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ELISA

HIV test

Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a determinação de anticorpos contra os vírus da imunodeficiência hu-mana HIV-1 (grupos M e O) e HIV-2

SIGNIFICADO CLÍNICO

Os vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) causa-dores da AIDS, são transmitidos principalmente por contato sexual ou através de sangue ou produtos derivados do san-gue contaminados.

Em indivíduos infectados com estes vírus, aparecem anticor-pos como resanticor-posta do sistema imunológico à invasão viral. Estes anticorpos não são protetores e não conferem imuni-dade, mas constituem atualmente a base do estudo da pato-logia. O presente kit foi desenvolvido para detectar conjunta-mente a presença dos anticorpos anti-HIV-1 (do HIV, grupos M e O) e anti-HIV-2.

A seqüênciação dos vírus HIV-1 e HIV-2 demonstrou que pos-suem cerca de 60% de homologia nos genes pol e gag, que descende em torno de 30-40% nos demais genes e na região LTR. O presente método emprega antígenos sintéticos com seqüências correspondentes a regiões antigênicas codifica-das por estes genes, que, adicionalmente cumprem com a condição de gerar anticorpos de aparição inicial na soroconversão. Esta condição e sua grande imunoreativida-de outorgam uma maior sensibilidaimunoreativida-de à imunoreativida-determinação. FUNDAMENTOS DO MÉTODO

A amostra é diluída no suporte no qual se encontra o antíge-no imobilizado. Se a mesma contiver os anticorpos específi-cos, estes formarão um complexo com os antígenos e per-manecerão unidos ao suporte. A fração não unida é eliminada por lavagem após da qual agregam-se anticorpos anti-imuno-globulina humana conjugados com peroxidase. Se ocorrer a reação na primeira etapa do processo, o conjugado se unirá. Após uma nova lavagem, agrega-se o substrato enzimático. Nos casos onde o conjugado tiver se unido, haverá surgimento de coloração celeste. A reação se detém com ácido sulfúri-co, com o que a coloração celeste torna-se amarela. REAGENTES FORNECIDOS

Microplaca sensibilizada: microplaca de tiras removíveis com cubetas que contém antígenos sintéticos de HIV-1 e HIV-2 imobilizados.

Conjugado: anti-imunoglobulinas humanas (cabra) conjuga-das com peroxiconjuga-dase.

Revelador A: peróxido de hidrogênio 60 mmol/l em tampão citrato 50 mmol/l pH 3,2.

Revelador B: tetrametilbenzidina (TMB) 0,01 mmol/l em áci-do clorídrico 0,1 N.

Stopper: ácido sulfúrico 2 N

Tampão de Lavagem concentrado: cloreto de sódio 1,4 mol/l em tampão fosfato 100 mmol/l e tensioativo não iônico 0,1 g/l. Diluente de Amostras: albumina bovina em solução

fisioló-gica tamponada com tampão fosfato pH 7,2.

Controle Positivo: diluição de soro inativo, contendo anticor-pos contra HIV-1 e HIV-2.

Controle Negativo: diluição de soro não-reativo, inativo. INSTRUÇÕES PARA USO

Tampão de Lavagem: para usar, diluir 1+4 com água desti-lada (1 parte de Tampão de Lavagem concentrado + 4 partes de água destilada). A baixa temperatura os componentes do reagente podem precipitar. Neste caso, colocar em banho-maria 37o_{C por alguns minutos, misturando a seguir por} inver-são.

Microplaca sensibilizada: pronta para uso. Conjugado: pronto para uso.

Revelador A: pronto para uso. Revelador B: pronto para uso. Stopper: pronto para uso.

Diluente de Amostras: pronto para uso. A cor do Diluente de Amostras pode variar de lote a lote sem que seja afetada sua capacidade reacional.

Controle Positivo e Controle Negativo: prontos para uso. PRECAUÇÕES

- Todas as amostras de pacientes devem ser manipuladas como se fossem capazes de transmitir a infecção. Os con-troles encontram-se inativos, porém devem ser empregados como se tratando de material infectado.

- Os soros controles foram examinados para HBsAg, encon-trando-se não-reativos.

- A microplaca encontra-se recoberta com antígenos sintéti-cos de HIV-1 e HIV-2. Qualquer possibilidade de contamina-ção com a mesma pode ser descartada com absoluta cer-teza.

- Todos os materiais utilizados no ensaio devem ser destruídos a fim de assegurar a inativação de agentes patogênicos. O método recomendado para este procedimento é autoclavar durante 1 hora a 121o_{C. Os líquidos descartados podem ser} desinfetados com hipoclorito de sódio, (concentração final de 5%) durante pelo menos 60 minutos.

- Não intercambiar reagentes de kits e lotes diferentes. - Não utilizar reagentes de outra origem.

- As microplacas devem ser incubadas em estufa. Não usar banho-maria. Evitar abrir a estufa durante a incubação. - Evitar que vapores de hipoclorito provenientes dos

recipien-tes de descarte biológicos ou outras formas entrem em con-tato com a microplaca, pois o hipoclorito afeta a reação. - Os reagentes são para uso “in vitro”.

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ESTABILIDADE E INSTRUÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Os Reagentes Fornecidos são estáveis sob refrigeração (2-10o_{C) até a data de vencimento indicada na embalagem. Não} congelar.

Tampão de Lavagem: estável 3 mêses a temperatura am-biente.

Microplaca sensibilizada: as tiras de cubetas com antíge-nos imobilizados são fornecidos em embalagem fechada à vácuo e com dessecante. Não abrir a embalagem até o mo-mento de uso, e esperar atingir a temperatura ambiente, pois ao contrário se favorecerá a humectação do conteúdo. As tiras de cubetas não utilizadas devem ser conservadas den-tro do envelope com o dessecante, e perfeitamente fechado com uma fita adesiva e mantida entre 2-10o_{C. As tiras} conser-vadas nestas condições, são estáveis por 3 meses, desde que não ultrapasse o vencimento do kit.

AMOSTRA Soro ou plasma

a) Coleta: obter soro da maneira usual. Não devem ser usa-das amostras inativausa-das pelo calor. Vide LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO.

b) Aditivos: não são necessários para soro. Ao empregar plasma poderá ser utilizado qualquer anticoagulante de uso corrente na prática transfusional.

c) Substâncias interferentes conhecidas: a hemólise, hi-perlipemia e outras causas de turbidez podem ser causa de resultados errôneos. Estas amostras devem ser clarificadas por centrifugação.

d) Estabilidade e instruções de armazenamento: as amos-tras não diluídas podem ser conservadas durante 7 dias entre 2-10o_{C. Para conservação por períodos mais prolongados} de-vem ser congelados a -20o_{C ou temperaturas menores. Evitar} os congelamentos e descongelamentos reiterados. Existem evidências que mostram que os congelamentos sucessivos podem ser causa de resultados errôneos.

Se as amostras precisam ser transportadas, embalar de acor-do com as especificações legais relativas ao envio de materi-ais infecciosos.

MATERIAL NECESSÁRIO (não fornecido) - Micropipetas para medir os volumes indicados. - Relógio alarme ou cronômetro.

- Estufa a 37o_C.

- Espectrofotômetro para leitura de microplacas. - Lavadora de microplacas.

CONDIÇÕES DE REAÇÃO

- Longitude de onda primária: 450 nm

- Longitude de onda secundária (bicromática): 620 nm - Calibração do instrumento: zerar o espectrofotômetro com

Branco de Reagente, processando da mesma forma que uma determinação, mas omitindo colocar a amostra. - Tempo de reação: variável, conforme a técnica selecionada.

- Temperatura de reação: 37 ± 2o_{C e temperatura ambiente} (18-25o_C).

- Volume de amostra: 10 ul

PROCEDIMENTO

I- TÉCNICA COM REVELADORES SEPARADOS Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a análise deve ser completada sem interrupção.

Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3 Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras, deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do líquido e não sobre as paredes ou o fundo da cubeta. En-xaguar a pipeta com o Diluente dispensado na cubeta, para assegurar a correta homogeneização.

Nas cubetas a utilizar da microplaca colocar:

D CP CN

Diluente de Amostras 200 ul 200 ul 200 ul

Controle Positivo - 10 ul

-Controle Negativo - - 10 ul

Amostra 10 ul -

-Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos após pipetadas as amostras em cada tira. No procedimento manual, para evitar a eva-poração, cobrir a placa e incubar em estufa 30 ± 2 minu-tos a 37 ±2o_{C. Após, aspirar cuidadosamente o líquido de} cada cubeta desprezando-o em um recipiente para deje-tos biológicos que contenha hipoclorito de sódio a 5%. Na continuação, lavar 5 vezes com Tampão de Lavagem (pre-parado conforme as instruções de uso da pág. 1) empre-gando aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Após cada la-vagem o líquido deve ser descartado no recipiente com hipoclorito. Empregar lavador automático. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residu-al, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes so-bre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão nas laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta:

Conjugado 50 ul 50 ul 50 ul

Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador for-necido.

Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar durante 30 ± 2 minutos em estufa a 37 ± 2o_{C. Após, aspirar o líquido} das cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclori-to e lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido resi-dual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta respeitando a ordem dos reagentes:

Revelador B 50 ul 50 ul 50 ul Pode-se colocar 1 gota de cada Revelador, utilizando o frasco gotejador fornecido.

Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos. Incubar 30 ± 2 minutos a tem-peratura ambiente (18-25o_{C), após adicionar:}

Stopper 50 ul 50 ul 50 ul

Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador for-necido.

Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos. Ler em espectrofotômetro a 450 nm ou efetuar leitura bicromática a 450/620 nm. II- TÉCNICA COM REVELADORES PRÉ-MISTURADOS Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a análise deve ser completada sem interrupção.

Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3 Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras, deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do líquido e não sobre as paredes ou o fundo da cubeta. En-xaguar a pipeta com o Diluente dispensado na cubeta, para assegurar a correta homogeneização.

Nas cubetas a utilizar da microplaca colocar:

D CP CN

Diluente de Amostras 200 ul 200 ul 200 ul

Controle Positivo - 10 ul

-Controle Negativo - - 10 ul

Amostra 10 ul -

-Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos após pipetadas as amostras em cada tira. No procedimento manual, para evitar a eva-poração, cobrir a placa e incubar em estufa 30-35 minutos a 37 ±2o_{C. Após, aspirar cuidadosamente o líquido de cada} cubeta desprezando-o em um recipiente para dejetos bio-lógicos que contenha hipoclorito de sódio a 5%. Na conti-nuação, lavar 5 vezes com Tampão de Lavagem (prepara-do conforme instruções de uso da pág. 1) empregan(prepara-do aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Após cada lavagem o líquido deve ser descartado no recipiente com hipoclori-to. Empregar lavador automático. Ao finalizar a última la-vagem, eliminar completamente o líquido residual, inver-tendo a microplaca e bainver-tendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão so-bre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta:

Conjugado 50 ul 50 ul 50 ul

Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador for-necido.

Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos. No procedimento manual, para

evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar durante 20-25 minutos em estufa a 37 ± 2o_{C. Após, aspirar o líquido das} cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclorito e lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a úl-tima lavagem, eliminar completamente o líquido residual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar uma mistura de par-tes iguais de Revelador A + Revelador B (estável 24 ho-ras):

Reveladores misturados 100 ul 100 ul 100 ul

Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos. Incubar 20-25 minutos a tem-peratura ambiente (18-25o_{C), após adicionar:}

Stopper 50 ul 50 ul 50 ul

Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador for-necido.

Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da micro-placa durante 10 segundos. Ler em espectrofotômetro a 450 nm ou efetuar leitura bicromática a 450/620 nm.

ESTABILIDADE DA MISTURA DE REAÇÃO FINAL A cor da reação é estável durante 30 minutos, ler os resulta-dos durante esse intervalo.

CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃO DA CORRIDA

A corrida é considerada válida se cumpridas simultaneamen-te as seguinsimultaneamen-tes condições:

a) As leituras de pelo menos 2 dos 3 Controles Negativos corrigidas contra o Branco de Reagente devem ser menores ou iguais a 0,150 D.O.

b) A leitura média dos Controles Positivos corrigida deve ser maior ou igual a 0,600 D.O.

Se uma ou ambas as condições não se cumprirem, repetir a corrida.

Para ambos os casos lembrar que as leituras obtidas depen-derão da sensibilidade do aparelho empregado.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

A presença ou ausência de anticorpos anti-HIV se determina relacionando a absorbância da amostra com o valor Cut-off. Cut-off = CN + 0,150 D.O.

onde CN é a média das leituras do Controle Negativo. Zona de indeterminação: Cut-off ± 10%

Amostras Não Reativas: consideram-se aquelas com ab-sorbâncias menores que o limite inferior da zona de indeter-minação.

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Esquema de interpretação Amostra Original

Leitura < que o limite inferior Leitura > que o limite superior da zona de indeterminação da zona de indeterminação

Não reativa Inicialmente reativa

(repetir sobre a amostra original por duplicata)

Ambas leituras < 1 ou ambas leituras > que o limite inferior que o limite superior

da zona de da zona de

indeterminação indeterminação

Não reativa Reativa

Ensaiar usando método de referência (Western Blot) e diferenciar HIV-1 e HIV-2 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

Vide Substâncias interferentes conhecidas em AMOSTRA. - Constituem causas de resultados errôneos:

Lavagem incorreta das cubetas de reação.

Contaminação cruzada de amostras Não Reativas com an-ticorpos procedentes de uma amostra Reativa.

Contaminação da solução cromogênica com agentes oxi-dantes (cloro, etc.).

Contaminação do Stopper.

Conservação inadequada das tiras de cubetas não utiliza-das.

Contaminação do Tampão de Lavagem diluído: recomenda-se conferir a limpeza dos frascos onde é preparado e arma-zenado. Se for observada turbidez ou precipitação na pre-paração, despreza-lo.

- Deve-se recordar que a presença de anticorpos anti-HIV no soro NÃO é diagnóstico de AIDS. Os resultados repetida-mente reativos devem conferir-se por métodos de referência como Western Blot.

- Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposi-ção ou infecexposi-ção pelo HIV-1 ou HIV-2. Não utilizar banho-maria para a incubação.

- Podem-se obter resultados falsos positivos nas seguintes situações: doenças autoimunes, tuberculose, lúpus eritematoso sistêmico, gravidez, vacinação contra a hepati-te B e outras imunizações, hemodiálise, doença hepática e outras doenças.

- Ocasionalmente, ao realizar leituras bicromáticas, podem obter-se absorbâncias negativas que não interferem a de-terminação, devido que algumas amostras resultam com leituras por baixo do Branco de Reagente.

- Não utilizar banho-maria para a incubação.

- Não utilizar amostras inativadas pelo calor já que podem obter-se resultados falsos positivos.

- Certifique-se que o sistema de lavagem automático que está utilizando aspire totalmente o conteúdo e que o volume da solução lavadora fique em níveis iguais.

PERFORMANCE

a) Sensibilidade: em un estudo realizado com diferentes paneis comerciais internacionais, obtiveram-se os seguintes resultados:

- Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel (PRZ 203), Boston Biomedica, Inc.: detectaram-se 14 das 14 amostras positi-vas.

- Anti-HIV-1 Mixed Titer Performance Panel (PRB 203), Boston Biomedica, Inc.: detectaram-se 22 das 23 amostras positi-vas.

- Anti-HIV-1 Low Titer Performance Panel (PRB 106), Boston Biomedica, Inc.: detectaram-se 13 das 14 amostras positi-vas.

Em outro estudo realizado sobre 48 amostras com sorologia positiva segundo outros métodos ELISA utilizados como refe-rência, foram detectadas as 48 amostras.

- Amostras HIV-1 grupo O, B7-2705-0001 e JP8-2707-0001 da Boston Biomedica Inc.: detectaram-se as duas.

b) Especificidade: em um estudo realizado sobre 212

amos-tras de soros e plasmas provenintes de bancos de sangue e consultórios externos, a especificidade estimou-se em 99,5%. Em outro estudo realizado sobre 311 amostras provenintes de pessoas hospitalizadas e ambulatórias, encontrou-se uma especificidade de 99,3%.

Em uma população de 94 plasmas provenintes do laboratório de um hospital, encontrou-se uma especificidade de 100%. PARÂMETROS PARA ANALISADORES AUTOMÁTICOS Vide as adaptações específicas para cada tipo de analisador, que deverão ser solicitadas ao setor Marketing da Wiener lab.

APRESENTAÇÃO

Kit para 96 determinações (Cód. 1723251). REFERÊNCIA

- Gallo, R.C. y cols. Science 224:500 (1984).

- Centers for Disease Control - Morbidity and Mortality Weekly Report 36/31 (1987).

- Lossa, G.R. - Acta Bioq. Clín. Latinoam. XXI/1:47-65 (1987). - Fernández, E.; Taborda, M.; Lorenzo, L.; Rojkín, F.; Fernández, A.; Fay, A. - Proceedings of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress, pág. 164 -Amsterdam (1992).

Rojkín, F.; Takeda, A.K.; Gariglio, R.C.; Lorenzo, L. -Proceedings of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress - Pag. 128 - Amsterdam (1992). - Rojkín, F.; Takeda, A.; Gariglio, R.; Lorenzo, L. - Proceedings

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-Schujman, L.; Suita, G.; Albrecht, A. - Acta Bioq. Clín. Latinoam. XXIX/4:513, 1995.