de mRNA e proteína.
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MATERIAIS E MÉTODOS
Os animais utilizados foram camundongos machos e fêmeas da linhagem C57BL/6J aprovados pela CEUA sob o número de protocolo 5216-1/2019 (ANEXO I), provenientes do CEMIB/UNICAMP, com idade entre 6 a 10 semanas. Os animais foram eutanasiados em câmara de CO2 seguindo as recomendações apresentadas na RN nº. 37 do CONCEA. As regiões torácica e abdominal foram desinfetadas com álcool 70% e com auxílio de materiais/utensílios cirúrgicos autoclavados, um corte mediano foi realizado expondo as cavidades. Utilizando a lupa Zeiss (Ref.: 435400 Discovery V20) os animais foram dissecados e os seguintes órgãos foram removidos: bexiga, cólon, estômago, ovário, próstata e o pulmão; os quais foram preparados para serem utilizados em três ensaios distintos. Para o ensaio de Polymerase Chain Reaction (PCR) foram utilizados dois machos e duas fêmeas, para o ensaio de Western Blot (WB), nove machos e nove fêmeas e para o ensaio de Imunofluorescência (IF), quatro machos e quatro fêmeas.
1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
1.1 Extração, precipitação, solubilização e quantificação de RNA
Todas as amostras foram manipuladas no gelo e os reagentes aqui utilizados mantidos em temperatura de 4ºC.
Após a coleta, os órgãos foram imediatamente imersos em nitrogênio líquido e macerados em cadinho de porcelana. Em seguida, foi adicionado 1 mL de Trizol (Ref.: 11667165001, Roche, USA) e utilizando uma micropipeta P1000 vigorosas sucções foram realizadas a fim de permitir que os fragmentos dos órgãos não ficassem aderidos na superfície do cadinho. O homogenato (órgão macerado mais Trizol) foi transferido para um microtubo de 2 mL e incubado no gelo por 5 minutos. Na sequência, foram adicionados 200 µL de clorofórmio (Ref.:1534-1, Dinâmica), agitando o microtubo manualmente no sentido vertical por cerca de 1 minuto e incubando no gelo por 3 minutos, seguido de uma centrifugação a 12.000g, por 15 minutos a 4ºC. Após esta etapa, separam-se as fases orgânica e aquosa do homogenato, sendo a última onde está presente as moléculas de RNA. A fase aquosa foi transferida para um novo microtubo e adicionado 500 µL de álcool isopropílico
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(Ref.: 11.36.67, Merck) responsável pela precipitação do RNA, o qual se concentra no fundo do microtubo após centrifugação a 12.000g por 10 minutos. Então, o sobrenadante foi descartado, o pellet lavado em álcool etílico (Ref.: A1084.01, Synth) 75% e centrifugado a 7.500g durante 5 minutos. Este último passo foi repetido por mais uma vez. Após o descarte do sobrenadante, os microtubos contendo as amostras foram expostos ao ar ambiente para eliminar quaisquer vestígios de álcool. O RNA de cada amostra foi ressuspendido em 20 µL de uma solução autoclavada de Diethyl pyrocarbonate (Ref.: D5758, Sigma Aldrich) diluído na proporção de 1:1000 em água deionizada (solução livre de RNAses – água DEPC) e incubado em banho seco a 60ºC durante 15 minutos. Desta solução final contendo moléculas de RNA foi retirada uma alíquota de 2 µL de cada amostra para quantificação em espectrofotômetro (Ref.: 112112, NanoVue plus, GE) (Tabela 1). Finalmente, as amostras de RNA foram armazenadas em biofreezer a -80ºC para ensaios posteriores.
TABELA 1 - Valores obtidos pela quantificação e qualidade de RNA total extraído das amostras.
Amostras [ ] ng/µL A 260/280 A 260/230 Fêmea 1 – bexiga 901 1,98 2,11 Fêmea 1 – cólon 1.023 1,71 1,77 Fêmea 1 – estômago 1.040 1,86 1,79 Fêmea 1 – ovário 832 1,75 1,92 Fêmea 1 – pulmão 800 1,69 2,06 Fêmea 2 – bexiga 796 1,64 1,79 Fêmea 2 – cólon 1.014 1,72 1,76 Fêmea 2 – estômago 1.033 1,67 1,81 Fêmea 2 – ovário 933 1,63 1,82 Fêmea 2 – pulmão 907 1,59 1,95 Macho 1 – bexiga 1.000 1,70 1,86 Macho 1 – cólon 1.028 1,84 1,77 Macho 1 – estômago 1.020 1,68 1,74 Macho 1 – próstata 986 1,63 1,78 Macho 1 – pulmão 905 1,66 1,91 Macho 2 – bexiga 894 1,74 1,88 Macho 2 – cólon 1.036 1,87 1,74 Macho 2 – estômago 946 1,78 1,97 Macho 2 – próstata 948 1,59 1,71 Macho 2 – pulmão 926 1,67 1,73
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1.2 Transcrição reversa
As amostras de RNA foram retiradas do biofreezer e, seguindo as recomendações do fabricante a concentração escolhida foi de 1 µg/µL e o kit utilizado para as reações necessárias neste ensaio foi o RevertAid First Strand cDNA Syntesis Kit (Ref.: K1622, Thermo Fisher Scientific). Na primeira etapa da síntese de cDNA, em microtubos de 200 µL alíquotas de RNA, previamente calculadas, foram diluídas em oligo (dt)18 e o volume completado para 12 µL com água DEPC. Posteriormente, este mix foi agitado no vórtex, centrifugado em spin brevemente e incubado em termociclador (Ref.: T-100, BIO-RAD) a 65ºC durante 5 minutos. Na segunda etapa, foram adicionados a cada amostra 4 µL de 5X reaction buffer, 1 µL de Ribolock RNase Inhibitor, 2 µL de dNTP Mix 10 mM e 1 µL de Revert Aid M-Mu LV RT totalizando um volume final de 20 µL em cada amostra que, mais uma vez, foi passada no vórtex e no spin brevemente. Na sequência, as amostras foram incubadas em termociclador por dois ciclos. O primeiro, a temperatura de 42ºC durante 60 minutos e, o segundo, a 70ºC por 5 cinco finalizando a síntese de cDNA. As amostras foram armazenadas no biofreezer a -80ºC para ensaios posteriores.
1.3 Desenhando primers
Esta etapa se deu iniciando com a busca da sequência do RNAm (apenas exons) do gene WFDC1 do modelo em estudo no endereço eletrônico do NCBI. O número/código correspondente à sequência do RNAm foi adicionado na plataforma Primer-BLAST a fim de se obter as possíveis alternativas dos primers resultantes. A sequência de nucleotídeos escolhida teve início no exon 2 (nucleotídeo 436) e, o término, no exon 4 (nucleotídeo 701). Com isso, o resultado da sequência nucleotídica do primer forward foi GCTACAATGGCTGTGCCTAT-3’ e do primer reverse foi 5’-GCGTTGCTTAACACATCGTCC-3’. Estes dois primers foram responsáveis pela amplificação do RNAm de WFDC1 que, neste caso foram apresentadas pelas variantes W e Δ3. Para amplificação da β-actina foram utilizados os primers forward 5’-CCACCATGTACCCAGGCATT-3’ e reverse 5’-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3’. É importante ressaltar que o mesmo par de primers é capaz de verificar a presença dos mRNAs da isorforma W e da isoforma Δ3, sendo que os tamanhos dos amplicons correspondentes são de 266 pb e 182 pb, respectivamente. O primer da β-actina
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apresenta amplicon de 243 pb. Antes de serem adquiridos da Thermo Fisher Scientific, os primers escolhidos foram checados pelo software Gene Runner para verificar formações de hairpins, dimers, bunge loops ou internal loops. Estas estruturas podem comprometer o andamento do ensaio de PCR.
1.4 Amplificação
Antes de iniciar esta etapa foi necessário diluir o cDNA das amostras e os primers forward e reverse em água DEPC na proporção de 1:10, respectivamente. A concentração de cDNA utilizada foi de 500 ng/µL. Em microtubo de 200 µL foram adicionados os reagentes apresentados na tabela 2.
TABELA 2 – Reagentes utilizados para etapa de amplificação de DNA
Reagentes Volume
10X PCR Buffer (Ref.: 52395, Invitrogen) 1 µL
Mg Cl2 50mM 0,3 µL
dNTP Mix 10mM (Ref.: 10000489G, Invitrogen) 0,2 µL
Primer forward 1 µL
Primer reverse 1 µL
Taq DNA polymerase 5U/µL (Ref.: 10342-178, Invitrogen) 0,053 µL
Amostra de DNA (500 ng/µL) 5µL
Água DEPC 1,45 µL
Volume final 10 µL
Já na tabela 3 estão apresentados as etapas, temperatura, tempo e número de ciclos em que as amostras foram submetidas no termoclicador.
TABELA 3 – Etapas e ciclos correspondentes à amplificação de DNA em termociclador
Etapas Temperatura Tempo Número de ciclos
Desnaturação inicial 94ºC 5 minutos 1
Desnaturação 94ºC 30 segundos -
Anelamento de primers 59ºC 15 segundos 1 (+34)
Extensão 72ºC 25 segundos -
Extensão final 72ºC 5 minutos 1
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1.5 Eletroforese e revelação
O gel utilizado para esta etapa foi de 2% de agarose, composto de 3 gramas de agarose (Ref.: A9539, Sigma Aldrich) diluído em 150 mL de TAE buffer 1X, aquecidos no micro-ondas até completa diluição da agarose, e em seguida, adicionados 15 µL de SYBR safe DNA (Ref.: S33102, Invitrogen), e transferido ainda quente para a cuba de eletroforese com o pente fixado no ponto específico. Após o término da amplificação, nas amostras foram adicionados 2 µL de Loading Dye (Ref.: 1037649, Qiagen). O marcador de peso molecular foi composto de 4 µL de água DEPC, 1 µL de Loading Dye e 1 µL de DNA ladder 100 pb (Ref.:15628019). Certificada a polimerização do gel na cuba de eletroforese, o pente foi removido e o gel foi submerso em TAE buffer 1X. Posteriormente, foi adicionado no primeiro poço 5 µL de marcador de peso molecular e, nos poços seguintes, 10 µL das amostras. Finalmente, o sistema de eletroforese foi fechado, a voltagem fixada a 115V, e a corrida teve duração de 60 minutos. Após o término da eletroforese, o gel foi removido da cuba e revelado no scanner Typhoon. No software, as configurações foram ajustadas para fluorescence, 526 SP fluorescein Cy2 e focal plane +3mm.
2. Western blot (WB)
Duas etapas anteriores foram necessárias para realização deste ensaio e consistem na extração e quantificação de proteínas. Todas as amostras foram manipuladas no gelo, e os reagentes utilizados mantidos em temperatura de 4ºC.
2.1 Extração e quantificação de proteínas
Após a coleta, os órgãos foram imediatamente imersos em nitrogênio líquido e macerados em cadinho de porcelana. Em seguida, foi adicionado 1 mL de PBS e, com a micropipeta P1000, vigorosas sucções foram realizadas afim de permitir que os fragmentos dos órgãos não ficassem aderidos na superfície do cadinho. O homogenato (órgão macerado mais PBS) foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL e centrifugado a 1.500 RPM durante 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi desprezado, o pellet ressuspendido por um volume semelhante a ele de coquetel RIPA com inibidor de proteases na proporção de 100:1, respectivamente, e incubado no gelo durante 40 minutos. A cada 10 minutos de incubação as amostras foram
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agitadas em vórtex. Terminado o tempo de incubação, o homogenato foi transferido para microtubo de 2 mL, centrifugado a 12.000 RPM durante 20 minutos e o sobrenadante contendo as proteínas foi transferido para um novo microtubo. Foi utilizada placa de ELISA (Ref.: 655061; Greiner Bio One) para a quantificação de proteínas baseada pelo método Bradford (Ref.: B6916; Sigma Aldrich) que consiste na mudança de cor do corante Coomassie Blue (cor avermelhada) para cor azulada na presença de proteínas. Para quantificar a concentração de proteínas em cada amostra, foi construída uma curva de padronização com concentrações conhecidas de BSA (2 e 1 mg/mL; 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 µg/mL) diluídas em água deionizada, adicionadas alíquotas de 10 µL de cada concentração de BSA em 290 µL de Bradford e submetidas ao espectrofotômetro (Ref.: expert plus, Asys) em absorbância a 595 nm. A partir desta curva (Figura 4) foram obtidos os valores das concentrações proteicas de cada amostra. Após a quantificação, as amostras foram conservadas em tampão de amostra 5X e β-mercaptoetanol (Ref.: M6250; Sigma Aldrich). Para cada 100 µL de lisado proteico obtido foram adicionados 20 µL do mix mencionado acima e, em seguida, agitado no vórtex, incubado em banho seco a 60ºC durante 5 minutos e armazenado em freezer a -20ºC.
Figura 4. Gráfico da curva padronizada por leitura de concentrações conhecidas de BSA pelo método Bradford para quantificação de proteínas.
y = 0,5805x + 0,4356 R² = 0,9876 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 0,5 1 1,5 2 2,5 A b so rb ân ci a [ ] de BSA (mg/mL) Média
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2.2 Eletroforese e transferência
Tendo como base o peso molecular da proteína de interesse (~20 kDa), a concentração do gel de poliacrilamida escolhida foi de 20%. Os reagentes e seus volumes necessários para obtenção dos géis de corrida e empacotamento estão apresentados nas tabelas 4 e 5, respectivamente.
TABELA 4 – Reagentes utilizados na composição do gel de corrida
Reagentes Volume Água deionizada 440 µL Tris HCl, 1,5 moles/L, pH 2,5 mL Acrilamida 30% e bis-acrilamida 0,8% 6,8 mL SDS 100 µL APS 140 µL TEMED 20 µL Volume final 10 mL
TABELA 5 – Reagentes utilizados na composição do gel de empacotamento
Reagentes Volume Água deionizada 2,93 mL Tris HCl, 0,5 moles/L, pH 1,26 mL Acrilamida 30% e bis-acrilamida 0,8% 670 µL SDS 50 µL APS 80 µL TEMED 10 µL Volume final 5 mL
Após a adição do reagente TEMED correspondente ao gel de corrida, a mistura foi transferida para o molde de vidro previamente fixado no suporte (Ref.: 1703811; BIO-RAD) e, adicionado sobre a mistura 1 mL de álcool isopropílico. O tempo de espera para a polimerização do gel de empacotamento foi de aproximadamente 30 minutos. Constatada a polimerização, o álcool foi descartado e a face superior do gel lavada com água destilada. Posteriormente, a mistura do gel de empacotamento foi adicionada sobre o gel de corrida polimerizado e um pente 1,5 mm correspondente a 10 poços foi inserido no topo do gel. O tempo de espera para a polimerização do gel de empacotamento foi de aproximadamente 60 minutos. Em
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seguida, o pente foi retirado, os poços lavados cuidadosamente 3 vezes com tampão de corrida e o suporte de vidro contendo os géis foi transferido para a cuba de eletroforese submerso em tampão de corrida. No primeiro poço do gel, foram adicionados 4 µL de marcador de peso molecular (Ref.: 26619; Thermo Scientific) e, nos poços seguintes, 60 µg/µL de lisado proteico previamente incubado a 95ºC durante 5 minutos em banho seco. Finalmente, o sistema foi fechado e a voltagem ajustada para 100 Volts. A corrida teve duração de aproximadamente 120 minutos.
Para a etapa de transferência, o gel de empacotamento foi descartado e o restante, contendo as proteínas, transferido para um aparato chamado “sanduiche”, composto por suporte, esponja, papel filtro, o gel, membrana de nitrocelulose (Ref.: RPN303D; GE Healthcare), papel filtro e esponja. Em seguida, o sanduiche foi transferido para a cuba e submerso em tampão de transferência. Após o fechamento do sistema em geladeira, a corrente elétrica foi ajustada a 0,4 A. A transferência teve duração de aproximadamente 70 minutos. A confirmação da transferência de proteínas para a membrana foi detectada com o uso do corante Ponceau S por 30 segundos de incubação. A membrana passou por várias lavagens em água destilada para remoção do corante e, em seguida, transferida para uma solução de bloqueio previamente preparada com leite em pó desnatado Molico a 5% diluído em TBS-T onde permaneceu incubada, sob leve agitação orbital, em temperatura ambiente durante 60 minutos.
2.3 Imunoblotting e revelação
Os anticorpos primários utilizados para reconhecimento da proteína de interesse foram antips20 EGR/2019 contra a extremidade Cterminal -EGRVLRQKLHKEYP- (figura 5) e EAV/2019 contra a região específica de aminoácidos -EAVPPPPAEACSTT- correspondentes à junção dos éxons 2 e 4 do RNAm da isoforma Δ3 da ps20 (Figura 6). Ambos foram purificados de coelho por cromatografia de afinidade, produzidos sob encomenda pelo Centro de Biotecnologia da UFRGS. O anticorpo EGR/2019 também poderá reconhecer a isoforma Δ3 da ps20, podendo se ligar à extremidade C-terminal desta isoforma. O anticorpo anti β-actina monoclonal (Ref.: A5316, Sigma Aldrich) foi utilizado como controle da quantidade de proteínas adicionada em cada poço. Os anticorpos primários para ps20
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foram diluídos na proporção de 1:1000 e para β-actina 1:5000 em TBS-T com leite Molico a 2% e a incubação ocorreu sob leve agitação orbital, a 4ºC por overnight. No dia seguinte, a membrana foi lavada com TBS-T por 4 vezes de 10 minutos cada e, posteriormente, incubada com anticorpos secundários Alexa Fluor 488® donkey anti rabbit (Ref.: A11008) Life Tecnologies) e Alexa Fluor 488® goat anti-mouse (Ref.: A11059) Life Tecnologies. Os anticorpos secundários foram diluídos na proporção de 1:1000 em TBS-T com leite Molico a 2% e a incubação ocorreu sob leve agitação orbital por 60 minutos em temperatura ambiente e protegida de luminosidade. Após o término da incubação, a membrana foi lavada em TBS-T por 2 vezes de 10 minutos e, finalmente mais duas lavagens em TBS durante 10 minutos cada e levada ao scanner Typhoon (Ref.: TRIO, GE) para revelação. No software (Typhoon Scanner Control v5.0) as configurações foram ajustadas com relação ao tipo de anticorpo secundário utilizado. Neste caso, a primeira incubação foi realizada com o uso dos anticorpos para ps20 e, posteriormente a revelação desta etapa, as membranas foram mais uma vez bloqueadas por 30 minutos, incubadas com anticorpos primário e secundário para β-actina por 60 e 90 minutos respectivamente. Em seguida, novas lavagens foram realizadas nas membranas e levadas ao Typhoon para uma nova revelação.
Figura 5. Sequência de aminoácidos da ps20. Realce em vermelho representa a sequência de aminoácidos próximos à extremidade C-terminal que será reconhecida pelo anticorpo para a isoforma W da ps20. Adaptado de GeneRunner.
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Figura 6. Sequência de aminoácidos da isoforma Δ3 da ps20. Realce em vermelho representa a sequência de aminoácidos resultante traducional da junção entre os éxons 2 e 4 da ps20 que será reconhecida pelo anticorpo para a isoforma Δ3. Adaptado de GeneRunner.
3. Imunofluorescência (IF)
Após a coleta, os órgãos foram lavados em PBS, imersos em OCT Tissue-Tek (Cat.: 4583, Sakura, Torrance, CA, USA) e congelados por imersão em nitrogênio líquido. Em seguida, os órgãos foram armazenados no biofreezer a -80ºC, para subsequente secção em criostato Leica CM1860 a -20ºC. As secções de 5 µm foram depositadas sobre lâminas de vidro tratadas com acetona/silano (lâminas silanizadas) e armazenadas a -80ºC. As lâminas foram retiradas do biofreezer e expostas à temperatura ambiente por 3 a 5 minutos e, posterirormente as secções foram fixadas em paraformaldeído (Cat.: 30525-89-4, Merck, Darmstadt, Germany) 4% em PBS por 15 minutos seguido de permeabilização com Tween 20 (Cat.: 655205, Calbiochem, USA and Canadá) a 0,2% em PBS por 20 minutos. Para inibir a autofluorescência do tecido, os cortes foram tratados com peróxido de hidrogênio (Cat.: 7722-84-1, Dinâmica) a 6% em PBS por 15 minutos. Entre os procedimentos de fixação e de inibição da autofluorescência ocorreram lavagens das secções em PBS por 4 vezes de 10 minutos cada. Para o bloqueio de ligações inespecíficas foi utilizado BSA (Cat.: A7906, Sigma Aldrich, USA) a 3% em PBS por 60 minutos em temperatura ambiente. Na sequência, as secções foram incubadas com os mesmos anticorpos primários utilizados no ensaio anterior. Para identificar a isoforma W da ps20 o anticorpo EGR/2019 contra a extremidade C-terminal -EGRVLRQKLHKEYP- (figura 4)e para a isoforma Δ3 o anticorpo EAV/2019 contra a região específica de aminoácidos
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EAVPPPPAEACSTT- correspondentes à junção dos éxons 2 e 4 do RNAm precursor da isoforma Δ3 da ps20 (Figura 5). O anticorpo EGR/2019 também poderá reconhecer a isoforma Δ3 da ps20, podendo se ligar à extremidade C-terminal desta isoforma A incubação ocorreu overnight em câmara úmida a 4ºC. Os anticorpos primários foram diluídos na proporção de 1:5000 em PBS com BSA 2% e, os controles negativos não foram incubados com anticorpos primários, apenas com a solução de diluição. No dia seguinte, as secções foram lavadas com PBS por 4 vezes de 10 minutos cada e, posteriormente, incubadas com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (Ref.: A11008; Life Tecnologies) e, para marcar os núcleos celulares utilizamos DAPI (Ref.: D9542; Sigma Aldrich). A incubação ocorreu por 60 minutos em temperatura ambiente e protegida de luminosidade. O anticorpo secundário foi diluído na proporção de 1:5000 e o DAPI, na proporção de 1:2000 em PBS com BSA a 2%. Na sequência, as secções foram lavadas em PBS por 4 vezes de 10 minutos cada e o processo de finalização foi realizado adicionando o meio de montagem (10% de Tris 20mM – pH 8 [Cat.: T1027.01.AG] Synth; 90% de glicerol [Cat.: G7893-1L] Sigma Aldrich e 0,5% de N-propyl-gallate [Cat.: P3130-100] Sigma Aldrich) e a lamínula sobre as secções. As bordas da lamínula foram estabilizadas com esmalte. Posteriormente, as amostras foram examinadas no INFABiC desta instituição, usando o microscópio confocal LSM880 Axio Observer 7 (Carl Zeiss AG, Germany) utilizando objetiva de 20X. As imagens foram coletadas usando lasers 488 e 405 nm para excitação e filtros de emissão 515 e 459 nm para os dois fluoróforos, com pinhole ajustado para 176,7 e 8,9, respectivamente. As imagens adquiridas foram tratadas no software livre FIJI (SCHINDELIN et al., 2012).
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266 182 pb
243 Amplicon para β-actina
Amplicon para variante W de WFDC1/ps20 Amplicon para variante Δ3 de WFDC1/ps20 RESULTADOS
Com o objetivo de investigar a presença de RNAm das isoformas W e Δ3 da ps20 em amostras de pulmão, estômago, cólon, bexiga, próstata e ovário, o RNA de cada um desses órgãos foi isolado para a síntese do cDNA. A concentração de cDNA das amostras aplicada em cada poço do gel de agarose corresponde à 500 ng e o número total de repetições por ciclo foi de 35.
Em todas as amostras analisadas, foi observado um amplicon de 266 pb correspondente à isoforma W da ps20. Apenas nas amostras de pulmão, estômago, colón e bexiga foi amplificada bandas de 182 pb, equivalente à isoforma Δ3 da ps20 (figura 7A). Tanto na próstata como no ovário não há presença do amplicon correspondente à variante Δ3. Além disso, é visivelmente notório a diferença na concentração de regiões específicas de DNA (amplicons) entre as duas variantes para o gene WFDC1. A figura 7B exibe, na altura de 243 pb os amplicons correspondentes aos RNAm da proteína β-actina.
(A)
(B)
Figura 7. Polymerase Chain Reaction. Em (A) amplificação das regiões de DNA correspondente à expressão de RNAm da ps20 nas formas W com 266 pb e Δ3 182 pb. (B) amplificação da região correspondente à expressão do RNAm da β-actina, 243 pb.
Para detectar a presença das diferentes isoformas da proteína ps20, foram realizados ensaios de Western blot. Foram utilizados para identificação da isoforma W da ps20 um anticorpo primário que reconhece a sequência de aa -EGRVLRQKLHKEYP- localizada na extremidade C-terminal da ps20 (Figura 5) e, para
33 55 (A) kDa (B) 130 15 35 25 17 35 25 55 100 130 100 42 β-actina (C) Is o fo rm a W Is o fo rm a Δ 3
a isoforma Δ3, um anticorpo que reconhece a sequência de aa -EAVPPPPAEACSTT-que corresponde à junção dos exons 2 e 4 (Figura 6). A quantidade de proteínas aplicada em cada poço do gel de poliacrilamida foi de 60 µg para todos os órgãos. O reconhecimento das variantes W e Δ3 da ps20 nos diferentes órgãos são mostrados na Figura 8.
Figura 8. Revelação das membranas de Western blot. Em (A) anticorpo primário correspondente à extremidade C-terminal identificando a isoforma W da ps20. Em (B) anticorpo primário correspondente à sequência de aminoácidos 97 a 103 e 132 a 138 resultantes traducionais da junção entre os éxons 2 e 4 do RNAm maduro da isoforma Δ3 da ps20 e em (C) anticorpo A5316 identificando a β-actina.
34
A Figura 8A apresenta diversas espécies moleculares para a isoforma W da ps20, principalmente para os órgãos como pulmão, estômago e bexiga. Os padrões de peso molecular da isoforma W tanto no pulmão quanto na bexiga variam entre 130 a 55 kDa e, no estômago, esta variação tem uma amplitude um pouco maior comparada com os órgãos anteriores, 130 a 25 kDa. Já os órgãos como cólon, próstata e ovário apresentam apenas bandas com peso molecular de 55 kDa para isoforma W.
O resultado apresentado na figura 8B também demonstra variedades de espécies moleculares para a isoforma Δ3 da ps20. No pulmão a variação ocorre entre 110 a 25 kDa, no estômago é de 130 a 17 kDa e, na bexiga, 130 a 100 kDa. No órgão cólon não há presença de variação, apenas uma banda na altura correspondente a 55 kDa. Já a próstata e o ovário apresentam ausência da isoforma Δ3 da ps20. A figura 8C exibe bandas correspondentes à proteína β-actina. O motivo da presença de diferentes espécies moleculares das duas isoformas de ps20 será discutido na próxima sessão. Resultados semelhantes a este ensaio também foram encontrados em amostras de lisados proteicos das linhagens celulares humana PC3 e DU-145 derivadas de adenocarcinoma prostático (material suplementar ANEXOII).
Para o ensaio de Imunofluorescência foram utilizados os mesmos anticorpos primários utilizados para Western blot. A identificação das isoformas W e Δ3 da ps20 nas diferentes secções dos órgãos são mostradas nas Figuras de 9 a 13. As pranchas de todas as imagens em A correspondem à isoforma W identificada pelo anticorpo primário que reconhece a sequência de aa -EGRVLRQKLHKEYP- C-terminal da ps20. As pranchas em B, correspondem à isoforma Δ3, identificada pelo anticorpo que reconhece a sequência de aa -EAVPPPPAEACSTT- que corresponde à junção dos exons 2 e 4 e as pranchas em C correspondem aos controles negativos, onde estão ausentes os anticorpos primários. As marcações em vermelho correspondem ao DAPI, marcando núcleo celular, e o merge é o resultado da sobreposição das duas marcações.
35 ps20 DAPI Merge A Is o fo rm a W B Is o fo rm a Δ 3 C C o nt ro le n eg at iv o
As secções do pulmão das Figuras 9A e B representam as marcações para as duas variantes da ps20 que ocorrem em todas regiões das secções, bem como no saco alveolar (Sa) e regiões alveolares (Ra).
Figura 9. Secções de 5 µm do órgão pulmão. Em (A), marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à extremidade C-terminal (aa 179 a 192) identificando ambas variantes da ps20. (B) marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à sequência de aa 97 a 103 e 132 a 138 resultantes traducionais da junção entre os éxons 2 e 4 do RNAm da variante Δ3 da ps20. (C) Controle negativo, ausência de anticorpo primário. (Da) Ducto alveolar, (Sa) Saco alveolar e (Ra) Região alveolar. Ampliação 200 vezes. Barras de escala 40 µm.
Sa
Ra
36 ps20 DAPI Merge A Is o fo rm a W B Is o fo rm a Δ 3 C C o nt ro le n eg at iv o
As secções do estômago das figuras 10A e B representam as marcações para as duas variantes da ps20 que ocorrem em regiões como em glândulas gástricas (Gg), fossetas gástricas (Fg) e músculo liso (Ml).
Figura 10. Secções de 5 µm do órgão estômago. Em (A), marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à extremidade C-terminal (aminoácidos 179 a 192) identificando a variante W da ps20. (B) marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à sequência de aminoácidos 97 a 103 e 132 a 138 resultantes traducionais da junção entre os éxons 2 e 4 do RNAm da variante Δ3 da ps20. (C) Controle negativo, ausência de anticorpo primário. (Gg) Glândulas gástricas, (La) Lâmina própria, (Ml) Músculo liso e (Fa) Fosseta gástrica. Ampliação 200 vezes. Barras de escala 40 µm.
Gg
Ml
Fg
37 ps20 DAPI Merge Is o fo rm a W A B Is o fo rm a Δ 3 C C o nt ro le n eg at iv o
As secções do cólon das Figuras 11A e B representam as marcações para as duas variantes da ps20 que ocorrem em regiões como na mucosa (Mu), submucosa (Sm) e músculo liso (Ml).
Figura 11. Secções de 5 µm do órgão cólon. Em (A), marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à extremidade C-terminal (aminoácidos 179 a 192) identificando a variante W da ps20. (B) marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à sequência de aminoácidos 97 a 103 e 132 a 138 resultantes traducionais da junção entre os éxons 2 e 4 do RNAm da variante Δ3 da ps20. (C) Controle negativo, ausência de anticorpo primário. (Mu) Mucosa, (Sm) Submucosa e (Ml) Músculo liso. Ampliação 200 vezes. Barras de escala 40 µm.
Mu Sm Ml Mu Mu Sm Ml
38 ps20 DAPI Merge A Is o fo rm a W B Is o fo rm a Δ 3 C C o nt ro le n eg at iv o
As secções da bexiga das Figuras 12A e B representam as marcações para as duas variantes da ps20 que ocorrem em regiões como no urotélio (Ur) e músculo liso (Ml). Nota-se no merge da figura B que a variante Δ3 da ps20 também está localizada em núcleos de células uroteliais.
Figura 12. Secções de 5 µm do órgão bexiga. Em (A), marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à extremidade C-terminal (aminoácidos 179 a 192) identificando a variante W da ps20. (B) marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à sequência de aminoácidos 97 a 103 e 132 a 138 resultantes traducionais da junção entre os éxons 2 e 4 do RNAm da variante Δ3 da ps20. (C) Controle negativo, ausência de anticorpo primário. (L) Lúmen, (Ur) Urotélio, (Ml) Músculo liso e (Cabeças de seta) marcação nuclear para ps20 Δ3. Ampliação 200 vezes. Barras de escala 40 µm.
L Ur
Ml
39 ps20 DAPI Merge A Is o fo rm a W B Is o fo rm a Δ 3 C C o nt ro le n eg at iv o
As secções do órgão próstata das figuras 13A e B representam as marcações para as duas variantes da ps20 que ocorrem em regiões como glândulas tubuloalveolares (Gta) e estroma prostático. Nota-se no merge da figura B que a variante Δ3 da ps20 também está localizada em núcleos de células epiteliais voltada para o lúmen da glândula tubuloalveolares e em núcleos de células que compõem o estroma prostático.
Figura 13. Secções de 5 µm do órgão próstata. Em (A), marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à extremidade C-terminal (aminoácidos 179 a 192) identificando a variante W da ps20. (B) marcação realizada utilizando anticorpo primário correspondente à sequência de aminoácidos 97 a 103 e 132 a 138 resultantes traducionais da junção entre os éxons 2 e 4 do RNAm da variante Δ3 da ps20. (C) controle negativo, ausência de anticorpo primário. (Gta) Glândulas tubuloalveolares da próstata, (L) Lúmen, (E) Estroma, (Setas) epitélio glandular e (Cabeças de seta) marcação nuclear para ps20 Δ3. Ampliação 200 vezes. Barras de escala 40 µm.
Gta E E L E E
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DISCUSSÃO
Diante dos resultados obtidos, a isoforma Δ3 da ps20, caracterizada pela forma truncada da proteína (ausência de 28 aa) foi detectada nas imagens de imunofluorescência em todos os órgãos analisados. Nos ensaios de WB e PCR a mesma isoforma não foi detectada na próstata e no ovário. Do ponto de vista da síntese da ps20, principalmente da isoforma Δ3, torna-se relevante a detecção desta isoforma em outros órgãos e não apenas na próstata.
Nos ensaios de WB foram observadas bandas de diferentes tamanhos moleculares tanto para a isoforma W quanto para a isoforma Δ3. De acordo com Hickman et al. (2016) a ps20 pode sofrer modificações estruturais por duas enzimas chamadas de transglutaminase 2 (TG2) e catepsina-L (CL) que através de crosslink e clivagem, respectivamente, podem gerar bandas de diferentes tamanhos moleculares neste ensaio.
O TGM2 é o gene precursor para a transglutaminase 2 (TG2) humana e está localizado no braço longo do cromossomo 20 e, assim como a ps20, a TG2 possui mais de uma variante para seu RNAm que, após a tradução a forma integral da enzima possui 687 aa. Dependente de cálcio, a TG2 é importante para vários processos celulares, incluindo apoptose (OLIVERIO et al., 1997), desenvolvimento (AESCHLIMANN; MOSHER; PAULSSON, 1996), diferenciação (TEE et al., 2010), reparo de feridas (UPCHURCH et al., 1991) e angiogênese (HAROON et al., 1999). Contudo, um de seus papeis primordiais que abordaremos aqui é na ligação entre duas proteínas através de uma reação de transamidação (Figura 14). Tal ocorrência é realizada pela tríade catalítica composta por C277, H335 e D358 no sítio ativo da TG2. O C277 ataca o grupo amida de um resíduo de glutamina formando um tioéster intermediário durante a reação de transamidação. Em seguida, o tioéster instável é decomposto pelo grupamento amina de um resíduo de lisina, produzindo uma ligação isopeptídica estável que resulta na ligação covalente entre os dois resíduos dos aminoácidos glutamina e lisina (KIM; PARK, 2020).
41
Figura 14. Mecanismo de reação de transamidação pela TG2. Os resíduos em verde são da TG2. São mostrados dois ataques consecutivos realizado pelo sítio ativo da TG2, um no grupo tiol e outro no doador de amina, (KIM; PARK, 2020).
A enzima catepsina-L (CL) humana é produto da expressão do gene CTSL localizado no braço maior do cromossomo 9 e apresenta mais de uma variante para seu RNAm. A CL é classificada como uma cisteína protease, sua isoforma completa apresenta 333 aa e a forma ativa da enzima atua no catabolismo de proteínas, por meio de clivagem proteolíticas (TAGGART et al., 2001). Vários estudos realizados com catepsinas têm demostrado a ocorrência de clivagens em proteínas da família WAP como são os casos da proteína inibidora de protease secretada por leucócito (SLPI) (TAGGART et al., 2001) e da elafina (SALLENAVE et al., 1994).
Uma pesquisa realizada por Hickman e colaboradores (2016) utilizando amostras com ps20 humana recombinante (rps20FL e rps20TR) testaram, via WB diversas proteases como trombina, furina, algumas metaloproteinases e catepsina B com o propósito de verificar possíveis clivagens proteolíticas. Porém, os resultados obtidos demonstraram que nenhuma evidência de clivagem foi encontrada. Quando as mesmas amostras foram incubadas com CL, elas apresentaram clivagens de 4 a 8 kDa nas duas isoformas utilizando um anticorpo anti-ps20 específico para o N-terminal. No entanto, utilizando um anticorpo anti-ps20 específico para o C-terminal, ocorreram o desaparecimento das bandas com pesos moleculares inferiores nas duas isoformas da ps20, sugerindo uma clivagem específica por CL próximo a região C-terminal da ps20. Além disso, tais amostras foram incubadas com inibidores de CL e marcadas com o anticorpo anti-ps20 N-terminal e puderam observar bandas com pesos moleculares maiores que variaram entre 4 a 8 kDa comparadas com aquelas
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que não foram incubadas com os inibidores, indicando que a enzima CL tem uma atividade em clivar a extremidade C-terminal da ps20.
Guyot (2005) e Baranger (2011) e seus colaboradores identificaram a ação da TG2 no crosslinking de proteínas da família WAP como a elafina e a SLPI com a fibronectina, respectivamente. Com essas perspectivas, Hickman e demais autores (2016) analisaram também se a TG2 tem alguma relação no crosslinking da ps20 entre macromoléculas da matriz extracelular. Com isso, no primeiro momento, via WB, adicionaram TG2 em amostras contendo ps20 e utilizaram anticorpos contra as extremidades N-terminal e C-terminal. Eles observaram a formação de multímeros de ps20 de alta massa molecular (150 kDa) com a marcação da região N-terminal da proteína, com isso, sugeriram que o crosslink da ps20 envolva uma ou mais das três glutaminas na região C-terminal. Num segundo momento, para analisar se a TG2 teria influência na interação da ps20 com uma proteína da MEC, a fibronectina, eles realizaram um teste de ELISA cobrindo a superfície dos poços da placa com fibronectina, adicionaram TG2 e diferentes concentrações ps20FL, onde obtiveram resultados positivos demostrando que a ps20 apresentou crosslink com fibronectina de maneira dependente de TG2.
As reações de crosslink e clivagem catalisadas pela TG2 e CL respectivamente, fazem necessárias para o entendimento dos resultados obtidos por WB e IF. Os resultados do WB (figura 8), apresentam diversas espécies moleculares para as duas isoformas de ps20 com variações de massa molecular. As espécies moleculares das figuras 8A e 8B foram designadas como ps20 de alta massa molecular com variações até 130 kDa. Devido ao fato das isoformas da ps20 terem apresentado alta massa molecular, sugerimos que a TG2 possa ser responsável por associar as isoformas da proteína ps20 a outras proteínas, como foi demostrado por Hickman e colaboradores e observados também na figura 15 (Anexo II). Também neste ensaio, principalmente para o resultado obtido nas amostras de estômago para isoforma Δ3, foi detectado uma banda resolvida na altura de 17 kDa. Para este dado, sugerimos um evento de clivagem da extremidade C-terminal pela ação da enzima catepsina L (CL), já que quando marcado com o anticorpo que reconhece a extremidade C-terminal da proteína a banda não está presente.
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Nas imagens de IF (figuras 9 a 13) podemos observar a identificação das isoformas de ps20 por toda superfície dos cortes e em tipos celulares diversos. Este dado demonstra que, neste caso, a ps20 não está concentrada apenas em tecidos específicos como é o caso do estroma prostático alegado por Larsen e colaboradores (1998). Esta distribuição espacial talvez esteja relacionada com as funções atribuídas a ela como adesão célula-célula ou célula-matriz (Rowley, et al. 1995), interações com proteínas da matriz extracelular (Hickman, et al. 2016) garantindo assim a homeostase geral (Ressler, et al. 2014). No entanto, na isoforma Δ3, para todos os órgãos analisados, podemos observar que a intensidade da marcação está um pouco reduzida. Isto, talvez se deva a uma quantidade reduzida na expressão desta isoforma encontrada nas secções e observados também, nos ensaios de PCR (figura 7) e WB (figura 8). Um ponto relevante observado nas secções dos órgãos bexiga e próstata é a localização da isoforma Δ3 em núcleos de células uroteliais, epiteliais das glândulas tubuloalveolares e células que compõem o estroma prostático. Até o momento, a ps20 foi estudada como uma proteína de secreção que atua em diversos processos celulares já citados no texto como reparo de feridas, angiogênese e homeostase tecidual, mas sua localização nuclear não foi descrita anteriormente.
Vale destacar que no ensaio de IF a isoforma Δ3 da ps20 (figura 13B) foi detectada na próstata. Porém, o mesmo resultado não se replicou nos ensaios de PCR (figura 7A na altura de 182 pb) e no WB (figura 8B) para as amostras do mesmo órgão. O motivo pela não detecção desta isoforma nos dois últimos ensaios talvez esteja relacionado à baixa expressão de WFDC1/ps20 para isoforma Δ3 nestas amostras.
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CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos pelos ensaios realizados podemos concluir que todos os órgãos analisados (pulmão, estômago, cólon, bexiga, próstata e ovário) apresentaram a proteína estromal da próstata (ps20) na sua isoforma W, que caracteriza a forma completa da proteína. Já a isoforma Δ3 da ps20 foi detectada no ensaio de IF, porém ficaram ausentes nas amostras da próstata e ovário nos ensaios de PCR e WB. Através das reações de crosslink e clivagem catalisadas pelas enzimas transglutaminase 2 e catepsina L, respectivamente, a ps20 pode sofrer ligações cruzadas com outras proteínas, principalmente da matriz extracelular e, também, está suscetível à clivagem, principalmente na sua extremidade C-terminal. É relevante destacar que a isoforma Δ3, no ensaio de IF, foi detectada no núcleo de células uroteliais da bexiga e em células epitelial de glândulas tubuloalveolares e estromal da próstata, caracterizando um dado novo relacionado à localização desta proteína que, até o momento, não tinha sido observada no compartimento nuclear de células.
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