UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
MARIANA PINHEIRO
Diversidade fúngica e perfil de contaminação por tricotecenos do tipo B em grãos de aveia
recém-colhidos no Brasil.
CAMPINAS
Diversidade fúngica e perfil de contaminação por tricotecenos do tipo B em grãos de aveia
recém-colhidos no Brasil.
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos/ Instituto da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientadora: LILIANA DE OLIVEIRA ROCHA
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA
MARIANA PINHEIRO E ORIENTADA PELA
PROFª. DRª. LILIANA DE OLIVEIRA ROCHA.
CAMPINAS
Profª. Drª. Liliana Oliveira Rocha (Presidente da Banca) Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profª. Drª. Nathália C. Cirone Silva
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profª. Drª. Lorena Carnielli-Queiroz
Instituição: Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Agradeço imensamente aos meus pais, por me possibilitarem a realização deste projeto, com todo o suporte emocional e financeiro, bem como seu amor. Por todos os conselhos e paciência comigo durante essa jornada, que me ajudaram a evoluir como ser humano e profissional.
Ao meu irmão, por ser sempre um ótimo ouvinte nas horas difíceis, pelas celebrações e encorajamento nas conquistas e toda sua ajuda e carinho.
À minha orientadora Profª. Drª. Liliana de Oliveira Rocha, pela oportunidade de realizar este projeto. Por ter me capacitado para isto, por ter confiado e acreditado em mim e por toda ajuda despendida. Muito obrigada por toda paciência comigo durante essa jornada, por todos os ensinamentos e pelos momentos de descontração e muitos cafés.
Aos meus amigos e familiares que apoiaram ao longo de todo este processo, aceitando as minhas constantes ausências.
Aos colegas de laboratório por terem tornado esse período mais divertido, com as inúmeras brincadeiras, risadas, celebrações e cafés. Todos os momentos vivenciados foram de muitas trocas de experiências, tanto profissional quanto pessoal. Foi um grande aprendizado para minha vida!
Em especial, aos colegas: Caio, Bruno, Victor, Juliana e Patrícia, por todos os conhecimentos e ajuda compartilhados.
À Profª. Drª. Eliana Badiale Furlong pela parceria, comprometimento e toda cordialidade conosco. À Profª. Nádia Canali Langaro da e à Drª. Lorena Carnielli-Queiroz por propiciarem amostras de aveia para o desenvolvimento do projeto.
Ao CNPq pela bolsa concedida nesse período de trabalho e à CAPES. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. Agência: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Nº do Proc.: 88882.329523/2010-01; 001 (CAPES- PROEX) e 167055/2017-8 (CNPq).
A Deus pela possibilidade de realizar mais um sonho em minha vida.
Enfim, muito obrigada, a todos aqueles que se envolveram diretamente e indiretamente neste trabalho!
O estudo de fungos toxigênicos em cereais, como a aveia, é de suma importância, pois, além de poderem causar grandes perdas econômicas na agricultura, suas toxinas podem propiciar a contaminação química dos grãos, que gera riscos à saúde humana e animal. Estes fungos acometem a qualidade dos cereais, reduzindo os rendimentos das lavouras e consequentemente gerando prejuízos econômicos à agricultura. Suas micotoxinas também podem causar doenças em animais vertebrados quando ingeridas, absorvidas através da pele ou inaladas. Devido ao crescente consumo da aveia na alimentação humana e animal, o presente projeto tem como objetivo principal caracterizar a micobiota com ênfase nas espécies de Fusarium e determinar o perfil de contaminação por tricotecenos do tipo B em grãos de aveia recém-colhidos, provenientes de duas regiões produtoras do Brasil: Paraná e Rio Grande do Sul. Nesse intuito, foram realizadas: caracterização morfológica dos fungos naturalmente encontrados em grãos de aveia recém-colhidos; identificação das espécies do gênero Fusarium por caracteres fenotípicos e genotípicos e determinação de tricotecenos do tipo B nos grãos de aveia. Observou-se predominância do complexo de espécies Fusarium sambucinum nas duas regiões de estudo, principalmente das espécies F. graminearum, F. meridionale e F. poae, sendo o primeiro, um dos maiores produtores de desoxinivalenol (DON) e os dois últimos produtores de nivalenol (NIV). Com relação à contaminação por tricotecenos, houve a presença de DON e seus derivados e NIV nos grãos de aveia, com 84% de co-ocorrência no Paraná e 58% no Rio Grande do Sul. Estudos futuros devem ser realizados no sentido de averiguar o potencial risco da exposição humana por múltiplas toxinas de Fusarium.
Palavras-chave: Aveia. Fusarium. Complexo de Espécies Fusarium sambucinum. Micotoxinas. Tricotecenos do tipo B. Filogenia.
The study of toxigenic fungi in cereals, such as oats, is of the utmost importance because, in addition to causing great economic losses in agriculture, their toxins can lead to chemical contamination of the grains, which poses risks to human and animal health. These fungi affect the quality of the cereals, reducing crop yield and consequently generating economic losses to the agriculture. The exposure to mycotoxins can also cause diseases in vertebrates when ingested, absorbed through the skin or inhaled. Due to the increasing consumption of oats in human and animal feeding, the main objective of this project is to characterize the mycobiota and to determine the contamination by Fusarium toxins in freshly-harvested oat grains from two producing regions of Brazil: Paraná and Rio Grande do Sul. In order to do this, we had performed: morphological characterization of fungi naturally found in freshly harvested oats; identification of species of the genus Fusarium by phenotypic and genotypic characters and determination of trichothecenes type B in oat grains. The Fusarium sambucinum species complex was predominant in both regions. The majority of the isolates belonged to F. graminearum, F. meridionale and F. poae species, with the first able to produce, mainly deoxynivalenol (DON) and the others nivalenol (NIV). Oat grains were contaminated by DON and its derivatives as well as NIV, with 84% of co-occurrence in Paraná and 58% in Rio Grande do Sul. Future research should be conducted in order analyze the human risk of the exposure to multiple Fusarium toxins.
Key words: Oats. Fusarium. Fusarium sambucinum Species Complex. Mycotoxins. Type B trichothecenes. Phylogeny.
Figura 1- Delineamento Experimental... 39
Gráfico 1- Resultados em porcentagem da frequência de ocorrência dos gêneros mais frequentes no Paraná (PR) das amostras positivas... 41
Gráfico 2- Resultados em porcentagem da frequência de ocorrência dos gêneros mais frequentes no Rio Grande do Sul (RS) das amostras positivas... 42
Gráfico 3- Frequência dos genótipos encontrados nas diferentes espécies do Complexo de Espécies F. sambucinum... 54
Gráfico 4- Frequência dos genótipos dos isolados provenientes dos estados do Rio Grande do Sul e Paraná... 54
Gráfico 5- Frequência de ocorrência de cada espécie do CEFSAM, CEFF, CEFIE, CEFT e CEFS entre Paraná e Rio Grande do Sul... 56
Gráfico 6- Comparação entre a frequência de ocorrência dos tricotecenos do tipo B (DON, 15-ADON, 3-ADON e NIV) em grãos de aveia recém-colhidos provenientes dos estados do Paraná e Rio Grande do Sul... 58
Gráfico 7- Porcentagem de co-ocorrência de NIV e DON (e seus derivados) nos grãos de aveia recém-colhidos provenientes dos estados do Paraná e Rio Grande do Sul... 59
Figura 2 - Filogenia obtida pelo método de máxima parcimônia inferida para o primeiro fragmento do locus RPB2 dos isolados do Complexo de espécies F. sambucinum (CEFSAM) de aveia recém-colhida no Brasil...
49
Figura 3- Filogenia obtida pelo método de máxima parcimônia inferida para o para o segundo fragmento do locus RPB2 dos isolados do CEFSAM de aveia recém-colhida no Brasil...
50
Figura 4- Filogenia obtida pelo método de máxima parcimônia inferida para o para os fragmentos concatenados do locus RPB2 dos isolados do CEFSAM de aveia recém-colhida no Brasil... 51
Tabela 1- Iniciadores utilizados para amplificação do gene da segunda subunidade maior da RNA polimerase (RPB2)...
35
Tabela 2- Iniciadores utilizados para identificação dos genótipos de tricotecenos... 36
Tabela 3- LOD (3x sinal do ruído) e LOQ (10x sinal do ruído) para nivalenol, desoxinivalenol e derivativos das amostras de aveia, através do método CLAE e detecção por DAD...
38
Tabela 4- Frequência de ocorrência (FO%) nas 100 amostras de aveia analisadas. Média (UFC/g) e variação (UFC/g) da micobiota isolada das amostras positivas de aveia provenientes da região do Paraná e Rio Grande do Sul, Brasil...
40
Tabela 5- Frequência de ocorrência (FO %), média (UFC/g) e variação (UFC/g) dos Complexos de Espécies de Fusarium isolados das amostras positivas de aveia...
41
Tabela 6 – Médias dos parâmetros: temperaturas e umidades relativas registradas durante o período de desenvolvimento da aveia (Abril a Novembro de 2017), nas regiões do Paraná e Rio Grade do Sul, Brasil...
43
Tabela 7- Frequência de ocorrência (FO%) das espécies de Fusarium isoladas de grãos de aveia, dos estados do Paraná e Rio Grande do Sul...
46
Tabela 8- Quantificação de tricotecenos em grãos de aveia provenientes dos estados do Rio Grande do Sul e Paraná...
1. INTRODUÇÃO... 15 2. OBJETIVOS... 19 2.1. Objetivo Geral... 19 2.2. Objetivos Específicos... 19 3. REVISÃO DE LITERATURA... 20 3.1. Aveia... 20
3.2. Principais fungos que acometem grãos de aveia recém-colhidos... 22
3.2.1. Gênero Fusarium... 23
3.2.2. Fusarium graminearum... 26
3.3. Tricotecenos... 27
3.4. Metodologias analíticas para a determinação de micotoxinas... 28
3.5. Ocorrência de micotoxinas em aveia no Brasil e no mundo... 30
4. MATERIAL E MÉTODOS... 32
4.1. Amostragem de aveia... 32
4.4. Identificação das espécies de Fusarium... 34
4.4.1 Extração do DNA genômico dos isolados... 34
4.4.2. Sequenciamento Sanger... 34
4.4.3. Análises filogenéticas... 34
4.5. Identificação dos genótipos de tricotecenos tipo B dos isolados do CEFSAM... 35
4.5.1. Reação de PCR... 35
4.6. Análise das micotoxinas presentes nas amostras de aveia por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Detecção por Arranjo de Diodos (DAD)... 36 4.6.1. Extração de tricotecenos do tipo B... 36
4.6.2. Análise cromatográfica de tricotecenos do tipo B... 37
4.6.3. Validação do método... 37
4.7. Análise estatística dos dados... 38
5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL... 39
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 40
6.2.1. Caracterização morfológica das espécies de Fusarium... 45
6.2.2. Caracterização molecular dos isolados dos complexos de espécies de Fusarium ... 47
6.2.3. Identificação dos genótipos de tricotecenos tipo B dos isolados do complexo de espécies de
F.sambucinum...
53
6.3. Análise estatística dos dados de ocorrência fúngica em aveia recém-colhida... 55
7. OCORRÊNCIA DOS TRICOTECENOS DO TIPO B (DON, 15-ADON, 3-ADON E NIV) EM GRÃOS DE AVEIA RECÉM-COLHIDOS PROVENIENTES DOS ESTADOS DO PARANÁ E RIO GRANDE DO SUL...
56
8. CONCLUSÕES... 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 62
APÊNDICES... 76
Apêndice A- Curvas padrão para a quantificação de micotoxinas nos grãos de aveia...
76
Apêndice B- Equações das curvas analíticas dos padrões de micotoxinas e suas linearidades...
78
Apêndice C- Cromatograma dos padrões de micotoxinas... 79
INTRODUÇÃO
A aveia (Avena sativa L) é um cereal rico em nutrientes e tem ganhado o mercado econômico brasileiro e mundial. O cultivo da aveia no Brasil apresentou um aumento significativo na área colhida, produtividade e produção, a partir de 1976. A área colhida média de aveia no Brasil passou de 91,3 mil hectares durante o período de 1976 a 1986 para 375,6 mil hectares durante o período de 2018 a 2019, um acréscimo de 411,4% de área colhida. Para a produtividade, os dados foram de 966 quilogramas por hectares (Kg/ha) durante o período de 1976 a 1986 e 2.228 (Kg/ha), para os períodos de 2018 e 2019, um acréscimo de 230,6%. E para a produção, os dados médios foram de 887 quilogramas por hectares (Kg/ha) durante o período de 1976 a 1986. O valor médio para os anos de 2017 e 2018 foi de 2.233(Kg/ha). Perfazendo, assim, um acréscimo médio de 251,74,% (CONAB, 2019).
Este cereal é bem adaptado às regiões de estação fria, áreas entre 35º e 50º de latitude norte e 20º e 40º de latitude sul. Tal adaptação se reflete na concentração de produção no hemisfério norte, sendo que os países da União Europeia, do Canadá e da Rússia foram responsáveis por 84,0% da produção mundial no período de 2018 a 2019 (USDA, 2019).
O consumo de aveia e de seus subprodutos tem aumentado nos últimos anos, sendo impulsionado, principalmente, pelo melhor conhecimento sobre suas propriedades nutricionais e benefícios que este cereal propicia à saúde humana e animal. Por constituir de alto valor proteico, boa capacidade de moagem e cozimento, é amplamente utilizada na indústria de alimentos, assim como seu alto conteúdo de proteína digerível e baixos teores de fibra bruta contribuem para a forragem animal (BIEL et al., 2009). A composição de lipídios na aveia é favorecida pelo alto teor de ácidos graxos insaturados, dentre eles o linoleico que é considerado essencial para a nutrição humana, sendo também o mais abundante (RUPOLLO et al., 2013).
De acordo com Grundy et al. (2017), a aveia é composta de três partes anatômicas distintas: o pericarpo e a testa (farelo), endosperma e embrião (germe). O farelo constitui um casaco grosso e fibroso, de difícil separação do endosperma e contém as camadas de aleurona e subaleurona que são ricas em: proteínas, lipídios, minerais, vitaminas e paredes celulares de polissacarídeos. O endosperma é rico em amido, enquanto o germe é uma fonte importante de proteínas e lipídios.
Os fungos constituem o mais numeroso e importante grupo de fitopatógenos associados à aveia, tendo como destaque os gêneros: Alternaria, Fusarium, Helminthosporium (H. avenae), Pyricularia, Rhynchosporium, Tilletia e Ustilago (U. avenae) (PITT & HOCKING, 2009). Estes
acometem a qualidade dos cereais, reduzindo os rendimentos das lavouras e consequentemente gerando prejuízos econômicos à agricultura.
Alguns gêneros de fungos podem produzir micotoxinas, compostos de baixo peso molecular que podem causar doenças em animais vertebrados quando ingeridos, absorvidos através da pele ou inalados (FRISVAD e SAMSON, 2007). Em plantas, alguns podem atuar como fatores de virulência, proporcionando modulação do sistema imune das mesmas e, em alguns casos, sendo essencial para a patogenicidade do fungo (MA et al., 2013).
Os fungos toxigênicos podem contaminar os grãos no campo, antes da colheita ou durante o armazenamento e, geralmente, as micotoxinas produzidas persistem em alimentos processados, devido à elevada resistência aos tratamentos dos quais o alimento foi submetido durante o processamento (RUPOLLO et al., 2005). Ressaltando que, a ocorrência de micotoxinas em alimentos e derivados é um problema que afeta o agronegócio de muitos países, podendo interferir ou até mesmo impedir a exportação e reduzir a produção animal e agrícola (MAZIERO & BERSOT, 2010).
Segundo O'Donnell et al. (2013) as espécies do gênero Fusarium estão entre as mais destrutivas do ponto de vista econômico como patógenos de plantas e fungos toxigênicos, sendo uma ameaça à saúde vegetal, animal e segurança alimentar do consumidor. Algumas das doenças em plantas, acometidas principalmente, pelo complexo de espécies F. graminearum (CEFG), incluem a giberela ou Fusarium Head Blight, cujos principais sintomas em cereais de inverno são: abortamento de flores, formação de grãos chochos, enrugados, ásperos e de coloração rósea à esbranquiçada (LIMA, 2004). São responsáveis, também, por reduzir a qualidade nutritiva e tecnológica dos grãos, bem como o teor de proteínas, valores nutricionais e vigor das sementes (TRALAMAZZA, 2015).
Outros danos, indiretos, são causados pela presença de micotoxinas nesses cereais. Entretanto, somente a presença do grão giberelado não significa que há micotoxinas. Neste sentido, Fusarium spp. produzem uma ampla variedade de micotoxinas, incluindo os tricotecenos tipo A (Toxinas T2, HT2, diacetoxiscirpenol - DAS) e B (desoxinivalenol e derivados, nivalenol), zearalenona, fumonisinas, moniliformina, beauvericina, ácido fusárico, giberelina e eniatinas (O'DONNELL et al., 2013 & MYLONA, 2011).
Desoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV), T-2 e HT-2, zearalenona (ZEA), moniliformina (MON), beauvericina (BEA) e eniatinas (ENNs) são importantes toxinas contaminantes em aveia. No entanto, no Brasil, devido às condições climáticas, as principais micotoxinas presentes na aveia são os tricotecenos tipo B e ZEA, produzidos principalmente por cepas do CEFG. O consumo de
elevados níveis de DON pode causar náuseas, diarreias e vômitos em humanos e alguns animais. Zearalenona está relacionada a casos de hiperestrogenismo, ocasionando danos aos órgãos reprodutivos, principalmente em suínos e possivelmente em humanos. T-2 e HT-2 são imunotóxicas e potenciais inibidoras de síntese de proteínas (FREDLUND et al., 2013). O consumo de NIV pode causar náuseas, diarreias, vômitos e dores abdominais (EFSA, 2013).
Outras espécies importantes sob o ponto de vista toxigênico e que são encontradas com menor frequência em cereais de inverno no Brasil são: Fusarium poae, sendo esta a maior produtora de NIV; Fusarium culmorum, capaz de produzir DON e ZEA; F. avenaceum e F. trincictum capazes de produzir ENNs e MON e, por último, F. incarnatum-equiseti que podem sintetizar DON e ZEA (O´DONNELL et al., 2013).
Os tricotecenos são um grupo de mais de cem micotoxinas e possuem esse nome devido a sua estrutura química, composta de um anel com esqueleto tetracíclico 12,13-epoxitricotecenos. Essas toxinas são classificadas em tipo A, na qual se encontram as toxinas T-2, HT-2, 15-monoacetoxiscirpenol (15-MAS) e DAS, e em tipo B, na qual está o DON e seus derivados acetilados: 3-acetildesoxinivalenol (3-ADON) e 15-acetildesoxinivalenol (15-ADON) (O´DONNELL et al., 2013).
A determinação do potencial toxigênico do fungo pela sua sequência gênica é denominada genótipo. O uso desta técnica permite definir a distribuição geográfica do perfil toxigênico e prever o impacto desses fungos na segurança alimentar, de maneira mais acessível que a determinação do conteúdo toxigênico por análises químicas. Os isolados produtores de tricotecenos tipo B normalmente apresentam um dos três perfis de genótipo: NIV: quando o fungo produz NIV e seus derivados acetilados; 3-ADON: quando produz o derivado 3-acetildesoxinivalenol como precursor de DON ou 15-ADON: quando produz o derivado 15-acetildesoxinivalenol como precursor de DON (TRALAMAZZA, 2015).
Os tricotecenos são formados a partir de uma molécula sesquiterpenóide (15 carbonos) denominada farnesil-pirofosfato. A biossíntese de tricotecenos decorre desta molécula por intermediário de tricodieno, considerado o seu precursor. Desta forma, sua síntese compreende na ciclização do anel sesquiterpeno catalisada pela enzima tricodieno sintase, seguida de oito oxigenações e quatro esterificações. A sequência de oxigenações, isomerizações, ciclizações e esterificações levam a molécula básica tricodieno a formar complexas estruturas de tricotecenos tais como diacetoxiscirpenol (DAS), toxina T-2, desoxinivalenol e nivalenol (ASTOLFI, 2010).
A zearalenona é uma lactona do ácido fenólico resorcílico e, sua estrutura sugere que seja sintetizada pela via do acetato - polimalonato, resultando na condensação de unidades de acetato
produzida por várias espécies de Fusarium. F. graminearum e F. culmorum são consistentes produtores de DON e ZEA em aveia (RUPOLLO et al., 2005; SAMSON, 2007; FREDLUND. et al, 2013 ).
De acordo com Watanabe et al. (2011), as espécies de Fusarium são amplamente estudadas em vários campos, tais como: biologia molecular, ecologia, fitopatologia, microbiologia médica, toxicologia, entre outros. No entanto, a precisão na identificação das mesmas é um problema comumente encontrado pelos pesquisadores. Em geral, as espécies são reconhecidas com base em seu conceito morfológico de espécie, biológico, filogenético e combinações destes, denominado sistema polifásico. Neste, ainda pode ser inclusa a caracterização pela produção de metabólitos secundários ou extrólitos, como parte da identificação fenotípica do fungo. Ainda, em diversas situações, espécies de Fusarium não se adequam a esta classificação, pois linhagens podem evoluir e diversificar rapidamente, por mecanismos variados de troca genética. Sendo assim, o conceito filogenético de espécie é considerado o mais adequado para a definição das linhagens no referido gênero (O´DONNELL et al., 2013).
Estudos anteriores demonstraram que diversos genes housekeeping podem ser informativos para distinção das espécies de Fusarium. Através da reconstrução de topologias constituídas de múltiplos genes, grupos puderam ser reclassificados em linhagens filogenéticas. Dentre os loci informativos para o gênero Fusarium, destacam-se RNA polimerase 1 (RPB1) e as subunidades da RNA polimerase 2 (RPB2) que são notados por sua capacidade de resolução de grupos intra e interespecíficos de fungos (GEISER et al., 2004; O´DONNELL et al., 2013).
Nos cereais de inverno, são destacados os complexos de espécies: F. sambucinum (CEFSAM) que inclui o complexo de espécies F. graminearum (CEFG), F. tricinctum (CEFT), F. incarnatum-equiseti (CEFIE) e, em menor frequência, F. fujikuroi (CEFF) (O´DONNELL et al., 2013). Neste sentido, o CEFG que, anteriormente, era composto por uma única espécie, F. graminearum (GERLACH & NIRENBERG, 1982), foi dividido em nove espécies filogenéticas (O´DONNELL et al., 2004) e, posteriormente, em dezesseis (AOKI et al., 2012). Através destes estudos, também se observou que as diferentes linhagens filogenéticas apresentavam estrutura biogeográfica e quimiotipos distintos (AOKI et al., 2012; VAN DER LEE et al., 2015). Na América do Sul, existem quatro espécies filogenéticas: F. austroamericanum, F. cortaderiae, F. brasilicum e F. meridionale, além de F. graminearum que possui distribuição mundial. As três primeiras podem apresentar quimiotipos NIV ou 3-ADON, enquanto F. meridionale apresenta apenas quimiotipo NIV e F. graminearum podendo ser NIV, 3-ADON ou 15-ADON. Estudos têm demonstrado que cepas 3-ADON podem apresentar perfil mais agressivo e com maior potencial de
produzir micotoxinas. Os isolados do CEFSAM possuem alta semelhança morfológica e seus membros podem produzir variados tipos de micotoxinas (AOKI et al., 2012).
Sendo assim, a determinação das espécies de Fusarium e a determinação das linhagens filogenéticas do CEFSAM, bem como das micotoxinas tricotecenos do tipo B, em grãos de aveia recém-colhidos do Rio Grande do Sul e Paraná agregam importantes e novas informações sobre este grupo. A determinação dos genótipos dos isolados possibilita avaliar a correlação dos mesmos com o perfil de tricotecenos do tipo B na aveia produzida no Brasil. Além disso, a quantificação dos níveis de tricotecenos do tipo B nas amostras de aveia contribui para avaliar o nível de exposição às estas micotoxinas pela população brasileira.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo geral deste estudo é caracterizar a micobiota, com ênfase no complexo de espécies Fusarium sambucinum e verificar o perfil de contaminação por tricotecenos do tipo B em grãos de aveia recém-colhidos, provenientes de diferentes regiões produtoras do Brasil.
2.2. Objetivos Específicos
Caracterizar a micobiota dos grãos de aveia recém-colhidos provenientes das regiões produtoras dos estados do Paraná e do Rio Grande do Sul;
Identificar os isolados fúngicos até o nível de gênero, através dos caracteres morfológicos clássicos;
Identificar as espécies de Fusarium, a partir do sequenciamento do gene da RNA polimerase 2 (RPB2);
Identificar os genótipos (3-ADON, 15-ADON e NIV) dos isolados pertencentes ao Complexo de Espécies Fusarium sambucinum;
Quantificar as micotoxinas desoxinivalenol (DON), 3-acetildesoxinivalenol (3-ADON), 15-acetildesoxinivalenol (15-ADON) e nivalenol (NIV) nos grãos de aveia provenientes das regiões de estudo.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Aveia
A aveia é uma gramínea anual pertencente à família Poaceae, tribo Aveneae e gênero Avena. Tal gênero compreende várias espécies silvestres, daninhas e cultivadas distribuídas nas Américas do Norte e Sul, Ásia, África, Oceania e Europa (EMBRAPA, 2012).
A origem da aveia é localizada na região da Ásia Menor. Sendo posteriormente levada à Europa, onde foi amplamente utilizada como componente de rotação de culturas e utilização no arraçoamento de cavalos na Europa do Norte, entre os anos de 1000 e 1500. A relação estabelecida entre aveia e alimentação de cavalos influenciou decisivamente sua expansão no período em que o animal serviu como principal meio de tração (MORI et al., 2012).
Os espanhóis introduziram a cultura da aveia na América, durante o século XV. Registros desta época relatam atividades fracassadas de introdução de inúmeros cultivares de aveia importados de várias partes do mundo, em especial, devido a doenças como a ferrugem da folha, ocasionada por Puccinia coronata. A área da cultura tem se concentrado na região sul do país, com registros de cultivo no Mato Grosso do Sul, a partir da década de 1980 e registros esporádicos em estados como Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Goiás, Distrito Federal e Mato Grosso (EMBRAPA, 2012).
As espécies cultivadas no Brasil são a aveia branca (Avena sativa L.), aveia amarela (Avena byzantina C. Koch), espécies de duplo propósito com produção de forragem e grãos, e a aveia preta (Avena strigosa Schreb) empregada como pastagem, de forma isolada ou em consorciação com outras forrageiras, e como adubo verde. Formas silvestres como Avena fatua L., Avena barbata Pott ex-Link e Avena sterilis L., também são encontradas (MORI et al., 2012). Apesar da ocorrência dessas espécies no país, A. sativa e A. strigosa ocupam grande área cultivada no Sul do Brasil, principal região produtora do referido cereal (CARVALHO et al., 1987). A aveia branca é uma gramínea anual de inverno. Morfologicamente, apresenta grãos maiores do que a aveia preta, sendo utilizada para alimentação de equinos ou para suprir as indústrias de cereais matinais (flocos e farinha). Pode ser utilizada também, na composição de pastagens anuais de inverno, para conservação na forma de feno e silagem, inclusive de grãos úmidos, ou como duplo-propósito, quando é pastejada durante fins de outono até meados do inverno e, então diferido para a produção de grãos ou ensilagem (EMBRAPA, 2012).
Esta espécie é mais exigente em fertilidade de solo e menos resistente à seca, porém, mais tolerante ao frio. A época de semeadura no Rio Grande do Sul é de Março a Maio, para pastagem, e de Maio a Julho, para produção de grãos, de acordo com a região (EMBRAPA, 2009).
A aveia preta é pouco exigente em fertilidade de solo, apresentando boa adaptação às condições climatológicas dos estados do Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, São Paulo e Mato Grosso do Sul. Possui sementes menores, e seus grãos não são utilizados na alimentação humana. Caracteriza-se por crescimento vigoroso e tolerância à acidez do solo. É a forrageira anual de inverno mais usada para pastejo no inverno, no Sul do Brasil (FONTANELI et al., 1982).
Atualmente, os maiores produtores mundiais de aveia são a União Europeia (UE), Rússia, Cazaquistão, Austrália, Estados Unidos e Brasil (USDA, 2019). Os três primeiros produziram em milhões de toneladas, respectivamente: 8,04; 4,75 e 3,20; perfazendo 67,1% da produção mundial. O Brasil apresentou produção de 0,83 milhões de toneladas, perfazendo 3,48% da produção mundial, sendo considerado o maior produtor do cereal na América Latina em 2017, seguido da Argentina, Chile e Uruguai. Esta situação também foi observada para a projeção da safra de 2018 (USDA, 2019).
O cultivo de aveia no Brasil apresentou aumento a partir de 1980 (ALMEIDA & REIS, 2009). Porém até o ano de 2015, os maiores produtores na América do Sul eram a Argentina e o Chile, seguido do Brasil (USDA, 2019). A preferência na utilização de aveia sempre recaiu sobre a produção de forragem, isolada ou associada a outras forrageiras, cultivando-se principalmente aveias pretas. A pequena área de cultivo de aveia nas décadas de 1940 a 1970 pode ser atribuída à falta de cultivares adaptadas às condições climáticas do país e aos problemas causados pela ferrugem da folha (MORI et al., 2012). Um dos fatores que contribuíram para o aumento da área cultivada com aveia foi à adequação do sistema de cultivo tradicional, em substituição ao trigo ou cevada, na rotação de culturas, devido à menor susceptibilidade aos patógenos que causam manchas foliares e de podridões radiculares, tais como Fusarium graminearum, Fusarium culmorum e Fusarium avenaceum (ALMEIDA & REIS, 2009 &TRALAMAZZA, 2015).
A produção brasileira de aveia grão está concentrada nos estados do sul do país. Na safra de 2017, o Rio Grande do Sul representou 77,2% da produção brasileira e o Paraná, aproximadamente 19,5%, sendo os cultivos destas regiões destinados, principalmente, à produção de grãos, forragem e adubação verde (EMBRAPA, 2009). Outro estado que participou da produção brasileira de aveia foi o Mato Grosso do Sul, correspondendo a 3,3% da produção total do país (CONAB, 2017), sendo o cultivo utilizado, especialmente, para a produção de forragem (DEL DUCA et al., 1999).
O consumo de aveia e seus subprodutos têm aumentado, impulsionado principalmente, pelo melhor conhecimento sobre suas propriedades nutricionais e pelos benefícios que este cereal propicia à saúde (RUPOLLO et al., 2013). Os benefícios atribuídos à fibra solúvel da aveia na redução de colesterol no sangue e como alimento funcional tem ampliado o interesse pelo consumo do cereal e incrementado a oferta de produtos. Um exemplo da ampliação do uso do produto é o leite UHT que mistura óleo de palma e aveia, ao qual é atribuída função de auxiliar o sistema gastrointestinal e no emagrecimento (EMBRAPA, 2012).
A aveia destaca-se dentre os outros cereais por seu teor e qualidade proteica, variando de 12,40 a 24,50% no grão descascado e por sua maior porcentagem de lipídios, que varia de 3,10 a 10,90%, distribuídos por todo o grão e com predominância de ácidos graxos insaturados. O cereal também se destaca por seu teor de fibras alimentares e, principalmente, pela concentração de beta-glucanas, componentes estruturais das paredes celulares dos cereais, que atuam na redução do colesterol em indivíduos com hipercolesterolemia. Além disso, o consumo de aveia pode diminuir a absorção de glicose, o que é benéfico para diabéticos, e pode estimular funções imunológicas, tanto in vitro quanto in vivo (MORI et al., 2012).
Apesar dos benefícios supracitados, o maior uso da aveia no Brasil e no mundo é na alimentação animal, incluindo pastagens e ração para cavalos de corrida. Na alimentação humana, o cereal tem sido empregado na produção de diversos produtos processados, tais como cereais matinais, constituintes de pães e bolos, componente adicional de sopas e molhos, dentre outros (MORI et al., 2012).
3.2. Principais fungos que acometem grãos de aveia recém-colhidos
Os cereais de inverno podem ser acometidos por diversas doenças fúngicas, tais como as manchas foliares, morte súbita e podridões (FONTANELI et al., 1982). Alguns fungos fitopatogênicos que infectam a planta durante o seu desenvolvimento são também, toxigênicos. Além disso, alguns endófitos podem também produzir micotoxinas durante esta etapa, contribuindo para o acúmulo destas substâncias nos grãos (SOUZA, et al., 2004). Sendo assim, a presença destes proporcionam perdas notórias para o agronegócio.
Os principais gêneros de fungos toxigênicos que acometem cereais são: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Nos cereais de inverno, destaca-se também o gênero Alternaria, principalmente nos países nórdicos devido à elevada umidade e clima temperado. No entanto, com
as alterações climáticas, espécies de Fusarium têm persistido na maioria dos cereais de inverno em todo o mundo (AOKI et al., 2012).
Na aveia recém-colhida, observa-se maior contaminação pelas espécies de Fusarium, que são patógenos de plantas e produzem micotoxinas antes ou imediatamente após a colheita. Os gêneros Penicillium e Aspergillus são mais comumente encontrados como contaminantes de produtos durante a secagem e o armazenamento, porém, também podem ser encontrados no campo (RUPOLLO et al., 2006). Outros fungos são importantes sob o ponto de vista patológico, sendo estes Helminthosporium (H. avenae), Pyricularia, Rhynchosporium, Tilletia e Ustilago (SILVA, 2016).
Giberela ou Fusarium Head Blight é uma doença que acomete cereais de inverno e é causada principalmente por Fusarium graminearum. Outras espécies, como Fusarium culmorum, F. avenaceum, F. poae e Microdochium nivale, também podem ocasionar a doença, embora geralmente sejam menos importantes do que F. graminearum (FAO, 2017).
A doença causada por F. graminearum é comum em áreas úmidas com clima mais ameno, como na América do Sul. A ocorrência aumentou nos últimos anos, atingindo níveis de epidemia em vários países, incluindo Argentina, Brasil, Canadá, México, Uruguai e EUA. Os danos causados pela doença podem ser diretos, relacionados a perdas de produção, ou indiretos, relacionados à contaminação de grãos com micotoxinas produzidas pelo fungo (FAO, 2017).
Os sintomas característicos da giberela na aveia são espigas descoloridas, de cor pálida ou esbranquiçada, que contrastam com panículas verdes saudáveis normais. Condições ambientais quentes e úmidas, como temperaturas entre 20 e 25ºC e umidade relativa atmosférica superior a 90%, favorecem a doença. O inóculo inicial vem de restos de colheita de vários hospedeiros, onde o patógeno pode sobreviver. Os ascósporos são disseminados pelo vento para as anteras, que são os locais de infecção preferidos (FAO, 2017).
3.2.1. Gênero Fusarium
O gênero Fusarium possui ampla distribuição nos mais diversos ecossistemas. Este gênero possui considerável flexibilidade ecológica, sendo que as suas espécies podem ser encontradas como saprófitas, endófitos e como importantes patógenos no sistema agrícola. Este grupo também possui a capacidade de produzir elevada variedade de micotoxinas, metabólitos secundários que causam intoxicação nos homens e animais e geram perdas substanciais à economia (O'DONNELL et al., 2013).
Este gênero é classificado em reino Eumycota, divisão Ascomycota, classe Euascomycetes, ordem Hipocreales, família Hypocreaceae (POLETTO et al., 2006). Inclui espécies que produzem macroconídios hialinos, geralmente septados, caracterizados por possuírem as células basal e apical distintas, que são de grande importância em sua taxonomia (GODOY & COLOMBO, 2004).
Fusarium foi primeiramente descrito por Link, em 1809, e na época denominado Fusisporium. Com mais de 1000 indivíduos descritos, o gênero foi divido pela primeira vez por Wollenweber e Reinking, em 1935. Os autores separaram o grupo em 16 seções que incluíam 65 espécies, 55 variedades e 22 formas, utilizando critérios morfológicos como tamanho e forma de macroconídios, presença de clamidósporos como também crescimento em diferentes meios (NELSON, 1991).
Seu alto potencial toxigênico e patogênico contribuem para a relevância dos estudos de taxonomia deste gênero. Entretanto, sua identificação e classificação foram sempre complexas e controversas, diferindo entre si, principalmente, pelas metodologias adotadas (TRALAMAZZA, 2015). Para o estudo da taxonomia do gênero Fusarium, existem três conceitos que definem uma espécie: morfológico, biológico e filogenético. O conceito morfológico baseia-se no fato de que um grupo de indivíduos apresentam as mesmas características morfológicas, divergindo de outros grupos (ROCHA, 2010).
Os microconídios possuem diferentes formas e os clamidósporos podem estar presentes ou ausentes. Os macroconídios são formados em esporodóquios (massa de macroconídios), o que é importante na identificação das espécies, enquanto que os microconídios se formam a partir de conidióforos sobre o ágar. O modo de formação dos microconídios, a presença de cadeias e a formação de clamidósporos são importantes na diferenciação entre espécies (VENTURA, 1999; NELSON et al., 1981; BOOTH, 1971).
De acordo com Booth (1971), a morfologia dos esporos é a melhor característica para a identificação de Fusarium. Quando os microconídios são formados em cadeias, é facilmente possível observar colocando-se uma placa de Petri aberta debaixo da lente de um microscópio de baixa magnitude (POLETTO et al., 2006).
Entretanto, ao longo dos anos, diversas divisões foram criadas para o gênero (NELSON, 1991). Em 1940 Snyder e Hansem diminuíram severamente o número de espécies para somente nove. Décadas depois, Niremberg em 1982, categorizou o gênero em aproximadamente 90 espécies e Nelson um ano depois, destacou 30 espécies oficiais e classificou outras 16 como prováveis espécies (BROWN & PROCTOR, 2013).
O conceito biológico de espécie classifica os diferentes grupos em termos de intercruzamento. Este conceito define o termo “espécie” pela capacidade em que os indivíduos, dentro de um grupo, têm de produzir gametas que se fundem para formar um novo indivíduo igualmente fértil (FUTUYMA, 1997). Contudo, com o tempo, diferentes definições de espécies começaram a surgir. O uso do cruzamento sexual entre diferentes espécies fúngicas (mating type) definiu um novo conceito: o conceito biológico de espécie. Este conceito é definido por: indivíduos capazes de cruzar entre si, combinar informação genética e passar para progênie (KLITTICH et al., 1997).
O conceito filogenético de espécie define que “espécie” é o menor subgrupo (clado) de indivíduos ou de populações que compartilham um conjunto único de caracteres diagnosticáveis (HARRINGTON & RIZZO, 1999).
Atualmente, a taxonomia do gênero está dividida em complexos de espécies, baseada em marcadores genéticos e reconstrução filogenética. Nos cereais de inverno, são destacados os complexos de espécies: F. sambucinum (CEFSAM) que inclui o complexo de espécies F. graminearum (CEFG), F. tricinctum (CEFT), F. incarnatum-equiseti (CEFIE) e, em menor frequência, F. fujikuroi (CEFF) (O´DONNELL et al., 2013).
As principais micotoxinas produzidas pelo CEFSAM são: tricotecenos tipo A (T-2, HT-2 e DAS); tricotecenos tipo B (DON e seus derivados 3-ADON e 15-ADON); NIV e seu derivado (4-ANIV) e ZEA. Filogeneticamente, o CEFG situa-se dentro do CEFSAM e, portanto, são também produtores de tricotecenos. No caso, principalmente, tricotecenos do tipo B e zearalenona. O CEFT produz giberelina, CEFIE tricotecenos tipo B. O CEFF é considerado o maior produtor de fumonisinas e moniliformina, porém, sua ocorrência é maior em cereais de verão, tais como: milho, sorgo e arroz (O’DONNELL et al., 2013).
Nos países europeus, a aveia possui elevada contaminação por Fusarium, especialmente as espécies F. poae e F. langsethiae. Estes são os produtores mais importantes de T-2 e HT-2, enquanto que F. poae é o principal produtor de NIV e BEA. Em outras regiões, encontram-se F. graminearum e F. culmorum produtores de DON e ZEA. F. avenaceum e F. tricinctum, espécies capazes de produzir ENNs e MON, são encontradas com menor frequência (FREDLUND et al., 2013).
A aveia é um cereal propício à contaminação por espécies do CEFSAM, sendo, portanto, importante considerar a possível exposição humana e animal às toxinas produzidas por este grupo, incluindo DON, 3-ADON, 15-ADON, NIV e ZEA. Outras toxinas relatadas na aveia incluem
MON, ENNs e BEA, produzidas pelo CEFSAM, CEFT e CEFF, apesar da baixa ocorrência deste grupo no cereal (FREDLUND et al., 2013).
3.2.2. Fusarium graminearum
O complexo de espécies Fusarium graminearum (CEFG) é o principal responsável pela giberela em cereais de inverno, uma doença de infecção floral e, devido aos surtos epidêmicos durante os últimos 20 anos, F. graminearum stricto sensu (s.s) foi considerado o principal fitopatógeno de cereais no mundo. Este grupo é capaz de produzir tricotecenos do tipo B e, recentemente, tricotecenos do tipo A, além de zearalenona (VARGA et al., 2014).
Os representantes do CEFG são morfologicamente semelhantes e foram rearranjados em grupos de múltiplas linhagens, através de estudos sobre o conceito de reconhecimento de espécies filogenéticas, baseado em concordância genealógica. Atualmente, o grupo é dividido em cinco clados correspondentes à origem biogeográfica: América do Norte (contendo F. graminearum s.s que é amplamente distribuída), Ásia, América Central e América do Sul. O clado sul americano é composto pelas espécies F. brasilicum, F. meridionale, F. cortaderiae e F. austroamericanum (O’DONNELL, 2013). Tanto a distribuição quanto a predominância destas espécies estão associadas a fatores climáticos, especialmente temperatura amenas, com temperatura ótima para o desenvolvimento de patógeno entre 24-26ºC e umidade relativa do ar elevada. A infecção por Fusarium ocorre sob condições de elevada pluviosidade e períodos de alternância entre baixa temperatura (~14ºC) e altas temperaturas (~28ºC) (MILANESI, 2012; EMBRAPA, 2009).
O estudo sobre a espécie de F. graminearum é muito importante, pois esta pode ser encontrada em restos culturais e em sementes como: aveia preta, trigo, arroz, milho, cevada, centeio e outras poáceas. Culturas desse patógeno foram recuperadas a partir de restos culturais de soja, o que pode significar maior intensidade de doenças em culturas subsequentes e menor rendimento em sistema de plantio direto. Estes podem ser disseminados para a parte aérea da planta, através de respingos da chuva ou irrigação por aspersão. O fungo sobrevive nos restos culturais devido a produção de estruturas denominadas peritécios. Os esporos que saem dos peritécios servirão como fonte de inóculo inicial para infectar a parte aérea dos cultivos da safra seguinte, tais como aveia preta, trigo, cevada e centeio (MILANESI, 2012).
De acordo com Yli Mattila (2010), F. graminearum foi isolado pela primeira vez em cereais finlandeses na década de 1960, ocasionando Fusarium Head Blight. Neste estudo, níveis mais altos de DON foram encontrados em aveia e os mais baixos, em centeio e trigo. Segundo FREDLUND et al. (2013), em países europeus, a aveia apresenta maior contaminação por micotoxinas como DON,
NIV, T-2 e HT-2, em relação a outros cereais como trigo e cevada. Vale ressaltar que o impacto da presença de F. graminearum e do acúmulo de micotoxinas na aveia tem sido pouco investigado nos países da América do Sul.
3.3. Tricotecenos
Os tricotecenos são micotoxinas constituídas por anéis tricíclicos que apresentam uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 10 e um grupamento epóxido nas posições 12 e 13 da estrutura. Os átomos de carbono ligados a um grupo hidroxila, acetil ou cetônico podem sofrer reações químicas características destes grupamentos, formando diferentes compostos. (GARDA et al., 2004).
As micotoxinas deste grupo são produzidas por diversos gêneros de fungos: Fusarium, Myrothecium, Stachybotrys, Cylindrocarpon, e Trichothecium, do qual o nome tricoteceno foi derivado. Apesar do grande número destes compostos na natureza, somente pequena quantidade (menos de 10) tem sido detectada a partir de contaminação natural em alimentos, tais como DON, NIV, T-2, HT-2 e diacetoxiscirpenol (DAS). Os tricotecenos inibem a síntese de proteínas, de DNA e RNA e acarretam efeitos imunossupressores e hemorrágicos. O efeito tóxico dos tricotecenos se deve principalmente ao anel epóxido, pois sua destruição resulta em perda total da toxicidade. No entanto, há evidências que indicam a influência dos grupamentos substituintes e da ligação dupla entre o carbono 9-10 nesta característica (GARDA et al., 2004).
Os genes responsáveis pela produção de micotoxinas estão, tipicamente, agrupados em clusters e, supostamente, possuem origens evolutivas complexas, envolvendo transferência horizontal, duplicação de genes, polimorfismo ancestral e perda de genes. Os genes TRI são responsáveis pela produção de tricotecenos e estão agrupados em 3 clusters. O cluster contendo a maior parte dos genes (core gene cluster) é composto por 12 genes responsáveis, na sua maioria, pela síntese das principais moléculas dos tricotecenos. Os outros dois loci são menores, sendo um composto por TRI1 e o outro composto por dois genes TRI1 e TRI16. Devido a diferenças estruturais em TRI1 e mutações deletérias em TRI16, ao invés de ocorrer reação de esterificação no carbono 8 da molécula 3,4,15- triacetoxiscirpenol (o que leva à produção de tricotecenos tipo A), reações de oxidação levam à produção de tricotecenos do tipo B, denominados desoxinivalenol (DON) e nivalenol (NIV) como também seus metabólitos intermediários (MCCORMICK et al., 2011).
Os tricotecenos são divididos em dois grupos: macrocíclicos e não-macrocíclicos. O último também é dividido entre tricotecenos de tipo A e de tipo B e estes são produzidos pelo gênero
Fusarium. Estão entre os tricotecenos do tipo A: toxinas T-2 e HT-2, neosolaniol (NEO) e diacetoxiscirpenol (DAS) (VARGA et al., 2014).
O CEFG é produtor de duas recém- descobertas toxinas, NX-2 e NX-3, do grupo de tricotecenos tipo A. Assim como 3-ADON e 15-ADON podem ser hidrolisados para DON, NX-1 é um derivado do NX-2 e seu produto desacetilado (denominado NX-3D) foi produzido por hidrólise alcalina e subsequente purificação (VARGA et al., 2015).
Após a formação do clado, novas espécies foram incluídas e, até o momento, 16 espécies fazem parte do complexo (VARGA et al., 2014). Entre os tricotecenos de tipo B estão desoxinivalenol e derivados acetilados como 3-acetil-DON e 15-acetil-DON, nivalenol e fusarenona-X (FUSX). A produção de toxina é maior com a elevação da umidade e temperaturas entre 6 – 24º C. O principal atributo tóxico dos tricotecenos é a inibição da síntese proteica. Isso afeta células em rápida divisão, como aquelas do trato gastrointestinal, pele e tecidos linfoides e eritroides. Os efeitos em animais incluem perda de peso ou baixo ganho de peso, diarreia sanguinolenta, necrose dérmica ou lesões herniantes, além de redução na produção (ganho de peso, produção de ovos, leite etc.). O limite máximo de DON, nos cereais recém-colhidos, de acordo com a Resolução RDC nº 138/2017 é de 1000 µg/kg (ANVISA, 2017). De acordo com a legislação da União Europeia o limite de DON em aveia é de 1750 µg/kg (EC, 2013). E de acordo com a legislação dos Estados Unidos o limite de DON em aveia é de 1000 µg/kg. (US FDA, 2017).
Os demais tricotecenos (T-2 e HT2) tem os respectivos limites máximos de acordo com a legislação da União Europeia é de 1000 µg/kg (EC, 2013) e para a legislação dos Estados Unidos seu limite é de 1000 µg/kg (US FDA, 2017).
3.4. Metodologias analíticas para a determinação de micotoxinas
Historicamente, a determinação de micotoxinas em alimentos sempre foi considerada um desafio, uma vez que estas podem ser encontradas em baixos níveis nos alimentos, apresentam estruturas químicas diversas e são extraídas a partir de matrizes complexas (SHEPHARD, 2016). Nos últimos anos, observou-se um avanço no desenvolvimento de métodos para detecção de micotoxinas e de suas formas mascaradas, culminado na detecção de múltiplas micotoxinas simultaneamente em uma única corrida (MALACHOVÁ ET AL., 2014, SHEPHARD ET AL., 2016).
As etapas de análise envolvem extração, limpeza, separação, detecção e quantificação. Sendo a etapa de limpeza realizada, principalmente, por colunas tais como SPE (Solid Phase
Extraction) e imunoafinidade (reação antígeno/ anticorpo). Dentre as técnicas de separação, as cromatográficas são as mais utilizadas (Shephard et al., 2016), destacando-se a tradicional cromatografia em camada delgada (CCD); cromatografia gasosa (CG) acoplada aos detectores de captura de elétrons (CG-CE), ionização por chama e de massas e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada aos detectores de fluorescência (FL), ultravioleta (UV), diodo (DAD) e de massas (MS) (XAVIER, 2007, BUENO et al., 2015).
A CCD é uma técnica simples, rápida e de baixo custo, gerando resultados qualitativos ou semi-quantitativos. Os estudos iniciais das micotoxinas foram possíveis através do uso desta técnica (BUENO et al., 2015).
Diversos trabalhos reportam a análise de tricotecenos por CG, nesta técnica, utiliza-se fase móvel e amostra no estado gasoso. A fase estacionária, presente no interior da coluna, pode ser líquida ou sólida, as amostras são submetidas a altas temperaturas para atingirem o estado gasoso. Os detectores mais utilizados para a análise de tricotecenos são o de captura de elétrons e espectrometria de massas, fornecendo resultados sensíveis para a detecção de múltiplos tricotecenos em matrizes complexas (RAN et al., 2013, BUENO et al., 2015).
A CLAE é a técnica analítica de separação mais usada para análise de micotoxinas. A razão desta popularidade reside na sua elevada sensibilidade, capacidade para efetuar determinações precisas e de separar espécies não voláteis (LINO et al, 2006). O nível de informação estrutural obtido é limitado pelo tipo de detector acoplado à CLAE. Detectores baseados em absorção de luz ultravioleta (UV), fluorescência, índice de refração, difração de luz e eletroquímica proporcionam uma boa detecção e sensibilidade, porém pouca ou nenhuma informação estrutural. A introdução das técnicas de acoplamento tais como CLAE /UV equipada com uma rede de detecção por fotodiodos (CLAE /UV-DAD) e o acoplamento com a espectrometria de massa (CLAE /EM), proporcionou um real avanço na identificação estrutural, em linha, de produtos naturais. Atualmente, esta técnica é amplamente empregada nos laboratórios de pesquisa. Os espectros no UV dos produtos naturais podem dar informações úteis sobre a classe de substâncias e, no caso de polifenóis, informações sobre a posição das oxigenações (QUEIROZ, E. F.; HOSTETTMANN, K., 2006). A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) ou espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) permite a identificação simultânea de um grande número de micotoxinas (BUENO et al., 2015, TURNER et al., 2015).
Na espectrometria de massas é realizado o estudo do efeito da energia de ionização nas moléculas. Essa depende, sobretudo, de reações químicas que ocorrem na fase móvel, na qual moléculas da amostra são consumidas durante a formação de espécies iônicas ou neutras. Embora a
amostra seja consumida de forma destrutiva pelo espectrômetro de massas, a técnica é muito sensível, necessitando de pequenos volumes de amostra para ser realizada. O espectrômetro de massas converte moléculas da amostra em íons na fase móvel, separa-as de acordo com sua relação massa/ carga. Uma vez carregadas estas moléculas tornam-se aptas a serem manipuladas em um campo elétrico (“túnel” sob alto vácuo). Basicamente, no interior do espectrômetro de massa, a molécula ionizada pode ser levada diretamente ao detector (sistema MS), ou então ser acelerada de encontro a uma célula de colisão (a qual cria uma barreira entre a molécula ionizada e o detector), para que ocorra um choque e formação de fragmentos para posterior detecção (sistema MS/MS), ou ainda, a molécula pode ser confinada em uma espécie de “armadilha” no interior da qual é fragmentada (sistema Ion Trap) e os fragmentos direcionados até o detector. Pela forma como os sistemas MS/MS e Ion Trap atuam, ocorre um aumento na especificidade e sensibilidade da detecção, pois a fragmentação de uma molécula sempre nas mesmas condições irá formar sempre os mesmos fragmentos, tornando o método auto-confirmatório (XAVIER, 2007).
Os imunoensaios são métodos mais rápidos, de menor custo e fácil manipulação. São empregados para detectar presença de anticorpos ou de antígenos em amostras de substâncias, como sangue, leite, urina, soro sanguíneo e extratos vegetais, sendo, portanto instrumento de diagnostico médico, veterinário e fitopatológico. Para análise de micotoxinas, são utilizados como testes rápidos e triagem dos alimentos (SILVA, 2016). O Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) é o método imunológico mais empregado, apresentando kits comerciais para análise de tricotecenos e zearalenona em alimentos. Diversos estudos demonstram que estes kits são ferramentas importantes para triagem e quantificação de micotoxinas, oferecendo benefícios como velocidade, facilidade de operação, e elevado número de amostras analisadas simultaneamente. No entanto, a principal desvantagem está vinculada às reações cruzadas com substâncias presentes na matriz, podendo ocasionar resultados equivocados (BUENO et al., 2015; MENEELY et al., 2011).
3.5. Ocorrência de micotoxinas em aveia no Brasil e no mundo
A qualidade dos alimentos, seja pela alimentação direta dos grãos ou após o seu processamento, está relacionada ao fornecimento de produtos seguros e controle da cadeia produtiva dos mesmos (SILVA, 2018). Entre os fatores que afetam negativamente as cadeias produtivas, está a ocorrência de fungos nos grãos, podendo causar deterioração devido ao crescimento e contaminação por micotoxinas. Estes reduzem a qualidade e segurança do produto e como consequência, o prejuízo econômico (BERTHILLER et al., 2007).
As toxinas produzidas pelo gênero Fusarium (fusariotoxinas), tais como tricotecenos e zearalenona têm sido alvos de vigilância por órgãos da União Europeia, Brasil, Estados Unidos e outros países, devido às perdas econômicas e suas ligações a diversas doenças humanas e animais, através do consumo de cereais contaminados, como por exemplo, a aveia (JANHAGER, 2018).
A ocorrência natural de DON em cereais é prevalente em pesquisas da América do Sul, Canadá, China e muitos países da Europa que mostraram incidência de contaminação superior a 50% em aveia, cevada e trigo. DON e derivados (3-ADON e 15-ADON) são frequentemente encontrados juntos, em produtos a base de cereais. DON é a toxina mais frequente e prevalente em culturas usadas para a produção de alimentos e rações (YAZAR; Z. OMURTAG, 2008).
Nivalenol ocorre em várias culturas de cereais como: trigo, milho, cevada, aveia e centeio. Também tem sido frequentemente detectado em grãos de cereais e alimentos produzidos na Coréia, China e outros países, e acredita-se que induzam micotoxicoses (PLACINTA et al., 1999).
Zearalenona é encontrada, principalmente, como contaminante do milho. Além disso, pode ocorrer em aveia, cevada, trigo e sorgo. No entanto, a produção de ZEA é favorecida por condições de alta umidade e temperaturas amenas. Pode coexistir com DON em grãos como trigo, cevada, aveia e milho e fumonisinas em milho. Geralmente, DON é encontrado em doses mais elevadas do que ZEA quando isso ocorre (OLIVEIRA et al., 2002).
Segundo Tanaka (1988), a frequência relativamente alta de ZEA (43%) foi encontrada em aveia de Beijing, que é usada como ração animal. A presença de NIV também foi demonstrada em aveia cultivada no Nepal e na Alemanha Ocidental. Quanto à aveia, utilizada para ração animal, foi observada contaminação por NIV nas amostras da Rússia e do sul da Alemanha.
Placinta et al. (1999) relataram a contaminação por ZEA em baixos níveis nas amostras de trigo, cevada, aveia, centeio e rações provenientes da Bulgária, Alemanha, Finlândia, Holanda, Noruega e Polônia. Cereais como aveia e cevada, da Finlândia, contiveram ZEA juntamente com desoxinivalenol (DON) e 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON) (ZINEDINE, 2006).
Nos trabalhos realizados na Europa, observou-se elevada contaminação por toxinas T-2 e HT-2 em aveia. DON e ZEA também são encontrados, porém, em menores níveis e frequência. Este fato é explicado pela melhor adaptação de fungos produtores de tricotecenos do tipo A em climas temperados, como é o caso de F. langsethiae e F. sporotrichioides, um dos maiores produtores de toxina T-2 e HT-2 (Edwards, 2009). Em países como o Brasil, espera-se maior ocorrência de fungos mais adaptados aos climas amenos, como F. graminearum (TRALAMAZZA, 2015).
Os alimentos disponíveis no Qatar, incluindo cereais e seus produtos derivados, como: arroz, trigo, aveia e flocos de milho apresentaram co-ocorrência de aflatoxinas, DON e ZEA, principalmente, em arroz (PLACINTA et al., 1999).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Amostragem de aveia
Foram utilizados grãos de aveia branca, cultivar UFRGS-15, recém-colhidos e provenientes de duas regiões produtoras do Brasil: Paraná e Rio Grande do Sul. Foram analisadas 100 amostras de aveia (50 amostras de cada região), referentes à safra de 2017. O local de plantio foi dividido em
10 parcelas uniformes de 80 m2. Foram escolhidas, ao acaso, cinco parcelas e, de cada uma dessas parcelas 10 amostras de aveia foram obtidas, totalizando 50 amostras por região, cada uma contendo 1 kg. De cada uma dessas amostras, sub-amostras de 300 g foram retiradas e analisadas, através do método de quarteamento em sub-amostras de 50 gramas e posteriormente 10 gramas (DELP et al., 1986).
4.2. Atividade de água (Aa)
A atividade de água das 100 amostras de grãos de aveia foi medida no equipamento CX-2 AquaLAB.
4.3. Isolamento e identificação da micobiota de amostras de grãos de aveia
Os isolamentos foram realizados dentro do período de três dias, a partir da coleta dos grãos (cujo período do plantio foi de Abril a Julho 2017, e colheita Outubro a Novembro, desse mesmo ano) pela técnica de diluição seriada, de acordo com a metodologia proposta por Silva et al., 2017.
A técnica de diluição foi selecionada para este projeto, pois através de testes prévios, se observou melhor recuperação de Fusarium quando comparada com a técnica de isolamento direto dos grãos. Como os grãos de aveia são muito pequenos, a cisão prévia realizada para a técnica de diluição também favoreceu o isolamento do referido fungo.
As amostras de aveia foram trituradas, separadamente e, em seguida, 10 gramas de cada amostra foram pesados. Foram adicionados 90 ml de água estéril peptonada (1%) em Erlenmeyer de 300 mL e, em seguida, as amostras foram agitadas por trinta minutos a 100 rpm.
Para o isolamento e contagem dos fungos, os tubos foram preparados através de diluições sucessivas (1:10), até a diluição 10-5. Testes foram realizados para padronização do fator de diluição a ser utilizado.
Em seguida, 0,1 ml de cada uma das diluições foram transferidos para placas de Petri contendo o meio de cultura DRBC (Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol), utilizando alça de Drigalski, de acordo com PITT & HOCKING (2009). Após esse procedimento, as amostras foram incubadas em estufas a 25ºC, por cinco dias e, a contagem realizada por Unidades Formadoras de Colônia (UFC/g).
As colônias pertencentes aos diferentes tipos morfológicos foram classificadas em nível de gênero de acordo com Pitt & Hocking (2009), em meio de cultura MEA (Ágar Extrato de Malte) e através da visualização da micromorfologia dos fungos em microscópio. Os fungos também foram transferidos para o meio PDA (Potato Dextrose Agar - Ágar Batata) para visualização da coloração das culturas, principalmente de Fusarium (LESLIE & SUMMERELL, 2006).
Foram selecionadas as colônias sugestivas de Fusarium spp. através da visualização microscópica dos isolados e coloração em PDA. Para a identificação morfológica apropriada dos diferentes grupos de Fusarium, os isolados foram submetidos à técnica de cultura monospórica, utilizando ágar água (15%) e microscópio óptico para visualização de conídios germinando após 24 h de incubação (LESLIE & SUMMERELL, 2006). Um único conídio foi transferido para o meio ágar cravo, em duplicata. Após o crescimento, apenas uma placa foi selecionada, conforme recomendado por LESLIE & SUMMERELL (2006). A identificação morfológica foi realizada de acordo com o recomendado pelo mesmo compêndio. Para tanto, os isolados foram observados através de microscópio óptico diretamente do ágar cravo, sem o preparo de lâminas, uma vez que esta é a metodologia padrão aplicada para análise morfológica do referido fungo. Para aqueles com formação de esporodóquio, lâminas foram preparadas para identificação apropriada de macroconídios (LESLIE & SUMMERELL, 2006; LAURENCE ET AL., 2014).
Para manutenção, as cepas foram crescidas em meio ágar cravo a 25ºC por cinco dias (LESLIE & SUMMERELL, 2006). Posteriormente pequenos pedaços de meio contendo micélio foram armazenados através do método de Castellani a 4 ºC em água deionizada estéril.
4.4. Identificação das espécies de Fusarium
Os loci da primeira e segunda subunidade maior da RNA polimerase (RPB2) foram utilizados pela capacidade de diferenciar espécies crípticas pertencentes ao gênero Fusarium e por identificar as linhagens filogenéticas do CEFSAM (O´DONNELL et al., 1998; O´DONNELL et al., 2010).
4.4.1 Extração do DNA genômico dos isolados
Para a obtenção da biomassa fúngica, as cepas selecionadas foram semeadas em meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar) (Oxoid) e incubadas em placa de Petri por 3 a 5 dias, a 25ºC. Após esse período, o micélio foi raspado e macerado em equipamento Omni Bead ruptor e o DNA extraído, conforme o manual de instruções do kit QIAGEN DNeasy Mini Plant.
4.4.2. Sequenciamento Sanger
Os loci foram amplificados utilizando-se iniciadores e condições de acordo com a descrição da literatura (O´DONNELL et al., 2010). Os produtos de PCR foram purificados com kit QIAGEN Qiaquick. As amostras foram enviadas para o Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LACTAD), parte da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). A qualidade das sequências foi visualizada pelo programa Geneious (Versão 6.1) e os contigs das sequências forward e reverse realizados no mesmo programa. O alinhamento múltiplo foi realizado pelo programa ClustalW, presente no Geneious. O alinhamento foi editado, manualmente, e todas as mutações checadas através da visualização dos cromatogramas. As sequências foram editadas utilizando o software Geneious e posteriormente alinhadas com o Blast dos bancos de dados, GeneBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
4.4.3. Análises filogenéticas
A identificação das linhagens foi realizada pelo programa PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002). Busca heurística com opção de 1000 sequências adicionais randômicas e algoritmo tree-bisection-reconnection para o branch-swapping foram utilizados para inferência da árvore mais parcimoniosa. Os índices de consistência e retenção foram calculados para verificar as homoplasias presentes. Para o método de distância, o algoritmo utilizado foi o Neighbour-joining e o modelo de substituições nucleotídicas estimado de acordo com JModelTest (POSADA, 2008). A estabilidade dos clados foi verificada através dos valores de bootstrap com 1000 réplicas (PAUP 4.0b10). A
espécie Fusarium tricinctum foi utilizada como grupo externo do complexo de espécies F. sambucinum (CEFSAM) e Fusarium oxysporum para o Complexo de espécies F. fujikuroi (CEFF).
As árvores foram visualizadas através do programa FigTree. As sequências dos isolados de referência foram obtidas pelo NCBI (National Center For Biotechnology Information). Na base de dados, as sequências foram selecionadas a partir de artigos publicados e provenientes de estudos de referência do gênero.
4.5. Identificação dos genótipos de tricotecenos tipo B dos isolados do CEFSAM 4.5.1 Reação de PCR
Após a extração do DNA genômico como descrito no item 4.4.1, foram realizadas as análises dos genótipos de tricotecenos e do gene housekeeping RPB2. Os parâmetros de amplificação foram:
Genótipos de tricotecenos: 95 °C (1 minuto), ciclo de 25 vezes de 95 °C (30 segundos), 52 °C (30 segundos), 72 °C (30 segundos) e ciclo final de 72 °C (7 minutos);
RPB2 primeiro fragmento: 94 °C (90 segundos), ciclo de 25 vezes de 94 °C (30 segundos), 62 °C (90 segundos), 64 °C (2 minutos) e ciclo final de 68 °C (5 minutos);
RPB2 segundo fragmento: 94 °C (90 segundos), ciclo de 25 vezes de 94 °C (30 segundos), 62 °C (90 segundos), 66 °C (2 minutos) e ciclo final de 68 °C (5 minutos).
O volume total de todas as reações de PCR foi de 25 µL utilizando-se o buffer 1x, 2,5 mM de MgCl2, dNTP a 0,31Mm, iniciadores a 0,56 Mm, Taq DNA polimerase a 0,04 U/µL e 3µL do
DNA (90 ng/μL). As Tabelas 1 e 2 mostram os iniciadores utilizados em cada PCR.
Tabela 1: Iniciadores utilizados para amplificação do gene da segunda subunidade maior da RNA polimerase (RPB2).
Reação Iniciador Sequência 5´--3´ Fragmento
(pb) Referência RPB2 Primeiro fragmento 5f2 GGGGWGAYCAGAAGAAGGC 1,700 –1,742 O’Donnell et al., 2010 7cr CCCATRGCTTGYTTRCCCAT Segundo fragmento 7cf ATGGGYAARCAAGCYATGGG 11ar GCRTGGATCTTRTCRTCSACC D =A, G ou T; R = A ou G; W= A ou T; Y= C ou T; S= C ou G; pb = pares de base.
