Luiz Vinícius Leão Moreira
INQUÉRITO SOROEPIDEMIOLÓGICO DE SARS-CoV-2 EM PACIENTES ATENDIDOS EM UM HOSPITAL UNIVERSITÁRIO NA
CIDADE DE SÃO PAULO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Infectologia.
São Paulo
2022
Luiz Vinícius Leão Moreira
INQUÉRITO SOROEPIDEMIOLÓGICO DE SARS-CoV-2 EM PACIENTES ATENDIDOS EM UM HOSPITAL UNIVERSITÁRIO NA
CIDADE DE SÃO PAULO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Infectologia.
Orientador(a):
Prof(a). Dr(a) Nancy Cristina Junqueira Bellei
São Paulo
2022
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr Alvaro Pacheco e Silva Filho
Coordenador(a) do Curso de Pós-graduação:
Prof(a). Dr(a) Ana Cristina Gales
Luiz Vinícius Leão Moreira
INQUÉRITO SOROEPIDEMIOLÓGICO DE SARS-CoV-2 EM PACIENTES ATENDIDOS EM UM HOSPITAL UNIVERSITÁRIO NA
CIDADE DE SÃO PAULO
Banca examinadora de Mestrado:
Prof. Dr Vinicius Ponzio da Silva
Prof. Dr Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe Profa. Dra Daniele Freitas Henriques
Dedico essa Dissertação de Mestrado aos meus pais e familiares que sempre me apoiaram e acreditaram nesse sonho junto comigo e a todos os familiares das vítimas de COVID-19...
AGRADECIMENTOS
À Universidade do Federal de São Paulo e a empresa Beckman Coulter, por fomentarem esta pesquisa e torna-la possível.
À minha orientadora Nancy Bellei pela confiança que depositou em mim na realização deste projeto e por ter contribuído imensamente na minha formação como pesquisador. Jamais esquecerei das discussões cientificas, as quais sempre guardarei como grande inspiração na minha trajetória a partir de hoje.
A todos os colaboradores do Laboratório de Virologia, em especial à Ana Helena e Luciano Luna, pelo suporte laboratorial e acadêmico que me deram.
Excelentes profissionais que me ensinaram com muita sabedoria e paciência ao longo de 2 anos.
Aos meus pais e familiares que me apoiaram e incentivaram durante esses anos, e não mediram esforços para que eu realizasse os meus sonhos.
As minhas amigas Ana Paula, Gabriela Barbosa, Danielle D. Conte e Joseane Mayara vocês foram essenciais nesses 2 longos anos de pandemia. Obrigado por todo apoio. Nunca irei esquecer dos lindos momentos que passamos, seja no laboratório ou não, tenho certeza que essa amizade levarei para o resto da vida.
“Não há quem goste de ser número, gente merece existir em prosa.”
(Edson Pavoni, 2020)
Resumo
O SARS-CoV-2 infecta indivíduos de todas as faixas etárias em geral, os idosos são mais suscetíveis a apresentar condições graves de COVID-19. Compreende-se também que a reposta imunológica do hospedeiro define se o indivíduo terá um quadro leve ou uma hospitalização pela COVID-19. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo realizar um inquérito sorológico de COVID-19 em pacientes ambulatoriais e hospitalizados por meio da mensuração de anticorpos da classe IgG.
As amostras sorológicas foram investigadas retrospectivamente em 1.085 pacientes ambulatoriais e 1015 pacientes hospitalizados atendidos no Hospital São Paulo de novembro de 2020 a julho de 2021. 25 pacientes hospitalizados puderam ser avaliados prospectivamente quanto a dinâmica da resposta humoral. Foram utilizados testes qualitativos e quantitativos de quimioluminescência (CLIA), com o Access SARS- Teste de anticorpo IgG CoV-2 (Beckman Coulter, Brea, EUA) (detecção de IgG de domínio de ligação ao receptor anti-Spike S1); seguindo as instruções do fabricante. No geral, os anticorpos IgG foram detectados em 16,2% (176/1085) dos pacientes ambulatoriais. A detecção de IgG foi maior em pacientes com doença renal crônica (37,5%), seguida por indivíduos com moléstias infecciosas (26,8%). No estudo transversal de pacientes hospitalizados, anticorpos anti-SARS-CoV-2 IgG foram detectados em 31,8% (323/1015) dos soros. No estudo prospectivo de pacientes hospitalizados, quem havia tomado duas doses da vacina CoronaVac, apresentou níveis de anticorpos mais elevados que pacientes não vacinados, porém ainda sim, observou-se uma alta taxa de óbitos dentre esses pacientes 58,8% (10/17). Notou-se que a maior frequência de detecção em pacientes ambulatoriais ocorreu em adultos não vacinados de 30 a 69 anos, que era a população mais exposta no início da pandemia, de acordo com estudos nacionais e internacionais. O título de anticorpos no estudo transversal de pacientes hospitalizados independente da produção em resposta a doença ou vacinação prévia não conferiu uma proteção quando o fator idade foi mais relevante para um pior desfecho. No estudo prospectivo de pacientes hospitalizados, a vacinação parece ter sido um fator que influenciou no aparecimento de maiores títulos de anticorpos, porém, duas doses de vacina e produção de anticorpos durante a internação não foram suficientes para proteger contra o pior desfecho, principalmente nos pacientes com faixa etária mais elevadas.
Abstract
SARS-CoV-2 infects individuals of all age groups and in general, the elderly are more susceptible to having severe conditions from COVID-19. It is also understood that the host's immune response defines whether the individual will have a mild condition or hospitalization for COVID-19. In this context, this study aimed to carry out a serological survey of COVID-19 in outpatients and hospitalized patients by measuring antibodies of the IgG class. Serological samples were retrospectively investigated in 1085 outpatients and 1015 inpatients seen at Hospital São Paulo from November 2020 to July 2021. 25 hospitalized patients could be prospectively evaluated for humoral response dynamics. Qualitative and quantitative chemiluminescence (CLIA) tests were used, with the Access SARS- CoV-2 IgG Antibody Test (Beckman Coulter, Brea, USA) (detection of IgG anti-Spike S1 receptor binding domain); following the manufacturer's instructions. Overall, IgG antibodies were detected in 16.2% (176/1085) of outpatients.
IgG detection was higher in patients with chronic kidney disease (37.5%), followed by individuals with infectious diseases (26.8%). In the cross-sectional study of hospitalized patients, anti-SARS-CoV-2 IgG antibodies were detected in 31.8%
(323/1015) of the sera. In the prospective study of hospitalized patients, those who had taken two doses of the CoronaVac vaccine had higher antibody levels than unvaccinated patients, but still, a high death rate was observed among these patients 58.8% (10/17 ). It was noted that the highest frequency of detection in outpatients occurred in unvaccinated adults aged 30 to 69 years, which was the most exposed population at the beginning of the pandemic, according to national and international studies. The antibody titer in the cross-sectional study of hospitalized patients regardless of production in response to disease or previous vaccination did not provide protection when the age factor was more relevant for a worse outcome. In the prospective study of hospitalized patients, vaccination seems to have been a factor that influenced the appearance of higher antibody titers, however, two doses of vaccine and production of antibodies during hospitalization were not enough to protect against the worst outcome, especially in patients with higher age groups.
Lista de Figuras
Figura 1. Genoma do SARS-CoV-2...3
Figura 2. Estrutura do SARS-CoV-2...3
Figura 3. O ciclo de infecção do SARS-CoV-2 dentro da célula hospedeira...5
Figura 4. Novos casos COVID-19 confirmados diariamente...7
Figura 5. Variação estimada ao longo do tempo em testes de diagnóstico para detecção do SARS-CoV-2 em relação ao início dos sintomas...13
Figura 6. Fluxograma do grupo de pacientes ambulatoriais e testes realizados...18
Figura 7. Fluxograma do grupo de pacientes hospitalizados (estudo transversal) e testes realizados...19
Figura 8. Fluxograma do grupo de pacientes hospitalizados com COVID-19 (estudo prospectivo) e testes realizados...20
Figura 9. Critérios de exclusão do estudo prospectivo...21
Figura 10. Etapas do teste quimioluminescente...22
Figura 11. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por faixa etária de pacientes ambulatoriais...25
Figura 12. Representaçãoesquemática da frequência de anticorpos em pacientes hospitalizados...26
Figura 13. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por faixa etária em pacientes hospitalizados (estudo transversal) ...29
Figura 14. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por gravidade da doença e desfecho clínico em pacientes hospitalizados (estudo transversal) ...30
Figura 15. Representação gráfica dos títulos de anticorpos entre pacientes hospitalizados vacinados e não vacinados (estudo prospectivo) ...33
Figura 16. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por faixa etária em pacientes hospitalizados e vacinados (estudo prospectivo) ...34
Figura 17. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por desfecho clínico em pacientes hospitalizados (estudo prospectivo) ...35
Figura 18. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por desfecho clínico em pacientes hospitalizados (estudo prospectivo - subanálise) ...36
Figura 19. Representação esquemática do desfecho clínico de pacientes
hospitalizados totalmente imunizados com a vacina CoronaVac...37 Figura 20. Representação gráfica da dinâmica da resposta anticórpica de dez
pacientes imunizados com a vacina CoronaVac (2 doses) ...38 Figura 21. Representação esquemática do desfecho clínico de pacientes
hospitalizados totalmente imunizados com a vacina CoronaVac...39 Figura 22. Representação gráfica da dinâmica da resposta anticórpica de cinco
pacientes vacinados com uma dose da vacina ChAdOx1 nCoV-19...40 Figura 23. Representação esquemática do desfecho clínico de pacientes
hospitalizados não vacinados...41 Figura 24. Representação gráfica da dinâmica da resposta anticórpica de oito
pacientes não vacinados...42
Lista de Quadros e Tabelas
Quadro 1. Soroprevalência de anticorpos anti-SARS-CoV-2 na população adulta da cidade de São Paulo de acordo com o estudo SoroEpi MSP...9 Tabela 1. Frequência de anti-SARS-CoV-2 em pacientes ambulatoriais segundo
faixa etária, Hospital São Paulo, SP, Brasil...23 Tabela 2. Frequência de anti-SARS-CoV-2 IgG segundo ambulatório de
atendimento, Hospital São Paulo, SP, Brasil...24 Tabela 3. Distribuição dos pacientes IgG positivos, segundo comorbidades, Hospital
São Paulo, SP, Brasil...24 Tabela 4. Frequência de anti-SARS-CoV-2 em pacientes hospitalizados segundo
faixa etária, Hospital São Paulo, SP, Brasil...27 Tabela 5. Distribuição dos pacientes IgG positivos infectados por COVID-19,
segundo características clinicas e desfecho clínico, Hospital São Paulo, SP, Brasil...28 Tabela 6. Distribuição dos pacientes hospitalizados, segundo características
demográficas e status de vacinação, Hospital São Paulo, SP, Brasil ...32
Lista de Abreviaturas e Siglas
ACE2: Enzima conversora de angiotensina 2 AMB: Ambulatório
BAU: Binding antibody unit
CT: Cycle threshold (valor do ciclo limiar) CoVs: Coronavírus
ECLIA: Eletroquimioluminescência
ELISA: Ensaio de imunoabsorção enzimática gRNA: RNA genômico
HAS: Hipertensão arterial sistêmica HCoV: Coronavírus humano
HIV: Vírus da imunodeficiência humana HSP: Hospital São Paulo
IgG: Imunoglobulina G IgM: Imunoglobulina M
MERS-CoV: Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio Nsps: Proteínas não estruturais
OMS: Organização Mundial da Saúde
ORFs: Open reading frames (fase de leitura aberta) PCR: Reação em cadeia da polimerase
RSV: Vírus Sincicial Respiratório
RTC: Complexo de replicação e transcrição
RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase precedida por transcrição reversa SARS-CoV: Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave
SARS-CoV-2: Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 SgRNA: RNA subgenômico
SRAG: Síndrome Respiratória Aguda Grave
Sumário
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Contexto Histórico do SARS-CoV-2 ... 1
1.2 Caracterização do SARS-CoV-2 ... 2
1.3 Replicação do SARS-CoV-2 ... 4
1.4 Epidemiologia... 6
1.5 Estudos soroepidemiológicos ... 8
1.6 Aspectos clínicos e diagnóstico laboratorial da infecção por SARS-CoV-2 ... 9
1.7 Resposta Imune do Hospedeiro após a Infecção pelo SARS-CoV-2 ... 11
1.8 Resposta Imune do Hospedeiro após a vacinação para SARS-CoV-2 ... 13
1.9 Testes sorológicos ... 15
2 OBJETIVOS ... 17
2.1 Objetivo Geral ... 17
2.2 Objetivos específicos ... 17
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 18
3.1 Aspectos éticos ... 18
3.2 Tipo de estudo, local e tempo da pesquisa ... 18
3.2.1 Estudo transversal: Pacientes ambulatoriais ... 18
3.2.2 Estudo transversal: Pacientes hospitalizados ... 19
3.2.3 Estudo prospectivo: Pacientes hospitalizados com COVID-19 ... 19
3.3 Critérios de inclusão e exclusão ... 20
3.4 Amostras ... 21
3.5 Levantamento de dados nos prontuários ... 21
3.6 Teste de detecção de anticorpos por Quimioluminescência (CLIA) ... 22
3.7 Análise estatística ... 22
4 RESULTADOS ... 23
4.1 Estudo transversal: Pacientes ambulatoriais ... 23
4.1.1 Distribuição dos pacientes ambulatoriais ... 23
4.1.2 Perfil dos pacientes Anti-SARS-CoV-2 IgG reagentes ... 23
4.1.3 Frequência de comorbidades dos indivíduos sororreagentes ... 24
4.1.4 Título de anticorpos IgG dos indivíduos sororreagentes ... 25
4.2 Estudo Transversal: Pacientes hospitalizados ... 26
4.2.1 Distribuição dos pacientes hospitalizados ... 26
4.2.2 Perfil dos pacientes Anti-SARS-CoV-2 IgG reagentes ... 27
4.2.3 Título de anticorpos IgG dos indivíduos sororreagentes ... 28
4.2.4 Análise do título de anticorpos IgG e desfecho clínico ... 29
4.3 Estudo prospectivo: Pacientes hospitalizados com Covid-19 ... 32
4.3.1 Perfil dos pacientes hospitalizados ... 32
4.3.2 Título de anticorpos IgG dos indivíduos sororreagentes ... 32
4.3.3 Analise do desfecho clinico e da dinâmica do título de anticorpos IgG dos indivíduos imunizados com a vacina CoronaVac ... 37
4.3.4 Análise do desfecho clínico e da dinâmica do título de anticorpos IgG dos indivíduos vacinados com uma dose da vacina ChAdOx1 nCoV-19 ... 39
4.3.5 Análise do desfecho clínico e da dinâmica do título de anticorpos IgG dos indivíduos não vacinados ... 41
5 DISCUSSÃO ... 43
6 CONCLUSÕES ... 55
7 REFERÊNCIAS ... 56
8 ANEXOS ... 63
ANEXO 1 – CALENDÁRIO DE VACINAÇÃO CIDADE DE SÃO PAULO ... 63
ANEXO 2 – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA ... 69
ANEXO 3 – EMENDA DO PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA ... 75
1 INTRODUÇÃO
1.1 Contexto Histórico do SARS-CoV-2
As grandes pandemias desafiaram a existência humana em diversos momentos ao longo da história, a partir do momento em que patógenos de animais evoluíram e se tornaram agentes infecciosos humanos, várias doenças pandêmicas com alto potencial de transmissão já foram descritas em populações no mundo inteiro (1).
As doenças respiratórias representam um grande impacto para a saúde pública e podem ser causadas por uma variedade de microrganismos (2). No entanto, em termos de capacidade de disseminação, as maiores taxas são normalmente associadas ao Sarampo, Vírus Sincicial Respiratório (RSV), Influenza A ou B e aos Coronavírus (CoVs), responsáveis por várias epidemias e pandemias ao longo do tempo (3).
Os Coronavírus humanos (HCoVs), caracterizados pela primeira vez na década de 1960, são patógenos importantes, causadores de infecção respiratória, entéricas ou sistêmicas em humanos e animais (4). O primeiro HCoV foi descoberto em 1965 por Tyrrell e Bynoe, nomeado de B814, o vírus foi encontrado em culturas de órgãos traqueais embrionários humanos obtidas a partir do trato respiratório de um adulto com um resfriado comum (5). No final da década de 1960, foram observados por microscopia eletrônica que várias cepas de vírus humanos e animais eram morfologicamente parecidos. Esse novo grupo de vírus foi denominado coronavírus pois apresentava projeções em forma de coroa a partir da sua superfície, e mais tarde foi oficialmente aceito como um novo gênero de vírus (6).
A partir disso, estudos epidemiológicos revelaram que os coronavírus eram responsáveis por várias doenças respiratórias, podendo causar pneumonia e bronquite em jovens e adultos (7). Novos estudos também descreveram os coronavírus como causadores de doenças complexas e variadas em diversas espécies de animais como: ratos, camundongos, galinhas, perus, bezerros, cães, gatos, coelhos e porcos (4).
Até o momento foram identificados sete HCoVs, quatro espécies (229E, OC43, NL63 e HKU1) possuem virulência relativamente baixa, são comumente encontradas pelo mundo e responsáveis por causarem resfriados leves (8, 9). Outras três espécies, o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV), coronavírus da
síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) e o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), têm patogenicidade e origem diferentes e maiores taxas de mortalidade em populações humanas (10).
Diante da atual pandemia associada ao coronavírus que o mundo enfrenta hoje, é importante lembrar que historicamente os humanos já enfrentaram duas epidemias associadas a eles, a primeira, uma nova síndrome respiratória aguda grave (SRAG) que surgiu em 2002-2003 no sul da China apresentando uma letalidade de 9,6%, e a segunda, a síndrome respiratória coronavírus do Oriente Médio (MERS-CoV) em 2012 que se limitou à alguns países, incluindo Arábia Saudita, Emirados Árabes Unidos e Coréia e apresentou uma letalidade de 34,4% (11).
O impacto sanitário e econômico e da doença coronavírus 19 (COVID-19) é evidente em todo o mundo. Detectado pela primeira vez em Wuhan (Hubei, China), em dezembro de 2019, foi rapidamente determinado como sendo causado por um novo coronavírus e nomeado Coronavírus do tipo 2 associado a síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) em 11 de fevereiro de 2020, pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (12, 13).
A pandemia de COVID-19 se disseminou por vários países, atingindo rapidamente um milhão de casos confirmados em abril de 2020 (14). Devido à rápida transmissão de pessoa a pessoa, o fornecimento de testes de diagnóstico molecular e estudos clínicos de novas vacinas foram fundamentais para tentar evitar a propagação do vírus (15). Apesar dos esforços globalmente realizados, não se pôde evitar que os hábitos sociais, culturais e as relações interpessoais fossem afetados pela pandemia em todo o mundo (16).
1.2 Caracterização do SARS-CoV-2
O SARS-CoV-2 pertence à família Coronaviridae, que pertence à ordem Nidovirales e ao gênero Betacoronavirus (17). Seu genoma (27–32 kb) é um RNA de fita simples de sentido positivo (+ ssRNA) que é maior do que qualquer outro vírus de RNA, cada transcrição viral tem uma estrutura de capa 5 'e uma cauda poli (A) 3' e a partir do RNA genômico (gRNA), nove RNAs subgenômicos principais são produzidos (18) (Figura 1).
Fonte: (18)
Figura 1. Genoma do SARS-CoV-2
Seu gRNA possui 14 open reading frames (ORFs), ou fase de leitura aberta, responsáveis pela síntese de 4 proteínas estruturais (N, S, M e E) e 16 não estruturais (nsp1-16) (18) (Figura 2).
Fonte: (18)
Figura 2. Estrutura do SARS-CoV-2
As proteínas S (Spike) dos coronavírus são glicoproteínas de fusão de classe I que são divididas em duas partes funcionalmente distintas (S1 e S2). A subunidade S1 consiste no domínio N-terminal (NTD) e no domínio de ligação ao receptor (RBD), já a subunidade S2 contém regiões de repetição do heptal e o peptídeo de fusão (17).
A função da subunidade S1 é ligar-se ao receptor na célula hospedeira enquanto que a subunidade S2 é responsável por fundir as membranas virais com as células hospedeiras (19).
A proteína S do SARS-CoV-2 contém um RBD que se liga ao o receptor ACE2 especificamente que possui dois domínios estruturais: o núcleo e os subdomínios externos, o que torna esta proteína um importante alvo para o desenvolvimento de drogas antivirais e anticorpos neutralizantes (20).
A proteína N contém dois domínios de ligação de RNA distintos, o domínio N- terminal [NTD] e o domínio C-terminal [CTD] que se ligam ao genoma de RNA viral. É considerada multifuncional, pois sua função está além de envolver o gRNA. Estudos mostram que a proteína N está amplamente envolvida nos processos relacionados a aspectos do ciclo de replicação, desempenhando um papel fundamental no aumento da eficiência da transcrição e montagem dos CoVs (21, 22). Após a infecção, a proteína N entra na célula hospedeira junto com o RNA viral para facilitar sua replicação e processar a montagem e liberação da partícula viral (23, 24).
A proteína M é considerada o organizador central da montagem dos CoVs, pois interage com todas as outras proteínas estruturais importantes atuando na formação do envelope viral (22). Estudos sugerem que a proteína M facilita a montagem interagindo com a ribonucleoproteína viral (RNP) e glicoproteínas S no local de brotamento, criando uma rede de interações capaz de excluir algumas proteínas da membrana do hospedeiro do envelope viral (25).
A proteína E é abundantemente expressa dentro da célula infectada, mas apenas uma pequena porção é incorporada ao envelope do vírion. Na ausência dessa proteína os títulos virais são significativamente baixos e a maturação viral é prejudicada pela produção de progênies incompetentes de propagação (22).
As proteínas não estruturais (Nsps) produzidas pelo SARS-CoV-2 possuem diversas funções e são essenciais para o ciclo de vida viral (19). Dentre suas 16 proteínas não estruturais, acredita-se que o Nsp2-11 forneça as funções de suporte necessárias, como modular as membranas intracelulares, evasão imune do hospedeiro e fornecer cofatores para replicação, enquanto o nsp12-16 determinam o curso do ciclo de replicação, pois contém as funções enzimáticas centrais envolvidas na síntese, revisão e modificação do RNA (26).
1.3 Replicação do SARS-CoV-2
Em humanos, os coronavírus utilizam sua proteína S para entrar nas células hospedeiras e essa entrada ocorre por meio do receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) presente na superfície da célula hospedeira, por meio de endocitose ou fusão de membranas (27). Com base nos conhecimentos já estabelecidos do mecanismo patogênico do SARS-CoV, após a entrada do vírus, o ACE2 é regulado negativamente e dá início a uma cascata que potencializa a
patologia pulmonar, portanto, tanto a lesão inicial quanto a mais prolongada ocorrem nos pulmões (28). (figura 3)
Fonte: Adaptado de Arya R, et al. (29)
Figura 3. O ciclo de infecção do SARS-CoV-2 dentro da célula hospedeira. A sequência de eventos, desde o reconhecimento da célula hospedeira até a liberação de um novo vírion, é representada graficamente nas etapas 1 a 12.
Além da ligação ao receptor, a clivagem proteolítica das proteínas S do coronavírus por proteases derivadas da célula hospedeira é essencial para permitir a fusão (30). Foi demonstrado que o SARS-CoV usa a serina protease de superfície celular TMPRSS2 para iniciação e entrada na célula (19).
A liberação do genoma do coronavírus no citoplasma da célula hospedeira marca o início de um programa complexo de expressão do gene viral, após a entrada na célula, o gRNA é traduzido para produzir proteínas não estruturais que irão formar o complexo de replicação-transcrição (RTC), a partir de dois quadros abertos de leitura (ORFs), ORF1a e ORF1b (18).
Intermediários de RNA de sentido negativo são gerados a partir do gRNA para servir como modelos para a síntese de gRNA de sentido positivo e RNAs
subgenômicos (sgRNAs) (18). Esses genomas recém-sintetizados são usados para tradução, na geração de mais nsps ou são empacotados em novos virions. Uma característica importante dos coronavírus é o processo de transcrição viral descontínuo, que produz um conjunto de RNAs subgenômicos que serão traduzidos em proteínas estruturais e acessórias (31).
As proteínas S, M e E se direcionam ao retículo endoplasmático (RE), e a proteína N se liga à fita de RNA genômico para produzir o complexo de nucleoproteína (32). O complexo de nucleoproteína e as proteínas estruturais movem-se para o compartimento intermediário onde os vírions se reúnem, amadurecem e brotam do complexo de Golgi na forma de pequenas vesículas. Essas vesículas são levadas para a membrana da célula hospedeira, onde são liberadas na região extracelular por meio de exocitose. Os vírions liberados infectam um novo conjunto de células levando à progressão da doença (29).
1.4 Epidemiologia
A COVID-19 começou a se espalhar em Wuhan, China, em meados de março de 2020, os casos COVID-19 já eram relatados globalmente em mais de 170 países (33). Em 15 de março de 2020, 153.517 casos de COVID-19 confirmados em laboratório com 5.735 mortes foram relatados de acordo com a OMS (34). Nos estágios iniciais da propagação global da COVID-19, os casos identificados fora da China eram em sua maioria viajantes infectados na China e que viajavam para outros países. Os primeiros países que relataram casos COVID-19 associados a viagens foram Cingapura, Japão, República da Coréia, Malásia, Vietnã, Austrália, Estados Unidos da América, Alemanha etc. (35).
Atualmente a doença atingiu mais de 487 milhões de casos em todo o mundo e mais de 6,4 milhões de mortes relacionadas até 31 de março de 2022, de acordo com a OMS (36). No Brasil, o primeiro caso COVID-19 foi notificado em 26 de fevereiro na cidade de São Paulo. O Brasil é o terceiro país mais afetado em número de casos absolutos com mais de 29,9 milhões de casos confirmados e o segundo em números de mortes, com cerca de 660 mil mortes (36). A primeira onda da pandemia de COVID- 19 no Brasil ocorreu de março a outubro de 2020, com a segunda onda iniciada em novembro de 2020 (12) (figura 4).
Fonte: (37)
Figura 4. Novos casos COVID-19 confirmados diariamente
Após a primeira onda epidêmica houve uma certa contenção da pandemia causada pelo SARS-CoV-2 em vários continentes. No entanto, alguns países europeus e asiáticos tiveram um ressurgimento da COVID-19 consistente com uma grande parte da população que ainda estava suscetível ao vírus (38). No Brasil o aumento abrupto no número de internações hospitalares COVID-19 em Manaus durante janeiro de 2021 acompanhado do surgimento da nova variante de interesse (Gama) deu início a segunda onda epidêmica (39).
O surgimento de novas variantes de SARS-CoV-2 geralmente está atrelado a um aumento dos casos de COVID-19 na população, além da Gama, outras duas variantes de preocupação surgiram e rapidamente se disseminaram no mundo (40).
A variante B.1 617.2 (Delta) foi descoberta na Índia e se expandiu rapidamente por todo o mundo. No Brasil, a variante delta foi detectada pela primeira vez em junho de 2021 na cidade do Rio de Janeiro e se tornou predominante no estado de São Paulo a partir de agosto de 2021, causando um impacto no aumento do número de casos em São Paulo (41, 42).
Recentemente, uma nova variante de preocupação do SARS-CoV-2 foi relatada na África do Sul em 26 de novembro de 2021 e foi denominada de B.1.1.529 (Ômicron) (43).
No Brasil o surgimento da variante Omicron tem sido acompanhada de um aumento progressivo na transmissão e de casos positivos para COVID-19 (44).
Comparando a Ômicron com as demais variantes de SARS-CoV-2 (Gama e Delta) observa-se que essa variante alcançou 100% dos casos positivos em um menor intervalo de tempo, substituindo rapidamente a variante Delta em todo o Brasil (44).
Atualmente o boletim epidemiológico especial de número 105 refere que durante a semana epidemiológica (SE) 11 (13/03 a 19/03/22) observou-se uma redução de 16% de novos casos de COVID-19 na região sudeste em relação a SE 10.
No Estado de São Paulo também nota-se uma redução no número de casos novos (- 19%) e nos novos óbitos registrados (-30%) em relação a SE 10 (45).
1.5 Estudos soroepidemiológicos
No primeiro ano da pandemia de COVID-19 diversos estudos de soroprevalência foram realizados pelo mundo, estudos feitos antes do início da vacinação foram em sua maioria realizados em profissionais de saúde e pacientes voluntários (46).
Grandes estudos sorológicos de base populacional foram realizados nesse primeiro momento da pandemia, com o objetivo de analisar a prevalência de anticorpos pós infecção em grandes cidades do mundo. Na Espanha por exemplo, um grande estudo feito entre 27 de abril a 11 de maio de 2020 recrutou 61.075 participantes e revelou uma prevalência anticórpica de 4,6% por meio de imunoensaios (47). Esse tipo de inquérito foi feito no Brasil em 133 cidades sentinelas de todos os estados brasileiros. Foram incluídos 25.025 participantes na primeira coleta (14 a 21 de maio) e 31.165 na segunda (4 a 7 de junho), revelando uma soroprevalência de 1,9% e 3,1% respectivamente (48).
Outros estudos de soroprevalência realizados na cidade de São Paulo em um período anterior ao início da vacinação revelaram frequências que variaram de 6% a 32% em pessoas previamente infectadas pela COVID-19 (49-51). Em São Paulo um dos primeiros trabalhos estimou uma soroprevalência de 6% anticorpos para SARS- CoV-2 em adultos entre os 6 bairros inicialmente mais afetados pela pandemia (49).
Após esse primeiro levantamento, vem sendo realizado um estudo coordenado pelo grupo Fleury - SoroEpi MSP – que objetiva monitorar a prevalência da infecção por SARS-CoV-2 no município de São Paulo. O estudo atualmente conta com 7 fases de coleta e inclusão de participantes, sendo a fase 1 iniciada em 4 de maio de 2020 e
a fase 7 em 9 de setembro de 2021 (52). Os resultados da prevalência anticórpica na população adulta da cidade de São Paulo em cada fase pode ser observada no quadro 1.
Quadro 1 – Soroprevalência de anticorpos anti-SARS-CoV-2 na população adulta da cidade de São Paulo de acordo com o estudo SoroEpi MSP.
Fases Período de coleta Ano Soroprevalência
1 4 a 12 de maio 2020 4,7%
2 14 a 24 de junho 2020 11,4%
3 20 a 29 de julho 2020 17,9%
4 1 a 10 de outubro 2020 26,2%
5 14 a 23 de janeiro 2021 29,9%
6 22 de abril a 1 de maio 2021 41,6%
7 9 a 20 de setembro 2021 52,8%
Durante o período de 4 de maio de 2020 a 20 de setembro de 2021, alguns fatores como; o começo de uma nova onda epidêmica de COVID-19, o início da vacinação no Brasil e o surgimento de testes sorológicos mais sensíveis, devem ser levados em consideração.
1.6 Aspectos clínicos e diagnóstico laboratorial da infecção por SARS-CoV-2 O SARS-CoV-2 infecta indivíduos de todas as faixas etárias, em geral, os idosos são mais suscetíveis a COVID-19 e têm maior probabilidade de apresentar um quadro grave da doença, isso pode ser devido a imunossenescencia e maior chance de comorbidades nessa população (53). Os primeiros estudos a relatarem as características clínicas dos pacientes infectados mostraram que muitos pacientes apresentavam doenças de base, incluindo doença cardiovascular, diabetes, hipertensão e doença pulmonar obstrutiva crônica (54, 55).
Os sinais e sintomas da COVID-19 são inespecíficos e o quadro clínico da doença pode variar de pessoa para pessoa, desde a ausência de sintomas à pneumonia grave, e morte (56). Os sintomas da COVID-19 geralmente aparecem entre 2 a 14 dias após a infecção e conforme as recomendações do Ministério da Saúde, as definições de caso suspeito são: indivíduo com quadro respiratório agudo, caracterizado por sensação febril ou febre, acompanhada de tosse ou dor de garganta ou coriza ou dispneia/desconforto respiratório ou pressão persistente no tórax ou saturação de oxigênio menor que 95% em ar ambiente ou coloração azulada dos lábios ou rosto (57).
Segundo o Ministério da Saúde os fatores de risco associados a um agravamento da COVID-19 são tabagismo, obesidade, doenças cardíacas, doenças pulmonares crônicas, imunodepressão e imunossupressão, doença renal em estágio avançado, diabetes mellitus, doenças cromossômicas que causam fragilidade imunológica, câncer, algumas doenças hematológicas e gravidez. Em pacientes imunocomprometidos, o vírus parece ser adquirido na mesma frequência que em indivíduos imunocompetentes, mas estão associados a infecções prolongadas e maior mortalidade (58).
Os testes para COVID-19 disponíveis comercialmente se enquadram atualmente em duas categorias principais. A primeira categoria inclui ensaios moleculares para detecção do RNA viral usando técnicas baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR). A segunda categoria inclui ensaios sorológicos e imunológicos que se baseiam amplamente na detecção de anticorpos produzidos por indivíduos como resultado da exposição ao vírus ou anteriormente vacinados, ou na detecção de proteínas antigênicas em indivíduos infectados (59).
Atualmente o teste padrão ouro para detecção do SARS-CoV-2 é a técnica de PCR em tempo real (qPCR) (60). Este teste geralmente apresenta alta especificidade e sensibilidade, e tempo de execução bastante reduzido, mas requer uma infraestrutura laboratorial com equipamentos e reagentes de custo elevado e pessoal treinado.
No método de qPCR, a fluorescência é medida após cada ciclo e a intensidade do sinal fluorescente reflete a quantidade de ácido nucleico naquele momento específico. Portanto, qPCR também pode fornecer resultados semiquantitativos de acordo com uma curva de calibração construída de amostras padrão diluídas em série (geralmente diluições decimais) com concentrações conhecidas (60).
Na maioria dos indivíduos com infecção sintomática por COVID-19, o RNA viral no esfregaço nasofaríngeo medido pelo limiar do ciclo (Ct) torna-se detectável já no 1° dia dos sintomas. O Ct é o número de ciclos de replicação necessários para produzir um sinal fluorescente, com valores de Ct mais baixos representando cargas de RNA viral mais altas. Um valor Ct inferior a 40 é clinicamente relatado como PCR positivo. Essa positividade começa a diminuir na semana 3 e, subsequentemente, torna-se indetectável (61).
Os testes de antígeno são eficazes na fase aguda da doença e podem detectar as proteínas virais do SARS-CoV-2 em vários tipos de amostras. Algumas das
vantagens do uso desse teste são a rápida resposta que pode ser visualizada em equipamentos pequenos e portáteis, não sendo necessário materiais e equipe altamente especializados para a aplicação dos testes. No entanto embora muito específicos, geralmente ocorre uma perda na sensibilidade quando comparado a métodos moleculares (62).
Os testes sorológicos podem ser uma ferramenta útil para auxiliar o diagnóstico em alguns casos específicos e podem ter um papel importante na identificação da exposição da população ao vírus, visto que alguns indivíduos apresentam um quadro sintomático leve ou inexistente, além de serem uma alternativa menos onerosa do que os métodos moleculares (63).
A pesquisa de anticorpos é especialmente importante para a compreensão da epidemia na comunidade, identificando aqueles indivíduos que adquiriram imunidade (64). Na fase pré-vacinal foi proposto a utilização de testes sorológicos como ferramenta para o diagnóstico da infecção prévia de COVID-19, principalmente em casos assintomáticos, contatos de indivíduos positivos e quando não era possível a realização de testes moleculares (64).
1.7 Resposta Imune do Hospedeiro após a Infecção pelo SARS-CoV-2
Após a infecção por SARS-CoV-2, tanto o sistema imune inato quanto o adaptativo do hospedeiro respondem à infecção. As respostas imunes adaptativas são específicas ao agente, porém mais lentas do que as respostas inatas (65). A resposta Imune adaptativa, composta pelas células B, T CD4 + e T CD8 + possuem papéis diferentes em diversas infecções virais. Embora mais estudos sejam necessários, compreende-se hoje que essa resposta contribui para o controle do SARS-CoV-2, seja em casos leves ou de hospitalização pela COVID-19 (66).
A resposta imune adaptativa é importante na eliminação viral e na memória imunológica de longa duração que visa proteger o hospedeiro da reinfecção por SARS-CoV-2 (67).Em uma infecção por SARS-CoV-2, o vírus é particularmente eficaz em evitar ou retardar o desencadeamento de respostas imunes inatas intracelulares, sendo assim capaz de se replicar sem nenhuma interferência até que as respostas imunes adaptativas sejam iniciadas (68).
Na maior parte dos casos de COVID-19, um atraso temporal nas respostas imunes inatas é suficiente para resultar em infecção assintomática ou doença clinicamente leve, isso acontece porque as respostas das células T e dos anticorpos
ocorrem de forma relativamente rápida e controlam a infecção (69). Estudos de pacientes com COVID-19 agudos e convalescentes observaram que as respostas de células T específicas para SARS-CoV-2 estão significativamente associadas a doenças mais leves (70-73)
Na ausência de uma resposta imune adaptativa, ou ainda se essa resposta começar tardiamente é plausível que o sistema imune inato tente preencher a falta das células T e B, tentando controlar o vírus através de uma resposta imune exacerbada, resultando em uma imunopatologia pulmonar agressiva (66). Isto consiste com a observação elevada de citocinas, químiocinas e neutrófilos no sangue e nos pulmões de pacientes em estágio final grave pela COVID-19 (74-76).
As células B de memória fornecem um mecanismo adicional para a manutenção durável da imunidade humoral.Os anticorpos que se ligam às proteínas virais, mas não neutralizam o SARS-CoV-2, contribuem para o controle imunológico da infecção por meio do aumento da depuração do vírus livre ou direcionando as células infectadas para a depuração imunológica (77).
Após o contato com o SARS-CoV-2, a produção de anticorpos pode ser identificada uma semana após o início dos sintomas e a soroconversão completa pode levar de 2 a 3 semanas (78) (Figura 5). Os anticorpos IgM começam a ser detectados em torno de 5 a 10 dias após o início dos sintomas e aumentam rapidamente (79). As concentrações de anticorpos IgG acompanham a resposta IgM (80). Há evidências de que estes anticorpos se mantêm presentes no sangue por cerca de um mês e depois decaem rapidamente, o que gera dúvidas quanto a durabilidade da resposta imune humoral, visto que a resposta anticórpica contra outros coronavírus é variável e transitória (81).
Os anticorpos neutralizantes são capazes de se ligar ao vírus e bloquear diretamente sua capacidade de infectar as células. Acredita-se que os anticorpos neutralizantes tenham um papel crucial na limitação da replicação viral dentro do hospedeiro, bem como o potencial de neutralizar o vírus no ponto de entrada antes que a infecção das células hospedeiras possa ocorrer (82).
Fonte: (61), adaptado de Sethuraman, et al.
Figura 5. Variação estimada ao longo do tempo em testes de diagnóstico para detecção do SARS-CoV-2 em relação ao início dos sintomas
A relação entre anticorpos neutralizantes e gravidade da doença COVID-19 parece ser complexa. Em geral, e em vários modelos animais, uma carga de antígeno mais alta leva a títulos de anticorpos mais altos. Isso parece ser verdadeiro no caso do SARS-CoV-2, onde os títulos de anticorpos neutralizantes se correlacionaram positivamente com a gravidade da doença COVID-19 em grandes estudos de coorte (83, 84).
1.8 Resposta Imune do Hospedeiro após a vacinação para SARS-CoV-2
Desde o início da pandemia de COVID-19, muitos esforços tem sido direcionados para o desenvolvimento de vacinas capazes de controlar a propagação viral. Atualmente, 3 plataformas principais de vacinas contra SARS-CoV-2 estão em uso: 1) vacinas de vírus inativado; 2) vacinas de vetor viral e 3) vacinas de ácido nucleico (85).
As vacinas inativadas são um método tradicional de fabricação de vacinas que são purificadas a partir de células infectadas por vírus, em geral, são usadas como vacinas de primeira geração pois, dessa forma, é mais fácil gerar anticorpos para todas as proteínas estruturais (86). A partir do momento em que os epítopos neutralizantes são identificados, as vacinas de vírus inativado podem ser substituídas por vacinas baseadas em fragmentos contendo esses epítopos, pois são mais seguras e eficazes (86).
Os vetores virais são considerados ferramentas potenciais para terapia gênica e vacinas. Sua utilidade é baseada na capacidade dos vírus de infectar células e
induzirem respostas imunes robustas capazes de aumentar a imunidade humoral e celular (87). As vacinas baseadas em mRNAs têm perfis de segurança favoráveis, pois o vírus não precisa ser manuseado durante a fabricação. O mRNA não tem risco de mutagênese insercional porque não precisa entrar no núcleo celular para expressar o antígeno (85).
As vacinas podem induzir a produção de anticorpos neutralizantes, reduzindo assim a gravidade da doença e duração da disseminação do vírus nas vias aéreas superiores, limitando sua transmissão (88). Os primeiros resultados pré-clínicos demonstraram que há uma correlação razoavelmente boa entre a resposta anti-RBD- IgG e os títulos de anticorpos neutralizantes. As vacinas baseadas em vetores virais e mRNA obtêm títulos neutralizantes que são comparáveis ou significativamente mais altos que os títulos mensurados após o fim de uma infecção natural por COVID-19 (89).
Uma análise preliminar de um ensaio clínico de fase 3 realizado no Chile com CoronaVac, revelou que a vacina é capaz de induzir uma resposta imune humoral e celular em ambas as faixas etárias avaliadas (18 a 59 e ≥60 anos). As taxas de soroconversão para domínio específico de ligação ao receptor S1 (RBD) imunoglobulina G (IgG) foram 82,22% e 84,44% na faixa etária de 18 a 59 anos e 62,69% e 70,37% na faixa etária ≥60 anos, 2 e 4 semanas após a segunda dose, respectivamente. Um aumento significativo nos anticorpos neutralizantes circulantes foi detectado 2 e 4 semanas após a segunda dose (90).
A vacina ChAdOx1 nCoV-19 induziu uma resposta específica de anticorpos à glicoproteína S de SARS-CoV-2 e RBD em 28 dias após uma dose única em todas as faixas etárias, incluindo adultos com 70 anos ou mais. Demonstrou-se que em 28 dias após a aplicação da segunda dose os títulos de anticorpos observados foram semelhantes em todos os grupos de duas doses, independentemente da idade ou da dose da vacina. A resposta de anticorpos neutralizantes e de células T foi observada 14 dias após a dose de reforço (91).
Resultados de imunogenicidade da vacina de RNAm BNT162b2 demostraram que o imunizante induz uma ampla resposta imune com anticorpos neutralizantes específicos para SARS-CoV-2 anti-S e células T CD4 + e CD8 + poli específicas. A vacina BNT162b2 estimulou fortes respostas de anticorpos uma semana após o reforço, considerando que os títulos de neutralização estavam até 3,3 vezes acima dos observados em amostras de indivíduos que se recuperaram do COVID-19 (92).
1.9 Testes sorológicos
O teste sorológico é definido como uma análise de soro ou plasma sanguíneo e foi expandido operacionalmente para incluir testes de saliva, expectoração e outros fluidos biológicos para a presença de anticorpos, como os da classe da imunoglobulina A (IgA), imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) (59). Esses ensaios desempenham um papel importante na epidemiologia comunitária e no desenvolvimento de vacinas, fornecendo uma avaliação da trajetória anticórpica a curto prazo (dias a semanas) e a longo prazo (anos ou permanência), bem como identifica os indivíduos que podem ser potenciais doadores de plasma convalescentes (93).
Numerosos imunoensaios sorológicos foram desenvolvidos para a detecção de proteínas virais e/ou anticorpos em soro ou plasma humano. Os anticorpos IgM e IgG são os biomarcadores que foram amplamente usados para a detecção de infecção prévia por SARS-CoV-2 em imunoensaios comerciais em um momento de escassez dos testes moleculares (94). A metodologia para essas determinações inclui o ensaio imunoenzimático tradicional (ELISA), ensaio de fluxo lateral imunocromatográfico, ensaio de neutralização e quimiossensores específicos. Cada um desses formatos apresenta vantagens (velocidade, multiplexação, automação) e desvantagens (pessoal treinado, laboratórios dedicados) (59).
Os imunoensaios de fluxo lateral são testes cromatográficos qualitativos que não requerem equipe técnica especializada, possuem um menor custo, apresentam um resultado rápido e podem ser realizados em grande escala. Na prática, as amostras de fluido são aplicadas a um material de substrato que permite que a amostra flua através da ação da capilaridade, havendo a presença de anticorpos, estes se ligam aos antígenos virais que por sua vez estão impregnados com nanopartículas de ouro ou outros corantes, gerando assim mudança de coloração em faixas do teste (59).
Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) são baseados em placa de micro poços projetada para detecção e quantificação de substâncias como peptídeos, proteínas, anticorpos e hormônios. Se presentes nas amostras clínicas, os anticorpos se ligarão especificamente formando um complexo anticorpo-proteína que pode ser detectado através de uma leitura colorimétrica ou baseada em fluorescência. Em geral possuem sensibilidade variada, porém maior que a dos testes rápidos (59).
Os imunoensaios luminescentes em geral, apresentam as mesmas etapas que o teste de ELISA e compreendem métodos que diminuem os limites de detecção para reagentes baseados em anticorpos. Geralmente eles envolvem quimioluminescência e fluorescência e por este motivo podem ser considerados testes mais rápidos e sensíveis (59).
Os ensaios de neutralização determinam a capacidade de um anticorpo para inibir a infecção. O teste de neutralização em placa (PRNT – Plaque Reduction Neutralization Test) avalia a resposta e a capacidade destes anticorpos neutralizarem a replicação viral em cultura de células. Em razão da necessidade de profissionais especializados e laboratório de biossegurança nível 3, trata-se de um teste de difícil execução sendo predominantemente realizado em laboratórios de pesquisa (95).
Os ensaios sorológicos para detectar anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro ou plasma de pacientes foram desenvolvidos por uma variedade de empresas comerciais e institutos de pesquisa até o momento, esses imunoensaios têm como alvo principal as proteínas imunogênicas do coronavírus: a proteína S, que é a proteína viral mais exposta, e a proteína N, que é abundantemente expressa durante a infecção, ambas associadas à atividade neutralizante (96).
Os testes sorológicos, aplicados na situação certa para que as medidas adequadas de saúde pública sejam implementadas, podem fazer uma diferença significativa durante o curso de uma pandemia (97). Um estudo que investigou e comparou imunoensaios com diferentes configurações de design contra a subunidade S1, proteína RBD e antígeno N, e um ensaio de anticorpo neutralizante viral revelou uma excelente especificidade para todos os ensaios testados e que os imunoensaios projetados com proteína Spike superaram os que possuíam nucleocapsídeo como alvo (98).
Para avaliar a resposta sorológica vacinal, a maioria dos ensaios objetivam a pesquisa de anticorpos neutralizantes para a porção S1 (RBD), pois a maior parte das vacinas atualmente administradas possuem a proteína S como alvo imunogênico devido a sua característica funcional importante que medeia a infecciosidade viral nas células humanas (99).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Verificar o status sorológico para a proteína Spike do SARS-COV-2 em pacientes ambulatoriais e hospitalizados atendidos em um Hospital Terciário Universitário durante a pandemia de COVID- 19 na cidade de São Paulo.
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar as características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com sorologia reagente para SARS-CoV-2 atendidos em um hospital universitário na cidade de São Paulo;
• Avaliar a titulação de anticorpos IgG em amostras de soro reagentes;
• Correlacionar título de anticorpos com idade, gravidade da doença e desfecho clínico em amostras pacientes hospitalizados.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Aspectos éticosO projeto intitulado “Inquérito Sorológico de SARS-CoV-2 em pacientes atendidos em um hospital universitário na cidade de São Paulo”, foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo de acordo com o parecer: 4.515.759, conforme consta no anexo 2 e 3.
3.2 Tipo de estudo, local e tempo da pesquisa
Este estudo inclui três inquéritos sorológicos realizados durante a pandemia de COVID-19 na cidade de São Paulo em pacientes atendidos no hospital São Paulo, conforme descritos abaixo.
3.2.1 Estudo transversal: Pacientes ambulatoriais
Trata-se de um estudo que contempla um inquerito epidemiologico transversal em amostras de soro armazenadas na soroteca do Laboratório Central, de pacientes ambulatoriais. Foram examinadas 1085 amostras de soro de pacientes de ambos os sexos, cuja idades variaram de 0 a 97 anos, atendidos nos ambulatórios do Hospital São Paulo diagnosticados com alguma comorbidade, de novembro de 2020 a janeiro de 2021.
Figura 6. Fluxograma do grupo de pacientes ambulatoriais e testes realizados
3.2.2 Estudo transversal: Pacientes hospitalizados
Trata-se de um inquérito sorológico em pacientes hospitalizados com ou sem infeccao por SARS-CoV-2 documentada laboratorialmente atendidos durante o período de março de 2021 a maio de 2021. Foram examinadas 1015 amostras de soro de pacientes hospitalizados de ambos os sexos, cuja idades variaram de 0 a 100 anos, com ou sem suspeita clínica cuja amostras de swab foram encaminhadas ao laboratório de virologia clínica para a realização do teste de RT-PCR para SARS-CoV- 2.
Figura 7. Fluxograma do grupo de pacientes hospitalizados (estudo transversal) e testes realizados
3.2.3 Estudo prospectivo: Pacientes hospitalizados com COVID-19
Trata-se de uma avaliação prospectiva da dinamica de producao de anticorpos de pacientes hospitalizados com COVID-19. Foram incluídas amostras de soro de 104 pacientes internados no Hospital São Paulo com PCR positivo para SARS-CoV-2, de junho a julho de 2021. As amostras foram coletadas diariamente a partir da detecção positiva no PCR realizado no laboratório de virologia clínica. A partir dos critérios de exclusão estabelecidos para essa análise, restaram 25 pacientes com um total de 625 amostras (figura 6).
Figura 8. Fluxograma do grupo de pacientes hospitalizados com COVID-19 (estudo prospectivo) e testes realizados
3.3 Critérios de inclusão e exclusão
No estudo tranversal de pacientes ambulatoriais foi definido como critério de inclusão pacientes que passaram por consulta em algum ambulatório do HSP que por conveniencia coletaram uma amostra de sangue que vieram a ser estocadas na soroteca do laboratório central após as análises de rotina.
No estudo tranversal de pacientes hospitalizados foi definido como critério de inclusão um teste de RT-PCR para SARS-CoV-2, independente do resultado.
No estudo prospectivo de pacientes hospitalizados foi definido como critério de inclusão um teste positivo de RT-PCR para SARS-CoV-2 para o acompanhamento sorológico. Neste estudo também foi definido como critério de exclusão pacientes que possuíam menos 10 amostras de soro coletadas e que não possuíam informação acerca da vacinação para COVID-19.
Figura 9. Critérios de exclusão do estudo prospectivo.
3.4 Amostras
Foram avaliadas amostras de soro de pacientes atendidos no Hospital São Paulo, durante o período de novembro de 2020 a julho de 2021, provenientes do descarte dos biorrepositórios do setor de bioquímica do Laboratório Central do Hospital São Paulo, da Universidade Federal de São Paulo. As amostras foram transportadas em compartimentos próprios para o transporte de material biológico, devidamente identificado e refrigerado da soroteca do Laboratório Central até o Laboratório de Virologia Clínica, onde foram realizados os ensaios sorológicos. Após a realização dos testes essas amostras foram armazenadas em freezers -80 C° por um período de até 10 anos no Laboratório de Virologia Clínica.
3.5 Levantamento de dados nos prontuários
Dados clínicos dos pacientes como; sexo, idade, desfecho clínico, outras doenças e comorbidades, ambulatório de acompanhamento e informação de vacinação contra COVID-19 foram obtidos através das fichas de prontuário médico
quando disponível. A coleta de sangue de pacientes hospitalizados para o estudo prospectivo eram checadas diariamente no sistema de prontuário online através do código que o paciente recebe ao ser internado no hospital, se a coleta era realizada, a amostra era depositada na soroteca no laboratório central no fim do dia, onde era feita a retirada do material biológico para este estudo.
3.6 Teste de detecção de anticorpos por Quimioluminescência (CLIA) Os testes foram feitos para identificar e quantificar o anticorpo IgG, com os kits ACCESS SARS-CoV-2 IgG/IgG para SARS-CoV-2 (qualitativo) e ACCESS SARS- CoV-2 IgG 1st IS (quantitativo) (Beckman Coulter®), realizado no aparelho Access 2 (Beckman Coulter®). Trata-se de um imunoensaio quimioluminescente com particulas paramagnéticas capazes de detectar anticorpos da classe IgG contra a porção RBD da proteina S, no qual a produção de luz gerada durante a reação é proporcional a quantidade de anticorpos presentes na amostra. O processamento das amostras e interpretação dos resultados foram feitos de acordo com as instruções dos fabricantes, sendo consideradas amostras reagentes aquelas cujas detecções foram maiores ou iguais a 1.0 S/CO no ensaio qualitativo e 30 UI/ml no ensaio quantitativo (100).
Figura 10. Etapas do teste quimioluminescente.
3.7 Análise estatística
A análise estatística foi realizada feita através de softwares específicos, com a realização do testeexato de Fisher para variáveis categóricas, Anova, Kruskal-Wallis e Mann-Whitney para comparação dos valores de variáveis numéricas, com nível de significância de p<0,05, com intervalo de confiança (IC) de 95% para os parâmetros preditivos de sensibilidade e especificidade.
4 RESULTADOS
4.1 Estudo transversal: Pacientes ambulatoriais
4.1.1 Distribuição dos pacientes ambulatoriais
Os pacientes incluídos apresentavam idades de 0 a 97 anos, com média de 53,6 (± 20,1) e mediana igual a 58 anos, encontrando-se, a maioria, a partir dos 50 anos de idade (66,8%). A proporção do sexo feminino foi ligeiramente maior (58,8%).
Os ambulatórios de Reumatologia (17,8%), Hematologia (16,9%), Cardiologia (15,7%) e Oncologia (14,1%) contribuíram com a maioria dos pacientes.
4.1.2 Perfil dos pacientes Anti-SARS-CoV-2 IgG reagentes
Anticorpos anti-SARS-CoV-2 IgG foram detectados em 16,2% (176/1085) dos soros. Os pacientes apresentaram idade variando de 0 a 85 anos de idade, com média de 51,0 ± 18,5 e mediana igual a 55 anos. As frequências de anti-SARS-CoV-2 IgG foram menores nas faixas etárias de 20 a 29 anos (7,0 %) e em idosos acima de 80 anos (5,1%). Houve pouca variação nas demais faixas etárias (10,7% a 22,2%) (tabela 1). 63,6% (112/176) dos pacientes tinham mais de 50 anos de idade. A proporção de mulheres foi ligeiramente maior (59,6%).
Tabela 1 – Frequência de anti-SARS-CoV-2 em pacientes ambulatoriais segundo faixa etária, Hospital São Paulo, SP, Brasil.
Faixa etária Total Anti-SARS-CoV-2 IgG
N % P-value OR IC
≤10 45 9 20,0 *0,0281 4,6 1,1 a 18,0
11-19 49 9 18,4 *0,035 4,2 1,0 a 16,5
20-29 72 5 7,0 0,7293 1,3 0,3 a 6,0
30-39 81 18 22,2 **0,0038 5,6 1,5 a 20,0
40-49 114 23 20,2 **0,0073 4,7 1,3 a 16,4
50-59 220 45 20,5 **0,0035 4,8 1,4 a 16,0
60-69 268 45 16,8 *0,0238 3,7 1,1 a 12,5
70-79 177 19 10,7 0,3002 2,2 0,6 a 7,8
≥ 80 59 3 5,1 Ref. Ref. Ref.
Total 1085 176 16,2
N: Amostras positivas; %: Frequência; OR: Odds Ratio; IC: Intervalo de confiança; Ref.: Referência.
* P foi calculado usando teste exato de Fisher
4.1.3 Frequência de comorbidades dos indivíduos sororreagentes
A maior parcela dos indivíduos sororreagentes fazia parte dos ambulatórios de hematologia (14,2%; 25/176), cardiologia (13,1%; 23/176) e infectologia (12,5%;
22/176) (tabela 2). A frequência de anti-SARS-CoV-2 IgG foi maior nos pacientes nefropatas, pneumopatas e pacientes do ambulatório de infectologia, e foi menor em pacientes geriátricos (tabela 2). Foram avaliados a presença de diabetes, obesidade e hipertensão arterial sistêmica (HAS) em todos os pacientes IgG positivos (176/1085). 46,% dos individuos possuiam diagnóstico de hipertensão arterial sistêmica. 64,2% dos individuos possuiam 2 ou mais comorbidades (tabela 3).
Tabela 2 - Frequência de anti-SARS-CoV-2 IgG segundo ambulatório de atendimento, Hospital São Paulo, SP, Brasil.
Ambulatório Pacientes
Total N % P-value OR IC
Nefrologia 16 6 37,5 *0,0167 8,1 1,3 a 46,9
Infectologia 82 22 26,8 *0,0339 4,9 1,0 a 22,5
Pneumologia 19 5 26,3 0,0967 4,8 0,8 a 28,1
Gastroclínica 75 18 24,0 0,0547 4,2 0,9 a 19,7
Endocrinologia 57 10 17,5 0,323 2,8 0,5 a 14,0
Reumatologia 193 33 17,1 0,271 2,7 0,6 a 12,2
Diabetes 60 10 16,7 0,3232 2,7 0,5 a 13,2
Hematologia 183 25 13,6 0,5467 2,1 0,4 a 9,5
Cardiologia 170 23 13,5 0,3871 2,4 0,5 a 11,0
Oncologia 153 18 11,8 0,7454 1,8 0,3 a 8,2
Neurologia 23 2 8,7 1,0000 1,2 0,1 a 9,9
Diálise Pediátrica 25 2 8,0 1,0000 1,1 0,1 a 9,0
Geriatria e Gerontologia 29 2 6,9 Ref. Ref. Ref.
Total 1085 176 16,2
N: Amostras positivas; %: Frequência; OR: Odds Ratio; CI: Intervalo de confiança; Ref.: Referência.
* P foi calculado usando teste exato de Fisher
Tabela 3 − Distribuição dos pacientes IgG positivos, segundo comorbidades, Hospital São Paulo, SP, Brasil.
Comorbidade N = 176 %
Diabetes 52 29,5
Obesidade 46 26,1
Hipertensão Arterial 81 46,0
2 ou mais comorbidades 113 64,2
3 ou mais comorbidades 49 27,8
N: Amostras positivas; %: Frequência.
4.1.4 Título de anticorpos IgG dos indivíduos sororreagentes
Foi possível realizar a titulação de anticorpos IgG anti-RBD em 100% das amostras reagentes no ensaio qualitativo. Os títulos variaram de 30.42 a 10686.56 BAU/mL. A mediana dos títulos de anticorpos por faixa etária variou de 63.39 à 248.40 em crianças menores de 10 anos e idosos acima de 80 anos, respectivamente (figura 11). Não houve diferença estatística entre os títulos de anticorpos por faixa etária (p = 0,2475). Os valores de BAU/ml foram transformados em LOG/ml para facilitar a representação gráfica.
F a ix a e t á r i a
Quantificação deanticorpos IgG anti-RBD (Log/mL)
< 1 0 1 1 -1 9 2 0 -2 9 3 0 -3 9 4 0 -4 9 5 0 -5 9 6 0 -6 9 7 0 -7 9 > 8 0
0 1 2 3 4 5
N = 9 N = 9 N = 5 N = 1 8 N = 2 3 N = 4 5 N = 4 5 N = 1 9 N = 3
Figura 11. Representação gráfica dos títulos de anticorpos por faixa etária de pacientes ambulatoriais. A linha tracejada representa o ponto de corte para a amostra ser considerada reagente (30.00 BAU/ml ou 1,48 LOG/mL) e a linha pontilhada representa o ponto de corte onde os títulos atingem 500 BAU/mL ou 2.71 LOG/ml. As barras inferior e superior indicam os percentis 25% e 75%, respectivamente. A barra horizontal indica o valor mediano. N representa o número de pacientes.
4.2 Estudo Transversal: Pacientes hospitalizados
4.2.1 Distribuição dos pacientes hospitalizados
As idades variaram de 0 a 100 anos, com média de 49,5 ± 23,2 e mediana igual a 54 anos. A proporção de homens e mulheres foi semelhante, embora um pouco maior a frequência do sexo masculino (54,2%), bem como a proporção de casos sintomáticos suspeitos de COVID- 19 (50,5%) e assintomáticos (49,5%) (figura 12).
Em relação ao teste de RT- qPCR, 26,4% (135/512) dos pacientes sintomáticos apresentaram um teste molecular positivo enquanto que apenas 4,3% (22/503) dos assintomáticos tinham um teste reagente. A maior parte dos pacientes sintomáticos e assintomáticos possuíam PCR negativo para SARS-CoV-2 e destes 12,5% e 43,0%
apresentaram anticorpos IgG respectivamente. 6,4% (65/1015) dos pacientes evoluíram a óbito.
Figura 12. Representação esquemática da frequência de anticorpos em pacientes hospitalizados. De acordo com a presença ou ausência de sintomas, resultados de RT- qPCR, presença de anticorpos e desfecho clínico.
