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RENATA CRISTINA FIOROTTI
“ESTUDO DA FLUORESCÊNCIA NATIVA DE MUCOSA
ORAL NORMAL: BUSCA DE UM PADRÃO
DE NORMALIDADE”
CAMPINAS
2005
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RENATA CRISTINA FIOROTTI
“ESTUDO DA FLUORESCÊNCIA NATIVA DE MUCOSA
ORAL NORMAL: BUSCA DE UM PADRÃO
DE NORMALIDADE”
Tese de Doutorado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, para obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas , Área de Concentração em Ciência Biomédicas.
Orientadora: Prof.a. Dra. Ester Maria Danielli Nicola
Co-orientador: Prof. Dr. Jorge Humberto Nicola
CAMPINAS
2005
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044
Fiorotti, Renata Cristina
F513e “Estudo da fluorescência nativa de mucosa oral normal: busca de um padrão de normalidade”. / Renata Cristina Fiorotti. Campinas, SP : [s.n.], 2005.
Orientadores : Ester Maria Danielli Nicola, Jorge Humberto Nicola Tese ( Doutorado ) Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas.
1. Fluorescência. 2. Mucosa oral. 3. Espectroscopia de fluorescência. I. Nicola, Ester Maria Danielli. II. Nicola, Jorge Humberto. III. Universidade Estadual de Campinas.F aculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais: Ilda e Daniel, pelo incentivo constante e por oferecer, a mim e aos meus irmãos, uma família unida pelo amor e coragem.
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AGRADECIMENTOS
Esta obra é produto de um trabalho intenso e do meu enorme entusiasmo em aprender. Sem dúvida, contei com a força e a idéia de muitas pessoas. Além disso, acredito que ela também é resultado de bênçãos divinas, pois, apesar de atravessar um momento pessoal difícil, sempre encontrei apoio e incentivo para finalizá-la.
Aos meus amigos, novos e velhos, próximos e distantes: saibam que me esforcei para alcançar um sonho antigo e serei eternamente grata por cada um que passou pela minha vida.
Aos meus irmãos: Daniela e Ricardo, pelo amor e amizade que incentivam a busca pelos meus sonhos.
Ao meu grande amor: Salah Ali Osman, pelos exemplos de persistência e por acreditar nas minhas conquistas.
Ao grande amigo Adolfo Lopes Alonso, pelo carinho e apoio.
À Diva Helena Baldin, pela amizade e carinho nos momentos alegres e tristes. À tia Cecília, pela torcida e por nunca hesitar em me apoiar, em tudo.
Aos colegas de profissão e amigos do coração Ana Cristina e Bruno, por dividirem seus conhecimentos e participarem do trabalho.
Ao Nilceu Pereira Cassitas, pela amizade e grande oportunidade da minha vida.
Aos queridos amigos Paulo e Roberto, pelo apoio e dedicação no projeto e construção da fonte de luz utilizada no projeto piloto.
À família Laser: Diva, Paula, Luzia, Dr. Reinaldo, Dra. Cândida, Dr. Bruno e
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Aos funcionários do Laboratório Laser do Núcleo de Medicina e Cirurgia experimental: Dr. Edymir Reis e Maria, pelo auxílio e suporte na realização do projeto experimental.
Ao pessoal da Diretoria de Apoio Didático, Científico e Computacional, especialmente ao Péricles, Mário e Marcos, pela competência e qualidade dos serviços prestados.
Aos funcionários e residentes do departamento de Otorrinolaringologia, em especial a Cristina e Ana Maria, pelo auxílio prestado, sempre com carinho.
Aos amigos da pós-graduação: João Wagner, Milene, Ana Lúcia e tantos outros, por tornarem o curso mais agradável, dividindo experiências com proveitosas discussões.
Aos amigos Denise, Adriana, Jaime e Nina, por ouvirem tantas vezes minhas frustrações e claro, não me deixarem desistir.
À CAPES, pela bolsa de estudo concedida durante o curso.
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AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora Profa. Dra. Ester Nicola e ao meu co-orientador Prof. Jorge Nicola, que muito além dos ensinamentos científicos, sempre baseados na ética e inteligência, dedicaram-me amizade e carinho, num momento tão delicado da minha vida.
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“Só se encontra o que se busca; o que nos é indiferente nos foge”.
ix SUMÁRIO PÁG. RESUMO... xi ABSTRACT... xiii 1- INTRODUÇÃO GERAL... 15 2- OBJETIVOS... 23 3- CAPÍTULOS... 25
CAPÍTULO 1- “Native Fluorescence of Oral Cavity Structures: experimental study in canidae”... 27
CAPÍTULO 2- “Native Fluorescence Spectroscopy of Oral Normal Mucosa: preliminary study in humans”... 39
CAPÍTULO 3- “Análise Qualitativa de Espectros de Fluorescência de Mucosa Bucal Normal em Diferentes Sítios”... 54
4- DISCUSSÃO GERAL... 80
5- CONCLUSÃO GERAL... 85
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 88
x
LISTA DE FIGURAS
PÁG.
Figura 1- Mecanismo de fototerapia... 18
xi
Resumo
O fotodiagnóstico ou diagnóstico por fluorescência é um método complementar ao exame anátomo-patológico para detectar alterações morfológicas dos tecidos biológicos. A presente tese, apresentada segundo o formato alternativo estabelecido pela Comissão de pós-graduação da Unicamp, consta de três artigos e teve por objetivos: (1) estudar o efeito fotodinâmico, principalmente sob o ponto de vista diagnóstico, revendo a literatura sobre sua aplicação na cavidade bucal; (2) analisar através de estudo experimental em cães, a fluorescência nativa da mucosa oral avaliando a relação da mesma com diferentes sítios e estruturas; (3) desenvolver e validar um protótipo de fonte de luz e um método para estimulação e captação das fluorescências nativas em cavidade bucal de humanos; (4) avaliar os espectros de fluorescência assim obtidos , no sentido de determinar um padrão de fluorescência para mucosa oral normal. Para a elaboração desta tese foram utilizados 20 cães e 2 grupos de estudo compostos por 50 e 100 adultos normais, respectivamente.
A revisão de literatura demonstrou que, embora exista grande quantidade de estudos sobre a fluorescência nativa, poucos se referem ao tecido normal, sem alterações patológicas. O projeto piloto (Capítulo 1) teve como objetivo principal estudar a fluorescência nativa produzida por radiação ultravioleta nos tecidos biológicos e desenvolver a metodologia necessária para realizar fotodiagnóstico, utilizando um modelo animal. A partir dos resultados deste estudo e da revisão de literatura, desenvolvemos uma fonte de luz adequada para a realização do fotodiagnóstico em humanos. Esta fonte de luz consiste em três diodos emissores de luz ultravioleta (LEDs) com comprimento de onda de 410 nm e foi desenvolvida e testada com auxílio de uma empresa nacional do ramo. O Capítulo 2 apresenta resultados preliminares em humanos, comprovando que o método desenvolvido para o estudo da espectroscopia demonstra sensibilidade para detectar a fluorescência nativa na mucosa oral. No último artigo (Capítulo 3) são apresentados os resultados do estudo em um grupo de 100 voluntários, nos quais foram avaliados três sítios da mucosa bucal freqüentemente sujeitos a alterações. Foi possível evidenciar características comuns ao espectro de cada sítio, bem como algumas particularidades inerentes a condições e hábitos pessoais.
O conjunto de trabalhos desenvolvidos, evidencia a importância do estudo da fluorescência nativa da cavidade bucal e seu grande potencial como método diagnóstico precoce e não invasivo de alterações da mucosa oral.
xiii
Abstract
Photodiagnosis or Fluorescence Diagnosis is a complementary method to detect morphological alterations in biological tissues. The present thesis is composed of three papers and have the following objectives: (1) to study the photodynamic effect and its applications, mainly from diagnostic view point, reviewing the literature about its application in the buccal cavity ; (2) to analyze, through experimental study in dogs, the native fluorescence of the oral mucosa in relation to different sites and structures; (3) to developed and validate a prototype used to stimulate and detect native fluorescence in humans oral mucosa; (4) to analyze the obtained spectra with the objective to determine patterns of fluorescence for normal mucosa. The literature review comproved that despite the large amount of researches on native fluorescence, very few concerns to normal tissue and its morphological or physiological alterations. The three studied groups for this thesis were composed of 20 adults’ mongrel dogs and, for the human study we selected 50 and 100 healthy volunteers, respectively. A pilot study was necessary to understand the fluorescent emissions of mucosal tissue under ultraviolet stimulation in order to develop the necessary methodology which was used with the animal model (Chapter I). With the obtained results and based on the literature review was possible to develop the prototype device used to study the native fluorescence of buccal cavity, in a group of 50 volunteers. This prototype is composed by three diodes (LEDs), emitting in ultraviolet region (410 nm) coupled to an optical fiber and connected to a plug-in spectrometer. The results of this preliminary work demonstrate that the fluorescence spectra shows significantly differences according to the various sites of the oral mucosa (Chapter II). Chapter III comprehends a more detailed study developed in three sites of the oral mucosa of 100 volunteers and made possible to stablish some common characteristics in the spectra of each site, according to the age, race, gender and alcohol or tobacco.
The analysis of the results of this thesis leads to the conclusion that the native fluorescence of the normal oral mucosa has great potential to be used for early diagnoses of oral disease and deserves deeper studies.
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Introdução Geral
Métodos e técnicas ópticas têm sido desenvolvidos visando tanto o tratamento clínico como o diagnóstico, principalmente de neoplasias malignas. Com o desenvolvimento acelerado nos últimos anos de fontes de luz eficientes , incluindo-se o laser, assim como de sistemas sensíveis de detecção (câmeras digitais e espectrômetros), o interesse de pesquisadores pela óptica aplicada à área médica trouxe inúmeros benefícios para diversas especialidades da saúde em geral.
Nesta introdução focalizamos duas técnicas ópticas muitas vezes consideradas complementares. A primeira – Terapia Fotodinâmica e a segunda - Fotodiagnóstico por Fluorescência. Esta última é objeto específico do presente trabalho.
Terapia Fotodinâmica e Fluorescência
A terapia fotodinâmica (PDT – do inglês, PhotoDynamic Therapy) é uma aplicação não-cirúrgica que utiliza a luz para provocar morte celular, e foi inicialmente idealizada para o tratamento de câncer. Desde o início dos anos 80, é considerada uma nova modalidade terapêutica devido à tríade básica da PDT: a combinação de dois agentes terapêuticos, uma droga fotossensibilizadora e a luz que, quando combinadas (e na presença de oxigênio) causam destruição dos tumores (VROUENRAETS, 2003).
Os primeiros trabalhos com resultados positivos envolvendo a PDT foram aplicados em tumores de camundongos, utilizando o derivado de hematoporfirina (HpD) ativado pela luz vermelha de uma lâmpada de xenônio com comprimento de onda de 660-700 nm (DOUGHERTY et al., 1975).
Em 1976, KELLY e SNELL descreveram um caso clínico completo de PDT para o tratamento de câncer de bexiga, utilizando HpD e luz de mercúrio, através de fibra óptica.
O aprimoramento de sistemas ópticos, como o uso de fibra óptica, viabilizou o tratamento de tumores do trato respiratório e gastrointestinal (DOUGHERTY, et al., 1978). A utilização do laser como fonte de luz também contribuiu para o desenvolvimento da PDT e sua aplicação em tumores malignos (WILSON e PATTERSON, 1986) em várias localidades do corpo humano, tais como cavidade oral e pele (KOLLI, et al., 1995;
Introdução Geral
SCHUITMAKER, et al., 1996; WALLACE, et al., 2000). Com o avanço e melhoria dos métodos, outras áreas da saúde, como a Odontologia também se beneficiam desta modalidade, tendo como alvo as bactérias envolvidas no desenvolvimento de lesões de cárie e doença periodontal (DORSHOW, et al., 1998; WOOD, et al.,1999; KÖNIG, et al., 2000; KÖMERIK, et al., 2003).
As células tumorais, assim como as maiorias das bactérias, não absorvem luz visível suficiente para promover citotoxidade. Portanto, para que aconteça dano ou morte celular, é necessária a utilização de um fotossensibilizador que se fixe ao tecido tumoral e intensifique a absorção da luz. Algumas horas após a administração deste composto químico - que pode ser feita via oral, inalatória, endovenosa ou tópica - o sensibilizador apresenta determinada seletividade por células tumorais, por um mecanismo ainda não bem definido. Neste momento, o tumor é irradiado por uma luz, laser ou não que, absorvida pelo fotossensibilizador desencadeia uma seqüência de fenômenos naturais, como explicado a seguir.
Quando o fotossensibilizador absorve energia ele converte-se para um estado excitado, caracterizado pela passagem dos seus elétrons para níveis de energia superiores. Isso pode resultar na formação de moléculas reativas como o oxigênio singlete, íons superóxidos, hidroxilas e outros radicais livres que podem matar as células teciduais (VROUENRAETS, 2003). Sabe-se que o oxigênio molecular (O2) pode apresentar dois
estados físicos possíveis: o tripleto (3 O2), estado de menor energia e pouco reativo (estado
natural ou fundamental) e o singleto (1 O2), que reage facilmente com outras substâncias,
liberando energia. Logo, para destruir uma célula, poder-se-ia provocar a passagem do oxigênio em seu estado natural (tripleto) para o estado excitado (singleto), induzindo uma reação oxidante com as substâncias da célula hospedeira. De acordo com a Mecânica Quântica*, para que esta transição ocorra, é necessário que condições físicas sejam satisfeitas simultaneamente: primeiro, “pacotes de energia” equivalentes ao “gap” entre os níveis de energia singlete-triplete devem estar disponíveis para cada transição e, em
*
Mecânica Quântica: parte da física em que se investigam os fenômenos ocorrentes com partículas, átomos e moléculas, e em que, abandonadondo-se a admissão clássica da continuidade dos processos subatômicos, se aceita a ocorrência de fenômenos discretos quantificados; mecânica ondulatória. Fonte: Dicionário Aurélio.
Introdução Geral
segundo lugar, a transferência destes “pacotes” deve ser realizada através do contato físico com outra molécula previamente energizada, isto é, sem a presença de fótons (NICOLA e NICOLA, 2002). Esta segunda condição é dificultada pela natureza e não ocorre de maneira direta, ou seja, por absorção de fótons pelo 3 O2. Do contrário, a presença de vida
na superfície da Terra seria impossível.
Também por razões quanto-mecânicas, algumas substâncias, em particular os derivados de Hematoporfirina (HpD – do inglês, Hematoporphyrin Derivative), podem absorver fótons diretamente e, quando na presença de oxigênio, servem de “pontes” intermediárias para a transição deste seu estado tripleto para o singleto. Estas substâncias foram desenvolvidas na década de 60, a partir dos estudos de Policard, que, em 1924, observou a fluorescência de porfirinas em tumores experimentais e concluiu que esta substância tinha seletividade por tecidos tumorais (VROUENRAETS, 2003).
Figura 1- Mecanismo de fototerapia.
H HPPDD J Joorrggee HH.. NNiiccoollaa O Oxxiiggêênniioo t trripiplleettoo D Deessttrruuiiççããoo c ceelluullaarr F Fóóttoonn λλ == 663322 nnmm T Trrananssffeerrêênncciiaa ddee e enneerrggiiaa n nããoo rraaddiiooaattiivvaa TERAPIA FOTODINÂMICA
Introdução Geral
O fotossensibilizador adequado é aquele que, além de absorver luz, não provoca efeitos colaterais no hospedeiro, seja totalmente eliminado do organismo após o tratamento e permaneça em estado excitado por tempo suficiente para que exista a transferência de energia e a formação de oxigênio singlete, causando morte celular por necrose ou apoptose (DOUGHERTY et. al., 1975; COLUSSI et al., 1996).
Assim como a PDT, outro fenômeno óptico desperta interesse para a área médica e odontológica, neste caso, permitindo diagnósticos. Trata-se da fluorescência óptica que ocorre quando um átomo ou molécula absorve energia de um fóton e reemite com energia menor e característica do átomo ou molécula responsável pelo fenômeno. Quando a fluorescência ocorre após administração de drogas fotossensibilizadoras, denominamos como fluorescência induzida. No caso da fluorescência de substâncias normalmente existentes nos tecidos chamamos de fluorescência nativa.
O interessante é que esta fluorescência permite observar alterações no tecido biológico sem a necessidade de administrar drogas fotossensibilizadoras, com grau de especificidade e sensibilidade de aproximadamente 90% (HEINTZELMAN, et al, 2000).
O fotodiagnóstico aplicado à área médica foi intensamente pesquisado através da fluorescência induzida. Isso porque, com a descoberta de que células tumorais tinham afinidade por Protoporfirina IX, muitos pesquisadores dedicaram-se a estudos com derivados de hematoporfirina.
Embora a fluorescência nativa fosse conhecida desde 1930, sua maior divulgação e pesquisa vem acontecendo só recentemente.
LEUNIG et al. (2000), relatou um estudo clínico sobre espectroscopia por fluorescência, utilizando o 5-ALA (ácido delta- aminolevulínico) em papilomas de laringe e concluiu que o método, além de não invasivo e fácil execução, detectou um número maior de lesões nos pacientes, comparado ao exame clínico. Neste caso o papel do ALA é de incrementar a produção local de protoporfirina IX, que é um fotossensibilizador conhecido, podendo, portanto, ser considerado um caso de fluorescência nativa ou endógena. Alguns autores utilizam o termo “biópsia óptica” para relatar o diagnóstico e monitorar lesões
Introdução Geral
malignas e pré-malignas da cavidade oral através da fluorescência (SUHR, et al., 2000). Constitui-se, desta maneira e ainda dentro do efeito fotodinâmico, a outra linha de utilização da luz para a área da saúde: a do diagnóstico por fluorescência ou fotodiagnóstico.
Fotodiagnóstico
O conceito de fotodiagnóstico ou diagnóstico fotodinâmico (PDD – do inglês,
PhotoDynamic Diagnoses) é baseado na observação da fluorescência endógena ou
exógena, emitida por estruturas moleculares presentes nos tecidos biológicos, quando irradiados por luz ultravioleta.
SUTRO, em 1933 foi quem introduziu o conceito de diagnóstico por fluorescência nativa, através da análise de amostras de tecido de mama, removidos cirurgicamente e excitados por uma lâmpada ultravioleta. Depois disso, surgiram estudos em pele e cavidade oral. RONCHESE, em 1954 relacionou a fluorescência do câncer de cavidade bucal em diferentes estágios através da luz ultravioleta.
Várias especialidades médicas utilizam a espectroscopia de fluorescência para detectar alterações, principalmente maligna (MARCHESINI, et al, 1992; DORSHOW, et al., 1998).
A partir de 1960, vários estudos demonstraram a fluorescência dos tecidos dentários e sua aplicação para o diagnóstico de lesões cariosas (MATSUMOTO,
et al., 1999).
A fluorescência nativa de lesões cancerígenas geralmente é observada na região vermelha do espectro e as displasias ou neoplasias demonstram redução da intensidade de fluorescência, especialmente na região do verde para o azul (DHINGRA, et al., 1998; SIERON, et al., 2003). Vários estudos têm demonstrado que a fluorescência nativa é um método diagnóstico de grande valor para distinguir câncer e tecidos normais em vários órgãos e sistemas, incluindo bexiga, mama, brônquios, cólon, esôfago e região de cabeça e pescoço (WANG, et al., 1999; MALZAHN, et al., 2002).
Introdução Geral
A maioria dos tecidos animais e vegetais apresentam fluorescência quando excitados por luz ultravioleta. As estruturas moleculares que apresentam fluorescência são denominadas fluoróforos e, muitas delas já foram identificadas, tais como: fibras colágenas e elásticas, flavinas, ácidos nucléicos (NADH, dinucleotideo adenina nicotina-amida, DNA, RNA), proteínas e aminoácidos (triptofano, tirosina, fenialanina). Este fenômeno é bastante explorado, há algum tempo, através de exames histopatológicos, como a microscopia de fluorescência.
Finalmente, o diagnóstico fotodinâmico pode ser aplicado no diagnóstico de lesões iniciais, já que lesões cancerígenas são precedidas de alterações displásicas. Também é utilizado como método para monitorar o tratamento quimioterápico e o controle pós-operatório de recidivas, reduzindo a necessidade e/ou número de biópsias. E ainda, para aumentar a precisão diagnóstica durante o trans-operatório, com resultados em tempo real (MALZAHN, et al., 2002).
b
a
c
A
bsorção UV
E
nergia (
ε
)
Fluoróforo
UV
0 20 40 60 80 100 120 546561575589603617631644657670683695708720732743755766777788799809819 Comprimento de Onda (nm) Inte nsid adea
b
c
Ester Nicola e Col.(1998)
Espectro de emissão
(característico da substância)
Introdução Geral
Fluorescência nativa e mucosa oral normal
O comprimento de onda mais adequado para o fotodiagnóstico está entre de 380 nm e 410 nm, região correspondente ao ultravioleta próximo do espectro eletromagnético (MATSUMOTO, et al., 1999; MALZAHN, et al., 2002).
O espectro da fluorescência nativa da mucosa oral normal, assim como a de outros tecidos humanos, representa a soma de vários espectros de suas estruturas moleculares e depende, igualmente, da composição química e de características histomorfológicas (ROST, 1995; MALZAHN, et al., 2002). Neste sentido, a espectroscopia de fluorescência provê informações sobre a arquitetura tecidual e principalmente sobre o metabolismo tecidual, através da concentração maior ou menor de moléculas fluoróforas. O aumento ou aparecimento de fluorescência a partir de 630 nm (região do vermelho) nos tecidos com características malignas, está relacionada ao aumento da concentração de porfirinas, substância endógena que tem afinidade por este tipo de tecido.
Já a diminuição na intensidade de fluorescência nas regiões clinicamente normais está relacionada com alterações morfológicas displásicas, devido à proliferação celular e conseqüente espessamento da mucosa, com isso, a presença da fibra colágena, que é altamente fluorescente, diminui na matriz extracelular, na membrana basal e na submucosa. A maioria dos artigos reporta estudos comparativos entre tecido normal e patológico de um mesmo paciente, geralmente utilizando o lado contralateral ou adjacente.
Embora os dados sejam promissores em relação ao diagnóstico da cavidade bucal, onde o câncer apresenta significância estatística em relação à morbidade e mortalidade , outros estudos devem ser desenvolvidos com o propósito de caracterizar ou padronizar a mucosa oral normal.
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Objetivos Os objetivos deste estudo foram:
01. Analisar através de um estudo experimental em cães, o efeito fotodinâmico da luz ultravioleta e a fluorescência nativa obtida em diferentes áreas da cavidade bucal.
02. Desenvolver e validar um protótipo de luz para estimulação e um método de captação de fluorescência nativa em cavidade oral de humanos.
03. Estudar os espectros da fluorescência nativa obtida em humanos (relacionando idade, gênero e raça), a fim de determinar um padrão de fluorescência para a mucosa oral normal.
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Capítulos
A deliberação CCPG - 001/98 da Universidade Estadual de Campinas regulamenta o formato alternativo para dissertações de Mestrado e Doutorado e permite que artigos científicos de autoria do candidato constem como capítulos da tese. Portanto, esta Tese é composta de três capítulos contendo artigos submetidos para publicação ou em fase de submissão em periódicos científicos.
- Capítulo 1
“Native Fluorescence of Oral Cavity Structures: experimental study in Dogs”. Fiorotti, R. C.; Nicola, J. H. N.; Nicola, E. M. D. Este trabalho foi submetido à publicação no periódico
Photomedice and Laser Surgery , e estamos aguardando o aceite.
- Capítulo 2
“Native Fluorescence Spectroscopy of Oral Normal Mucosa: preliminary study in humans”. Fiorotti, R. C.; Nicola, J. H.; Nicola, E. M. D. Este trabalho encontra-se em revisão final do inglês para submissão a periódico indexado especializado.
- Capítulo 3
“Fluorescência Nativa de Mucosa Oral Normal de diferentes sítios em relação a hábitos, faixa etária, gênero e raça”. Fiorotti, R. C.; Nicola, J. H.; Nicola, E. M. D. Este trabalho será submetido à publicação em periódico especializado e, para isso, está sendo traduzido para o inglês.
Capítulos
CAPÍTULO 1
NATIVE FLUORESCENCE OF ORAL CAVITY
STRUCTURES: EXPERIMENTAL STUDY IN DOGS.
Renata C. Fiorotti1, Jorge H. Nicola2 , Ester M. D. Nicola3
Laser Laboratory, Center for Experimental Medicine and Surgery, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP).
Campinas, SP, Brazil
1- Dental surgeon. Doctoral Student in Medical Sciences, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
2- Physicist. PhD, Professor in the Post-graduate Program in Medical Sciences, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil. 3- Otorhinolaryngologist. PhD, Professor in the Department of Ophthalmology and
Otorhinolaryngology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
Corresponding author: Ester M.D. Nicola, MD, PhD Disciplina de Otorrinolaringologia,
Departamento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia, Faculdade de Ciências Médicas
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) CP 6111, Campinas, SP,
Brazil. CEP: 13083-970
Telephones: (55) (19) 3788-7523 / 3788-7902
Capítulos
Abstract
Native fluorescence occurs in many animal and plant tissues following excitation by UV light. The fluorescence spectrum characteristic of a given tissue may vary with changes in tissue composition and organization. Hence, this optical phenomenon provides a reliable and minimally invasive diagnostic tool for examining tissues in normal and pathological conditions. The oral cavity contains a variety of structures, including the lips, tongue, palate and gingiva that differ in their location and function. These structures can be easily traumatized or show different degrees of keratinization. Objective: To compare the fluorescence of different areas of the buccal mucosa of dogs. Background Data: Experimental. Material and Method: Study sample: 20 healthy, adult, mongrel dogs of both sexes. The dogs where anesthetized and manipulated in accordance with institutional guidelines. The fluorescence spectra were obtained using a “plug-in” spectrometer and optical fibers, with a final resolution better than 2 nm. The fluorescence of five areas (palate, gingiva, tongue, buccal mucosa and teeth) was examined. A UV-Hg lamp (emission wavelength: 350-410 nm) was used for excitation. Results and Discussion: One hundred and twenty spectra were collected from various regions of the oral cavity and all of them showed the same profile, with maximum fluorescence between 500 and 520 nm.
Conclusion: The similarity of the spectra for the different sites allowed us to establish a
standard fluorescence spectrum of the buccal cavity.
Capítulos
Introduction:
Autofluorescence or native fluorescence of endogenous substances occurs in animal and plant tissues following excitation with ultraviolet (UV) light1. Alterations in the composition and organization of a tissue in normal and pathological conditions can change the characteristic fluorescence spectrum of the tissue, which suggests that the monitoring of spectral variations could provide a minimally invasive diagnostic tool1, 2.
The oral cavity and upper aerodigestive tract consist of a variety of tissues and mucosa that form structures, such as the lips, palate, tongue and pharynx that are frequently affected by pathologies. The oral mucosa consists basically of a stratified squamous epithelium and fibrous connective tissue that is easily traumatized and shows varying degrees of keratinization, depending on the site examined. Metaplastic sites in leukoplakic lesions, in
situ or Grade I carcinomas, dental caries in the initial phase, are examples of lesions that
have been diagnosed at an early stage based on their fluorescence3, 4. However, no studies have examined the pattern of native fluorescence in the various structures that form the oral cavity.
The objective of this paper was to systematically investigate the native fluorescence of clinically normal oral cavity structures in dogs, and to assess whether alterations in the observed pattern of fluorescence could serve as an early diagnosis of oral cavity pathologies.
Materials and Methods:
This paper describes an experimental study of the buccal cavity of dogs done at the Center for Experimental Medicine and Surgery of the Faculty of Medical Sciences, UNICAMP. Twenty male and female mongrel dogs (10-15 kg) were used. The dogs were housed under standard conditions in the kennel maintained by the Multidisciplinary Center for Biological Investigation (CEMIB/UNICAMP) and received a standard diet of commercial dog food and water ad libitum. The dogs were handled in accordance with institutional guidelines. When required, the dogs were anesthetized with thiopental (25 mg/kg, i.v.) and the fluorescence spectra were obtained for the dorsal and ventral surface of the tongue, the buccal mucosa, attached gingiva, floor of the mouth, palate and teeth. The plaque deposited
Capítulos
on the surface of the teeth was also analyzed. The sites chosen (except for the teeth) were those most likely to be affected by oral cavity lesions.
The fluorescence spectra were determined using a “plug-in” type spectrometer (PC2000-S, Ocean Optics Inc.) connected to an optical fiber and a personal computer. Fluorescence was produced by irradiating the oral cavity with UV light (UV TL 4 W/08 lamp, Phillips) that was innocuous to biological tissue. Three spectra were obtained from different regions at each site, with only the best spectrum being considered for analysis. The software OOIBase 32TM (Ocean Optics, Inc.) was used to display the spectra that were obtained.
Results:
One hundred and twenty fluorescence spectra were analyzed (six from each dog) and all showed the same characteristic profile, with a peak of maximum fluorescence between 500 and 520 nm. Figure 1 shows representative spectra of the sites that were studied.
Figure 1: Representative spectra obtained from the six sites studied. The circled area
represents the native fluorescence of the mucosa.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
assoalho de boca - cão 18.Slave1.sample dorso de língua - cão 8.Slave1.sample esmalte cão 7.Slave1.sample gengiva inserida - cão 10.Slave1.sample mucosa jugal - cão 9.Slave1.sample Palato-cão 3.Slave1.sample
Capítulos
The mercury (Hg) lamp (source of excitation) used in this study emitted light between 350 nm and 430 nm. Comparison of the spectrum of this lamp (Figure 2) with Figure 1 shows that the spectra obtained in dogs contained a characteristic peak in the 500 nm region. This finding indicated that the tissues examined showed significant fluorescence in response to UV radiation.
Figure 2: Emission spectrum of the Hg lamp. The 500 nm region lacks the characteristic
peak seen in dog tissues.
Discussion:
Biological tissues contain various substances that show endogenous fluorescence5, 6, and any change in the tissue content of such compounds may alter the fluorescence spectrum of the tissues7, 9. Such variation suggests that optical methods may be useful for the diagnosis of illnesses. An example of this application that is currently being intensively explored is the diagnosis of dental tissue lesions. This approach is much simpler and more efficient than periapical X-ray, which is the only alternative for the early detection of carious lesions in tooth enamel and/or dentine4, 8.
Oral cavity tissue emits green fluorescence that is not easily seen by the human eye, but is readily detected with a highly sensitive spectrometer. In the case of plaque, which is considered a pathological alteration, autofluorescence is easily observed with the naked eye (Figures 3 and 4). 0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
Capítulos
The region between 650 nm and 700 nm showed less variation in the level of fluorescence, except for plaque (see below). In some cases (dogs 14 to 17), the floor of the mouth showed no fluorescence in the 700 nm region (Figure 5).
Figure 5: Fluorescence spectra of the floor of the mouth in dogs. The black line represents
the mean spectrum for all dogs except animals 14-17. Note that the spectra for dogs 14-17 lacked a well-defined peak in the 650-700 nm regions (circled area).
Figure 3: Clinical aspect of canine mucosa
and teeth seen under white light.
Figure 4: The same site as in Figure 3, but
with UV light. Note the fluorescence of the mucosa and dental plaque.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
assoalho de boca- cão 14.Slave1.sample assoalho de boca- cão 15.Slave1.sample assoalho de boca- cão 16.Slave1.sample assoalho de boca- cão 17.Slave1.sample assoalho de boca - cão 8.Slave1.sample
Capítulos
The dorsal surface of the tongue showed a similar spectral profile (dogs 13, 14, 15 and 17) (Figure 6) to that seen in the floor of the mouth in dogs 14-17 (Figure 5).
Figure 6: Fluorescence spectrum of the dorsal surface of the tongue. The black line
represents the mean spectrum for all dogs except animals 13-15 and 17. Note that the spectra for dogs 13-15 and 17 lacked a well-defined peak in the 650-700 nm regions
(circled area).
The similarity among the spectral profiles of the buccal mucosa was considerably greater than that observed among other structures. A reduction in fluorescence was observed in the 700 nm region in three dogs (14, 16 and 17) (Figure 7).
Figure 7: Fluorescence spectra of the buccal mucosa. The average spectrum is shown in
red and the spectrum of one of the three dogs that showed variation in the 700 nm region is indicated in blue. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
Dorso de língua cão 13.Slave1.sample dorso de lingua- cão 14.Slave1.sample dorso de lingua- cão 15.Slave1.sample dorso de lingua- cão 17.Slave1.sample dorso de língua - cão 9.Slave1.sample
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
mucosa jugal - cão 9.Slave1.sample mucosa jugal- cão 16.Slave1.sample
Capítulos
In the palate, the fluorescence in the 500 nm region was attenuated by the presence of a large amount of local melanin in some of the dogs. No fluorescence was detected in five dogs (6, 13, 15, 17 and 19) in which the palate was completely covered by melanin pigmentation (Figure 8).
Figure 8: Fluorescence spectra of the palate showing the three variations observed. The red
curve corresponds to the average spectrum for all dogs except animals 6, 13, 15, 17 and 19). The blue curve (dog 16) shows a reduced fluorescence in the 650-700 nm regions, and
the green curve (dog 15) shows a lack of fluorescence over the entire spectrum.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Palato-cão 3.Slave1.sample palato- cão16.Slave1.sample palato- cão 15.Slave1.sample
Capítulos
In the attached gingiva, all of the dogs showed a peak at approximately 500 nm, and in four dogs (14, 15, 16 and 17) there was also a reduction in the fluorescence between 650 nm and 700 nm (Figure 9).
Figure 9: Fluorescence spectra of the attached gingiva. The colored curves show lower
peak absorbency in the 650-700 nm regions.
The teeth showed an enhanced fluorescence in the 500 nm region, with a “shoulder” at ~450 nm. The teeth were the only structure that showed a consistent decrease in fluorescence in the 700 nm region.
Figure 10: Fluorescence spectrum of a tooth (green line). Note the increased intensity in
the 500 nm region and the decrease in the 650-700 nm region compared to the spectrum obtained at another site (black line).
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
gengiva inserida- cão 17.Slave1.sample gengiva inserida- cão 14.Slave1.sample gengiva inserida- cão 15.Slave1.sample gengiva inserida- cão16.Slave1.sample gengiva inserida - cão 12.Slave1.sample
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
esmalte- cão 15.Slave1.sample assoalho de boca - cão 9.Slave1.sample
Capítulos
Some dogs showed variation in tooth coloration. In one of the animals (dog 3), this difference was particularly evident and produced an important alteration in the spectrum of the tooth. The “dark” tooth showed no fluorescence and its spectrum had a reduced intensity in the 500 nm region. The spectra of a dark tooth and a normal tooth are compared in Figure 11. The very high intensity of the peak in the 500 nm region (red curve) was probably caused by band distortion.
Figure 11: Comparison of the spectra of a normal tooth (red curve) and a “dark” tooth
(blue curve) from the same dog.
The dental plaque or biofilm showed alterations at around 600 nm that corresponds to the red region in the electromagnetic spectrum. Dental plaque showed intense red fluorescence that was visible to the naked eye. Various studies have shown that a large number of bacteria fluoresce in red, particularly staphylococcal species, which are the most abundant in dental biofilm. In two dogs (3 and 20), this fluorescence was yellow, but not as intense as the red fluorescence (Figure 12). In one dog (13), the distribution and amount of this film was lower than in the other dogs and showed little alteration in the spectrum from 600 nm region onwards. The fluorescence seen in the 500 nm region of the three curves in Figure 12 was related to the dental structure seen in Figure 9.
0 100 200 300 400 500 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Esmalte-cão 3.Slave1.sample Esmalte escuro 200-cão 3.Slave1.sample
Capítulos
Figure 12: Fluorescence spectra of the biofilm showing the three variations observed. The
red curve corresponds to the average spectrum for all dogs except animals 3, 13 and 20. The blue curve, representing dogs 3 and 20, shows a reduced fluorescence in the 630-650 nm regions. The green curve (dog 13) shows a lower fluorescence over the entire spectrum.
Conclusion:
The results of this study showed that various structures in the oral cavity of dogs had endogenous fluorescence and that their spectra were very similar to each other. This similarity suggests that the spectral analysis of these tissues could provide a means of detecting structural alterations in the oral cavity. This technique has the advantage that it does not involve traditional invasive procedures such as incisional biopsy and scaling, although the presence of melanin pigmentation can attenuate the level of fluorescence.
Acknowledgements:
R.C.F. was supported by a doctoral studentship from CAPES. This work was supported by FAEP/UNICAMP. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
Tártaro 2 -cão 5.Slave1.sample placa bacteriana - cão 19.Slave1.sample Placa bacteriana (clara) cão 13.Slave1.sample
Capítulos
References: 1
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Capítulos
CAPÍTULO 2
NATIVE FLUORESCENCE SPECTROSCOPY OF ORAL
NORMAL MUCOSA: PRELIMINARY STUDY IN HUMANS.
Renata C. Fiorotti1, Jorge H. Nicola2, Ester M. D. Nicola3.
Multidisciplinary Unit of Laser Medicine, HC – UNICAMP Discipline of ORL, FCM – UNICAMP
Campinas, SP - Brazil
1- Dental surgeon. Doctoral Student in Medical Sciences, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
2- Physicist. PhD, Professor in the Post-graduate Program in Medical Sciences, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil. 3- Otorhinolaryngologist. PhD, Professor in the Department of Ophthalmology and
Otorhinolaryngology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
Corresponding author: Ester M.D. Nicola, MD, PhD Disciplina de Otorrinolaringologia,
Departamento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia, Faculdade de Ciências Médicas
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) CP 6111, Campinas, SP,
Brazil. CEP: 13083-970
Telephones: (55) (19) 3788-7523 / 3788-7902
Capítulos
Summary:
When components of the human tissue, such as collagen and elastic fibers, flavins and some proteins, are excited by ultraviolet radiation they become strongly autofluorescent and present their native fluorescence in the 450 to 500 nm regions (blue-green). When any constitutional tissue alterations occur, pathological or otherwise, the autofluorescence may be modified. Hence, this optical phenomenon can be considered a reliable method for early diagnosis. Study Design: Preliminary Clinical study. Purpose: to establish standard parameters for the native fluorescence of normal oral mucosal sites that could help in the diagnoses of early compared with spectra of pathological alterations, through comparison of spectra. Material and Methods: The native fluorescence of the oral mucosa of 50 healthy adults selected at the Ambulatory of ENT and Multidisciplinary Laser Unit, Faculty of Medical Sciences, UNICAMP, were collected using a “plug in” spectrometer, a computer and optical fiber. Data related to six distinct predefined sites in the oral cavity were obtained, using an ultraviolet light source developed at our Laser Laboratory with the help of a local industry. Results and Discussion: Overall, the 300 spectra obtained presented similar fluorescent bands and peaks. The degree of fluorescence differed significantly according to the type and site of the mucosa. Conclusion: The results of this pilot study suggest that the native fluorescence spectra of healthy oral mucosa should be deeply studied, if possible standardized, in order to be used in non-invasive diagnoses.
Capítulos
Introduction:
Native fluorescence, which is also designated as autofluorescence or natural fluorescence, can be found, upon ultraviolet excitation (UV), in a large quantities of animal and vegetal tissues without requiring a sensitizing agent. (ROST, 1995).
Light excitation of the medium, which in this case is the tissue, results in the transference of ground energy levels of atoms and/or molecules, which compose the tissues, to higher levels. The natural tendency, based on physical concepts, is the spontaneous return of all molecular structures to their basic state (less energized) and consequently, the acquired energy has to be liberated, in form of luminous energy (photons), defining the optical phenomenon called fluorescence (COLUSSI, et al., 1996).
Numerous studies have been conducted to detect the fluorescence of normal and pathologic tissues (GILLENWATER et al, 1998; BETZ, et al., 1999; DELANK, et al., 2000; EKATERINA, et al., 2004) evincing that a precise, safe and non-invasive diagnostic mechanism may be established after systematic data acquisition of fluorescence spectra from normal and pathologic tissues (HEINTZELMAN, et al., 2000).
Hence, with regard to human tissue, collagen fibers, flavins and other molecular structures are known to be fluorophers substances that emit light in the region of 470 to 500 nanometers (nm) when excited by an ultraviolet source of light. The emission band is, normally, in between 350 to 440 nm (GILLENWATER et al, 1998).
Human teeth also present fluorescence under the effect of UV radiation in the 450 nm region due to the presence of triptophane, collagen fiber links and hydroxypyridium present in the dentine and enamel (FUKUSHIMA et al., 1987; MATSUMOTO, et al., 1999; BANERJEE, et al., 2004). In general, the fluorescence of the oral mucosa and of the teeth is a sum of several spectra of the individual substances that compose the tissues and is also related the histomorphological characteristics, (MATSUMOTO, et al., 1999). Table 01, adapted from ROST (1995) summarizes the fluorescence characteristics of some important substances, for present study.
Capítulos
Substance Native Fluorescence Excitation Source
Proteins UV – blue UV
NADH Blue UV
Collagen Fibers Blue to green UV
Elastic Fibers Blue to green UV
Vitamin A Blue–green to yellow-green UV
Riboflavins Greenish yellow Blue
Porphyrins Red UV
Flavoproteins Green to Yellow Blue
Ceroids Yellow Blue
Table 1: Main fluorophorus substances present in animal tissues. Adapted from Rost, In:
Fluorescence Microscopy, 1995 (2):2.
According to WINNING and TOWSEND (2000), the oral mucosa is basically composed of two types of tissues: externally the stratified squamous epithelium and below this, a dense conjunctive tissue. Blood vessels, fat and glands are found between these two layers. Both, the epithelium and the submucosal layer present structural modifications in different regions of the oral cavity, forming three histologically differentiated types of structures in accordance with their function, namely:
Mastigatory mucosa: composed of the gums and hard palate;
Flexible mucosa: comprehending of the lips, cheeks, vestibule, alveolus, soft palate, floor of the mouth and venter of the tongue.
Specialized Mucosa: a mixture of mastigatory and flexible mucosa, founded on the tongue dorsum.
These three types of mucosa are composed of several cellular and extra cellular components common to the general mucosa, but presenting histological and clinical differences.
Capítulos
The color and the intensity of fluorescence in the tissues provide information about the local biochemical composition, which may permit the detection of a simple fluorophorus deposit or, even, tissue alterations caused by pathologic processes, both benign and malignant. Since the incidence of mouth cancer in humans is known to be very high, early detection of neoplastic alterations is of great importance for clinical purposes.
In this work, we present the results of a pilot study on the use of an optical method, developed at our Laser Laboratory to stimulate and record native fluorescent spectra of different normal oral mucosa sites. The aim of this work, besides validating the used method and prototype is to study the spectra of the various sites with the attempt to identify characteristics which could enables their use in early and non invasive diagnosis of oral cavity lesions.
Materials and Methods:
This pilot study on the native fluorescence of normal oral human mucosa received the approval of the Ethics Committee, Faculty of Medical Sciences, Universidade Estadual de Campinas (protocol number 440/02).
The participants were 50 healthy adults of both genders and varying ages, who were selected from volunteers at the Multidisciplinary Laser Unit, UNICAMP. The assessment protocol included personal data, information on general health, dietary habits and oral hygiene. The criterion for exclusion was the existence of a prior lesion in the mouth.
The oral cavity sites selected for the study were: lower lip, cheek mucosa, dorsum and venter of the tongue, hard palate and floor of the mouth, which can be considered the most representatives sites concerning neoplasic and premalignant alterations.
The fluorescence was measured using a “plug in” type spectrometer (resolution better than 1.6 Milimeters), coupled in a PC computer (PC2000-S, Ocean Optics Inc.) with an optic fiber connected to a terminal in the spectrometer. The fluorescence was obtained by stimulating the oral mucosa with an innocuous ultraviolet source of light, developed with the help of a local industry. The prototype of this luminous source, used for exciting the tissue, is composed of three low power LEDs, distributed in an aluminum structure with an
Capítulos
optical fiber collector adapted in the central region. Figure 01 shows the setup of the equipment, composed of prototype, optical fiber, computer, spectrometer and, in detail, the of optical device terminal.
Figure 1: The equipment used to fluorescence spectroscopy. In detail, the prototype.
The emission wavelength of these LEDs is centered in 410 nm. In order to prevent the spectrometer from detecting this emission, a small filter was installed at the front of the optical fiber, blocking this spectral region. All procedure is realized in completely dark room.
All the spectra were graphically recorded by the software OOIBase 32™, Ocean Optics, In.
Results:
This study involved 300 spectra of the oral cavity. Spectra were measured at different points in each site, for every patient and for each site. Five measurements were carried out and the mean spectrum was considered. Although the graphics of all recorded spectra show a similar pattern, some differences among the sites need to be considered, since for some sites they seem to be constant. Figures 2 to 7 represent the average and more representative spectra of the different sites studied. The intensity (counts) is a relative unity.
Capítulos
Figure 2: Average emission spectrum of the lower human lip.
Figure 3: Average spectrum of the cheek human mucosa.
0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Lábio.Master.Sample 0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Mucosa jugal.Master.Sample
Capítulos
Figure 4: Average of all the normal tongue dorsum samples, with the presence of a
characteristic peak at 634, 52 nm.
Figure 5: Average native fluorescence spectrum of the venter of the tongue.
0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Ventre de língua.Master.Sample 0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master
Capítulos
Figure 6: Average native fluorescence spectrum of the human palate.
Figure 7: Average spectrum of the floor of the human mouth.
0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Palato.Master.Sample 0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Assoalho de boca.Master.Sample
Capítulos
Discussion:
On an average, all the 300 graphs that were analyzed demonstrated similar characteristics at two fluorescent peaks region (± 500 nm and ± 600 nm). These spectra, shown in figures 2 to 7, represent the sum of individual fluorescence of all the existing fluorophorus substances, similar to the ones shown in Table 1.
It is important to underscore the fact that the lip spectra were obtained from the lower lip, more precisely from the vermilion, and not really from the mucosa, as a result of the onset of a large number of neoplastic alterations in this region.
In some samples an important reduction in intensity was clearly observed at the first peak (± 500 nm). No clinical alteration was detected in these subjects, but it’s important to point on the fact that all these patients were Negroes or negroids. Figure 8 represents this situation.
Figure 8: The blue line represents the average of all the lower lip samples and the red one
demonstrates the average reduction in intensity, corresponding to Negroes.
0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Lábio.Master.Sample Lábio.Master.Sample
Capítulos
The cheek mucosa spectra present similar characteristics for both peaks as illustrated by Figure 3. This site presented the most regular curve pattern of all the samples.
It is important to highlight the fact that the tongue dorsum was the only site, among the samples of this study, to present important fluorescence pattern alterations, both in curve shape as well as in intensity around the 630 nm region, corresponding to red fluorescence. Volunteers who presented a coated tongue dorsum show an intense sharp peak in this region, as marked in figure 9.
Figure 9: The red line represents the average of all the normal tongue dorsum samples,
with the characteristic peak at 634, 52 nm. In the blue line, a high peak at the same region found in volunteers with clinical evidence of white- coating tongues.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Língua.Master.Sample Dorso de língua.Master.Sample
Capítulos
The tongue venter and the floor of the mouth repeated the curve characteristics as well as the width of the bands found for the cheek mucosa and lower lip.
In the case of the palate, although its native fluorescent spectra were similar in shape to the spectra of other sites, the intensity of the fluorescence was normally weaker, presenting some difficulty to be recorded.
Figure 10: Average of native fluorescence from hard palate (red line), compared to the
average of cheek mucosa.
Common characteristics for the fluorescence spectra of some sites in the oral mucosa enabled us to report our result according to the three group classification proposed by WINNING & TOWNSEND (2000).
The hard palate representing the mastigatory mucosa group has a thick keratinized epithelium with the presence of palatal rugae, which could respond for the lower fluorescence when compared to other sites of the oral mucosa, as shown in figure 10.
The four sites represented by the lower lip, floor of the mouth, cheek mucosa and venter of the tongue, belong to the flexible mucosa group and, according their native fluorescence spectra, presented very similar patterns, as can be seen by comparison of their average spectra in figure 11. 0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Palato.Master.Sample Lábio.Master.Sample
Capítulos
Figure 11: The comparison of the four sites of flexible mucosa shows a similar pattern.
The mucosa found at the tongue dorsum, considered a specialized mucosa, consists of a mixture of the mastigatory and flexible mucosa. This mucosa presented peculiar characteristics including the presence of papillae. The tongue dorsum, as previously cited was the only site of all the six analyzed that presented an important alteration as show in the figures 4 and 9.
Conclusion:
Although the results of this study were obtained from a relatively small sample, they demonstrate that the optical device, developed for this study and the method applied in obtaining the data can be considered reliable and sensible to analyze the native fluorescence of the oral mucosa.
The results obtained from the samples made possible a preliminary identification of some patterns for different types of oral normal mucosa, according to their structural differences. This suggests that is possible to use native fluorescence spectroscopy as a non-invasive, easily applicable diagnostic method to identify early alterations of the oral mucosa.
Additional studies are in course, involving a larger sample and other parameters.
0 1000 2000 3000 4000 400 500 600 700 800 900 1000 Intensity (counts) Wavelength (nm) Master Lábio.Master.Sample Assoalho de boca.Master.Sample Mucosa jugal.Master.Sample Ventre de língua.Master.Sample Master Lower lip.Master.Sample Mouth Floor.Master.Sample Cheek.Master.Sample Tongue venter.Master.Sample
Capítulos
Acknowledgements:
The author would like to thank CAPES for the postgraduate doctorate grant and FAEP/UNICAMP for the technical support.
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Capítulos
CAPÍTULO 3
FLUORESCÊNCIA NATIVA DE MUCOSA ORAL NORMAL
DE DIFERENTES SÍTIOS EM RELAÇÃO A HÁBITOS,
FAIXA ETÁRIA, GÊNERO E RAÇA.
Renata C. Fiorotti1, Jorge H. Nicola2, Ester M.D. Nicola3
Unidade Multidisciplinar de Medicina Laser do HC/Unicamp e Disciplina de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP.
Campinas, SP
1- Cirurgiã-dentista. Doutoranda do Curso de Pós-graduação em Ciências Médicas da FCM- UNICAMP, área de concentração em Otorrinolaringologia.
2- Físico. PhD , Professor do Curso de Pós-graduação em Ciências Médicas da FCM- UNICAMP.
3- Médica otorrinolaringologista. Chefe do Laboratório de Laser do NMCE. Prof. Dra. do Depto. de OFT/ORL da FCM- UNICAMP
Endereço para correspondência:
Professora Dra. Ester Maria Danielli Nicola
Departamento de Oftalmologia / Otorrinolaringologia Disciplina de ORL
Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP Campinas – SP
P.O.Box: 6111 CEP: 13083 – 970
Telefones: (0 55 XX 19) 3788-7523 / 3788-7902 e-mail: [email protected]
Capítulos
Resumo
Das técnicas ou métodos de diagnóstico utilizados para identificar lesões pré-malignas ou malignas, o exame anatomo-patológico ainda é o mais indicado. Este estudo histomorfológico identifica tipos celulares e estruturas moleculares, assim como a distribuição destes nos tecidos, permitindo diagnosticar displasias ou neoplasias. A fluorescência nativa dos tecidos biológicos depende de sua composição bioquímica e de suas características histomorfológicas. A mucosa da cavidade bucal está sujeita a traumatismos e à ação de hábitos como tabagismo e etilismo e, consequentemente, ao risco de displasias ou neoplasias que, despertam grande interesse da comunidade científica, pela incidência de câncer bucal na população mundial. Objetivos: Analisar três diferentes sítios da cavidade bucal normal, de acordo com sua fluorescência nativa, em relação a hábitos, faixa etária, gênero e raça. Materiais e Métodos: Com espectrômetro tipo “plug-in” (PC2000-S, Ocean Optics Inc.), computador com Software OOIBase 32™ (Ocean Optics
Inc.) e fibra óptica, registrou-se a fluorescência nativa da mucosa bucal de 100 indivíduos
saudáveis, de gênero e idade variáveis, selecionados no Ambulatório de Laser da Disciplina de ORL, da FCM/ Unicamp. Foram obtidos registros de três sítios distintos cavidade bucal, usando fonte de luz ultravioleta próximo, cor “índigo-blue”, desenvolvida com auxílio de indústria local. Conclusão: O fator tabagismo e/ou álcool não influenciou a fluorescência nativa da mucosa bucal normal da amostra, independente do sítio; Os indivíduos do grupo III e IV, com faixa etária de 41 a 82 anos, apresentaram intensidade relativa de fluorescência nativa menor em relação ao Grupo I e II; Entre os gêneros masculino e feminino, não foram detectadas diferenças espectrais significativas.
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Abstract
In human tissue, components like collagen and elastic fibers, flavins and some proteins are strongly autofluorescent when excitated by ultraviolet radiation. Its native fluorescence is presented in 450 to 500 nm regions (blue-green). When any constitutional tissue alteration occurs, pathological or not, its autofluorescence will be modified. Thus, this optical phenomenon can be considered a reliable diagnostic method. Study Design: Clinical preliminary. Aim: This works aims to study different sites of oral mucosa, comparing their native fluorescence’s spectra. Material and Method: 100 adults, healthy. The fluorescence spectra were obtained using a “plug-in” spectrometer (PC2000-S and Software OOIBase 32™) and optical fiber. The native fluorescence was observed in three different sites of oral cavity, using a UV light, this prototype was manufacturing with local industry. Results and
Discussion: 300 spectra were collected and show the same graphical characteristics. The
fluorescence intensity had different degree, according the sites and mucosal type.
Conclusion: The similarity of preliminary results, as well for different mucosa sites, leads
us to consider stablishing a standard for native fluorescence spectra of oral mucosa.
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Introdução:
O procedimento adequado para detectar lesões ou alterações patológicas consiste em exame clínico e inspeção física, seguida de biópsia em local suspeito. Das técnicas ou métodos de diagnóstico utilizados para identificar lesões pré-malignas ou malignas, o exame anatomo-patológico ainda é o mais indicado. Este estudo histomorfológico identifica tipos celulares e estruturas moleculares, assim como a distribuição destes nos tecidos, permitindo diagnosticar displasias ou neoplasias.
Diferentemente da biópsia convencional, a espectroscopia de fluorescência é um método alternativo para caracterizar química e morfologicamente os componentes dos tecidos. A grande vantagem é que se constitui de um método não-invasivo, além dos resultados serem obtidos em tempo real e o exame realizado num curto espaço de tempo (GILLENWATER, et al., 1998).
A fluorescência nativa dos tecidos biológicos depende de sua composição bioquímica e de suas características histomorfológicas (ROST, 1995; INGRAMS, et al., 1996; SUHR, et al., 2000), e os espectros obtidos da fluorescência da mucosa oral representam a soma de várias substâncias fluoróforas que a constituem, independente do sítio. A maioria dos fluoróforos encontrados nos tecidos humanos, tais como proteínas e aminoácidos, apresentam fluorescência nativa quando excitados por fonte de luz ultravioleta (WANG, et al., 1999)
O diagnóstico por espectroscopia de fluorescência têm sido estudado por diversos autores para diferenciar displasias e neoplasias da cavidade bucal, comparando tecido normal e patológico (VAN STAVEREN, et al., 2000; DHINGRA, et al., 2000).
Vários estudos relatam o uso de fontes de excitação ultravioleta com diferentes comprimentos de onda (λ) utilizadas para espectroscopia de fluorescência: 320 nm (WANG, et al., 1999), 380 nm (COGHLAN, et al., 2001) e 400 nm, sendo que HEINTZELMAN, et al. (2000), concluiu que as alterações neoplásicas da cavidade oral eram melhor detectadas com excitação de 410 nm, apresentando 90% de sensibilidade e 88% de especificidade.
