TÍTULO: EXPRESSÃO GÊNICA DE TNF-ALFA E P-SELECTINA EM CAMUNDONGOS OBESOS EXPOSTOS À POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA.
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: MEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE SANTA CECÍLIA
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): MURILO RIBAS DE BIASO
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): DANIEL SIQUIEROLI VILAS BOAS
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): MARCELO DIAS MARQUES, MONICA VALÉRIA MARQUEZINI, MONIQUE MATSUDA
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1. Resumo
Introdução: Os problemas da poluição atmosférica atingem todos os grandes centros
urbanos, em particular as megacidades com população maior do que 10 milhões de habitantes. Nestas megacidades, uma dificuldade crescente é a identificação e quantificação de fontes poluidoras. Emissões veiculares e industriais destacam-se entre as principais fontes responsáveis pelas altas concentrações de poluentes do ar nos grandes centros urbanos. Os diferentes componentes da poluição atmosférica, a dose e o tempo de exposição, podem levar a diversos impactos na saúde e a descompensação e/ou agravamento de comorbidades pré-existentes. Objetivo: Esse estudo teve por objetivo avaliar a ação da poluição atmosférica (PM2,5) na expressão gênica do TNF-alfa e da P-selectina em camundongos obesos. Metodologia: Fizeram parte do estudo 40 camundongos C57BL6, criados no Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz, Salvador/BA. Depois de desmamados os animais foram divididos em dois grupos: o primeiro grupo (M) recebeu alimentação regular e o segundo grupo (O) recebeu uma alimentação hiperlipídica. Após um ano de tratamento, os animais foram transferidos para o Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Neste laboratório, 10 animais de cada grupo foram expostos ao PM2,5 (E) e os demais, considerados grupo controle, não foram expostos à poluição (NE). A expressão gênica do TNF-alfa e da P-selectina foi estudada por PCR em Tempo Real a partir de amostras de músculo cardíaco dos animais. Essa pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para a Utilização de Animais da Fundação Oswaldo Cruz, protocolo LW 16/09. Resultados: Os resultados foram comparados pelo teste anova Tukey-Kramer post hoc no programa IBM SPSS, versão 21. Em relação ao gene P-selectina, foi identificado um aumento significativo da expressão gênica entre os grupos MNE e ONE (p=0,001) e uma diminuição significativa entre os grupos ONE e OE (p=0,021). Em relação ao gene TNF-alfa, foi identificado um aumento significativo da expressão gênica entre os grupos MNE e ONE (p<0,001), MNE e OE (p=0,007) e ME e ONE (p=0,001) e uma diminuição significativa entre os grupos ONE e OE (p=0,037).
Conclusão: A obesidade promove um aumento da expressão dos genes P-selectina
e TNF-alfa em indivíduos não expostos e uma redução dessas expressões nos indivíduos expostos à poluição atmosférica.
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Descritores: Poluição atmosférica, PM2,5, Obesidade, Expressão gênica, TNF-α,
P-selectina.
2. Introdução
O presente estudo deu continuidade à linha de pesquisa dos subprojetos clínicos e de pesquisa envolvendo indicação de exposição e biomonitoramento do projeto temático intitulado “Avaliação da toxicidade da poluição por material particulado gerado por diferentes fontes emissoras: proposição de estudos clínicos e experimentais” referente aos editais MCT-CNPq/CT-Saúde, nº 18-555223/06 e FAPESP-PPSUS, nº 50110-0/14, patrocinadores deste estudo, coordenado pelo Prof. Dr. Paulo Hilário Nascimento Saldiva da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP) e pelo Prof. Dr. Daniel Siquieroli Vilas Boas da Faculdade de Ciências Biológicas da Universidade Santa Cecília (UNISANTA).
A proposta geral desta pesquisa foi realizar uma análise experimental responsável dos efeitos da exposição aos poluentes atmosféricos de diferentes origens sobre a expressão gênica de marcadores inflamatórios. Para este fim, foi usado o Concentrador de Partículas Atmosféricas (CPA), uma tecnologia de medida de exposição à poluição atmosférica original e inovadora desenvolvida pela Escola de Saúde Pública da Universidade de Harvard e adaptada pelo Engenheiro do Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental (LPAE) da FM-USP, Dr. Paulo Afonso de André (Demokritou et al., 2003; Gupta et al., 2004).
A questão da poluição atmosférica atinge todos os grandes centros urbanos, em particular as megacidades com população maior do que 10 milhões de habitantes. Nestas megacidades, uma dificuldade crescente é a identificação e quantificação de fontes poluidoras (Carvalho et al., 2015), que têm importantes impactos nas políticas de redução de emissões e na minimização do impacto na saúde da população (Saldiva et al.,1995; Cançado et al., 2006; Martins et al., 2006).
Emissões veiculares e industriais destacam-se entre as principais responsáveis pelos altos níveis de poluentes na atmosfera em grandes centros urbanos. O grande desafio nestas áreas com qualidade do ar comprometida é determinar a contribuição
3 quantitativa das diferentes fontes de emissões para as concentrações de material particulado e de gases. A quantificação detalhada dos diferentes processos de emissão, formação, transporte, deposição e reatividade química desses compostos é um desafio científico (Seinfeld e Pandis, 2006).
O poluente de referência escolhido nesta pesquisa foi o aerossol atmosférico que é o mais consistentemente associado aos efeitos adversos da poluição do ar e permite a sua coleta in situ para análises mais detalhadas a posteriori. O aerossol é composto, entre outros, pelo material particulado (PM) em suspensão, que se refere a uma mistura de partículas sólidas e/ou líquidas que variam em forma, composição e origem. De modo geral, pode-se definir a distribuição do PM como trimodal, com frações grossa, fina e ultrafina.
O PM fino (PM2,5), material amostrado nesse estudo, possui diâmetro aerodinâmico entre 0,1 a 2,5µm e é derivado, de maneira geral, de processos de combustão de automotores, indústrias ou usinas termoelétricas e queima de biomassa (Baird, 2002). Contém partículas primárias, produzidas diretamente pelas fontes emissoras, bem como partículas secundárias (principalmente sulfatos e nitratos), geradas pelo processo de conversão de gás em partículas, a partir de óxidos de enxofre e óxidos de nitrogênio.
Fazem parte do PM2,5 partículas de carvão produzidas pela combustão dos combustíveis fósseis, que possuem adsorvidos à sua superfície diferentes elementos e compostos, tais como metais pesados e hidrocarbonetos (Kampa e Castanas, 2008).
A extensão da ação dos poluentes e os seus mecanismos de atuação no organismo humano são alguns dos principais temas que ainda exigem da comunidade científica um grande esforço para elucidação. Sabe-se que pessoas que passam longos períodos nas ruas, muitas vezes presas nos congestionamentos, são submetidas a doses maiores de poluentes e ficam mais tempo expostas aos mesmos, tornando-se mais vulneráveis aos seus efeitos adversos (Cançado et al., 2006).
Os diferentes componentes da poluição atmosférica, a dose e o tempo de exposição, podem levar a diversos impactos na saúde humana. Os efeitos à saúde dependem do tipo de poluente, sua concentração, tempo de exposição e suscetibilidade individual (Kampa e Castanas, 2008). Nos últimos anos, acumularam-se evidências de que o PM aumenta a morbimortalidade cardiovascular e respiratória,
4 especialmente em indivíduos obesos. O aumento da mortalidade ocorre ou concomitantemente ao aumento dos níveis de PM ou 1 a 5 dias após sua emissão/exposição (Pope, 2000).
As informações mais relevantes no monitoramento ambiental são obtidas pela mudança no comportamento do indivíduo exposto (impactos sobre a saúde, desempenho fisiológico e/ou morfológico) ou através da dosagem de substâncias específicas em seus tecidos.
A expressão gênica do Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-alfa), citocina pró-inflamatória e da P-selectina (SELP), molécula de adesão de células endoteliais e plaquetas ativadas, tem sido investigado em diversos estudos toxicológicos a fim de se verificar se suas atividades ou inatividade estão relacionadas com alguma doença inflamatória conhecida (Liu Z et al., 2007; Zarbock A et al., 2011 Stiegel MA et al., 2016) e, por esta razão, a análise dessas moléculas foram incluídas em nosso estudo. Em função do apresentado, é de vital importância a compreensão da intimidade dos mecanismos subjacentes aos efeitos tóxicos do PM sobre a saúde, pois permitirá o desenho de estratégias de redução de risco baseados não apenas no controle de emissão de PM, mas também atuando sobre a saúde humana e a consequente melhoria da qualidade de vida. Esse é o objetivo da ciência voltar-se à saúde pública: intervenção e prevenção.
3. Objetivo
Esse estudo teve por objetivo avaliar a expressão gênica da P-selectina e do TNF-α em camundongos obesos expostos à poluição atmosférica (PM2,5).
4. Metodologia
4.1. Desenho do Estudo
Ensaio clínico observacional, longitudinal, não randomizado, controlado, aberto, de medidas repetidas, em ambiente real de exposição, para análise dos efeitos da poluição atmosférica em camundongos obesos.
5 4.2. Aspectos Éticos
O projeto deste estudo foi submetido à Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa com Animais do Instituto Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz de Salvador/BA (protocolo de pesquisa nº LW 1609) e somente foi iniciado após ter sido aprovado pela instituição. Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios éticos do COBEA e em conformidade com as resoluções Normativas do CONCEA.
5. Desenvolvimento
5.1. Modelos experimentais e grupos de estudo
Para esta pesquisa foram adquiridos 66 camundongos C57BL/6 machos, com 1 ano de idade, do biotério do Instituto Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz de Salvador/BA.
Após o período de desmame, os animais foram divididos em dois grupos: o grupo daqueles alimentados com uma dieta hiperlipídica, grupo O (n=36) e o grupo controle com uma dieta regulada, grupo M (n=30). Essas dietas foram ministradas por um ano. Após este período, os animais já idosos, foram transferidos para o Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental (LPAE) da FMUSP.
Após 1 mês de aclimatação, os animais foram aleatoriamente subdivididos em dois grupos: o grupo controle (NE) cujos animais respiraram apenas ar filtrado durante o experimento, composto por 16 camundongos magros e 19 obesos e o grupo de exposição (E), cujos animais respiraram durante 1h/dia, por 30 dias, ar contendo PM2,5 concentrado (600µg.m-3), composto por 14 camundongos magros e 17 obesos. A exposição dos animais foi conduzida nas câmaras “limpa” e “suja” do Concentrador de Partículas Atmosféricas (CPA) do LPAE-FMUSP (Figura 1).
Com o exposto, os animais foram divididos então em quatro grupos experimentais: 1) o grupo dos animais magros e não expostos a poluição (MNE), considerado o grupo controle, 2) o grupo dos animais magros e expostos a poluição (ME), 3) o grupo dos animais obesos e não expostos a poluição (ONE) e 4) o grupo dos animais obesos e expostos a poluição (OE).
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Figura 1. (A) Área interna do CPA com os estágios para concentração das partículas e sistema de tubulações por onde o ar ambiente entra para o container e a estante ventilada para hospedagem de animais no laboratório ao fundo. (B) câmaras de exposição (ar filtrado “limpa” e ar ambiente concentrado “suja”), nesta imagem contendo ratos Winstar em exposição. No detalhe, camundongos C57BL/6 do grupo magros (M) e do grupo obesos (O). Fonte: Inaira - Instituto Nacional de Análise Integrada do Risco.
No período de exposição os animais foram pesados diariamente e sua glicemia em jejum foi medida nos trinta dias anteriores a eutanásia (dados não mostrados neste artigo).
5.2. Análise da Expressão Gênica
Para o estudo da expressão gênica o RNA total foi extraído de amostras de músculo esquelético dos animais pesquisados pelo método do TRIzol, de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen).
Em sequência, o cDNA foi gerado a partir de 2µg do RNA total usando o kit SuperScript Vilo cDNA Synthesis (Invitrogen). Para o cálculo do ciclo de limiar (Ct), curvas padrões foram geradas usando 10 soluções com diferentes diluições para cada gene. Somente as curvas com coeficiente de correlação igual ou superior a 98% foram aceitas.
Os cDNAs então foram submetidos aos ciclos de amplificação por PCR, de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen, Brasil). Todas as amostras foram testadas em triplicatas e o gene β-actina foi usado como referência endógena (housekeeping gene).
O método relativo de quantificação (∆∆Ct) foi utilizado com a relação RNAm gene alvo/RNAm β-actina normalizada em relação a uma amostra calibradora, usando o programa High-resolution Melting Analisys (Rotor-gene ScreenClust; Qiagen). Na
7 análise estatística, os resultados obtidos nos grupos experimentais foram expressos em porcentagem em relação ao valor médio do grupo controle.
5.3. Análise dos resultados
A variância dos resultados encontrados foi analisada com o teste ANOVA fator único e a identificação dos pares de médias entre os grupos estudados com diferença significativa pelo teste Tukey-Kramer post hoc. Todas as análises foram realizadas no programa IBM SPSS, versão 21.
6. Resultados
O ciclo de limiar (Ct) dos genes TNF-alfa e SELP foram determinados a partir das curvas padrões, feitas de soluções com diluições seriadas, que apresentaram coeficientes de correlação superior a 98% (Figura 2).
Figura 2. Curvas padrão geradas para os genes TNF-alfa (A) e SELP (B). Análise de correlação para as curvas do gene TNF-alfa, R = 0,9815 (C) e SELP, R = 0,9829 (D).
As curvas dos ciclos de amplificação dos cDNAs por PCR estão mostradas na figura 3.
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Figura 3. Análise por PCR em Tempo Real a expressão dos genes TNF-alfa (A), SELP (B) e β. Análise de correlação para as curvas do gene TNF-alfa, R = 0,9815 (C) e SELP, R = 0,9829 (D).
A quantificação (∆∆Ct) da expressão gênica utilizando a relação RNAm gene alvo/RNAm β-actina normalizada em relação a amostra calibradora está descrita na tabela 1 e representada na figura 4. A variância dos resultados encontrados e a identificação dos pares de médias entre os grupos estudados com diferença significativa estão descritas na tabela 2.
Tabela 1. Descrição da quantificação relativa da expressão dos genes TNF-alfa e SELP nos grupos de estudo.
Figura 4. Representação da quantificação relativa da expressão dos genes TNF-alfa e SELP nos grupos de estudo. * = diferenças significativas entre os grupos para os genes SELP (p=0,021) e TNF-alfa (p=0,037).
Gene Grupos Média DP 95% CI
inf ; sup Mín. Máx. MNE 1,20 0,50 0,58 ; 1,82 0,66 1,80 ME 3,22 0,14 2,88 ; 3,55 3,09 3,36 ONE 5,39 1,72 1,12 ; 9,66 4,00 7,31 OE 2,62 0,99 0,17 ; 5,08 1,76 3,70 MNE 1,41 0,65 0,59 ; 2,22 0,81 2,41 ME 2,53 0,13 2,20 ; 2,86 2,38 2,62 ONE 6,00 1,47 2,36 ; 9,65 4,89 7,67 OE 3,91 0,32 3,11 ; 4,71 3,63 4,26 SELP TNF-alfa
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Tabela 2. A variância dos resultados encontrados dos pares de médias entre os grupos estudados.
ns = não significativo
7. Considerações finais
Em relação ao gene SELP, foi identificado um aumento significativo da expressão gênica entre os grupos MNE e ONE (p=0,001) e uma diminuição significativa entre os grupos ONE e OE (p=0,021).
Em relação ao gene TNF-alfa, foi identificado um aumento significativo da expressão gênica entre os grupos MNE e ONE (p<0,001), MNE e OE (p=0,007) e ME e ONE (p=0,001) e uma diminuição significativa entre os grupos ONE e OE (p=0,037). A partir dessas informações, concluímos que obesidade promove um aumento da expressão dos genes SELP e TNF-alfa em indivíduos não expostos e uma redução dessas expressões nos indivíduos expostos à poluição atmosférica.
8. Fontes consultadas
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MNE ME ONE OE MNE ME ONE OE
MNE - ns 0,001 ns - ns <0,001 0,007
ME ns - ns ns ns - 0,001 ns
ONE 0,001 ns - 0,021 <0,001 0,001 - 0,037
OE ns ns 0,021 - 0,007 ns 0,037
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