Efeitos da quercetina na atividade da cetilcolinesterase, na peroxidação lipídica e nos testes comportamentais em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA. EFEITOS DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DA ACETILCOLINESTERASE, NA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA E NOS TESTES COMPORTAMENTAIS EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA. TESE DE DOUTORADO. Roberto Marinho Maciel. Santa Maria, RS, Brasil 2013.

(2) EFEITOS DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DA ACETILCOLINESTERASE, NA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA E NOS TESTES COMPORTAMENTAIS EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA. Roberto Marinho Maciel. Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de PósGraduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Cirurgia Veterinária, Sub-área de Patologia Clínica Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Medicina Veterinária. Orientadora: Prof.ª Sonia Terezinha dos Anjos Lopes. Santa Maria, RS, Brasil 2013.

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(4) 4. Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária. A Comissão examinadora, abaixo assinada, Aprova a Tese de Doutorado. EFEITOS DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DA ACETILCOLINESTERASE, NA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA E NOS TESTES COMPORTAMENTAIS EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA elaborada por Roberto Marinho Maciel. como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Medicina Veterinária Comissão Examinadora: Sonia Terezinha dos Anjos Lopes, Dra. (UFSM) (Presidente/orientadora) Angela Patrícia Medeiros Veiga, Dra. (UFSC). Fabiano Zanine Salbego, Dr. (UDESC) Glaucia Denise Kommers, Dra (UFSM) Roselia Maria Spanevello, Dra (UFPEL). Santa Maria, 28 de fevereiro de 2013..

(5) AGRADECIMENTOS. A Deus, por ter me concedido esse sonho e permitido essa vitória. À minha mãe pelo apoio em todos os momentos de minha vida. À minha família pelo apoio incondicional, nos momentos decisivos desta caminhada. À Professora Sonia, minha orientadora, pela oportunidade de crescimento profissional na Patologia Clínica Veterinária e principalmente pela amizade e confiança. À Professora Cinthia, minha co-orientadora, pelo exemplo profissional, amizade e motivação em seguir em frente, sempre. Ao Professor Carlos Mário, pela amizade e incentivo para seguir esta caminhada. Ao Professor Paulo Lovato, pela amizade, motivação e apoio nos momentos mais sombrios da caminhada. Que Deus te passe esse recado. Ao Professor Fabiano Salbego, pela amizade, motivação em seguir em frente. Ao Médico Veterinário Paulo Estivalete, pelo apoio incondicional nos momentos críticos. Ao Médico Veterinário Silvandro, pelo apoio incomum. Aos Professores da Universidade Federal de Santa Maria, especialmente as Professoras Dominguita, Cristiane Danesi, pela amizade e horas de abnegação em prol desse trabalho! À equipe da Bioquímica Toxicológica: Professora Maria Rosa, Roberta Schmatz, Fátima, Naiara e tantos mais pela amizade e profissionalismo incomum. À equipe da Neurotoxicidade e Psicofarmacologia: Professora Maribel Rubin, Fabiano Carvalho e Michelle Rosa, pela amizade e profissionalismo incomum. À Médica Veterinária Devanir pelo carinho e amizade, de longa data. À equipe de funcionários do LACVET (Rosangela, Danieli) e do Biotério Central da UFSM (Elton). Aos funcionários do Hospital Veterinário da UFSM. Ao Médico Veterinário Demetrius Cansian, pelo fundamental apoio na logística da maravalha..

(6) À Secretária da PPGMV Maria, por sua eficiência, correção e amizade. À Professora Danieli Brolo, pela amizade e cooperação incondicional. Aos colegas e amigos da PPGMV, Residência e Graduação: Raqueli, Verônica, Jorge, Helô, Patrícia, Rovania, Andréa, Andressa, Cássia, Francine, Marciélen, Breno, Marcos, Thais, Cristina e Diandra Camila pela amizade, apoio e profissionalismo. Ao amigo e cúmplice nesse trabalho, Professor Márcio Machado Costa, pelas centenas de horas de planejamento, confabulação e trabalho árduo nesse experimento..

(7) “A maior recompensa do nosso trabalho não é o que nos pagam por ele, mas aquilo em que ele nos transforma.” John Ruskin.

(8) RESUMO Tese de Doutorado Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria. EFEITOS DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DA ACETILCOLINESTERASE, NA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA E NOS TESTES COMPORTAMENTAIS EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA AUTOR: Roberto Marinho Maciel ORIENTADORA: Profª. Drª. Sonia Terezinha dos Anjos Lopes Data e Local da Defesa: Santa Maria, 28 de fevereiro de 2013. Diabetes melito (DM) refere-se a um grupo de distúrbios metabólicos comuns que compartilham o fenótipo da hiperglicemia, sendo uma condição crônica que surge quando o pâncreas não produz insulina em quantidade suficiente ou quando o organismo não consegue utilizar de modo eficaz a insulina produzida. A condição de hiperglicemia crônica favorece o desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a defesa antioxidante endógena, gerando o estresse oxidativo e por fim a peroxidação lipídica de estruturas e membranas celulares, ricas em lipídios. A quercetina (QUE) é um flavonoide que apresenta propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, sendo por isso, investigada como possível adjuvante no tratamento do DM. No presente trabalho foram analisadas as ações do excesso de radicais livres, promovido pelo diabetes melito tipo 1 (DM T1) tanto em nível sistêmico como, principalmente, no sistema colinérgico. Além disso, os possíveis efeitos de proteção antioxidante e anti-inflamatória da QUE. Foram utilizados 130 ratos Wistar, machos, pesando entre 160 a 250 g, distribuidos em 2 grupos: não diabéticos e diabéticos, sendo cada um deles divididos em 5 tratamentos: salina 0,9%, etanol 25% e QUE (5, 25 e 50 mg/Kg). A indução do DM T1 se deu com uma única injeção intraperitoneal de 70 mg/Kg de estreptozotocina (STZ). Quinze dias depois, teve início o tratamento com QUE por 40 dias. Ao término do experimento, foram realizados os testes comportamentais e a coleta de material biológico (sangue e tecidos corporais). O grupo diabético sem tratamento em relação ao controle não diabético apresentou: redução das ilhotas de Langerhans e da população de células beta, perda de peso, hiperglicemia crônica, leucopenia associada à neutropenia, redução na insulina e albumina, elevação na frutosamina, triglicerídeos, ureia, fosfatase alcalina (FA), alanina aminotransferase (ALT), além das frações proteicas de beta e gamaglobulinas. Houve aumento das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) sérico e redução na atividade de superóxido dismutase hepática. Falha na formação de memória aversiva e comportamento ansioso foram observados nesses animais, bem como, elevação na atividade da acetilcolinesterase (AChE) nas estruturas e sítios cerebrais (córtex, hipocampo, estriado e sinaptossomas) e TBARS (córtex, hipocampo e estriado). Os ratos diabéticos tratados com QUE em relação ao grupo controle diabético: apresentaram elevação na albumina (50 mg/Kg), redução nas betaglobulinas (25 e 50 mg/Kg) e gamaglobulinas (50 mg/Kg), diminuição dos triglicerídeos (5, 25 e 50 mg/Kg). A quercetina nas concentrações utilizadas reverteu a falha de memória aversiva e apresentou propriedades ansiolíticas. A atividade da AChE foi reduzida: no córtex (50 mg/Kg), no hipocampo (5 e 50 mg/Kg) e sinaptossomas (50 mg/Kg). Houve diminuição nos níveis séricos das TBARS no córtex, hipocampo e estriado (5, 25 e 50 mg/Kg). A quercetina elevou a concentração da insulina, nos grupos não diabéticos e diabéticos (5, 25 e 50 mg/Kg). Quando administrada em animais não diabéticos a QUE aumentou a inquietação dos animais (50 mg/Kg); aumentou a atividade da AChE no hipocampo (5, 25 e 50 mg/Kg), estriado (5 mg/Kg) e sinaptossomas (25 mg/Kg), diminuindo no córtex (5 mg/Kg). Além disso, aumentou o nível de TBARS no córtex (25 mg/Kg). A partir desses resultados conclui-se que a QUE possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias que podem ser utilizadas no tratamento auxiliar do DM. Contudo, também apresentou propriedades não desejáveis, como efeito pró-oxidante, o que sugere a resistência à insulina.. Palavras – chave: Estresse oxidativo. Acetilcolinesterase. Superóxido dismutase. Catalase. Teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico..

(9) ABSTRACT Doctoral Thesis Postgraduate Program in Veterinary Medicine Universidade Federal de Santa Maria. EFFECTS OF ACTIVITY IN QUERCETIN ACETYLCHOLINESTERASE, IN LIPID PEROXIDATION AND BEHAVIOUR IN TESTS IN RATS STREPTOZOTOCIN-INDUCED DIABETIC AUTHOR: Roberto Marinho Maciel ADVISER: Profª. Drª. Sonia Terezinha dos Anjos Lopes Place and Date of Defense: Santa Maria, February 28th, 2013. Diabetes mellitus (DM) refers to a group of common metabolic disorders that share the phenotype of hyperglycemia, is a chronic condition that arises when the pancreas does not produce enough insulin or when the body can not effectively use the insulin produced.The condition of chronic hyperglycemia promotes an imbalance between the production of free radicals and endogenous antioxidant defense, causing oxidative stress and finally lipid peroxidation, structures and cell membranes rich in lipids. Quercetin (QUE) is a flavonoid that has antioxidant and anti-inflammatory properties and is therefore investigated as a possible adjuvant in the treatment of diabetes. In this study we analyzed the actions of excess free radicals, promoted by type 1 diabetes mellitus (DM T1) at both systemic and mainly in the cholinergic system. Moreover, the possible effects of antioxidant protection and anti-inflammatory of QUE were analysed. We used 130 male Wistar rats, weighing 160 to 250 g and divided into 2 groups: non-diabetic and diabetic, which are divided into 5 treatments: 0.9% saline, 25% ethanol and QUE (5, 25 and 50 mg/kg).The induction of DM T1 occurred with a single intraperitoneal injection of 70 mg/kg streptozotocin (STZ). Fifteen days later, the treatment with QUE for 40 days started. At the end of the experiment behavioral tests and collection of biological material (blood and tissues) were performed. The untreated diabetic group compared to non-diabetic control showed: reduction of the islets and beta-cell population, weight loss, chronic hyperglycemia, leukopenia associated with neutropenia, decreased insulin and albumin, increase in fructosamine, triglycerides, urea, alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), in addition to protein fractions of beta and gamma globulin.The increase of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels was accompanied by a reduction in the concentration of hepatic superoxide dismutase. Failed aversive memory formation and anxious behavior were observed in these animals, as well as increase in the activity of acetylcholinesterase (AChE) in brain structures and sites (cortex, hippocampus, striatum and synaptosomes) and TBARS (cortex, hippocampus and striatum). Diabetic rats treated with QUE in relation to diabetic control had increased albumin (50 mg/kg), reduction in betaglobulins (25 and 50 mg/kg) and gamma globulins (50 mg/kg), decreased triglycerides (5, 25 and 50 mg/kg). Quercetin reverted the aversive memory failure and showed anxiolytic properties. AChE activity were decreased in the cortex (50 mg/kg), hippocampus (5 and 50 mg/kg) and synaptosomes (50 mg/kg). Levels of TBARS were reduced in the cortex, hippocampus and striatum (5, 25 and 50 mg/kg). Quercetin increased the concentration of insulin in non-diabetic and diabetic groups (5, 25 and 50 mg/kg). When administered in non-diabetic animals, QUE increased the uneasiness of the animals (50 mg/kg) increased AChE activity in the hippocampus (5, 25 and 50 mg/kg), striatum (5 mg/kg) and synaptosomes (25 mg/kg), lowering in the cortex (5 mg/kg), furthermore, increased the level of TBARS in the cortex (25 mg/kg).From these results we conclude that QUE have antioxidant and antiinflammatory properties which may be used in conjunction with treatment of diabetes. However, it also had undesirable properties, such as pro-oxidant effect and induces insulin resistance.. Keywords: Oxidative stress. Acetylcholinesterase. Superoxide dismutase. Catalase. Thiobarbituric acid reactive substances..

(10) LISTA DE QUADRO. Quadro 1 – Predisposição genética ao desenvolvimento do diabetes melito em cães (Estudo de 5.922 cães) ............................................................................................. 16 Quadro 2 – Complicações de diabetes melito em cães e gatos. .............................. 17.

(11) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Sistema colinérgico (encéfalo humano). Fibras colinérgicas em vermelho, núcleo pedúnculo pontilhado em azul, interneurônios estriatais em laranja. (MS = núcleos septo medial) e (nb = núcleo basal).. ........................................................... 20 Figura 2 – Aspecto físico de animais de controle: (A) rato não diabético e (B) rato diabético. ................................................................................................................... 93 Figura 3 – Comparação entre a massa muscular de animais de controle: (A) rato não diabético e (B) rato diabético ..................................................................................... 94.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACh – Acetilcolina AChE – Acetilcolinesterase AGL – Ácidos graxos livres AGPI – Ácidos graxos poliinsaturados ALT – Alanina aminotransferase ATP – Adenosina trifosfato CAT – Catalase ChAT – Colina-O-acetil-transferase CS – Estímulo condicionado C3 – Componente 3 do Complemento C4 – Componente 4 do Complemento DM – Diabetes melito DMID – Diabetes melitoinsulino-dependente DM T1 – Diabetes melito tipo 1 DM T2 – Diabetes melito tipo 2 ERO – Espécies reativas de oxigênio ERN – Espécies reativas de nitrogênio FA – Fosfatase alcalina GSH – Glutationa reduzida GLUT 4 – Transportador de glicose sensível à insulina HDL – Lipoproteínas de alta densidade HO. – Radical hidroxila IgA – Imunoglobulina A IgD – Imunoglobulina D IgE – Imunoglobulina E IgG – Imunoglobulina G IgM – Imunoglobulina M IRS – Substratos do receptor de insulina L. – Radical alquila LO. – Radical alcoxila LOO. – Radical peroxila LDL – lipoproteínas de baixo densidade LPL - Lipoproteína lipase LPO - Lipoperoxidação MDA - Malondialdeído O2.- - ânion radical superóxido PAS – Coloração ácido periódico-Schiff PI-3 quinase – Fosfatidilinositol-3‟-quinase RL – Radicais livres SNC – Sistema nervoso central SOD – Superóxido dismutase STZ - Estreptozotocina TBA – Ácido tiobarbitúrico TBARS – Teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico US – Estímulo incondicionado VAChT – Transportador vesicular de acetilcolina VLDL – Lipoproteínas de desnsidade muito baixa.

(13) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 14. 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 28. 2.1. Objetivo geral ................................................................................................ 28. 2.2. Objetivos específicos ................................................................................... 28. 3. MANUSCRITOS ................................................................................................. 29. 3.1. Manuscrito 1: ................................................................................................ 29. 3.2. Manuscrito 2.................................................................................................. 63. 4. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 92. 5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 102. 5.1. Manuscrito 1................................................................................................ 102. 5.2. Manuscrito 2................................................................................................ 102. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 103.

(14) 1 INTRODUÇÃO O diabetes melito (DM) refere-se a um grupo de distúrbios metabólicos comuns que compartilham o fenótipo da hiperglicemia. Existem vários tipos distintos de DM que são causados por uma interação complexa de fatores genéticos e ambientais. Dependendo da etiologia do DM, os fatores que contribuem para a hiperglicemia incluem secreção reduzida de insulina, menor utilização de glicose e maior produção de glicose. A desregulação metabólica associada ao DM acarreta alterações fisiopatológicas secundárias em muitos sistemas orgânicos que impõem uma sobrecarga aos indivíduos com diabetes (POWERS, 2009). O DM é uma condição crônica que surge quando o pâncreas não produz insulina em quantidade suficiente ou quando o organismo não consegue utilizar de modo eficaz a insulina produzida (ALVARENGA et al., 2005). O DM corresponde a um grupo de distúrbios do metabolismo glicídico, no qual a glicose é subutilizada, produzindo. hiperglicemia.. Alguns. pacientes. podem. desenvolver. episódios. hiperglicêmicos agudos, com risco de vida, como cetoacidose ou coma hiperosmolar (SACKS, 1998). Dentre as endocrinopatias o DM é a mais comum em cães e gatos e pode ser fatal se for incorretamente diagnosticada ou inadequadamente tratada (NELSON, 1998). Ao contrário dos gatos, a maioria dos cães são insulino-dependentes no momento do diagnóstico. A etiologia do diabetes melito insulino-dependente (DMID) não foi caracterizada nos cães, mas provavelmente seja multifatorial (NELSON, 2009). As predisposições genéticas, a destruição imunomediada das células beta, os fatores ambientais como mudanças alimentares, agentes infecciosos e drogas, a obesidade induzindo resistência à insulina e a destruição de células beta, secundárias à pancreatite, são todos fatores potenciais predisponentes (HOENING & DAWE, 1992; GUPTILL et al., 1999). Em gatos, o DM também é um dos distúrbios endócrinos mais comuns. A carência absoluta ou relativa de insulina, associada com a resistência à insulina, observada em cerca de 80 a 95% dos casos em felinos, é análoga ao DM do tipo 2, em humanos. O restante, cerca de 5 a 20% dos gatos atingidos, apresenta outros tipos específicos de DM (RAND & MARSHALL, 2009)..

(15) 15. O DM do tipo 1, resulta da destruição imunomediada das células beta. Essa doença é rara em gatos e apenas casos eventuais de filhotes ou gatos com lesões histológicas ou com anticorpos são consistentes com tal patogênese (WOODS et al., 1994). As lesões patológicas mais comuns em cães com DM são: redução no número e no tamanho das ilhotas pancreáticas, diminuição no número de células beta dentro de ilhotas e degeneração distensível hidrópica das células beta (NELSON, 2009). O DM do tipo 2 é o resultado da diminuição da secreção de insulina combinada com uma ação insuficiente desta. Essa ação é caracterizada como uma sensibilidade diminuída à insulina ou como resistência à insulina. Conforme aumenta a resistência à insulina, mais insulina é necessária para produzir o mesmo efeito de diminuição da glicose do que quando a sensibilidade da insulina é normal. Existem muitas causas de resistência à insulina, algumas das quais podem estar interligadas (RAND & MARSHALL, 2009). A obesidade é um importante fator para a ocorrência da resistência à insulina. Foi observado que gatos com 44% de sobrepeso apresentavam 50% de diminuição da sensibilidade de insulina (APPLETON et al., 2001). A inatividade física também diminui a sensibilidade da insulina, independentemente da obesidade (LEDERER et al., 2003). Atualmente, o sedentarismo é comum, especialmente em zonas urbanas e nos animais confinados em espaços pequenos (RAND & MARSHALL, 2009). A maioria dos cães tem entre 4 a 14 anos de idade no momento em que é diagnosticado o DM, com um pico de prevalência entre 7 e 10 anos. O DM, de início juvenil, ocorre em cães com menos de 1 ano de idade, mas é incomum. As cadelas são afetadas cerca de duas vezes mais que os machos. Em cães, a predisposição genética influencia no desenvolvimento do DM (Quadro 1) (GUPTILL et al., 1999; HESS et al., 2000). A maioria dos gatos é relativamente idosa no pico da incidência do DM, apresentado entre 10 e 13 anos (RAND, 1999; PRAHL et al., 2003). Os gatos machos castrados apresentam o dobro do risco de desenvolver DM em comparação com as fêmeas castradas (RAND & MARSHALL, 2009)..

(16) 16. Raças de alto risco. Raças de baixo risco. Terrier australiano Schnauzer standart Schnauzer miniatura Bichon frisé Spitz Fox terrier Poodle miniatura Samoieda Cairn terrier Keeshond. Pastor Alemão Collie Shetland Retriever Cocker Spaniel Australian Shepherd Labrador Retriever Dobermann Pinsher. Quadro 1 – Predisposição genética ao desenvolvimento do diabetes melito em cães (Estudo em 5.922 cães). Adaptado de Guptill et al. (1999).. As complicações crônicas do DM afetam muitos sistemas orgânicos e são responsáveis pela maior parte da morbidade e da mortalidade associadas a essa doença (Quadro 2). Essas complicações podem ser dividas em vasculares e nãovasculares. As vasculares, podem ainda serem subdivididas em: microvasculares (retinopatia,. nefropatia. e. neuropatia). e. macrovasculares. (doença. arterial. coronariana, doença arterial periférica e doença vascular cerebral). Já as nãovasculares incluem problemas como gastroparesia, infecções e alterações cutâneas (POWERS, 2009). Ainda segundo POWERS (2009), a hiperglicemia crônica é um fator etiológico importante responsável pelas complicações do DM, porém o mecanismo pelo qual ela induz uma disfunção celular e orgânica tão diversificada é desconhecido. Dentre as várias teorias que buscam explicar como a hiperglicemia promove complicações crônicas do DM, existe a hipótese de que a hiperglicemia acelere o metabolismo da glicose pela via sorbitol. A glicose intracelular é metabolizada predominantemente por fosforilação e subsequente glicólise, porém, quando aumentada, alguma glicose é transformada em sorbitol pela enzima aldose redutase. A maior concentração de sorbitol altera o potencial de oxidação-redução, eleva a osmolaridade celular, gera espécies reativas de oxigênio e, provavelmente, dá origem a outros tipos de disfunção celular (POWERS, 2009)..

(17) 17. Comuns. Incomuns. Hipoglicemia iatrogênica Poliúria, polidpsia, perda de peso persistentes ou recorrentes Cataratas (cão) Uveíte induzida pela lente (cão) Infecções bacterianas, especialmente envolvendo o trato urinário) Pancreatite crônica Cetose recorrente, cetoacidose Lipidose hepática Neuropatia periférica (gato) Hipertensão sistêmica (cão). Neuropatia periférica (cão) Nefropatia diabética - Proteinúria significativa - Glomeruloesclerose Retinopatia Insuficiência pancreática exócrina Paresia gástrica Hipomotilidade intestinal e diarreia Dermatopatia diabética (dermatite necrolítica superficial). Quadro 2 – Complicações de diabetes melito em cães e gatos. Adaptado de Nelson R.W. (2009).. No DM, as lesões neurológicas estão relacionadas a alterações do metabolismo da glicose em nível de sistema nervoso periférico (SNP) (KAPLAN & RICHARDS, 1988), e também à encefalopatia diabética, quando as complicações ocorrem no sistema nervoso central (SNC) (BIESSELS et al., 2002). Em humanos, a neuropatia diabética ocorre em 50% dos indivíduos com DM tipo 1 e tipo 2 de longa duração. Pode manifesta-se como polineuropatia, mononeuropatia. e/ou. neuropatia. autônoma.. Como. acontece. com. outras. complicações do DM, o surgimento de neuropatia correlaciona-se com a duração do diabetes e o controle glicêmico (POWERS, 2009). A encefalopatia diabética pode ser reproduzida em animais experimentais. A relação entre hiperglicemia e dano neuronal no córtex cerebral é demonstrada em ratos diabéticos por estreptozotocina (STZ) e o tratamento com insulina previne o dano neuronal (GUYOT et al., 2001). Diversas drogas como antidepressivos, drogas anti-inflamatórias. não. esteroidais,. anticonvulsivantes. e. opioides. agonistas. receptores, estão correntemente sob investigação para o manejo da neuropatia diabética (JAMES et al., 1999). Contudo, tratamentos com essas drogas são limitados por apresentarem efeitos parciais, desenvolvimento de tolerância e potencial toxicidade (COURTEIX et al., 1994; CLARK & LEE, 1995; ARNER & MEYERSON, 1998; GUL et al., 2000)..

(18) 18. O DM está associado com alterações cognitivas, estruturais e fisiológicas do cérebro, condição esta denominada encefalopatia diabética. O SNC é protegido de muitos efeitos tóxicos por uma barreira anatômica denominada barreira – hematoencefálica (BHE) (MÉNDEZ-ARMENTA & RIOS, 2007); mesmo assim, alterações nervosas resultantes da degeneração cerebral, são descritas no estado diabético, provavelmente em decorrência de modificações na plasticidade sináptica, o que compromete o mecanismo de regulação da homeostase celular, e tem como consequência a disfunção na atividade dos neurotransmissores na fenda sináptica (BIESSELS et al., 2002). O SNC é modulado por vários tipos de neurotransmissores que integram o corpo com o seu meio, sendo, uma via informacional para o indivíduo conseguir interpretar os estímulos externos e reagir de acordo com os mesmos (PATEL et al., 2001). Os principais neurotransmissores que desempenham essas funções no SNC são a dopamina, o glutamato, a serotonina, a epinefrina, a norepinefrina e a acetilcolina, entre outros (EVERITT & ROBBINS, 1997; LOPES et al., 1999). A acetilcolina (ACh) foi a primeira molécula a ser identificada como neurotransmissor e passou a ser amplamente investigada nas sinapses do SNC e SNP (DESCARIES et al., 1997). A ACh desempenha um importante papel na regulação de muitas funções vitais como aprendizagem e memória, processamento da informação sensorial, organização cortical do movimento e controle do fluxo sanguíneo cerebral (MESULAM et al., 2002). A ACh é sintetizada a partir da colina e de acetil-coenzima A, pela colina-O-Acetil-Transferase (ChAT) (VENTURA et al., 2010). Uma vez sintetizada, parte da ACh é transportada e armazenada em vesículas sinápticas. Esse processo é realizado por um transportador vesicular de ACh (VAChT), capaz de elevar em até 100 vezes sua concentração no interior dessas vesículas. Após ser liberada inteiramente por exocitose, a ACh interage especificamente com os receptores colinérgicos presentes nas membranas pré e pós-sinápticas (FUJII et al., 2008). A ação da ACh cessa quando é hidrolizada em acetato e colina pela enzima acetilcolinesterase (AChE), presente na fenda sináptica. A AChE é uma serina hidrolase que hidrolisa rapidamente a ACh, tanto na sinapse colinérgica, quanto na junção neuromuscular, finalizando a transmissão do impulso nervoso (GRISARU et al., 1999). Por ser uma das mais eficientes e conhecidas catálises.

(19) 19. biológicas, a AChE tem sido investigada como um importante alvo terapêutico em várias doenças neurodegenerativas, sendo considerada uma importante enzima regulatória e um bom indicador da atividade colinérgica (APPLEYARD, 1994; SZEGLETES et al., 1999; DAS et al., 2001). O DM pode modificar funções do SNC (BELLUSH et al.,1991). Disfunções cognitivas observadas em pacientes humanos e modelos experimentais de diabetes têm sido relacionadas com alterações na atividade da AChE, o que pode indicar modificações na neurotransmissão colinérgica (SANCHEZ-CHAVEZ & SALCEDA, 2000). Estudos na atividade da AChE, em ratos diabéticos, demonstraram que a enzima apresentou atividade mais elevada em algumas regiões cerebrais: córtex cerebral, hipocampo, estriado, cerebelo e hipotálamo (SCHMATZ et al., 2009). Por esse motivo, agentes inibidores da atividade da AChE têm sido estudados com o objetivo de diminuir os efeitos hipocolinérgicos, observados quando a atividade da enzima aumenta (DAS et al., 2001), contudo, uma diminuição além do esperado, nessa atividade, pode levar ao acúmulo de ACh, o que resultaria numa hiperatividade colinérgica, convulsão e epilepsia (OLNEY et al., 1986). A ACh, seus receptores e o aparato enzimático responsável por sua síntese e degradação constituem o sistema de neurotransmissão colinérgica (Figura 1) (BRUNEAU & AKAABOUNE, 2006). O sistema colinérgico realiza uma das mais importantes funções modulatórias no SNC desempenhando um papel fundamental na regulação de muitas funções vitais relacionadas com o comportamento, a aprendizado e a memória, além de atuar na organização cortical do movimento e do controle do fluxo sanguíneo cerebral (PERRY et al., 1999; MESULAM et al., 2002). Conceitualmente, a memória pode ser definida como o processo de armazenamento e evocação de informações adquiridas através de experiências, quantidade de tipos de memórias e está relacionada com a variedade de experiências vividas (IZQUIERDO, 1989). O principal papel do sistema colinérgico sobre a memória parece ser o de desempenhar um efeito modulatório (SEGAL & AUERBACH, 1997). A memória só pode ser avaliada em animais com a observação de comportamentos modificados durante a evocação (QUILLFELDT, 1994). O encéfalo está constantemente criando e evocando memórias, sendo que a memória não é apenas a capacidade de repetir, mas sim de variar a resposta frente a uma nova aprendizagem. A aprendizagem transforma as experiências em memórias e é o.

(20) 20. processo pelo qual os humanos e outros animais, formam o conhecimento (KANDEL et al., 2000).. Figura. 1. –. Sistema. colinérgico. (encéfalo. humano).. Fibras. colinérgicas em vermelho, núcleo pedúnculo pontilhado em azul, interneurônios estriatais em laranja. (MS = núcleos septo medial) e (nb = núcleo basal). Adaptado de PERRY et al. (1999), modificado por MAZZANTI (2007).. É possível que o nível de atenção, dependente da atividade cortical, dado a uma determinada nova experiência leve à ativação da formação hipocampal, que sofreria alterações plásticas, fazendo com que a nova informação possa ser armazenada de forma mais definitiva nas estruturas corticais mais ascendentes. O hipocampo parece constituir um local transitório onde a informação seria temporariamente armazenada. Outras áreas encefálicas como o telencéfalo basal, principalmente o estriado, o cerebelo e os córtices motores também participam do processamento de memórias com conteúdo procedural ou implícito. Talvez, atuando.

(21) 21. de forma paralela e independente de estruturas límbicas ou dos lobos temporais (FUSTER, 1997). O hipocampo, a amígdala e o córtex entorrinal são interconectados por vias aferentes e eferentes, o córtex entorrinal, adicionalmente, tem conexões com o córtex parietal posterior e córtex pré-frontal. Todas essas estruturas desempenham papeis de forma integrada na memória (QUILLFELDET et al., 1996; IZQUIERDO et al., 1997; LORENZINI et al., 1999). A contribuição de cada estrutura e região não é idêntica. O hipocampo processa principalmente informações espaciais e contextuais. A amígdala é um importante núcleo modulador da atividade hipocampal e sua função apresenta, como principal substrato, informações com fortes componentes emocionais e aversivos. O estresse é um fator importante no processamento integrado entre hipocampo e amígdala (PITKANEN et al., 1997). O córtex entorrinal está encarregado de integrar as informações provenientes do hipocampo e da amígdala. Assim, o córtex entorrinal participa do processamento e do armazenamento de diferentes conteúdos cognitivos, tanto aversivos contextuais como espaciais (QUILLFELDT et al., 1996; IZQUIERDO et al., 1997). A observação de alteração no comportamento, durante a evocação da memória, pode ser utilizada na avaliação das condições de reativação das redes sinápticas de cada tipo de memória (QUILLFELDT et al., 1994). Acredita-se que a habituação a um novo ambiente é uma das formas mais elementares de aprendizagem, no qual o decréscimo na exploração como uma função de exposição repetida a um mesmo ambiente é tomada como um índice de memória (THIEL et al., 1998, THIEL et al., 1999). Uma análise mais comportamental é acompanhada do desenvolvimento de conceitos neurobiológicos de representação. O relatório de um grupo de estudo sobre biologia da aprendizagem (HOLLAND, 1984), aponta três níveis dos sentidos de representação: representação do setor de superfície; representação neural do estímulo presente, que forma a base da percepção e talvez de muitos tipos de memória a curto-prazo; e uma representação armazenada, permanente, de um estímulo que forma a base do que é denominada memória de longo-prazo. Estas representações de eventos são topograficamente organizadas e podem ser encontradas em muitos locais do cérebro (BUENO, 1997)..

(22) 22. A análise experimental comparativa da cognição tem levado em conta diferentes níveis de processamento e de diferentes tipos de representação, embora não haja a esse respeito unanimidade entre os pesquisadores. MACPHAIL (1987) defende a possibilidade de uma análise que contemple apenas a formação de associações entre estímulos e respostas, sem referências à noção de representação e a concepções cognitivistas. Estudos experimentais em condicionamento pavloviano com estimulação complexa indicam, portanto, a possibilidade de o organismo animal estar operando não só representações de eventos, mas também representações mais complexas de relações entre os eventos, exigindo um alto nível de processamento no momento do desempenho (HOLLAND, 1990). O labirinto em cruz elevado é um modelo animal validado do ponto de vista farmacológico, bioquímico e comportamental como teste de ansiedade no rato (PELLOW et al., 1985). Contudo, pesquisadores dedicados ao desenvolvimento de modelos animais de ansiedade se defrontam com vários problemas que começam pela falta de uma definição clara desta patologia. Estudos indicam a possibilidade de que a ansiedade pode não consistir de uma manifestação única, mas de vários subtipos de ansiedade que se manifestariam sob exposições a determinados estímulos ou condições (GONZALES et al., 1997). Outras considerações sugerem que a ansiedade estaria associada a outras psicopatologias como a depressão (BUENO, 1997). Vários modelos animais de depressão têm sido elaborados com o objetivo de reproduzir em laboratório mudanças comportamentais próprias desta patologia (HANSEN et al., 1997). Segundo GONZALES et al., (1997), é possível que as duas desordens (ansiedade e depressão) sejam manifestação do mesmo fator etiológico. Além disso, o isolamento social em estádios precoces da vida modifica uma variedade de comportamentos em muitos animais (WONGWITDECHA & MARSDEN, 1996), além de produzir alterações neuroquímicas (PEREZ et al., 1997) e fisiológicas (JIMENEZ & FUENTE, 1993). Efeitos tóxicos do oxigênio sobre componentes biológicos já eram conhecidos no final do século XIX (LORRAIN-SMITH, 1899). Esses efeitos são resultantes da oxidação de componentes celulares como tióis, cofatores enzimáticos, proteínas, nucleotídios e lípides, principalmente ácidos graxos poli-insaturados (AGPI), mediada por espécies reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN), conhecidas genericamente como radicais livres (RL) (GILLER & SIGLER,.

(23) 23. 1995). As ERO são moléculas contendo oxigênio, formadas a partir de radicais livres durante o metabolismo normal e/ou quando o organismo é exposto a vários estímulos, como radiação ionizante ou biotransformação de xenobióticos. Radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativos que possuem elétrons não emparelhados em sua última camada (HALLIWELL & GUTTERIGDE, 2007). As ERO incluem todos os radicais do oxigênio, como o ânion radical superóxido (O2 .-), radical hidroxila (HO.), radical alquila (L.), alcoxila (LO.) e peroxila (LOO.) (BARBER & BERNHEIM, 1967; CHANGE et al., 1979). Os RL estão relacionados com uma variedade de doenças, incluindo câncer, doenças hepáticas, aterosclerose e envelhecimento (ESTERBAUER et al., 1992; CHIRICO et al., 1993; MORIEL et al., 1999; CHISOLM & STEINBERG, 2000). Na maioria das vezes esta relação se dá pela propriedade que os RL têm de reagir com os ácidos graxos poliinsaturados (AGPI), servindo como iniciadores do processo de peroxidação lipídica ou lipoperoxidação (LPO) (LIMA et al., 2001). Em situações fisiológicas, a formação de RL ocorre normalmente no organismo de seres aeróbicos, especialmente durante a respiração. Na mitocôndria, em torno de 1 a 2% do O2 participa de reações monoeletrônicas, escapando da redução tetravalente do O2 pela aceitação de quatro elétrons para sua neutralização, resultando na formação de H2O. O aumento da formação dessas ERO pode levar à condição de estresse oxidativo (SIES, 1997; SHAW, 1998; HALLIWELL & GUTTERIGDE, 2007). O estresse oxidativo pode resultar da geração excessiva de ERO, da diminuição da capacidade antioxidante natural do organismo ou ainda da combinação desses fatores (SIES, 1997). Vários fatores podem contribuir para o estabelecimento do estresse oxidativo, como por exemplo, a liberação de metais de transição ou mesmo metais sem ação redox direta, como o Zn 2+ (MARET, 1998). De um modo geral, o acentuado aumento do metabolismo da glicose, na hiperglicemia diabética, está associado a uma formação aumentada de RL. Nestas condições, pode haver um distúrbio no balanço entre a produção acentuada de RL e as defesas (BAYNES, 1991). A hiperglicemia, marcador através do qual se diagnostica tanto diabetes tipo1 quanto tipo 2, promove o aumento na produção de ERO (BAYNES, 1991; NISHIKAWA et al., 2000). Ocorrem, também, efeitos bioquímicos secundários, como a produção do ânion superóxido pela auto-oxidação da glicose. O aumento de proteínas glicadas.

(24) 24. no plasma dos pacientes está relacionado com o estresse oxidativo, uma vez que essas proteínas interagem com receptores celulares, estimulando a produção de espécies reativas de oxigênio e diminuindo a glutationa intracelular. Esse aumento de produção de ERO contribui para uma série de complicações secundárias ao diabetes, tais como a aterosclerose e a peroxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) nas células endoteliais (BAYNES, 1991; NISHIKAWA et al., 2000). A LPO pode ser definida como uma cascata de eventos bioquímicos resultantes da ação dos RL sobre os lípides insaturados das membranas celulares, gerando principalmente radical alquila (L.), radical alcoxila (LO.) e radical peroxila (LOO.), levando à destruição de sua estrutura, falência dos mecanismos de troca de metabólitos e, numa condição extrema, a morte celular (BENZIE, 1996). A LPO pode provocar uma desrregulação na homeostase iônica, através do aumento da concentração de Ca2+ intracelular. Além disso, lesões oxidativas ao DNA tendem a aumentar pelo ataque direto de ERO (TROTTI et al., 1998; MARTINDALE & HOLBROOK, 2002; LEE et al. 2002). As principais metodologias utilizadas para a avaliação da LPO em sistemas biológicos medem a formação de produtos gerados durante as diferentes fases deste processo (LIMA et al., 2001). A oxidação dos AGPI é acompanhada pela formação de hidroperóxidos dienos conjugados, o que não ocorre em ácidos graxos insaturados não oxidados (HALIWELL &GUTERIDGE, 1999). Uma das técnicas mais utilizadas para se avaliar a oxidação de lípides é o teste do malondialdeído (MDA), um dialdeído formado como um produto secundário durante a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados por cisão beta dos AGPI peroxidados, principalmente o ácido araquidônico (LIMA et al., 2001). O MDA é volátil, possui baixo peso molecular, tem uma cadeia curta 1,3-dicarbonil e é um ácido moderadamente fraco (pKa=4,46). Em condições apropriadas de incubação (meio ácido e aquecimento), reage eficientemente com uma variedade de agentes nucleofílicos para produzir cromógenos com alta absortividade molar no espectro visível (JANERO, 1990; BENZIE, 1996). Sua condensação com o ácido tiobarbitúrico (TBA) forma produtos, que podem ser determinados por absorção no visível (532 nm) ou por fluorescência (exc = 515 nm e exc = 553 nm) (JANERO, 1990). A reação denominada de teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), representa múltiplos métodos que utilizam o TBA, formando o complexo MDA:TBA (1:2), C11H8N4S2O4.H2O, que.

(25) 25. tem absorção máxima em 532 nm e apresenta fluorescência (lexc = 515 nm e lem = 553 nm). Neste teste utiliza-se como padrão o MDA obtido pela hidrólise do tetrametoxipropano ou tetraetoxipropano (YU et al., 1986). Distúrbios do metabolismo energético estão intimamente associados com a elevação do estresse oxidativo, que resulta em oxidação de biomoléculas e inicia danos citotóxicos em células neuronais (OLANOW, 1993; MARTINEZ et al., 1994). Normalmente as células são providas de um mecanismo de defesa denominado sistema antioxidante que pode ser dividido em enzimático, o qual inclui enzimas como a catalase, a superóxido dismutase e a glutationa peroxidase, e em não enzimático, que inclui a glutationa reduzida, a vitamina C e a vitamina E (MATÉS et al., 1999). O termo flavonoide é derivado do latim flavus que significa amarelo, e recebeu este nome por ter sido encontrado originalmente em alimentos de coloração amarelada, mas atualmente já foi encontrado também em outros de colorações diversas (COTELLE, 2001). Os flavonoides são amplamente encontrados em vegetais, frutas, sucos e chás. Eles representam um importante componente da dieta humana (RICE-EVANS et al.1996; HOLLMAN & KATAN, 1999). Os flavonoides são formados nas plantas pela combinação dos aminoácidos fenilalanina e tirosina com unidades acetato. Existem mais de 8.000 variedades de flavonoides, mas os seis grupos já classificados são flavononas, flavonas, flavonóis, isoflavonoides, antociainas e flavans (COTELLE, 2001). A presença de grupos hidroxila aromáticos nos flavonoides confere acentuadas propriedades antioxidantes. Eles eliminam ERO e, portanto inibem reações de peroxidação. Além disso, macrófagos também são protegidos do estresse oxidativo pela retenção de glutationa em sua forma reduzida (THIE & CROZIER, 2000). Está bem estabelecido que os compostos fenólicos exercem efeitos positivos em doenças crônicas, como o câncer e desordens neurodegenerativas. Os principais benefícios fisiológicos dos flavonoides têm sido atribuídos às suas propriedades antioxidantes de eliminação de radicais livres, antibacteriana, antiinflamatória, anti-alérgica, antiviral, antitumor, anti-isquêmica e vasodilatadora (RICE-EVANS et al., 1996; LEE et al., 2000; MORIMOTO et al., 2003; PILORGET et al., 2003; KIM et al.,2004; NOVAKOVIC et al., 2006)..

(26) 26. O efeito neuroprotetor dos flavonoides foi evidenciado em experimentos, onde catequinas originadas de chá verde protegeram as células neuronais de morte em modelos animais de doenças neurodegenerativas como pela toxicidade por MPTP (Doença de Parkinson), pelo peptídeo -amiloide (Doença de Alzheimer), na isquemia cerebral unilateral ou global e ainda, em modelos de estresse oxidativo por peróxido de hidrogênio (MANDEL et al., 2005). Os flavonoides ainda protegem células neuronais do estresse oxidativo causado por outros tipos de insultos, como do ácido homocisteico, privação de cistina, butionina sulfoximina, hipoglicemia, insultos isquêmicos e peróxido de hidrogênio que podem levar à morte celular induzida por glutamato. A ação neuroprotetora dos flavonoides pode ocorrer por três mecanismos distintos: alteração do metabolismo da glutationa reduzida (GSH), extinção de ERO, inibição do influxo de Ca2+ e manutenção dos níveis de adenosina trifosfato (ATP) (ISHIGE et al., 2001). A quercetina (QUE) (3,3‟,4‟,5,7-pentaidroxiflavona) é um dos mais abundantes flavonoides encontrados em frutas e vegetais, principalmente na cebola, no brócolis, na couve, na maçã, no Ginkgo Biloba, no chá e também no vinho tinto, com uma dose diária de ingestão acima de 25 mg em uma dieta de adulto normal (DAJAS et al., 2003). É formada por anéis catecóis que podem sofrer metabolização oxidativa até ser desmetilada, se conjugando com a glutiona e formando o 2‟-glutationilquercetina, podendo exercer efeitos protetores ou tóxicos nas células (PRIOR, 2003). Além disso, tanto a quercetina quanto a rutina podem também, exibir in vitro propriedades antioxidantes em diferentes modelos pró-oxidantes (SPANOS & WROLSTAND, 1992; WAGNER et al., 2006; PEREIRA et al., 2009). Os efeitos da quercetina são devido às suas propriedades antioxidantes, reduzindo diretamente os radicais livres, inibindo a xantine oxidase e a peroxidação lipídica (PLUMB et al., 1999; FIORANI et al., 2001). Evidências experimentais têm demonstrado que ERO tais como, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e ânion superóxido, tem um papel central no desenvolvimento de complicações crônicas características do estado diabético (RAO et al., 2001; MARITIM et al., 2003). A QUE é mais potente que outros antioxidantes, como a vitamina C, vitamina E e -carotenos, que são nutrientes antioxidantes (RICE-EVANS et al., 1995). Além disso, a QUE ajuda na quelação de íons metálicos de transição, incluindo o ferro,.

(27) 27. assim prevenindo a ferro-catálise na reação de Fenton (FERRALI et al., 2000). Em modelos animais, a quercetina apresentou o efeito de proteger a memória contra danos causados pela D-galactose, assim como da isquemia cerebral (LU et al., 2006; PU et al., 2007). Dessa forma, a utilização de agentes antioxidantes como a QUE pode representar uma nova abordagem na inibição dos danos provocados pelo estresse oxidativo, servindo como adjuvante na terapia complementar ao DM..

(28) 2 OBJETIVOS. 2.1. Objetivo geral. Investigar o efeito da quercetina na atividade da acetilcolinesterase, nos testes comportamentais, perfil oxidativo e o efeito anti-inflamatório em ratos diabéticos, induzidos experimentalmente pela estreptozotocina.. 2.2. Objetivos específicos Em ratos diabéticos, induzidos experimentalmente pela estreptozotocina. objetiva-se avaliar: - A resposta hematológica, o perfil eletroforético e a função hepática e renal. - Os níveis séricos de peroxidação lipídica e atividade das enzimas CAT e SOD hepática e renal. - As alterações morfológicas hepáticas e pancreáticas. - O comportamento e a formação da memória aversiva. - A atividade da acetilcolinesterase e a peroxidação lipídica em diferentes estruturas encefálicas (córtex, hipocampo, estriado e sinaptossomas cerebrais)..

(29) 3 MANUSCRITOS. Os resultados desta tese estão sob a forma de dois manuscritos científicos. Os itens materiais e métodos, resultados, discussão e referências bibliográficas encontram-se nos manuscritos.. 3.1. Manuscrito 1:. Antioxidant and anti-inflamatory effects of quercetin in functional and morphological alterations in streptozotocin-induced diabetic rats. Roberto Marinho Maciel, Márcio Machado Costa, Danieli Brolo Martins, Raqueli Teresinha França, Roberta Schmatz, Dominguita Lühers Graça, Marta Maria Medeiros Frescura Duarte, Cristiane Cademartori Danesi, Cinthia Melazzo Mazzanti, Maria Rosa Chitolina Schetinger, Francine Chimelo Paim, Heloisa Einloft Palma, Fátima Husein Abdala, Naiara Stefanello, Cristina Kraemer Zimpel, Diandra Visentini Felin, Sonia Terezinha dos Anjos Lopes. Manuscrito aceito na Research in Veterinary Science.

(30) 30. Antioxidant and anti-inflammatory effects of quercetin in functional and morphological alterations in streptozotocin-induced diabetic rats. R.M. Maciela,*, M.M. Costaa, D.B. Martinsb , R.T. Françaa , R. Schmatzc , D.L. Graçaa , M.M.M.F. Duartee , C.C. Danesid , C.M. Mazzantia, M.R.C. Schetingerc, F.C. Paima, H.E. Palmaa, F.H. Abdalac, N. Stefanelloc, C.K. Zimpela, D.V. Felina, S.T.A. Lopesa. a. Laboratório de Análises Clínicas Veterinária – LACVet, Universidade Federal de Santa. Maria, Av. Roraima nº 1000 – Cidade Universitária – Bairro Camobi, 97105-900 Santa Maria, RS, Brazil. b. Centro de Ciências da Saúde – Universidade de Cruz Alta, Rod. Jacob Della Meia, Km 56,. Parada Benito, 98020-290 Cruz Alta, RS, Brazil. c. Laboratório de Enzimologia Toxicológica – ENZITOX, Universidade Federal de Santa. Maria, Av. Roraima nº 1000 – Cidade Universitária – Bairro Camobi, 97105-900 Santa Maria, RS, Brazil. d. Centro de Ciências da Saúde – Departamento de Patologia – Curso de Odontologia,. Universidade Federal de Santa Maria, Av. Roraima nº 1000 – Cidade Universitária – Bairro Camobi, 97105-900 Santa Maria, RS, Brazil. e. Departamento de Ciências da Saúde – Universidade Luterana do Brasil, BR 287, Km 252,. Trevo Maneco Pedroso, Bairro Boca do Monte, 97020-001 Santa Maria, RS, Brazil. * Corresponding author. Tel.: +55-55 3220-8814 Email address: roberto.marinho@uol.com.br (R.M. Maciel)..

(31) 31. Abstract The aim of this study was to investigate functional and morphological alterations caused by oxidative stress in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats and to evaluate the antioxidant effect of quercetin (QUE) in this disease. One hundred and thirty male Wistar rats, were randomly distributed in 10 different experimental groups, with ten animals per group: Control Saline (CS), Control Ethanol (CE), Control QUE 5mg/kg (CQ5), Control QUE 25mg/kg (CQ25), Control QUE 50mg/kg (CQ50), Diabetic Saline (DS), Diabetic Ethanol (DE), Diabetic QUE 5mg/kg (DQ5), Diabetic QUE25mg/kg (DQ25), Diabetic QUE 50mg/kg (DQ50). Therefore, hyperglycemia is directly involved in oxidative stress production, as well as in functional and morphological alterations caused by the excess of free radicals. QUE, specially at the dosage of 50mg/kg, can act as an antioxidant and anti-inflammatory agent, becoming a promising adjuvant in the treatment of diabetes mellitus. Keywords: Diabetes mellitus; hepatic enzymes; proteins electrophoresis; oxidative stress.. Introduction Diabetes mellitus (DM) is a very complex disease in people and equally so in the dog and cat (Hoenig, 2002). DM is considered to be a common endocrinopathy in dogs, presenting prevalence between 0.3% to 1.3% (Davison et al., 2005). The incidence of diabetes in cats ranges from 1 in 50 to 1 in 400 depending on the population studied (Baral et al., 2003). The most common form of diabetes in companion animals varies with the species. Type 1 DM (T1DM), previously called insulin-dependent diabetes, is most common in dogs, whereas type 2 (T2DM), previously called non-insulin-dependent or adult-onset diabetes, appears to be the more common form of diabetes in cats (Rand et al., 2004). The etiology of canine DM is considered multifactorial and may be broadly divided into insulin resistence and insulin deficiency (Catchpole et al., 2005). Certain breeds have been shown to have either an.

(32) 32. increased or a decreased risk of developing the DM, implying the existence of important genetic factors in the aetiology (Davison et al., 2005). Streptozotocin (STZ) is the drug of choice for the induction of experimental diabetes in rats, once this substance causes a selective destruction of pancreatic beta-cells, resulting in a hyperglycemic model similar to that observed in T1DM (Jin et al., 2010). Even that in this case the mechanism responsible for beta-cells destruction is not an autoimmune process this model remains viable, especially in studies where hyperglycemia is the main cause of the alterations evaluated (Obrosova et al., 2005). Impaired glucose metabolism observed in diabetes may increase reactive oxygen species (ROS) production (Robertson and Harnon, 2006). An increased oxidative stress is a well-known pathogenic mechanism related to diabetic complications. Induction of diabetes with streptozotocin causes an increase in thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) levels, that can be indirectly used to evaluate free radicals formation (Maritim et al., 2003). Quercetin (QUE) is a flavonoid with antioxidant properties (De Groot, 1994). This compound is present in fruit, vegetables, and is abundant in red wine (Gaspar et al., 1993). Several researchers have investigated substances with antioxidant effect (Dallaqua and Damasceno, 2011). Currently, over 800 types of plants are used in the treatment of diabetes (Saxena et al., 2004) and most of these have a broad spectrum in the clinic. Thus, it is necessary to explore the phytomedicine area to provide alternative therapies for the treatment of diabetic syndrome (Yeh et al., 2003; Suba et al., 2004). The objective of the present study was to investigate functional and morphological alterations caused by oxidative stress and to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory effects of QUE in STZ-induced diabetic rats. Searching with this, new possibilities for supporting therapy in the treatment of diabetes in veterinary medicine, mainly dogs. Materials and methods.

(33) 33. Animals One hundred and thirty male Wistar rats (70-90 days old; 160–250g) from the Bioterium of the Federal University of Santa Maria were used in this study. Of this total, 96 rats reached the end of the experiment being used to collect samples. From the remaining 34 rats, 15 rats died between the induction of diabetes and end of the experiment, and the others whose do not reach 250mg/dL blood glucose, were euthanized with halothane (deep anesthesia). The animals were maintained at a constant temperature (23 + 1ºC), on a 12h dark/light cycle with free access to food and water. All procedures were approved by the Animal Ethics Committee from the Federal University of Santa Maria (protocol number: 57/2010).. Experimental induction of diabetes The animals were housed five per cage and submitted to a period of 15 days of adaptation. Diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of 70mg/Kg STZ (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). diluted in 0.1 M sodium-citrate buffer (pH 4.5), in the proportion of 0.001mL per 1g of body weight. The age-matched control rats received an equivalent amount of the sodium-citrate buffer. STZ-treated rats received 5% of glucose instead of water for 24h after diabetes induction in order to reduce death due to hypoglycemic shock. Blood samples were taken from the caudal vein 48 h after STZ or vehicle injection to measure glucose levels. Only animals with fasting glycemia higher than 250 mg/dL were considered diabetic and used for the current study. During the experimental period the levels of blood glucose were verified six times (15 days before, on day one, 10, 20, 30, and 40 days after the beginning of treatment).. Treatment with quercetin (QUE).

(34) 34. The rats were randomly divided into ten groups (10 rats per group): Control Saline (CS); Control Ethanol (CE); Control QUE 5mg/Kg (CQ5); Control QUE 25mg/Kg (CQ25); Control QUE 50mg/Kg (CQ50); Diabetic Saline (DS); Diabetic Ethanol (DE); Diabetic QUE 5mg/Kg (DQ5); Diabetic QUE 25mg/Kg (DQ25); Diabetic QUE 50mg/Kg (DQ50). Ten days after diabetes induction, the animals belonging to groups CQ5 and DQ5 received 5mg/Kg of QUE, the animals from CQ25 and DQ25 groups received 25mg/Kg and the rats from groups CQ50 and DQ50 received 50mg/Kg of QUE, while the animals from groups CS and DS received 0,9% saline solution by gavage. The groups CE and DE received 25% ethanol by gavage. QUE, (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), was freshly prepared in 25% ethanol and was administered at between 3 and 4 p.m. once a day during 40 days, by gavage. The dose of QUE was adjusted weekly, according to the body weight of the rats. The volume of saline solution and ethanol were adjusted according to the proportional 0.001mL per 1g of body weiht.. Blood collection Forty days after DM induction, the rats were anesthetized with halothane and blood was collected by cardiac puncture. Blood samples for biochemical assays were collected in tubes without anticoagulant and serum was obtained by centrifugation of the samples for 10 minutes. Blood samples for hematological analysis were collected in tubes containing EDTA as anticoagulant.. Hematological profile Hematological analysis was performed using an automatic hematological analyzer (Auto Hematology Analyz, BC-2800 Vet – Mindray). Hematological parameters evaluated were total red blood cell (RBC) and white blood cell (WBC) count, hematocrit (HCT), hemoglobin.

(35) 35. (Hb), mean corpuscular volume (MCV) and mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC). For the differential leukocytes count (neutrophils, lymphocytes, eosinophils and monocytes) differential, a blood smear was prepared and the slides were stained with DiffQuick. The WBC count was performed in groups of 100 leukocytes, and then examined under oil immersion by optic microscope.. Electrophoresis profile of serum proteins determination The total serum protein was determined through the biuret method, using commercial reagent and the analysis were accomplished in semi automatic spectrophotometer, according to fabricant instructions. The protein fractionation was determined using cellulose acetate strip electrophoresis in a horizontal cube (Labex), with Tris-glycine buffer (pH 8.6), adapted from technique described by Naoum (1999). Samples were applied to the strips and run using a constant voltage of 180 volts for 25 minutes. Strips were then stained with Ponceau for 15 minutes, the excess was removed by washing the strips in 5% acetic acid until background was completely clear. Then strips were fixed in methanol for 30 seconds and washed for 1 minute with a destain solution. Strips were dried at 60ºC for 15 minutes and read by the Descan system. The fractions analyzed were the albumin, alphaglobulin, betaglobulin and gammaglobulin.. Biochemical profile Biochemical analysis of serum samples was performed using a semi automatic chemistry analyzer (Bioplus, BIO-2000), using commercial kits (Labtest, Minas Gerais, Brazil), according to the recommendations of the manufacturer. Biochemical parameters measured were fructosamine, triglycerides, cholesterol, urea, creatinine, alkaline phosphatase (ALP) and alanine aminotransferase (ALT). Blood glucose was determined by portable glucometer.

(36) 36. Accu-Check Nano Performa (Roche, Brazil). Insulin was evaluated by solid phase radioimmunoassay using commercial kit Coat-A-Count, purchased from Diagnostic Products Corporation (Gwynedd, UK).. Determination of lipid peroxidation Lipid peroxidation in serum was estimated by measuring TBARS according to a modified method of Jentzsch et al. (Levini et al., 1990). Briefly, 0.2mL of serum was added to the reaction mixture containing 1mL of 1% orthophosphoric acid and 0.25mL alkaline solution of thiobarbituric acid (final volume 2mL), followed by 45 min heating at 95ºC. After cooling, samples and standards of malondialdehyde were read at 532 nm against the blank of the standard curve. The results were expressed in nmol MDA/mg protein.. Catalase and superoxide dismutase activities The determination of CAT activity was carried out in accordance with a modified method of Nelson and Kiesow (1972). For determination of CAT activity in liver and kidney, the tissues were homogenized in 50mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, at a proportion of 1:9 (w/v) and 1:5 (w/v), respectively. The homogenate was centrifuged at 2000g for 10 min to yield a supernatant that was used for the enzyme assay. The reaction mixture contained 50mM potassium phosphate buffer (pH 7), 10mM H202 and 20mL of the supernatant. The rate of H2O2 reaction was monitored at 240nm for 2 min at room temperature. The enzymatic activity was expressed as nmol CAT/mg protein (one unit of the enzyme is considered as the amount of CAT which decomposes 1mol of H2O2 per min at pH 7 at 25ºC). Measurement of superoxide dismutase activity is based on the inhibition of the radical superoxide reaction with adrenalin as described by Misra and Fridovich (1972). With the purpose of performing the SOD assay in liver and kidney (Misra and Fridovich, 1972), the.

(37) 37. tissues were adequately diluted with Tris-HCl pH 7.4 at a proportion of 1:40 (w/v) and 1:60 (w/v) respectively. Briefly, epinephrine undergoes auto-oxidation at pH 10.2 to produce adrenochrome, a colored product that was detected at 480 nm. The addition of samples (10, 20, 30L) containing SOD inhibits the auto-oxidation of epinephrine. The rate of inhibition was monitored during 180 seconds. The amount of enzyme required to produce 50% inhibition was defined as one unit of enzyme activity. The enzymatic activity was expressed as UI SOD/mg protein.. Tissue preparation After blood collection the rats were submitted to euthanasia. Pancreas and liver were quickly removed and placed on buffered formalin. Twenty-four hours later, a fragment of the tissue samples were included in paraffin.. Immunohistochemical analysis of the pancreas The slides from pancreas were incubated with insulin antibodies (DAKO), Anti Guinea-Pig and Complex ABC (Avidin-biotin-peroxidase) used as secondary markers aiming to identify and measure pancreatic beta-cells. Ten fields per slide were then examined under microscope at 400x magnification.. Hepatic histological and morphometric analysis The histological and morphometric analysis from hepatic tissue were examined in slides stained by hematoxiline-eosine method (HE), periodic acid-Schiff reactive technique and Harris hematoxiline (PAS). Hepatic morphology and possible alterations were observed by HE technique and the hepatocytes with glycogen accumulation were quantified (PAS technique) in ten standardized microscope fields at 400x magnification..

(38) 38. Statistical analysis As data presented normal distribution, proven by the Kolmogorov Smirnov test, they were submitted to one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test, using the statistical program, SPSS 17.0 for Windows. Differences were considered significant when P0.05. All data were expressed as mean  standard deviation.. Results Clinical course, body weight and glucose levels Diabetic rats from this study presented clinical disorders commonly observed in this condition, such as, polydipsia, polyuria, lethargy, polyphagia, and weight loss. The values of body weight and blood glucose levels are presented in Table 1 and 2, respectively. There was not a significant difference in body weight among the groups before the beginning of the study, but fifteen days after administration of STZ, the average body weight of diabetic animals decreased when compared to CS group. Ten days after the start of treatment with QUE, the difference in body weight from DS and CS groups was significant, and remained so until the end of the experiment. Fifteen days after induction of diabetes, blood glucose levels of diabetic animals increased when compared to control animals and remained high during the 40 days of treatment with QUE (P0.05).. Hematological parameters Evaluating the hematological parameters studied (Table 3), there were changes in the number of total leukocytes and neutrophils (P0.05). Total leukocytes number was significantly lower in diabetic rats when compared to non-diabetic animals, characterizing a significant leukopenia. In DQ5 group, this number reduced, considered statistically similar to CS group.

(39) 39. (P0.05). The diabetic rats also presented neutropenia; the neutrophil count was significantly lower when compared to CS group. In DQ25 group, the number of neutrophils decreased, being statistically similar to those observed in CS group (P0.05).. Serum proteinogram The electrophoretic profile is represented by the following parameters: albumin, alphaglobulin, betaglobulin and gammaglobulin (Table 3). DS group showed decreased levels of albumin in relation to CS group. DQ50 group showed a reduction of serum albumin level, similar to those from CS group (P0.05). In DS group there was an increase in alphaglobulin fraction when compared to CS group. Animals who received 25 and 50mg/Kg of QUE showed a reduction of this fraction when compared to DS group (P0.05). The concentration of betaglobulin in DS group was higher than CS group. Diabetic rats treated with 25 and 50mg/Kg of QUE, presented increased concentration of betaglobulin, when compared to CS group (P0.05). The gammaglobulin fraction in DS group increased when compared to CS group (P0.05). No significant difference was observed in diabetic rats treated with 50mg/Kg of QUE and CS group.. Biochemical and hormonal parameters The biochemical parameters evaluated in this study are described in Table 4. It was observed a high rate of insulin release in treatments with 5, 25 and 50mg/Kg of QUE, both in CS and DS groups, the last one presenting the highest release rate of this hormone. Diabetic rats showed a decreased in serum concentration of insulin when compared to CS group; DQ50 group showed similar levels to those observed in CS group (P0.05). The concentration of fructosamine in serum of diabetic rats increased in relation to CS group. In diabetic rats treated with 5, 25 and 50mg/Kg of QUE, the concentration of fructosamine remained higher.

(40) 40. compared to CS group (P0.05). Serum concentration of triglycerides in DC group increased when compared to CS group (P0.05). In diabetic rats, treated with 5, 25 and 50mg/Kg of QUE, it was found a decrease in concentration of triglycerides to values similar to those observed in CS group. Concentration of serum urea increased in DS group, comparing with CS group. Diabetic rats treated with 5, 25 and 50mg/Kg of QUE showed an increase, when compared to healthy groups who received this same dosages of this compound (P0.05). DS group showed ALP activity higher than CS group. In diabetic rats treated with 5, 25 and 50mg/Kg of QUE, the ALP activity remained higher when compared to CS group (P0.05). When compared to CS group, ALT activity of diabetic rats increased. In diabetic rats treated with 5, 25 and 50mg/Kg of QUE, the enzyme activity remained high in relation to CS group (P0.05).. Lipid peroxidation, catalase and superoxide dismutase activities TBARS in serum, SOD and CAT activities in renal and liver tissues were used in this study as biomarkers of oxidative stress (Table 5). The TBARS levels increased in the DS group, when compared to CS group. After treatment with 50mg/Kg of QUE, the levels reverted close to normal values observed in CS group (P0.05). Regarding the CS group, the SOD activity in both the liver and kidney, decreased in the DS group. However, only in the hepatic tissue was observed significance. In DQ50 group, it was observed a reduction of the enzyme activity, similar to the activity observed in CS group (P0.05). Regarding the CS group, CAT activity, both as kidney liver, decreased in the DS group, no significant difference in the two organs.. Immunohistochemical, histological and morphometric analysis Diabetic animals showed a reduction in the number of islet of Langerhans when compared to CS group (P0.05) (Table 6). Pancreas presented less number of beta-cells in diabetic rats.