CONIC-SEMESP

OBTIDOS DE TECIDO E PAPEL, A PARTIR DE DILUIÇÕES SERIADAS.

CATEGORIA: CONCLUÍDO

CATEGORIA:

ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE

ÁREA:

SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

SUBÁREA:

INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS

INSTITUIÇÃO:

AUTOR(ES): EVELIN CAROLINE DA SILVA

AUTOR(ES):

ORIENTADOR(ES): ROGÉRIA MARIA VENTURA

ORIENTADOR(ES):

COLABORADOR(ES): PHILIP WOLLF

1 1. RESUMO

Os relatos de crimes sexuais vêm aumentando em todo o mundo. Para investigação forense de crimes sexuais, antes das análises de DNA, são necessários exames laboratoriais, tais como a pesquisa de espermatozoides por microscopia a fresco ou esfregaço laminar possibilitando a confirmação destas células em manchas investigadas. Entretanto, com as manchas de liquido seminais secas, a visualização e analise do espermatozoide nem sempre será fácil, uma vez que quando eluídos da mancha, estes podem apresentar-se sem a cauda e com sua morfologia não preservada. Este trabalho tem por objetivo avaliar a sensibilidade e especificidade do teste de detecção de espermatozoides em manchas, como prova de certeza para crimes sexuais.

2. INTRODUÇÃO

Os casos de crimes sexuais, principalmente o estupro, vêm aumentando na sociedade em geral. No Brasil, o estupro é classificado como crime hediondo e desde 2010 até o momento, segundo dados da SENASP (Secretaria Nacional de Segurança Pública) foram registrados aproximadamente 42.950 casos, sendo o índice elevado de casos na região norte (DE PAULA, 2011). A Lei 12.015 de 2009 que entrou em vigor em 07 de agosto de 2009 confere que, os delitos de estupro e atentado violento ao pudor foram unificados em uma única capitulação penal, passando a integrar crime único de múltiplas ações, tendo como vítima homem ou mulher. (REVISTA DE DOUTRINA E JURISPRUDENCIA, 2014).

Em caso de estupro, o médico-legista procurará comprovar a conjunção carnal, sendo a vítima virgem ou com a vida sexual pregressas, comprovado através de exames do hímen. Em mulher virgem, a ruptura indicará a ocorrência da violência sexual, caso contrário, a Perícia irá atrás de evidências ou prova da existência de sêmen. E em mulheres com a vida sexual pregressa, será realizado a busca de sêmen. Os testes laboratoriais de analise obrigatórias são os bioquímicos (Fosfatase ácida e PSA - Antígeno Prostático Específico (antigamente chamada como proteína P30), que são componentes do liquido seminal, e a analise microscópica para pesquisa de espermatozoides Além dos testes bioquímicos, é de fundamental

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importância realizar a análise microscópica do material para confirmação e pesquisa da presença de espermatozoides. “Contribui para a resolução de homicídios, condenação de criminosos e exclusão de inocentes, além de casos de paternidade e de imigração” (TOLEDO PIZA, 2012).

Em locais do crime, as evidências devem ser recolhidas, e classificadas como evidências portáteis ou fixas, sendo necessária a coleta desses objetos com ferramentas adequadas para cada tipo de evidência, e manuseio específico para cada tipo de amostra. (SILVIA E PASSOS, 2006). Nos casos de evidências de crimes sexuais, é necessário recolher roupas e qualquer tipo de tecido ou objeto com manchas, sendo essas manchas circundadas com giz e entregues ao perito laboratorial para a realização da análise. No local do crime, quando é verificada a presença de manchas de esperma em roupas, o procedimento padrão é a verificação do estado físico-químico (úmido ou seco) e então, se a mancha estiver úmida, o material é transferido para o tubo de ensaio, e se estiver seca é adicionado água destilada o suficiente submergir a mancha com o fluido seminal e em seguida, coletada e transferida para tubo de ensaio (SILVEIRA, 2010).

Amostras físicas e biológicas que não são coletadas, documentadas e preservadas de modo apropriado, não obtém bons resultados e não possuem valor científico em investigações criminais (GAERTNER, 2011). Tratando-se de manchas de liquido seminal, é realizada a documentação e em seguida coleta-se parte do material biológico no qual este esteja aderido (por exemplo, lençol, vestes, guardanapo, etc.), e com utensílios apropriados, acondicionando as amostras em recipientes neutros e estéreis, tendo o cuidado de evitar contaminações (SILVIA E PASSOS, 2006; apud GAERTNER, 2011). Com este trabalho, pretendemos verificar de forma comparativa se amostras de esperma depositadas em tecidos e/ou em papel permitem identificar os espermatozoides por pesquisa em microscopia, mesmo em casos de amostras muito diluídas. Estas análises também avaliarão de forma comparativa a integridade das células depositadas em tecido e em papel.

3. OBJETIVOS GERAIS

Avaliar a sensibilidade e especificidade de testes a partir de amostras de espermatozoides obtidas de tecido e papel.

3 3.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Avaliar morfologicamente a integridade de espermatozoides obtidos em tecido e papel, a partir de diluições seriadas.

4. METODOLOGIA

4.1 Obtenção de espermatozoides em manchas de liquido seminal em papel e tecido

Foi selecionado no tecido e/ou papel que contenha manchas de esperma um círculo de aproximadamente 2cm de diâmetro. A amostra retirada foi fragmentada milimetricamente e transferida para um tubo cônico. Em seguida, foi adicionado 2ml de água destilada e homogeneizado por 10 minutos. Centrifugada a 8000 rpm por 10 minutos e com uma pipeta, foi retirado a sedimentação e aplicado uma gota do material em uma lâmina de vidro. Por fim, a lâmina permaneceu por 20 minutos à 50°C para secagem total.

4.2 Coloração

O material foi corado com Eosina amarela e recoberto com lamínula para análise microscópica.

4.3 Análise Qualitativa

Em um microscópio, foi analisada a lâmina com espermatozoides para a avaliação qualitativa dos mesmos.

4.4 Análise Quantitativa

Foram realizadas diluições seriadas para contagem de espermatozoides em câmara de Neubauer.

4 5. DESENVOLVIMENTO

5.1 Obtenções de espermatozoides de tecido e papel

Para a obtenção, uma área de 2 cm da mancha de liquido espermático no tecido e no papel foram circundadas e fragmentadas milimetricamente e transferidas para microtubos de 1,5 mL. Em seguida, foram adicionados 1 mL de formaldeído e submetidos a incubação em temperatura ambiente por 20 minutos, homogeneizados vigorosamente por 15 minutos e mantidos por mais 20 minutos em temperatura ambiente. Após esse processo, foram retirados o tecido e papel, mantendo-se o liquido nos microtubos. Por fim, foram centrifugados a 8000rpm por 7 minutos, sobrenadantes transferidos para microtubos limpos e o pellet ressuspendido com 1 mL de formaldeído. Com essa técnica, podemos observar um aumento considerativo do pellet obtido e melhora na obtenção da integridade celular.

5.2 Coloração

Foram utilizados 10 µL do pellet ressuspendido com formaldeído e depositados na lâmina com mais 10 µL de Eosina amarela seguido de esfregaço. A lâmina foi analisada em objetiva de 400x.

5.3 Contagem de espermatozoides na câmara de Neubauer

Foram realizadas contagens dos espermatozoides obtidos de um fragmento de 2cm de tecido, ressuspendidos a 1 mL de formaldeído. Foram realizadas contagens dos espermatozoides totais presentes no sobrenadante e presentes no pellet, e diluições, segundo as normas da OMS. Para a contagem de cada amostra, foi adicionado em um microtubo de 0,6 mL, 10 µL de formaldeído e 10 µL da amostra. Foram contados 4 quadrantes para obter a média, dividido por 4(Número de quadrantes contados), multiplicado por 2 (fator de diluição), multiplicado por 10.000 (padrão) e multiplicado por 1(volume final ressuspendido). Resultados obtidos representados no Quadro 1, 2 e 3.

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Foram utilizadas 5 amostras doadas de pacientes diferentes, obtidas na Clinica Genics, pelo Dr. Philip Wolff. O procedimento adotado obedece aos critérios do Código de Ética em Seres Humanos, resolução N° 196/96 do Conselho Nacional de Saúde. As amostras foram diluídas seriadamente nas concentrações de 1:1, 1:2, 1:3, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:350, 1:500, contadas (Quadro 3) e depositadas em tecido perflex e papel. Os papeis e tecidos com as diluições depositadas, foram mantidos em temperatura ambiente para a secagem total dos mesmos. E em seguida, foram realizados os procedimentos utilizados para a obtenção dos espermatozoides, no material depositado. Resultados obtidos representados na Figura 3 e 4.

6. RESULTADOS

6.1 Análise microscópica – Coloração

Foram encontrados espermatozoides com integridade morfológica completa (cabeça e cauda) e parcial (cabeça e cauda degradada/ sem cauda). As lâminas foram analisadas em objetiva de 40X.

Figura 1 – Espermatozoides obtidos de tecido, corados com eosina amarela, analisados em objetiva de 40X. Seta com preenchimento indicando espermatozoide com morfologia integra e seta sem preenchimento indicando espermatozoide com morfologia parcial.

6 Figura 2 – Espermatozoides obtidos de papel corados com eosina amarela, analisados em objetiva de 40X. A seta está indicando a presença de espermatozoides morfologicamente íntegros.

6.2 Contagem de espermatozoides na câmara de Neubauer

As contagens na câmara de Neubauer foram realizadas utilizando o mesmo padrão técnico para contagem, sendo ele: Soma de 4 quadrantes / por 4 X 2 X 10.000 X1.

Quadro 1: Valor total da contagem de espermatozoides do sobrenadante e sedimento de espermatozoides obtidos da mancha no tecido.

Sobrenadante Sedimento

TECIDO 305.000 1.450.000

PAPEL 225.000 130.000

6.3 Diluições seriadas das amostras obtidas de tecido e papel

Quadro 2: Valores das contagens de espermatozoides (número de células) do sobrenadante e sedimento obtidos da mancha e submetidos a diluições seriadas com formaldeído de 150 µL

1:1 1:2 1:3 1:5 1:10 1:15 1:20 1:30 TECIDO SEDIMEN TO 805.00 0 415.000 150.000 95.000 55.0 0 15.000 0 0 SOBREN ADANTE 65.000 30.000 10.000 0 0 0 0 0 PAPEL SEDIMEN TO 55.000 15.000 0 0 0 0 0 0 SOBREN ADANTE 105.00₀ 75.000 10.000 0 0 0 0 0

7 6.4 Depósitos de liquido seminal in natura, em tecido e papel.

Quadro 3: Contagens de espermatozoides depositados em tecido e papel, total e submetidos a diluições seriadas com formaldeído de 150 µL.

(Continua) TOTAL 106(mL) 1:1 1:2 1:3 1:5 AMOSTRA 1 TECIDO E PAPEL 22.960,000 12.450.000 9.270.000 5.050.000 2.870.000 AMOSTRA 2 TECIDO E PAPEL 24.420,000 19.600.000 13.250.000 5.420.000 1.650.000 AMOSTRA 3 TECIDO E PAPEL 16.570,000 11.720.000 6.110.000 3.160.000 960.000 AMOSTRA 4 TECIDO E PAPEL 19.250,000 8.040.000 5.370.000 3.490.000 1.860.000 AMOSTRA 5 TECIDO E PAPEL 11.410,000 4.050.000 2.820.000 1.800.000 846.000 (Continuação) TOTAL 106(mL) 1:10 1:25 1:50 1:100 AMOSTRA 1 TECIDO E PAPEL 22.960,000 1.970.000 805.000 490.000 295.000 AMOSTRA 2 TECIDO E PAPEL 24.420,000 1.280.000 600.000 265.000 150.000 AMOSTRA 3 TECIDO E PAPEL 16.570,000 790.000 645.000 305.000 130.000 AMOSTRA 4 TECIDO E PAPEL 19.250,000 1.512.000 675.000 330.000 125,000 AMOSTRA 5 TECIDO E PAPEL 11.410,000 750.000 600.000 200.000 75.000 (Conclusão) TOTAL 106(mL) 1:200 1:350 1:500 AMOSTRA 1 TECIDO E PAPEL 22.960,000 165.000 10.000 0 AMOSTRA 2 TECIDO E PAPEL 24.420,000 105.000 60.000 0 AMOSTRA 3 TECIDO E PAPEL 16.570,000 15.000 0 0 AMOSTRA 4 TECIDO E PAPEL 19.250,000 25.000 0 0 AMOSTRA 5 TECIDO E PAPEL 11.410,000 10.000 5.000 0

8 6.4.2. Obtenção de espermatozoides depositados a partir de diluições seriadas

em tecido e papel Teci do T otal 1:1 1:2 1:3 1:5 _1:10 _1:25 _1:50 1:10 0 1:20 0 1:35 0 1:50 0 0 20 40 60 80

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Figura 3 – Gráfico representativo das diluições seriadas da amostra de espermatozoides obtidas do tecido. Foi utilizado o teste T student para analise estatística, sendo considerado o resultado com p<0,05 como significativos.

Pap el T otal 1:1 1:2 1:3 1:5 1:10 1:25 1:50_1:10 0 1:20 0 1:35 0 1:50 0 0 200 400 600 800

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Figura 4 – Gráfico representativo das diluições seriadas da amostra de espermatozoides obtidas do papel. Foi utilizado o teste T student para analise estatística, sendo considerado o resultado com p<0,05 como significativos.

9 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Neste trabalho, podemos concluir que com a técnica utilizada e padronizada para a obtenção de espermatozoides obtidos através de tecidos e papeis, foi possível obter grandes quantidades e concentrações significativas de espermatozoides. A sensibilidade de detecção de espermatozoides foi até 1:350, com integridade morfológica preservada, revelando que a técnica é consistente e importante para analises e laudos periciais.

10 8. FONTES CONSULTADAS

BONACCORSO, N. S. Aplicação do exame de DNA na elucidação de crimes. São Paulo: Faculdade de Direito da Universidade de São Paulo (FD-USP). Dissertação (Mestrado) - Curso de Medicina Forense, 2005.

DE PAULA, K. A. Análise Molecular Com Y-Strs Em Amostras Biológicas Sem

Espermatozoides Coletadas de Vítimas de Estupro. Brasília: Universidade Católica de

Brasília. Dissertação [Stricto Sensu] Ciências Genômicas e Biotecnologia, 2011.

DOLINSKY, C. D. DNA Forense – Artigo de Revisão. Saúde e ambiente em revista, Duque de Caxias, 2007.

GAERTNER, F. J. C. Técnicas de Biologia Molecular aplicadas na Investigação Forense,

2011. Disponivel em:

<http://www.cpgls.ucg.br/6mostra/artigos/SAUDE/CARLA%20JOARA%20DE%20FRAGA %20GAERTNER.pdf>. Acesso em: 14 março 2015.

KHALDI, N. et al. Evaluation of three rapid detection methods for the forensic identification of seminal fluid in rape cases. Journal Forensic Sciences, 2004.

RIBEIRO, T. Manual de recolha e envio de vestígios biológicos para identificação

genética. Delegação do INML de Lisboa. Lisboa. 2003.

SAWAYA, M. C. T.; ROLIM, M. R. S. Antígeno específico da próstata em fluidos biológicos: Aplicação forense. Visão Acadêmica, Curitiba, v. 5, p. 109-116, 2004.

SILVA, L. A. F.; PASSOS, S. N. DNA Forense - Coleta de amostrar biológicas em locais

de crime para estudo do DNA. 2. ed. Maceió: Edufal, 2006.

SILVEIRA, P. R. Exame de Local, 2010. Disponivel em:

<http://www.drpaulosilveira.med.br/visualizar.php?idt=1625568>. Acesso em: 3 março 2015. TOLEDO PIZA, P. B. Análise Genética dos Vestígios de Crimes Sexuais. Goiânia: Pontifícia Universidade Católica de Goiás. Dissertação. [Stricto Sensu] Genética, 2012. WHITE, P. Crime Scene to Court: The Essentials of Forensic Science. 3. ed. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2010.