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J OSÉ A IRTON J ORGE A LVES
ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM
ADULTOS
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Orientadores: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Profª. Maira Monteiro Fróes
Rio de Janeiro Fevereiro
2009
FICHA CATALOGRÁFICA
ALVES, José A. J.
ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O
DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS /JOSÉ AIRTON JORGE ALVES, RIO DE JANEIRO, 2009.
xii, 114 f
Orientador: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Orientadora: Profª. Maira Monteiro Fróes
Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – UFRJ – Instituto de Ciências Biomédicas – Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2009.
1. Junções comunicantes. 2. Medula espinhal. 3. Desenvolvimento. 4.
Adultos. I. Menezes, JR. II. Fróes, MM. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-graduação em ciências morfológicas. IV. Título
.
JOSÉ AIRTON JORGE ALVES
“ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS”
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Aprovada por:
Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto Presidente da Banca
Prof. Dr. João Ricardo Lacerda de Menezes Membro
Profa. Drª. Tatiana Lobo Coelho de Sampaio Membro
Profa. Drª. Claudia Vargas Membro
Prof. Dr. Luis Anastácio Alves - Fiocruz Prof. Drª. Patríca Franca Gardino Membro e Revisora
Prof. Dr. Jean Christophe-Houzel Membro
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agredecer especialmente ao meu orientador JOÃO RICARDO, sem você esta tese nunca seria possível. Excelente orientador, sempre foi um amigo e ainda torna qualquer momento divertido. Minha co-orientadora, MAIRA FRÓES, obrigado por ceder sua casa e seu tempo para me ajudar durante a construção da tese. CECÍLIA HEDIN, Obrigado pelas idéias e ajuda, principalmente durante o projeto de tese.
Gostaria de agradecer também de forma especial à minha esposa SIMONE ALENCASTRE, obrigado pela paciência de esperar tantos anos, por me incentivar constantemente e por fornecer toda a ajuda necessária para que eu pudesse acabar a tese. Te amo!
Outro agradecimento especial também é para a minha filha JÚLIA ALENCASTRE. Seu nascimento foi um dos grandes eventos durante este doutorado. Eu adorei ser pai e você é uma filha maravilhosa, e finalmente vai poder parar de me perguntar “Quando acaba esse doutorado?”.
Agradeço também aos amigos do Laboratório de Neuroanatomia Celular, LEO MORITA, EDUARDO, LUCIANA, ANA LENICE, ELISA, LEONARDO e ADIEL. Não poderia esquecer também dos meus ex-alunos de iniciação científica, JOSÉ EDUARDO e MANUELA. Muito obrigado, vocês tem grande participação neste trabalho.
Agradeço também a minha família que sempre me ajuda e me dá força, mesmo eu não estando muito presente. MARIA (mãe), JOSÉ (pai), ANA e FRANCISCO (irmãos), CLARA (afilhada), JOSÉ LUIZ (sogro) e SILVÉRIA (sogra).
Obrigado.
Agradeço também aos amigos, AD e PATRÍCIA que compartilham das mesmas dificuldades e sempre tem uma palavra de esperança.
Não posso deixar de agradecer a Deus por ter me dado saúde e força para suportar as dificuldades e chegar até aqui. Muito obrigado.
José Airton Jorge Alves
ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS
Tese de Doutorado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, Departamento de Anatomia, no Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.
Esta tese foi desenvolvida, no Laboratório de Neuroanatomia Celular, sob a orientação do Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes e co-orientação da Profa. Maira Monteiro Fróes e contou com o apoio financeiro das seguintes entidades:
CAPES, CNPq, CNPq/PRONEX , FAPERJ, FUJB.
Rio de Janeiro 2009
ALVES, José Airton Jorge. ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS. Rio de Janeiro, 2008.
Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
RESUMO
A primeira semana pós-natal é um período de refinamento sináptico da circuitaria motora e sensorial da medula espinhal. Foi demonstrado que a comunicação juncional mediada por junções comunicantes participa diretamente deste processo em motoneurônios do corno ventral durante o desenvolvimento e após lesões periféricas no adulto. Apesar de ser bem estabelecido para motoneurônios do corno ventral, pouco se conhece sobre o acoplamento juncional no corno dorsal, a porção sensorial da medula espinhal, tanto no neonato como no adulto. Neste trabalho empregamos uma técnica de carregamento celular por transecção, de uma mistura de fluorocromos permeante (lucifer yellow, LY) e não permeante juncional (rodamina-conjugada dextran 3KDa, RD), conhecida como “transection loading”, para revelar o acoplamento celular por corantes in situ na medula espinhal de ratos neonatos e adultos. Nossos resultados demonstraram que o acoplamento celular esta presente e distribuído por toda a medula espinhal no neonato e no adulto, principalmente nas lâminas I, III, IV, VIII, IX e epêndima. Este acoplamento é sensível a inibição farmacológica de junções comunicantes e responde agudamente a lesões de nervo periférico. Estes resultados demonstram de forma pioneira a presença de junções comunicantes funcionais no corno dorsal no desenvolvimento e no adulto, bem como corroboram a hipótese de que a comunicação juncional, assim como no corno ventral, também pode desempenhar um papel no refinamento da circuitaria sensorial durante a primeira semana pós natal e na resposta fisiológica a lesões.
ALVES, José Airton Jorge. CELL COUPLING IN THE SPINAL CORD DURING DEVELOPMENT AND ADULT RATS. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
ABSTRACT
The first postnatal week is a period of intense sinaptic remodelling of motor and sensory circuits for the spinal cord. It is well established that gap junctional communication plays a role in this process for motorneurons in the anterior horn, as well as cellular responses to peripheral lesion. However little is known for GJC involvement in the dorsal horn, a sensory portion of the spinal cord. In this study we employed a transection-based method, call “transection loading”, for loading cells with gap juction permeant (lucifer yellow, LY) and non- permeant (rhodamine- conjugated dextran 3KDa, RD) fluorochromes to reveal the pattern of dye coupling in the developing and adult spinal cord of the rat. Our result reveal widespread dye coupling in both the neonatal and adult spinal cord, distributed mainly in laminae I, III, IV, VIII, IX and ependyma layer. Coupling was sensitive to pharmacological inhibition of gap junctions and was responsive to peripheral nerve lesion. These results show for the first time functional junctional coupling in the dorsal horn during development and adulthood. It also corroborate the hypothesis that junctional coupling, as described for motorneurons, may play a role in the refinement of sensory synaptic circuits during the first postnatal week, as well as in physiological response to lesions.
Lista de Abreviaturas
AFF = Ácido Flufenamico
βIII-Tubulina = Classe III β-tubulina
CBX = Carbenoxolone CMM = Coluna motora medial CML = Coluna motora lateral CT = Coluna de Terni Cx = Conexina
DAPI - 4’,6’-diamidina-2’-fenilindol
GSS – solução salina de Gey (do inglês, Gey´s salt solution) GJ = “Gap junction” - Junção comunicante
GFAP = Proteína glial fibrilar acídica (glial fibrillary acidic protein) LY = Lucifer Yellow (sem tradução em português)
LY+/RD- = Células marcadas somente com Lucifer Yellow
LY+/RD+ = Células marcadas com Lucifer Yellow e Rodamina Dextran L3 = Terceira vértebra lombar ou terceiro segmento medular
P0 = Dia do nascimento
PBS = solução de tampão fosfato (phosphate buffered saline) RD = Rodamina dextran 3k
SNC = sistema nervoso central SNP = sistema nervoso periférico TL = “Transection Loading”
Ø Ca2+ - livre de Ca2+
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO 01
1- A medula espinhal do roedor 03
1.1 Morfologia externa da medula espinhal 05
1.1.1 – Morfologia interna e anatomia seccional da medula espinhal 06 1.1.2 – Composição celular da medula espinhal 07
1.2 – Neurogênese da medula espinhal 13
1.2.1 – Geração de neurônios motores 14
1.2.2 – Geração de interneurônios do corno ventral 16 1.2.3 – Geração de interneurônios do corno dorsal 16 1.2.4 – Geração de neurônios sensoriais primários 17
1.3 – Gliogênese 18
1.3.1 – Oligodendrócitos 18
1.3.2 – astrócitos 18
1.3.3 – Microglia 19
1.3.4 – células ependimárias 19
1.5 – Junções comunicantes 21
1.5.1 – Junções comunicantes e o desenvolvimento pós-natal da medula espinhal
27
1.5.2 – Junções comunicantes na medula espinhal de ratos adultos 29 1.5.3 – Junções comunicantes e a resposta celular na medula espinhal após lesão central ou periférica
31
2 – OBJETIVOS 36
2.1 – objetivo geral 36
2.2 – Objetivos específicos 36
3 – MATERIAIS E MÉTODOS 37
3. 1 – Animais 37
3. 2 – “Transection Loading” 37
3.3 – Imuno-histoquímica 41
3.4 – Distribuição do acoplamento celular na medula espinhal 42
3.5 – Lesão do nervo ciático 42
3.6 – Bloqueio do acoplamento celular com Carbenoxolone (CBX) e ácido flufenâmico
43
3.7 – Quantificação do acoplamento celular nos experimentos de transecção do nervo ciático em ratos neonatos e adultos
44
4.0 – RESULTADOS 46
4.1 – O carregamento de corantes por transecção da medula espinhal revela padrões esperados de marcação intracelular em ratos neonatos
46
4.2 – Distribuição espacial do acoplamento celular na medula espinhal do rato neonato
49
4.3 – Diversos tipos celulares encontram-se acoplados na medula de ratos neonatos
53
4.4 – Acoplamento celular está presente no epêndima de ratos neonatos 59 4.5 – O acoplamento celular é também revelado por carregamento através dos nervos espinhais na medula espinhal do rato neonato
59
4.6 – O acoplamento celular e a expressão de conexina 43 aumentam após lesão periférica do nervo ciático em ratos neonatos
64
flufenâmico
4.8 – A técnica de carregamento por transecção revela acoplamento celular na medula espinhal de ratos adultos
70
4.9 – O acoplamento celular na medula espinhal de ratos adultos em resposta a lesão periférica
72
4.10 – Bloqueio do acoplamento celular com carbenoxolone abole o acoplamento entre as células da medula espinhal
74
5 – DISCUSSÃO 76
5.1 – O carregamento celular por transecção é uma forma eficiente de demonstrar o acoplamento cleular na medula espinhal de animais neonatos e adultos
76
5.2 – O acoplamento celular é distribuído por todas as lâminas da medula espinhal de ratos neonatos
83
5.3 – Tipos celulares marcados com Lúcifer Yellow na medula espinhal e possíveis parceiros acoplados
85
5.4 – A lesão ao nervo ciático aumenta o acoplamento celular mediado por junções comunicantes na medula espinhal de ratos neonatos
88
5.5 – Junções comunicantes em ratos adultos 89
6 – CONCLUSÕES 92
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
1– INTRODUÇÃO
A comunicação entre as células tem papel central durante o desenvolvimento, na vida adulta e também em resposta a lesões e processos patológicos (Thompson et al., 2006; John et al., 1999). Uma das formas de contato direto entre células no sistema nervoso central (SNC) é através de junções comunicantes, que agindo como canais intercelulares conectam o citoplasma de células adjacentes e permitem a passagem rápida de íons e pequenas moléculas que chegam até um pouco mais de 1 KDa. Provavelmente devido à natureza direta do intercâmbio intercelular promovido pelos canais juncionais e à sua baixa seletividade, a comunicação juncional desempenha papéis fisiológicos diversos no indivíduo adulto e durante o desenvolvimento.
Durante o desenvolvimento embrionário da medula espinhal existe um grande número de junções comunicantes envolvendo vários tipos celulares, inclusive neurônios jovens (Bittman et al., 2004; Russo et al., 2008). Para os neurônios motores da medula, onde este fenômeno foi melhor estudado, o acoplamento celular alto no período neonatal precoce, gradualmente reduz-se e não é mais detectável ao final da primeira semana pós-natal (Walton e Navarrete, 1991; Chang et al., 1999).
Durante a vida adulta, no entanto, lesões centrais ou periféricas parecem levar ao reaparecimento de junções comunicantes funcionais entre neurônios e um aumento da expressão das conexinas, proteínas que formam estas junções. (Rohlmann et al., 1993; Theriault et al., 1997; Li e Nagy, 2000; Lee et al., 2005).
Trabalhos recentes demonstram que o acoplamento persistente em motoneurônios no corno ventral da medula espinhal de ratos parece exercer um
papel no refinamento da circuitaria motora durante as duas primeiras semanas pós- natais (Chang et al., 1999; Mentis et al., 2002; Personius et al., 2008)
Apesar de relativamente adiantados em bases tanto estruturais quanto fisiopatológicas, os estudos acerca das junções comunicantes no corno ventral da medula de roedores, reconhece-se uma lacuna quando consideramos o seu equivalente dorsal em animais pós-natos ou mesmo em adultos. É importante ressaltar que, também para o corno dorsal, é durante a primeira semana pós-natal que ocorrem os processos ontogenéticos que levam ao estabelecimento da circuitaria sináptica (Fitzgerald et al., 1994; Bardoni, 2001; Mentis et al., 2006).
Sendo assim o desenvolvimento e a plasticidade sináptica da circuitaria sensorial podem envolver junções comunicantes, à semelhança do sugerido para os motoneurônios do corno ventral (Chang e Balice-Gordon, 2000; Personius et al., 2008).
O presente manuscrito de tese pretende apresentar os dados resultantes da avaliação funcional da comunicação juncional no contexto do desenvolvimento pós- natal e do adulto, e nas respostas fisiopatológicas do corno dorsal da medula espinhal do rato à injúria neural periférica provocada experimentalmente. Neste estudo, emprega-se uma técnica de acoplamento por corante, que permite rastrear a histoarquitetonia da comunicação juncional em grandes populações celulares in vivo/in situ. Esta técnica foi desenvolvida em nosso laboratório em anos anteriores e denominada “transection loading” (Menezes et al., 2000).
1 – A medula espinhal do roedor:
A medula espinhal é a parte do SNC que conecta as estruturas corticais e/ou subcorticais encefálicas com a rede neural periférica, esta por sua vez composta por terminações sensoriais e efetoras distribuídas, através dos nervos espinhais, por todo o corpo, incluindo tegumento, vísceras e músculos. A medula espinhal não é simplesmente um centro aferente e efetor do SNC, mas possui centrais de comando próprio, integrando reflexos e capazes de gerar ritmos na ausência de sinais dos centros superiores, ritmos estes possíveis de gerar padrões motores específicos (McCrea e Rybak, 2008).
A medula espinhal em ratos divide-se em 34 segmentos, distribuídos como 8 cervicais, 13 torácicos, 6 lombares, 4 sacrais e 3 caudais (Gilerovich et al., 2008). Ao longo do canal vertebral, em roedores, estende-se do forame magno até a vértebra L4 (Gilerovich et al., 2008). A extremidade distal apresenta a forma de um cone, sendo assim denominado, cone medular. Um filamento delgado de tecido conjuntivo (filamento terminal) continua inferiormente, a partir do ápice do cone medular, fixando-se em vértebras caudais.
Cada segmento medular apresenta prolongamentos axonais (radículas) que emergem ventralmente e conduzem estímulos motores para a periferia, e radículas dorsais que recebem estímulos sensoriais. A união das radículas forma raízes ventrais e dorsais, que novamente se unem para formar nervos espinhais. O número de nervos espinhais é equivalente ao número de segmentos medulares.
No corte transversal, a medula espinhal é circular a oval com um canal central se estendendo longitudinalmente através de toda sua extensão. A medula espinhal
denominadas intumescência lombar e intumescência cervical. Estas regiões refletem o maior número de neurônios em regiões da medula responsáveis pela inervação dos músculos dos membros inferiores e superiores (Lent, 2001).
Figura 1. Localização da intumescência lombar na medula espinhal de ratos. (a) vértebras (b) segmentos medulares. A intumescência lombar em roedores está localizada entre a vértebra T12 – L1. Retirado de Gilerovich et, 2008.
Ao nível das vértebras T12 – L1, em roedores, encontra-se a intumescência lombar, correspondendo aos segmentos medulares L1 – L5, que são responsáveis pela inervação dos membros posteriores do roedor (Figura 1) (Gilerovich et al., 2008). Um dos nervos importantes para esta inervação dos membros posteriores é o nervo ciático. Este formado pela junção das raízes ventrais e dorsais dos segmentos medulares L1 –L3 (Walton e Navarrete, 1991).
Cone medular
Cauda eqüina
1.1 – Morfologia externa da medula espinhal:
A superfície externa da medula espinhal apresenta uma série fissuras e sulcos que são úteis para determinações do eixo ântero-posterior. Estes são: sulco mediano dorsal, que se estende longitudinalmente na face dorsal da medula espinhal; fissura ventromedial, que se estende longitudinalmente na face ventral da medula espinhal; sulco posterolateral, a cada lado da face dorsal, marcando o local onde as radículas posteriores dos nervos espinhais entram na medula espinhal; e o sulco ventromedial, a cada lado da face ventral, marca onde as radículas anteriores dos nervos espinhais saem da medula espinhal. A vascularização arterial distinta ajuda na identificação das faces ventrais e dorsais. Na face anterior, a artéria espinhal anterior é proeminente e continua, e na face posterior a artéria espinhal posterior é descontinua e muitas vezes sinuosa e duplicada. É possível visualizar com grande facilidade a presença de um conjunto de corpos de neurônios sensoriais, distribuídos ao longo da lateral da medula espinhal, denominados gânglios das raízes dorsais (Lent, 2001).
Envolvendo a medula espinhal dentro do canal vertebral encontramos 3 camadas distintas de tecido conjuntivo, as meninges. Estas envolvem, protegem e sustentam a medula espinhal. A camada mais externa é chamada de dura-máter, a intermediária de aracnóide-máter e a mais interna, aderida ao tecido nervoso é chamada de pia-máter. Entre estas meninges existem espaços clinicamente importantes que são: espaço subdural (entre a dura-máter e a aracnóide-máter) e espaço subaracnóide (entre a aracnóide-máter e a pia-máter), o líquido cérebroespinhal.
1.1.1 – Morfologia interna e anatomia seccional da medula espinhal:
Internamente a medula espinhal apresenta um pequeno canal central cercado por substância cinzenta e branca. Semelhante a outras estruturas do SNC, na substância branca da medula espinhal encontramos fibras nervosas mielínicas e amielínicas de diversos calibres, poucos corpos neuronais e células da glia (Lent, 2001). Estas fibras são agrupadas em feixes e fascículos que ascendem e descendem em seu trajeto até os nervos periféricos ou até o encéfalo. Transportam informações sensoriais da pele, músculos, articulações e outros tecidos do corpo ou distribuem o comando motor gerado em níveis supra segmentares, distribuindo-os para as demais estruturas através de nervos periféricos.
A substância branca é dividida em 3 pares bilaterais de colunas ou funículos (Figura 2). 1. Coluna dorsal – Em humanos consiste primariamente de axônios que conduzem informações sensoriais para o tronco encefálico. Em roedores, no entanto, apresenta majoritariamente axônios de neurônios motores córtico- espinhais. 2. Coluna Lateral – Contém axônios que se dirigem aos centros sensoriais, e que partem de centros motores e autonômicos do cérebro. 3. Coluna ventral – Contém primariamente axônios encefálicos descendentes que controlam basicamente a musculatura axial. Além destas 3 colunas, temos o Trato de Lissauer, contendo ramificações centrais de fibras sensoriais primarias de pequeno diâmetro, e o fascículo próprio da medula, contendo axônios dos neurônios proprioespinhais que interconectam diferentes regiões da medula espinhal, localizados ao longo da margem da substância cinzenta e substância branca (Tanabe et al., 1996).
A substancia cinzenta é composta principalmente de neurônios, formando uma série de núcleos ou grupamentos neuronais com funções correlacionadas,
organizados em grandes massas de substância cinzenta denominadas cornos ventral, dorsal e lateral (Figura 2). Estas massas encontram-se agregadas, revelando, ao corte transversal da medula espinhal, a forma da letra H, e definindo a susbstância cinzenta da medula espinhal, referida como "H medular".
Figura 2. Anatomia geral da medula espinhal em secção transversal. Em (a), organização da substância cinzenta. Dorsalmente, originário da placa alar, encontramos o corno dorsal formado por neurônios sensitivos e interneurônios. Ventralmente, encontramos o corno ventral, originário da placa basal, composto por neurônios motores e interneurônios.
Em (b), organização da substância branca da medula espinhal, através da formação de colunas ou funículos. Adaptado de Prometeus, 2007.
1.1.2 – Composição celular da medula espinhal:
A medula espinhal foi um modelo de estudo citológico muito empregado no início do século XX devido ao seu caráter anátomo-histológico relativamente simples. Esta aparente simplicidade esconde, no entanto, a grande complexidade dos domínios fisiológicos dispostos em uma organização semi-randômica dentro da susbtância cinzenta medular. Isto estimulou mais recentemente, a busca por modelos, embora anatomicamente mais complexos, histo-fisiologicamente mais
Esta complexidade da organização celular somado a relativa dificuldade de acesso cirúrgico da medula espinhal (musculatura abundante e componentes ósseos móveis em oposição a imobilidade relativa dos ossos do crânio) o estudo detalhado dos componentes celulares nesta região ainda está por estabelecer-se à luz de novos ferramentais tecnológicos.
A substância cinzenta da medula espinhal apresenta-se dominada por grupamentos nucleares dispostos principalmente em colunas com orientação longitudinal. Em cortes coronais, os grupamentos nucleares na medula espinhal têm sua organização definida em camadas, denominadas lâminas de Rexed, as quais são numeradas de I a X em sentido póstero-anterior tanto em humanos quanto em roedores (Figura 3).
Figura 3. Disposição das lâminas de Rexed no segmento lombar da medula espinhal do rato adulto. Lâminas de I – VI formam o corno dorsal. Lâmina VII forma a zona intermediária. Lâmina VIII e IX, formam o corno ventral. A lâmina X se encontra ao redor do canal central da medula espinhal. Adaptado de Gilerovich et al., 2008.
Classicamente, os neurônios da medula espinhal se dividem em neurônios sensoriais, neurônios motores e interneurônios. No entanto, esta nomenclatura simples esconde uma grande diversidade de sub-tipos neuronais, especialmente verdadeira para os interneurônios, como veremos a seguir.
Os interneurônios na medula espinhal podem ser de projeção curta ou longa, com alvos contidos em um mesmo segmento ou distantes, por diversos segmentos da medula ou em níveis suprasegmentares (Petko e Antal, 2000). Apenas em relação aos interneurônios proprioespinhais (interneurônios que conectam diferentes segmentos da medula) acredita-se que existam na ordem de uma dezena de tipos variados, classificados segundo seus aferentes e eferentes, suas ações gerais (inibição ou excitação do neurônio alvo) e especializações, sejam estas definidas por propriedades neuroquímicas adicionais, participação em circuitos medulares específicos, eletrofisiologia celular intrínseca e padrão de excitabilidade (para revisão ver Jankowska, 2001).
Na substância cinzenta, a maioria dos corpos celulares refere-se a neurônios.
A maioria das fibras são amielínicas, em grande densidade, assumindo padrões de entrelace e orientações diversas. As células gliais correspondem a astrócitos protoplasmáticos, oligodendrócitos e microglia.
A porção de substância cinzenta da medula espinhal dorsal, o corno posterior ou dorsal (laminas I-VI), é composta principalmente por interneurônios sensoriais que recebem informações do ambiente externo através dos axônios centrais do gânglio da raiz dorsal. Estes aferentes primários após entrarem na medula espinhal são distribuídos espacialmente de forma diferenciada dependendo do diâmetro das fibras e das modalidades sensoriais conduzidas: fibras de grosso calibre correm
do corno dorsal através do fascículo de Lissauer (trato de fibras longitudinais não- mielinizadas na porção mais superficial do corno posterior lamina I-II) e são distribuídas nas lâminas da medula espinhal. Este padrão, embora tenha sido descrito inicialmente em gatos, pode ser, em linhas gerais, reconhecido em roedores (Paxinos, 2001).
Os componentes celulares distribuídos nas lâminas da medula espinhal são diferenciados por sua maquinária de neurotransmissão (Polgar et al., 2003), e por seus atributos morfofuncionais (Lima e Coimbra, 1986; Han et al., 1998).
A grande maioria dos neurônios da lâmina I – III consiste de interneurônios, por definição, de projeção intrínseca medular (Polgar et al., 2006). No entanto, encontramos também neurônios de projeção para regiões supramedulares. Estes neurônios são marcados para o receptor Neurokinina 1 que é excitado por substância P (Spike et al., 2003). Recente trabalho quantificou o número de células das lâminas I, III e IV que projetam diretamente para o tálamo (Al-Khater et al., 2008). Dos interneurônios sensoriais da intumescência lombar foram encontrados 17% deles que projetam para o tálamo.
A lâmina I, também conhecida como zona marginal medular, apresenta um grande número de neurônios de pequeno diâmetro, somáticos, em meio a alguns maiores e alongados mediolateralmente. Por critérios fisiológicos e morfológicos estes neurônios são categorizáveis em 3 grupos distintos: (1) piramidais, (2) fusiformes e (3) multipolares (Lima e Coimbra, 1986; Han et al., 1998). Estes neurônios são imunorreativos para encefalina, substância P, dinorfina (Lima et al., 1993), calbindina e calretinina (Anelli e Heckman, 2005). Finalmente, a camada I e sua população neuronal parece constituir uma importante estação para recepção de
informações de dor e temperatura, para retransmissão até o tronco encefálico (Tavares et al., 1993) e outras áreas supratentoriais.
A lâmina II (Substância gelatinosa ou de Rolando) é paralela à lâmina I, e caracterizada pela presença de neurônios com corpos pequenos e arredondados, em grande densidade. Estes foram categorizados morfológica e eletrofisiologicamente em células “islet” (ilha), central, radial e vertical. Dentre estes tipos, as células ”islet” apresentam seus prologamentos dispostos rostrocaudalmente por vários micrômetros (Toshiharu et al., 2007).
Na lâmina II chegam aferentes primários não mielinizados conduzindo informações de dor (Sugiura et al., 1986), que são moduladas por interneurônios desta camada. Grande número destes neurônios respondem a glutamato (Santos et al., 2007) e alguns outros são gabaérgicos (Polgar et al., 2003) e glicinérgicos (Bardoni et al., 2007). Os interneurônios da lâmina II podem ser identificados através da expressão de calbindina e calretinina (Anelli e Heckman, 2005).
Ao nível das intumescências a lâmina II é aumentada, pois aportam-lhe muitos aferentes não mielinizados, de origem espinhal e supraespinhal, integrando estas informações com fibras aferentes pouco mielinizadas que projetam para a lâmina I.
As lâminas III, IV e V formam o núcleo próprio, que integra entradas sensoriais com informações que descendem do cérebro e da base do corno dorsal, onde muitos neurônios que projetam para o tronco encefálico estão localizados.
Na lâmina III são encontradas células pequenas e arredondadas. No entanto, com uma densidade celular menor do que a registrada na lâmina II. Estão presentes também neurônios de corpo grande que projetam para o tronco encefálico. Estes
A lâmina IV é formada por algumas células pequenas e redondas, outras triangulares e grandes neurônios que projetam para o tronco encefálico e também expressam o receptor neurokinina 1 (Polgar et al., 2007). O limite entre a lâmina IV e lâmina V é claramente visível pela diferença na distribuição de fibras.
A parte intermediária da medula espinhal consiste das lâminas V-VIII. A lâmina VI ocupa a base do corno dorsal e é identificada somente nas áreas de diâmetro aumentado da medula espinhal. Neurônios nesta lâmina são menores do que os da lâmina V, e sua distribuição mais homogênea e projetam contralateralmente e ipsilateralmente para o núcleo reticular lateral (Girafoli et al., 2006).
A lâmina VII contém o núcleo de Clark, presente em segmentos torácicos e lombares superiores. Estes neurônios recebem informações proprioceptivas dos membros e enviam-nas para o cerebelo. O núcleo intermédio lateral encontra-se descrito no contexto desta lâmina, apresentando na sua composição motoneurônios autonômicos pré-ganglionares. As células desta lâmina são em sua maioria triangulares e ovais.
O corno ventral, formado pelas lâminas VIII e IX, contém além de vários tipos de interneurônios, os neurônios motores, ou motoneurônios inferiores (Lamina IX) que inervam os músculos estriados esqueléticos. Estes neurônios estão dispostos em colunas, algumas vezes abrangendo diversos segmentos medulares. As colunas motoras são divididas morfofuncionalmente em dois grupos: medial e lateral. A coluna motora medial estende-se por toda a medula e inerva os músculos axiais; as colunas motoras laterais ocupam principalmente a extensão longitudinal das duas intumescências medulares.
São distinguíveis 2 tipos de motoneurônios (1) motoneurônios alfa – apresentam corpos celulares de tamanho médio ou grande e extensa arborização dendrítica. Os axônios dos motoneurônios alfa emergem da medula espinhal e se integram aos nervos espinhais, fazendo sinapses com fibras musculares, caracterizadas como especializações histofisiológicas, denominadas junções neuromusculares; são responsáveis pela contração muscular. (2) motoneurônios gama – apresentam corpos celulares pequenos e poucos dendritos. Os axônios destes motoneurônios inervam as fibras musculares intrafusais, controlando indiretamente a contração muscular (Lent, 2001).
São encontrados também interneurônios, principalmente distribuídos na mal definida lamina VIII. Estes interneuronios podem ser de axônios curtos (Lent, 2001), e interneurônios comissurais, excitatórios ou inibitórios (Jankowska et al., 2007). São encontrados também pequenos interneurônios, denominados células de Renshaw, que recebem informações colaterais dos motoneurônios alfa, modulando, por alças sinápticas de retroalimentação negativa a atividade do motoneurônio (Uchiyama e Windhorst, 2007). As células ao redor do canal central da medula espinhal formam a lâmina X.
1.2 – Neurogênese da medula espinhal:
Os neurônios na medula espinhal são originários de uma camada neuroepitelial simples pseudoestratificada, caudal às vesículas encefálicas do tubo neural primitivo, denominada camada ventricular. As células que proliferam na camada ventricular recebem sinais moleculares que induzem a diferenciação em
que os neurônios são gerados, migram radialmente, associados com células de glia radial (McDermott et al., 2005). Após migrarem, acumulam-se na camada do manto e assumem suas posições na medula espinhal. Os primeiros neurônios gerados localizam-se nas camadas mais externas, enquanto os mais jovens encontram-se nas regiões mais internas (Altman e Bayer, 1984).
1.2.1 – Geração de neurônios motores:
A futura região ventral da medula espinhal recebe influência da notocorda através da expressão de SHH, dando origem a uma estrutura denominada placa basal, que em E10,5 emite sinais moleculares iniciadores do processo de diferenciação em neurônios motores (Goulding et al., 1993; Matsuda, 2002). Ao longo do desenvolvimento diversos subtipos de neurônios da região ventral são gerados e passam a expressar um complemento final do gene homeótico LIM (Islet 1, Islet 2, LIM 1 e LIM 3). A expressão de Islet 1 na região ventral da medula espinhal confere as células geradas o fenótipo de motoneurônio (Figura 4), antes mesmo de sua via axonal ser estabelecida na periferia e da segregação em colunas (Toshida et al., 1994; Lumsden, 1995).
Os neurônios motores gerados podem ser classificados de acordo com as projeções de seus axônios ou sua posição específica dentro do corno ventral (Figura 4) (Lumsden, 1995). (1) Neurônios motores localizados próximos à linha média formam a coluna motora medial (CMM), contínua ao longo da medula espinhal, e inervam músculos axiais do tronco. (2) Neurônios localizados mais lateralmente formam a coluna motora lateral (CML) ocupando a intumescência cervical e lombar e inervam músculos dos membros superiores e inferiores respectivamente. (3) Outra
coluna motora é formada nos níveis torácico e sacral, denominada coluna motora de Terni (CT), responsável pela inervação dos neurônios motores pós-ganglionares viscerais simpáticos e parassimpáticos (Lumsden, 1995).
As colunas motoras são subdivididas em: CMM lateral (inerva músculos da parede torácica anterior) e medial (inerva músculos próximos a coluna vertebral) e CML lateral (inerva músculos dorsais dos membros) e medial (inerva músculos ventrais dos membros) (Lumsden, 1995; Tanabe.et al., 1996).
Prolongamentos axonais dos neurônios motores emergem ventrolateralmente, crescendo em direção ao somito adjacente a seu ponto de emergência. Esta atração das radículas pelos somitos mais próximos sublinha o padrão segmentar de emergência dos nervos espinhais periféricos.
Figura 4. Distribuição anátomo-sistêmica geral da inervação motora. Neurônios motores das colunas motoras mediais são responsáveis por inervar os músculos axiais.
Enquanto neurônios motores das colunas motoras laterais inervam músculos dos membros.
A coluna motora lateral apresenta-se subdividida em coluna motora lateral medial e coluna motora lateral lateral, especializadas na inervação dos músculos ventrais e dorsais. Já os neurônios motores autonômicos advêm da coluna motora intermédia. (Retirado de Tanabe
Geração de neurônios motores
Músculos axiais
Músculos ventrais
Músculos dorsais
Neurônios autônomos
1.2.2- Geração de interneurônios do corno ventral:
Quatro subtipos de interneurônios são encontrados na coluna ventral da medula espinhal, e são denominados de acordo com a sua origem em nichos restritos na zona ventricular definidos por expressão diferencial de fatores de transcrição. Estes quatro tipos são: V0, expressam Evx1/2 e são localizados mais dorsalmente no corno ventral; V1, expressam En1 e são localizados ventralmente aos interneurônios V0 (Burrill, et al., 1997); V2, expressam Lim3/Chx10 (Ericson et al., 1996) e GATA 2 (Zhou et al., 2000) e são localizados entre os interneurônios V1 e os motoneurônios; e finalmente V3, que expressam Sim 1 (Pierani et al., 1999) e estão localizados mais ventralmente na medula espinhal. Acredita-se que a principal função destes interneurônios ventrais seja formar a circuitaria reflexa e coordenar a atividade motora junto aos motoneurônios (Allum et al., 1989; Goulding et al., 2002).
As células de Renshaw, interneurônios inibitórios que modulam a atividade dos motoneurônios são originários dos interneurônios V1 (Wenner e Donovan, 1999).
Neurônios gerados de V0 são interneurônios comissurais gabaérgicos e glumatamatérgicos (Lanuza et al., 2004). V1 são interneurônios de projeção ipsilateral gabaérgicos e glicinérgicos (Wenner et al., 2000). V2 são interneurônios de projeção ipsilateral (Lee e Pfaff, 2001) e V3 são interneurônios excitatórios ipsilaterais e comissurais (Zhang et al., 2008).
1.2.3 – Geração de interneurônios do corno dorsal:
Na linha média dorsal da medula espinhal, um grupo de células não neurais, denominado placa alar, serve como centro sinalizador para a diferenciação de
neurônios recém gerados em interneurônios sensoriais (Lee e Jessell, 1999). Entre E10-E12,5 são gerados seis tipos neuronais (Figura 5) denominados dI1 - dI6. Estes neurônios podem ser divididos em duas classes distintas (A e B). Neurônios classe A (dl1-dl3) são dependentes da sinalização da placa alar, enquanto neurônios classe B (dl4-dl6) são independentes desta sinalização (Muller et al., 2002). Em um segundo momento, entre E11-E13.5, são gerados dois tipos de interneurônios da classe B (dlLa e dlLb), responsáveis por formar os interneurônios das lâminas I, II e III do corno dorsal (Muller et al., 2002; Matise, 2002). Os neurônios classe A migram, ventralmente, para lâminas mais profundas da medula espinhal, gerando neurônios que processam informações proprioceptivas nas lâminas IV – VII (Bermingham et al., 2001) e interneurônios comissurais da lâmina VIII (Lee et al., 1998).
Figura 5. Geração de neurônios no corno dorsal a partir de duas ondas proliferativas.
Os neurônios da camada I, II e III são gerados através da proliferação dos neurônios de classe B.Matise, 2002
1.2.4 – Geração de neurônios sensoriais primários:
Neurônios sensoriais primários são gerados a partir das células da crista
Classe A
Classe B
centrais e periféricos. Os prolongamentos periféricos crescem para tecidos adjacentes como músculos, pele, vísceras. Os prolongamentos centrais formam as raízes dorsais e penetram na medula espinhal dorso lateralmente onde podem fazer conexões com interneurônios medulares ou ascender diretamente pelas colunas dorsais até regiões supramedulares (Fitzgerald et al., 1991).
1.3. – Gliogênese:
1.3.1. – Oligodendrócitos:
Os oligodendrócitos são células gliais maduras que mielinizam os axônios no SNC. Ao final da geração de motoneurônios na medula espinhal (E14), as células da linha média ventral periventricular que expressam Olig1/Olig2 tornam-se progenitores de oligodendrócitos (Zhou et al., 2000). Esta diferenciação parece ser dependente de SHH (Alberta et al., 2001) e os progenitores gerados migram dorsalmente e lateralmente através da substância branca e cinzenta, antes de diferenciar-se em oligodendrócitos (McMahon e McDermott, 2001).
1.3.2 – Astrócitos:
Os astrócitos são originários das células de glia radial da medula espinhal. A partir de E13 são encontradas células de glia radial (Shibata et al., 1997; McMarron e McDermott, 2002), nas quais um dos prolongamentos fica ancorado à pia mater e o outro aderido à superfície ventricular. O processo de transformação da glia radial medular em astrócitos inicia-se ao final do período de neurogênese, prosseguindo
após o nascimento (McMahon e McDermott, 2001; Barry e MacDermott, 2005).
Semelhante à geração de neurônios na medula espinhal, as células de glia, tanto astrócitos como oligodendrócitos, também parecem ter origem em regiões específicas e bem delimitadas da zona germinativa da medula (Sun et al., 2006).
1.3.3 – Microglia:
As células da microglia derivam do tecido mesodérmico periférico. No entanto, ainda não se tem total certeza sobre a identidade dos seus precursores, se são provenientes de monócitos circulantes do sangue ou de origem extravascular (Chan et al., 2007). No período pós-natal, os progenitores de células microgliais entram no sistema nervoso como monócitos derivados da medula óssea (Kaur et al., 2001)
1.3.4 – Células ependimárias:
As células ependimárias são remanescentes das células neuroepiteliais do tubo neural primitivo. São geradas a partir de E14 – E16 e a diferenciação termina durante a primeira semana pós-natal (Spassky et al., 2005; Bruni, 1998).
Atualmente, estas células revestem-se de importância devido a sua provável capacidade progenitora durante o desenvolvimento e no adulto (Johanson et al., 1999; Coskun et al., 2007), hipótese esta ainda controversa (Doetsch et al., 2003).
1.4 – Desenvolvimento pós-natal da medula espinhal de roedores:
Roedores nascem imaturos em relação ao seu sistema motor. A primeira semana pós-natal é um período muito importante para desenvolvimento da locomoção e das reações posturais das quais participam os membros de ratos (Vinay et al., 2004). Este desenvolvimento é dependente da maturação dos sistemas muscular esquelético e sensorial, dos centros cerebrais superiores, da chegada das vias descendentes corticais e sub-corticais à medula espinhal e estabelecimento de conexões intrínsecas entre os interneurônios da medula espinhal (Para revisão ver Vinay et al., 2004).
As primeiras fibras descendentes a alcançar a medula espinhal têm origem na formação reticular bulbar e núcleos vestibulares, e chegam em E14-E15 na medula cervical. No entanto, atingem a medula lombar somente após o nascimento e em P4 a maioria das fibras descendentes do tronco encefálico já atingiram a medula lombar e encontram-se em fase de estabelecimento de refinamento da circuitaria sináptica (Lakke, 1997). O trato corticoespinhal, principal via motora voluntária, penetra na medula espinhal a partir de P0 (Gribnau et al., 1986), com os axônios pioneiros sendo encontrados na coluna torácica em P3, e na coluna lombar a partir de P7 (Nagashima, 1994; Joosten et al., 1989). A citoarquitetura da medula espinhal está completa ao final da segunda semana pós-natal (Vinay et al., 2004). A mielinização axonal aumenta gradativamente a partir da segunda semana pós-natal (Schreyer e Jones,1982).
Os ramos centrais dos neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal entram na medula espinhal precocemente (Fitzgerald et al, 1991). As fibras de grande diâmetro adentram na medula a partir de E15 enquanto as fibras de menor diâmetro
(fibras C) somente em E19. Apesar desta entrada precoce, suas terminações sinápticas só são totalmente estabelecidas ao final da terceira semana pós-natal (Fitzerald e Jennings, 1999; Mentis et al., 2006). A mediação por receptores NMDA e purinérgicos, na lâmina II, parece ser importante para a estabilização sináptica que se desenvolve nesta idade (Bardoni, 2001).
Na primeira semana pós-natal existe intensa sinaptogênese (Bardoni, 2001) e os interneurônios comissurais já exibem forte circuitaria e são encontrados em grupos de interneurônios na camada marginal do corno dorsal; no corno ventral e próximo à linha média (Eide, et al., 1999). Os campos receptivos são maiores e mais sobrepostos do que em adultos (Fitzgerald e Jennings, 1999). No entanto, a estimulação dos campos receptivos relacionados as fibras C não provoca respostas nas células do corno dorsal, respostas estas somente detectadas a partir de P10 (Woolf e Thompson, 1991). Após lesão de nervos periféricos, modificações sinápticas e estruturais ocorrem no corno dorsal (Bester et al., 2000).
1.5 – Junções comunicantes (Gap Junctions):
Os tecidos são geralmente formados por uma maioria de células com características morfológicas ou fisiológicas semelhantes. Estas células precisam estar coordenadas para o funcionamento normal, e mesmo para a própria formação destes tecidos. Comunicação intercelular é, por si só, um termo bem abrangente, pois reunindo uma miríade de formas de transferência de informações entre células, desde aquelas dependentes de fatores humorais até as que implicam em contato direto de membrana. É a condição fundamental para a coordenação fisiológica
celular e, portanto, para a homeostasia tecidual (Spray e Dermietzel, 1995; Bruzzone et al., 1996).
A forma fisicamente mais direta de intercâmbio de metabólitos, de mediadores de excitabilidade elétrica e de sinalização fisiológica celular é representada pela comunicação dita juncional, dependente de especializações presentes nas regiões de contato das membranas plasmáticas de células adjacentes, denominadas junções comunicantes (Gap Junctions – GJ). São encontradas em vertebrados (White et al., 2004), e organizadas como placas juncionais, isto é, agregados de canais intercelulares distribuídos regularmente, segundo um padrão semi-cristalino, hexaédrico em vertebrados superiores. Estas junções encontram-se descritas em metazoários em geral, e são formadas por duas grandes classes de proteínas, estruturalmente homólogas, porém geneticamente não relacionadas, as conexinas e as panexinas, em vertebrados, e proteínas ortólogas às panexinas, as inexinas, em invertebrados (Phelan, 2005; Bruzzone e Dermietzel, 2006; Shestopalov e Panchin, 2007).
Os canais intercelulares que compõem as placas juncionais conectam as duas células adjacentes ao nível de suas membranas plasmáticas. Cada canal intercelular permite o fluxo bidirecional de moléculas de baixa massa molecular (até pouco mais de 1000 kDa) como íons K+, Ca2+, pequenos carboidratos, aminoácidos e pequenos peptídeos e segundo-mensageiros como cAMP, cGMP, inositol a,4,5- trifosfato (IP3). Desta forma, as células são ditas acopladas bioquímica e eletricamente (Bruzzone e Dermietzel, 2006).
Um canal intercelular é resultado do alinhamento de dois hemicanais, ou conexons, cada qual composto de um arranjo hexamérico de proteínas juncionais, as conexinas (Cx), dispostas em torno de um poro hidrofílico (Figura 6) (Beyer et al.,
1990). Algumas conexinas são fosfoproteínas, sendo a fosforilação um mecanismo relacionado à regulação da organização e das propriedades fisiológicas dos canais juncionais (Lampe e Lau, 2004).
As conexinas são oligomerizadas e então enviadas para a membrana celular onde formam os hemicanais ou conexons. Os conexons alinhados na formação da placa juncional obrigam a uma aproximação dos folhetos extracelulares das duas membranas vizinhas que passa à ordem de 2-4 nanômetros (Zampighi et al., 1988).
Hoje reconhece-se uma família de conexinas e 21 membros clonados no homem e 20 em camundongo (Söhl et al., 2004 e 2005). Destas, cerca de 11 são expressas no SNC do roedor. As conexinas têm na massa molecular calculada a partir de análise direta ou de dedução por clonagem da sequência primária de aminoácidos, a base para a construção da nômina mais amplamente empregada para diferenciar seus membros, situando-se entre 25 e 62 kDa.
Os conexons podem ser homoméricos, quando formados pela mesma conexina, ou heteroméricos, quando formados por associações de conexinas diferentes. O canal juncional pode compor-se por conexons idênticos, em canais homotípicos, ou diferentes, em canais heterotípicos (Rabionet et al., 2002; Chang et al., 2003). As junções comunicantes, por sua vez, podem ser classificadas em homocelulares, quando conectam células de um mesmo tipo, ou heterocelulares, quando conectam células diferentes (Rouach et al., 2002).
A formação dos conexons e a meia-vida funcional da junção sugerida para Cx43 situa-se em torno de 1,5 hora (Van Slike e Musil, 2000; Leithe e Rivedal, 2007). Além disso, a fisiologia e a biofísica particulares aos canais intercelulares formados por cada tipo de conexina parecem relacionar-se primariamente à
natureza intrínseca da conexina formadora em questão, e pouco influenciáveis pelo tipo de tecido (Dermietzel et al., 1991).
As conexinas possuem quatro domínios transmembranares, M1 a M4 (Figura 6), que formam o poro do canal. Estes domínios são conectados com duas alças extracelulares unidas por pontes de cistina, E1 e E2 (White et al., 1995) e responsáveis pelo reconhecimento e conexão célula-célula. Os terminais amino- e carboxi-, além de uma alça intracelular unindo os segmentos M2 e M3, voltam-se para o citossol. A porção C-terminal é a principal determinante das diferenças de massa molecular entre conexinas (Evans et al., 2006), por representar o sítio de maior variabilidade entre seus sub-tipos (Rabionet et al., 2002). É neste terminal que se concentram os múltiplos sítios de fosforilação das conexinas, reconhecidos, por exemplo, para proteína C cinase (PKC), proteina cinase mitógeno ativadora (MAPK) e Src cinase (Solan et al., 2005).
A presença da placa juncional entre células adjacentes não determina sua funcionalidade à priori. Sensíveis ao estado metabólico e fisiológico celular, os canais intercelulares juncionais transitam de forma dinâmica entre estados de fechamento e abertura, por sua vez resultantes de complexos 'chaveamentos' intramoleculares e interações entre as conexinas e complexos moleculares vizinhos (Thomas et al., 2005; Hervé et al., 2007). Sabe-se hoje que a propriedade de abertura dos canais juncionais encontra em elementos básicos da homeostasia celular, tendo como sítio e graus específicos de fosforilação, voltagem ou acidificação citoplasmática, os seus principais moduladores (Harris, 2001).
Diferentes conexinas determinam a formação de canais intercelulares com diferentes graus de permeabilidade. De fato, à massa molecular e, menos
Figura 6. A junção comunicante em modelo esquemático. a) Placa juncional, hemicanais alinhados para a formação de canais intercelulares, e arranjo hexamérico de conexinas, as proteínas juncionais em estudo nesta tese. Observe-se o estreitamento do espaço intercelular na região de placa juncional; b) Arranjo estrutural de uma conexina na membrana plasmática, destacando-se os 4 segmentos transmembranares, as duas alças extracelulares unidas por pontes de cistina, a alça intracelular e os terminais amino- e carboxi- voltados para o citossol. Adaptado de Sohl et al., 2005.
Conexina
Membrana
Citoplasma
comumente, à carga líquida ou parcial dos permeantes juncionais, somam-se evidências de que a conformação tridimensional destas moléculas, relativamente à natureza específica do poro iônico considerado, toma importância na determinação do repertório possível de agentes intercambiáveis entre as células acopladas.
Coerentemente, o diâmetro interno dos poros juncionais de permeação parece variar pouco quando se consideram canais intercelulares formados por diferentes conexinas, situando-se em torno de 12 Å (Harris, 2007); apesar disso, registram-se valores bem distintos de condutância e permeabilidade (Goldberg et al., 2004). A variabilidade no comportamento de canais heterólogos (Figura 7) frente a representantes moleculares de uma mesma família ilustra bem este aspecto da biofísica da comunicação juncional (Mese et al., 2007; Kanaporis et al., 2008).
Figura 7. Permeabilidade seletiva das junções comunicantes. Junções formadas por diferentes conexinas apresentam diferenças de permeabilidade a moléculas muito próximas quimicamente, como AMPc e GMPc, a exemplo de outras substâncias. Adaptado de Mese et al., 2007.
A comunicação juncional tem se revelado diretamente relacionada à manutenção da homeostasia, morfogênese e diferenciação celular em vertebrados, especialmente em estudos com roedores (Spray e Dermietzel, 1995; Bruzzone et al., 1996). Os processos de crescimento e morte celular também parecem modulados pelas proteínas juncionais (Vinken, et al., 2006). Mutações em genes que codificam para conexinas, seus níveis de expressão e/ou estados funcionais têm sido relacionados a doenças neurológicas como a Doença de Charcot-Marie-Tooth
(Braathen et al., 2007), esclerose múltipla (Brand-Schieber et al., 2005) e câncer (Cronier et al., 2008). As conexinas 32, 36 e 43, isotipos no SNC predominantemente oligodendrocítico, neuronal e astroglial, parecem envolvidas na propagação de injúria pós-isquêmica (Frantseva et al., 2002). Além disso, com o avanço do quadro pós-isquêmico, a expressão de Cx43, por exemplo, parece elevar- se no foco gliótico, inserindo-se na regulação positiva da proliferação da astroglia reativa (Haupt et al., 2007).
1.5.1 – Junções comunicantes e o desenvolvimento pós-natal da medula espinhal
Durante o desenvolvimento embrionário (Bittman et al., 2002) e pós-natal da medula espinhal (Chang et al., 1999) o acoplamento celular entre motoneurônios é extenso. Neste período, vários motoneurônios do corno ventral da medula espinhal inervam simultaneamente a mesma fibra muscular. Um motoneurônio pode estabelecer sinapses químicas com várias fibras musculares. No entanto, uma fibra muscular só estabelece sinapse com um único motoneurônio. A cada conjunto de motoneurônio e fibras musculares por este inervadas denominamos unidade motora.
A eliminação das sinapses entre motoneurônios e fibras musculares é necessária ao refinamento da circuitaria motora durante a primeira semana pós-natal (Thompson, 1985; Colman e Lichtman, 1993). Acredita-se que a exuberância na comunicação juncional estabelecida transitoriamente entre os motoneurônios esteja envolvida no processo seletivo de eliminação sináptica. O aumento da atividade sináptica, presente no início da deambulação, é acompanhado no roedor por
semana pós-natal (Mentis et al., 2002), desaparecendo em animais adultos (Chang et al., 1999).
Pastor e colaboradores (2003) demonstraram que o acoplamento celular entre motoneurônios aumenta após a exposição periférica à toxina botulínica durante a primeira semana pós-natal. Após a interrupção da transmissão neuromuscular, perifericamente, tem-se a recuperação dos altos níveis de comunicação juncional entre motoneurônios da medula espinhal, centralmente. Este quadro é reminiscente do daquele registrado no período embrionário do desenvolvimento da medula, implicando diretamente o amadurecimento e a funcionalidade das sinapses químicas periféricas, definindo e estabilizando as unidades motoras, no enfraquecimento e desaparecimento da rede sináptica elétrica entre os membros da população de motoneurônios espinhais. Esta regulação negativa da comunicação juncional medular parece depender também da manutenção da neurotransmissão central local excitatória, mediada pelo receptor glutamatérgico do tipo NMDA, uma vez que o bloqueio farmacológico do receptor de NMDA por MK801 torna o acoplamento entre os motoneurônios da medula espinhal persistente (Personius et al., 2008).
Diversos estudos vêm endereçando uma possível importância da comunicação juncional para o desenvolvimento da medula espinhal, baseados na caracterização celular e temporal da expressão de diferentes subtipos de conexinas.
As conexinas 36, 37, 40, 43 e 45 foram encontradas em motoneurônios em desenvolvimento, desde o período embrionário E15 até o período P4 (Chang et al., 1999), bem como em outros tipos celulares, neuronais e gliais, da medula espinhal (Rash et al., 2001).
Enquanto a comunicação juncional está relativamente bem documentada no corno ventral da medula espinhal, no corno dorsal da medula a literatura é ainda
escassa. Quanto à expressão de conexinas nesta região, destaca-se a descrição de Cx37 (Lin et al., 2002) e de Cx 43 (Li e Nagy, 2000), não identificados, no entanto, os tipos celulares de expressão, tampouco a funcionalidade das putativas junções por estas formadas no corno ventral. No artigo de Lin e colaboradores (2002) a lesão periférica e/ou ativação das fibras de aferência de dor leva ao aumento da expressão de Cx37 no corno dorsal da medula espinhal. Em estudo complementar, Li e Nagy (2000) demonstram que a ativação de aferentes de dor que compõem o nervo ciático leva a um aumento da forma fosforilada da Cx43 no corno dorsal.
Sendo assim, existe um potencial para a formação de acoplamento celular, que é evidenciado somente após lesão. Desta maneira, estudos prévios do acoplamento celular no corno dorsal restringem-se a modelos pós-lesão, e revelam uma lacuna na área, que aguarda por sua investigação na medula espinhal durante o desenvolvimento e na idade adulta.
1.5.2 – Junções comunicantes na medula espinhal de ratos adultos:
A medula espinhal é uma porção filogeneticamente antiga do SNC. Uma vez consideradas as sinapses elétricas como formas primitivas de comunicação celular, pois não são facilmente encontradas em neurônios de mamíferos adultos (Shepherd, 1988), apostava-se mais na exuberância do que na escassez da comunicação juncional na medula. Ao contrário, no entanto, a surpresa veio de um estudo pioneiro em roedores adultos, que restringia as evidências morfológicas das junções comunicantes às superfícies de aposição de membrana entre neurônios sacrais envolvidos no controle da ejaculação (Matsumoto et al., 1988; 1989).
Estudos posteriores, no entanto, desenvolvidos por John Rash e colaboradores (1996), apresentam evidências morfológicas, por eletromicroscopia, da presença de junções comunicantes na medula espinhal adulta. O estudo ressalta as dimensões reduzidas das placas juncionais, que teriam dificultado sua detecção por grupos anteriores. Utilizando ensaios de crio-fratura, o grupo descreve placas juncionais estabelecidas entre interneurônios e motoneurônios, em arranjos sinápticos mistos (i.e., placas juncionais na região de zonas ativas pré-sinápticas e especializações pós-sinápticas), distribuídos entre as lâminas III e IX de segmentos lombares da medula espinhal.
Diante dos recursos de clonagem e avanço das técnicas de imunorreconhecimento, anos mais tarde o mesmo grupo demonstraria a expressão da Cx36 em contatos homocelulares envolvendo neurônios da medula espinhal adulta (Rash et al., 2000, 2001). Uma recente evidência funcional da comunicação juncional na medula veio de estudos em rã adulta, realizados por Bacskai e Matesz (2002), demonstrando passagem de permeantes juncionais a partir de axônios de aferentes sensoriais primários para neurônios situados no corno dorsal da medula espinhal, no tronco encefálico e no cerebelo.
As junções comunicantes, na medula espinhal adulta, são encontradas mais facilmente entre células não neuronais como astrócitos e oligodendrócitos (Nagy e Rash, 2000). Sobretudo a rede astrocitária tem sido proposta como responsável pela criação de domínios medulares de composição metabólica e iônica particulares, exemplificadas por uma presumível barreira histológica e molecular entre o SNC e o SNP (Fraher, 1992).
Dentre as conexinas descritas na medula espinhal adulta (CX 26, 30, 32, 36, 43 e 45), a Cx36 parece ser a forma neuronal funcional na medula espinhal de
animais adultos enquanto a Cx43 é predominante astrocitária (Rash et al., 2000). No entanto, em astrócitos medulares foi determinada também a existência das conexinas 26 e 30. A Cx32 (Rash, et al., 2001) e a Cx45 (Dermietzel et al., 2000) são encontradas principalmente em oligodendrócitos (Figura 8).
Figura 8. Tipos celulares e conexinas predominantes na medula espinhal de ratos adultos. Adaptado de Rash et al., 2001. E = Epêndima, A = Astrócito, N = Neurônio, O = Oligodendrócito, L = Leptomeninge, Cx = Conexinas, ECM = Matriz extracelular.
Como vimos, no roedor adulto, apesar de contarmos com uma descrição não puntual da distribuição geral histológica e celular das conexinas e de placas juncionais por estas formadas na medula espinhal, a funcionalidade destas junções permanece inexplorada experimentalmente.
As lesões ao sistema nervoso provocam uma série de alterações celulares que podem ser percebidas ao redor ou a grandes distâncias do local da lesão (Aldskogius e Kozlova, 1998; Block et al., 2005). Estas respostas variam com a intensidade e o mecanismo e/ou agente causador da injúria.
Desenvolvem-se nos diversos tipos celulares do sistema nervoso, incluindo neurônios, astrócitos, microglia, oligodendrócitos, células de Schwann e epêndima, apresentando, no entanto, perfis fisiopatológicos celulares distintos, em bases de tempo também distintas (para revisão ver Aldskogius e Kozlova, 1998). Dentre estas reações fisiopatológicas, incluem-se alterações de expressão de proteínas juncionais que, se somam àquelas observadas na medula (descritas abaixo), no que respondem a insultos isquêmicos e manobras de excitotoxicidade induzida (Sawchuk et al., 1995; Ochalski et al., 1995).
Desde os anos 20, sabe-se que os axônios sensoriais periféricos apresentam crescimento rápido após lesão, no entanto o ramo central, ao atingir as proximidades da zona de transição entre o gânglio da raiz dorsal e a medula espinhal, tem o seu crescimento bloqueado (Aldoskogius e Kozlova, 1998). Quando da lesão periférica, as reações fisiopatológicas se estendem aos terminais axonais no corno dorsal da medula espinhal ou tronco encefálico, dependendo se nervos espinhais ou cranianos, incluindo degeneração do terminal central e axônios, mudanças moleculares e em proteínas de crescimento, arborização e alterações na transmissão sináptica (para revisão ver Woolf e Doubell, 1994)
A transecção de nervos espinhais ou cranianos exerce uma rápida resposta glial no sistema nervoso central. Uma destas respostas é o aumento da expressão de Cx43 em modelo de lesão do nervo facial, aumento este desenvolvido num
