UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA
Alessandra Guedes Manzoni
EFEITO DA RUTINA E DA CURCUMINA EM MARCADORES
INFLAMATÓRIOS E OXIDATIVOS EM MODELO EXPERIMENTAL
DE HIPERLIPIDEMIA
Santa Maria, RS
2019
Alessandra Guedes Manzoni
EFEITO DA RUTINA E DA CURCUMINA EM MARCADORES INFLAMATÓRIOS E OXIDATIVOS EM MODELO EXPERIMENTAL DE
HIPERLIPIDEMIA
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Daniela Bitencourt Rosa Leal
Santa Maria, RS 2019
Alessandra Guedes Manzoni
EFEITO DA RUTINA E DA CURCUMINA EM MARCADORES INFLAMATÓRIOS E OXIDATIVOS EM MODELO EXPERIMENTAL DE
HIPERLIPIDEMIA
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica.
Aprovado em 28 de fevereiro de 2019:
______________________________________ Dra. Daniela Bitencourt Rosa Leal, (UFSM) (Presidente/Orientador)
_____________________________________
Dra. Marina Prigol, (UNIPAMPA) (Parecer)
___________________________________
Dra. Maria Rosa Chitolina (UFSM)
Santa Maria, RS 2019
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha familia em especial aos meus pais Betânia e Gilnei, à meu irmão Alexandre e ao meu namorado Nícolas.
Vocês são a força e os motivos que me fazem querer ser sempre melhor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente á minha família, pelo apoio e amor incondicional, em especial aos meus pais e meu irmão. Obrigada por acreditarem em mim, pelos valores a mim ensinados e por me mostrarem que a família é o maior porto seguro de alguém. É graças á voces que minhas conquistas se tornam possiveis.
Ao meu namorado Nícolas Krüger, pelo apoio e incentivo. Obrigada por estar sempre ao meu lado.
À minha orientadora Daniela Bitencourt Rosa Leal, pela oportunidade e confiança. Obrigada pelos ensinamentos, atenção e orientação.
Aos meus colegas e amigos do LABIBIO ,obrigada pela companhia, pelos ensinamentos compartilhados e por fazerem parte desta caminhada. Meu agradecimento especial aos colegas que tornaram esse experimento possível: Jean Gutknecht, Matheus Jantsch, Joao Matheus Bremm, Viviane Martins Bernardes, Jossiele Leitemperger, Tamiris Storck, Thais Mann, Juliana de Oliveira.
À minha amiga Daniela Passos, pela dedicação em ajudar a todos sempre, muito obrigada pelo carinho, pelos ensinamentos, por todo o apoio que me deu durante este periodo.
Aos professores que tornaram esse projeto possível: Vania Loro e Cinthia de Andrade, pela atenção e auxílio prestados.
Aos professores e funcionários do Departamento de Microbiologia e Parasitologia e do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica da UFSM, pelos ensinamentos e assistência prestados.
À banca examinadora, por aceitarem o convite e pelas contribuições que farão a este trabalho.
Aos meus filhos de quatro patas Maggie e Maloy, pelo amor incondicional e apoio emocional.
A todos que colaboraram de alguma forma e contribuíram para tornar essa caminhada possível, minha gratidão e respeito. Muito obrigada!
“Se a educação sozinha não transforma a sociedade, sem ela tampouco a sociedade muda”. (Paulo Freire)
RESUMO
EFEITO DA RUTINA E DA CURCUMINA EM MARCADORES INFLAMATÓRIOS E OXIDATIVOS EM MODELO EXPERIMENTAL DE
HIPERLIPIDEMIA
AUTORA: Alessandra Guedes Manzoni
ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª Daniela Bitencourt Rosa Leal
A hiperlipidemia é caracterizada por anormalidades lipídicas que resultam em inflamação e dano oxidativo, fatores envolvidos no desenvolvimento da aterosclerose. A adenosina desaminase (ADA) e seu substrato adenosina são capazes de modular a resposta imune e inflamatória assim como o metabolismo de lipídios. A curcumina e a rutina são polifenóis com ação antioxidante, anti-inflamatória e potencial hipolipemiante. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar os marcadores inflamatórios em linfócitos, plaquetas, neutrófilos e soro e o perfil oxidativo em fígado e rim de ratos com hiperlipidemia induzida, tratados com curcumina e/ou rutina. Ratos machos Wistar adultos foram pré-tratados por gavagem com rutina e/ou curcumina durante 30 dias. A hiperlipidemia foi induzida, de forma aguda, mediante administração intraperitoneal de Poloxamer-407 (P-407). Após 36 horas os animais foram eutanasiados e o sangue foi coletado para hemograma e separação de células e soro para a avaliação da atividade das enzimas e parâmetros bioquímicos. O fígado e o rim foram coletados para avaliar os marcadores de estresse oxidativos e defesas antioxidantes. A indução com P-407 aumentou os níveis de colesterol total e triglicerídeos, além de causar alterações hematológicas, aumento de espécies reativas de oxigênio (EROS), da atividade da ADA e da mieloperoxidase (MPO) e de marcadores de dano oxidativo no fígado e rim, bem como a redução das defesas antioxidantes. Os pré-tratamentos previniram o aumento nos triglicerídeos, na atividade da MPO no plasma, e na atividade da ADA no soro e nas células, o aumento no estresse oxidativo no figado e rim, a redução nos níveis de lipídeos de alta densidade e nas defesas antioxidantes no fígado e rim bem como reverteram os parâmetros hematológicos. Foi demonstrado assim o efeito positivo na utilização dos pré-tratamentos curcumina e/ou rutina frente aos danos causados pela hiperlipidemia, sugerindo a sua utilização como adjuvantes que possam beneficiar pacientes com hiperlipidemia.
ABSTRACT
EFFECT OF RUTIN AND CURCUMIN IN INFLAMMATORY AND OXIDATIVE MARKERS IN EXPERIMENTAL MODEL OF HYPERLIPIDEMIA
AUTHOR: Alessandra Guedes Manzoni ORIENTER: Prof. Dr. ª Daniela Bitencourt Rosa Leal
Hyperlipidemia is characterized by lipid abnormalities that result in inflammation and oxidative damage, factors involved in the development of atherosclerosis. Adenosine and adenosine deaminase (ADA) modulate immune and inflammatory responses as well as lipid metabolism. Curcumin and rutin are polyphenols with antioxidant, anti-inflammatory, and hypolipidemic potential. Thus, the objective of this study was to evaluate the activity of ADA in lymphocytes, platelets, neutrophils, and serum and the oxidative profile in liver and kidney of rats with induced hyperlipidemia, treated with curcumin and/or rutin. Adult Wistar male rats were pre-treated by gavage with rutin and/or curcumin for 30 days. Hyperlipidemia was acutely induced by intraperitoneal administration of Poloxamer-407 (P-407). After 36 hours, the animals were euthanized, and blood was collected for hemogram and serum and cell separation to evaluate enzymatic activity and biochemical parameters. The liver and kidney were collected to evaluate oxidative stress markers and antioxidant defense. P-407 induction increased levels of total cholesterol and triglycerides, reactive oxygen species (ROS), ADA and myeloperoxidase activity (MPO), and markers of oxidative damage in the liver, reduced antioxidant defenses and caused hematological changes. The pre-treatments prevented the increase in triglycerides, plasma MPO activity, ADA activity in serum and cells, oxidative stress in the liver and kidney, prevented the reduction of high-density lipid levels and antioxidant defenses in the liver and kidney, as well as reversing hematological parameters. Thus, positive effects of curcumin and/or rutin pre-treatments on the effects of hyperlipidemia were demonstrated, suggesting that their use as adjuvants may benefit patients with hyperlipidemia.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁGICA
Figura 1 Transporte de lipídeos ... 21
Figura 2 Formação da placa aterosclerótica. ... 22
Figura 3 Mecanismo de ação do poloxamer-407... 25
Figura 4 Sistema purinérgico na superfície de uma célula imune ativada. ... 27
Figura 5 Papel das células na formação da lesão aterosclerótica. ... 29
Figura 6 Papel das plaquetas na formação do trombo...30
Figura 7 Sistema de defesa antioxidante enzimático e não enzimático...32
Figura 8 Estrutura química da curcumina... 33
Figura 9 Estrutura química da rutina. ... 34
Figura 10 Ação dos polifenóis na regulação lipídica, inflamação e estresse oxidativo. ... 35
ARTIGO Fig. 1. Adenosine deamination in the serum of hyperlipidemic rats ……….36
Fig. 2. Adenosine deamination in lymphocytes of hyperlipidemic rats………..36
Fig. 3. Adenosine deamination in platelets of hyperlipidemic rats ………36
Fig. 4. Adenosine deamination in neutrophils of hyperlipidemic rats………36
Fig. 5. Reactive oxygen species in the serum of hyperlipidemic rats………37
Fig. 6. Myeloperoxidase activity in plasma of hyperlipidemic rats………..37
MANUSCRITO Fig. 1. Protein carbonyl levels in tissues of hyperlipidemic rats……….58
Fig. 2. Lipid peroxidation in tissues of hyperlipidemic rats………..58
Fig. 3. Antioxidants enzymes activities in tissues of hyperlipidemic rats……….59
Fig. 4. Antioxidants enzymes activities in tissues of hyperlipidemic rats………..60
Fig. 5. Non-enzymatic antioxidants levels in tissues of hyperlipidemic rats………….………60
DISCUSSÃO Figura 11 Esquema geral dos resultados...67
LISTA DE TABELAS
ARTIGO
Table 1 Lipid profile after induction of hyperlipidemia in rats pretreated with rutin and/or curcumin………36 Table 2 Comparison of laboratory findings between control and hyperlipidemic groups……36 Table 3 Comparison of hematological parameters between the untreated hyperlipidemic rats and each of the pretreatments...……….37 Table 4 Correlations between the parameters………...38
MANUSCRITO
Table 1 Biochemical parameters after induction of hyperlipidemia in rats pretreated with rutin. curcumin and association of rutin and curcumin………57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACAT Acil-Coa: colesteril aciltransferase ADP Adenosina Difosfato
ALT Alanina Aminotransferase AMP Adenosina Monofosfato ANOVA Análise de Variância
AST Aspartato Aminotransferase ATP Adenosina Trifosfato CAT Catalase
CD39 NTPDase CD73 5’nucleotidase
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CETP Proteína de transferência de ésteres do colesterol CT Colesterol Total
DCs Células dendriticas DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucleico DNPH 2,4-dinitrofenil hidrazina E-ADA Ecto-adenosina desaminase EDTA Ácido Etilenodiaminotetratécito
E-NPP Ecto-nucleosídeo pirofosfatase/fosfodiesterase E-NTPDase Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase E-5-NT Ecto-5’-nucleotidase
ERN Espécies Reativas de Nitrogênio EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FACS Classificador de Células Fluorescentes Ativadas FAL Fosfatase Alcalina
GSH Glutationa
GST Glutationa S- transferase
HDL Lipoproteínas de Densidade Alta HE Hematoxilina/eosina
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HVU Hospital Veterinário Universitário
IL Interleucinas IFN Interferon
LABIBIO Laboratório de Imunobiologia Experimental e Aplicada LCAT Lecitina-colesterol aciltransferase
LDH Lactato Desidrogenase
LDL Lipoproteínas de Densidade Baixa
LDL-ox Lipoproteínas de Densidade Baixa oxidada LPL Lipase Liporoteica
LDLR Receptores de lipoproteínas de baixa densidade MDA Malondialdeído
MPO Mieloperoxidase
MHC- I Classe I do Complexo Principal de Histocompatibilidade
NO Óxido Nítrico
NPSH Tióis Não-Proteicos NKT Natural Kilers
(p-Nph-5’-TMP)p-nitrofenil-5’- timidina monofosfato OMS Organização Mundial de Saúde
P-407 Poloxamer-407
PAI-1 Fatores Endoteliais Trombóticos
SBCAL Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório SDS Dodecil Sulfato de Sódio
SOD Superóxido Dismutase
TBARS Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TG Triglicerídeo
Tregs Linfócito T regulatório
UFSM Universidade Federal de Santa Maria VLDL Lipoproteínas de Densidade Muito Baixa.
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação está subdividida em seções dispostas da seguinte maneira: Introdução, composta de uma descrição breve do contexto e relevância do estudo proposto; Revisão Bibliográfica, constituída de um embasamento teórico-científico dos principais tópicos abordados no estudo e Objetivos, composto das finalidades da pesquisa. As subdivisões Materiais e Métodos, Resultados, Discussão e Referências encontram-se nas seções “Artigo e Manuscrito”.
O artigo está publicado na revista “Blood Cells Molecules and Diseases”
O manuscrito foi submetido no dia 08 de novembro de 2018 à revista “Biomedical
Journal”.
Os itens discussão e conclusões, contêm interpretações e comentários dos resultados obtidos. Por fim, a seção Referências refere-se às citações mencionadas ao longo das seções Introdução e Revisão Bibliográfica.
INDICE APRESENTAÇÃO ... 14 1. INTRODUÇÃO ... 16 2. OBJETIVOS ... 19 2.1 Objetivo geral ... 19 2.2 Objetivos específicos ... 19 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20
2.1 Lipídios: Metabolismo e fisiopatologia ... 20
2.2 Hiperlipidemia ... 23
2.3 Poloxamer-407 como indutor da hiperlipidemia ... 24
2.4 Adenosina e adenosina desaminase no metabolismo lipídico e hiperlipidemia ... 25
2.5 Inflamação associada à hiperlipidemia ... 27
2.6 O papel das plaquetas na hiperlipidemia ... 29
2.7 Produção de espécies reativas de oxigênio na hiperlipidemia ... 30
2.8 Importância dos polifenóis ... 32
4. ARTIGO E MANUSCRITO ... 36
4.1 Artigo publicado na revista Blood Cells Molecules and Diseases. ... 36
4.2 Manuscrito submetido à revista Biomedical Journal ... 44
5. DISCUSSÃO ... 65
1. INTRODUÇÃO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 56% da população brasileira sofre com sobrepeso ou obesidade. As principais causas que estão associadas a esta taxa elevada são sedentarismo, consumo elevado de alimentos industrializados e com altos níveis de açúcar e gordura, assim como o baixo consumo de alimentos saudáveis (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016).
As dietas atualmente estão cada vez mais ricas em gorduras saturadas, açucares refinados, e pobres em alimentos saudáveis como frutas e verduras. Está bem descrito que este padrão alimentar está associado ao aumento plasmático das concentrações de colesterol, sendo que o aumento nos níveis de colesterol está diretamente associado ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares como a aterosclerose (XAVIER et al., 2013).
Aproximadamente 30% das mortes ao redor do mundo são causadas por doenças cardiovasculares (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). No Brasil, dados de 2016 mostram que as doenças cardiovasculares são responsáveis 20% das mortes de indivíduos acima de 30 anos, sendo que no Sul e no Sudeste é maior causa de morte em indivíduos acima de 60 anos (MANSUR DE PADUA; FAVARATO, 2016).
A hiperlipidemia se sobressai entre os fatores de risco para doenças cardiovasculares sendo que, cerca de 16,5% dos brasileiros, 12,9 dos norte-americanos e 36,5 dos chineses apresentam hiperlipidemia e 53% dos norte-americanos tem LDL elevado (DE OLIVEIRA et al., 2017; KARR, 2017). O risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares é duas vezes mais alto em indivíduos com hiperlipidemia e está associado ao processo inflamatório desencadeado pelo acúmulo de lipídeos na corrente sanguínea que pode resultar em eventos cardiovasculares como aterosclerose (FALUDI et al., 2017; KARR, 2017)
A hiperlipidemia é um tipo de dislipidemia caracterizada por um excesso dos níveis de lipídeos na corrente sanguínea, sendo eles o colesterol total (CT), lipoproteínas de densidade baixa (LDL), triglicerídeos (TG) ou uma associação de dois ou mais deles (NELSON, 2013). O excesso de gorduras no plasma desencadeia um processo de agressão ao endotélio vascular, aumentando a permeabilidade da camada íntima às lipoproteínas e facilitando o acúmulo dessas no espaço subendotelial. Retidas, as partículas de LDL são oxidadas e estimulam a expressão e liberação de uma série de fatores envolvidos no recrutamento de células de defesa e na amplificação do processo inflamatório (FENG et al., 2018).
Como resposta a lesão endotelial decorrente do estado hiperlipidêmico, as células imunes como macrófagos, linfócitos, neutrófilos e plaquetas são ativadas e recrutadas ao local da lesão.
Estas células se acumulam e liberam mediadores inflamatórios contribuindo para a formação do trombo (DRECHSLER et al., 2010; WANG; TALL, 2016).
Dentre os principais mecanismos envolvidos na ativação destas células está a liberação de grânulos contendo adenosina trifosfato (ATP) a qual é o substrato para formação de adenosina. Esses importantes mediadores fazem parte de um grupo de moléculas conhecidas como nucleotídeos e nucleosídeos de adenina que, ao se ligarem a receptores purinérgicos específicos, são responsáveis por desencadearem uma cascata de reações envolvidas na modulação de diversos efeitos biológicos, como a agregação plaquetária, inflamação, modulação da função cardíaca e das respostas imunológicas (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003).
A adenosina é produzida a partir do ATP pela enzima NTPDase (CD39), que converte ATP em ADP e AMP, e da enzima 5’nucleotidase (CD73), que hidrolisa ADP em adenosina (DI VIRGILIO et al., 2001). A adenosina é conhecida por sua função anti-inflamatória, em condições de aumento de lipídeos seus níveis podem estar alterados, devido ao processo inflamatório causado pelo acumulo de LDL e dano no endotélio que resulta no aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e ativação de linfócitos, macrófagos, neutrófilos e plaquetas (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003).
Sabe-se que a hiperlipidemia, além de induzir o processo inflamatório, também gera a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) tanto no endotélio quanto em diversos órgãos, ocasionando danos (TRIBBLE, 1999). O excesso de colesterol pode causar alterações na composição lipídica das membranas plasmáticas, podendo ocasionar lesão celular (SOZEN; OZER, 2017). O excesso destes lipídeos causa uma lipotoxicidade em diversos órgãos como o fígado e o rim, que pode levar a danos nestes tecidos. Para reparar estes danos, o organismo possui defesas antioxidantes que podem ser divididos em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos, que são capazes de neutralizar as EROS reduzindo o estresse oxidativo. (SAMARGHANDIAN et al., 2013; TANG; ZHONG, 2014).
Os modelos experimentais animais permitem avaliar parâmetros envolvidos em diversos processos fisiopatológicos, além de contribuir na investigação e desenvolvimento de novas terapias. O modelo de indução de hiperlipidemia por Poloxamer-407 (P-407), por exemplo, é um método bem descrito na literatura, capaz de exercer efeito sobre a atividade biológica de uma variedade de enzimas-chave envolvidas no metabolismo e transporte lipídico (PALMER; EMESON; JOHNSTON, 1998; SUN et al., 2012).
Os fármacos mais utilizados no tratamento da hiperlipidemia são as estatinas, que atuam inibindo seletivamente a enzima chave na síntese de colesterol a HMG-CoA redutase, porem o uso prolongado deste medicamento causa, resistência ao tratamento e falta de aderência assim
como efeitos adversos, como por exemplo o desenvolvimento de miopatias. Sendo assim, cada vez mais buscam-se tratamentos alternativos para minimizar estes efeitos adversos (KARR, 2017).
Dentre os tratamentos alternativos possíveis, destacam-se o uso de compostos naturais como os polifenóis curcumina e a rutina, compostos presentes no açafrão da índia e em frutas cítricas e vegetais folhosos, respectivamente. Em estudos recentes, estes compostos demonstram ação antioxidante e anti-inflamatória, além de apresentarem atividades hipolipemiante e anti-aterosclerótica (SIASOS et al., 2013).
O fato dos polifenóis como a curcumina e a rutina, terem demonstrado potente ação antioxidante e anti-inflamatória, torna-se relevante determinar o possível efeito preventivo destes compostos naturais frente a um modelo experimental de hiperlipidemia induzida. A hiperlipidemia trata-se de uma condição associada ao desenvolvimento de um processo inflamatório crônico e capaz de gerar dano oxidativo, repercutindo em um alto impacto nas doenças cardiovasculares. Além do dano endotelial a lipotoxicidade causa efeitos deletérios em outros órgãos que estão direta ou indiretamente envolvidos no metabolismo de lipídios. Portanto é relevante também a investigação dos potenciais efeitos destes polifenóis frente à regulação do metabolismo da adenosina e do perfil oxidativo. Ambos os compostos demonstram atividades benéficas em relação à diversas doenças, porém o potencial da associação destes compostos ainda não foi testado. Assim, busca-se contribuir para a elucidação dessa patologia, bem como buscar novas terapias adjuvantes que possam beneficiar pacientes com hiperlipidemia.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os marcadores inflamatórios em linfócitos, plaquetas, neutrófilos e soro e o perfil oxidativo em fígado e rim de ratos com hiperlipidemia induzida, tratados com curcumina e/ou rutina.
2.2 Objetivos específicos
Em ratos com e sem hiperlipidemia induzida pretendeu-se:
• Determinar a concentração sérica do colesterol total e suas frações, assim como triglicerídeos, albumina, ácido úrico, fosfatase alcalina e creatinina;
• Avaliar a atividade sérica das enzimas marcadoras de dano hepático; • Avaliar parâmetros hematológicos;
• Avaliar razões entre parâmetros hematológicos;
• Avaliar a atividade da enzima e ADA em linfócitos, plaquetas, neutrófilos e soro; • Avaliar a atividade da enzima mieloperoxidase em plasma;
• Avaliar os níveis de espécies reativas de oxigênio em soro; • Avaliar correlações entre os parâmetros testados;
• Avaliar marcadores de dano oxidativo em órgãos periféricos como rim e fígado. • Avaliar defesas antioxidantes em órgãos periféricos como rim e fígado.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Lipídios: Metabolismo e fisiopatologia
O colesterol (CT) e os triglicerídeos (TGs) são lipídios biologicamente importantes no metabolismo humano (XAVIER et al., 2013). Enquanto os TGs constituem uma importante forma de armazenamento e transporte de ácidos graxos dentro das células e no plasma (ALVES-BEZERRA; COHEN, 2018), o colesterol desempenha um papel crucial na manutenção da fluidez e permeabilidade da membrana celular em vertebrados. Além disso, o colesterol atua como precursor de hormônios esteroidais, ácidos biliares e vitamina D (BHATNAGAR; SORAN; DURRINGTON, 2008).
Em geral, as células liberam e captam o colesterol para manter a homeostase deste componente essencial. Contudo, enquanto algumas células produzem o colesterol de maneira endógena, em excesso para suprir outras células, outras necessitam de colesterol exógeno devido a sua limitada capacidade biossintética. Em condições normais cerca de 60% do colesterol do corpo é sintetizado endogenamente e o restante é proveniente da dieta. (NGUYEN et al., 2008).
O fígado é o órgão central do metabolismo dos ácidos graxos. Os ácidos graxos presentes no fígado são provenientes da absorção hepatocelular do plasma e pela biossíntese de novo. A eliminação destes é feita por oxidação dentro da célula ou por secreção no plasma dentro de lipoproteínas de densidade muito baixa ricas em triglicerídeos (ALVES-BEZERRA; COHEN, 2018).
Durante o metabolismo lipídico, os TGs são hidrolisados e absorvidos no intestino, onde são formados os quilomícrons. Enquanto circulam, os quilomícrons sofrem ação da enzima lipase lipoproteica (LPL) e liberam ácidos graxos livres para os tecidos periféricos, onde são consumidos ou armazenados como fonte de energia. Os remanescentes dos quilomícrons e ácidos graxos são também captados pelo fígado, onde são utilizados na formação de VLDL (ALVES-BEZERRA; COHEN, 2018)
Por ser insolúvel em água, o colesterol precisa se ligar a proteínas para ser transportado no sangue. Com esta ligação temos a formação de lipoproteínas, que se dividem em dois grandes grupos: as de baixa densidade, incluindo LDL e VLDL (muito baixa densidade), e as de alta densidade (HDL) (XAVIER et al., 2013).
A LDL é formada essencialmente por um conteúdo residual de TG e colesterol e possui como principal função o transporte de colesterol livre até os tecidos periféricos. No interior das células, o colesterol livre pode ser esterificado para depósito por ação da enzima acil-Coa:
colesteril aciltransferase (ACAT) (HUANG; ELVINGTON; RANDOLPH, 2015). Tanto nas células hepáticas quanto nas periféricas, as LDL são capturadas por receptores de LDL (LDLR) sendo, portanto, a expressão desses receptores no fígado a principal responsável pelo nível de colesterol no sangue. O caminho inverso do transporte de colesterol, ou seja, dos tecidos periféricos até o fígado, é realizado pela HDL, onde o colesterol livre, recebido das membranas celulares, é esterificado por ação da lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT), contribuindo para sua estabilização e transporte no plasma no interior dessa lipoproteína (WÜSTNER; SOLANKO, 2015).
O processo de transporte de lipídeos no plasma está representado na Figura 1. A influência das lipoproteínas no metabolismo lipídico faz com que possuam um grande impacto no processo aterogênico. Enquanto as LDL modificadas constituem um fator chave no processo inflamatório de formação da placa aterosclerótica, as HDL podem inibir a modificação de lipídios e proteínas em virtude de suas atividades biológicas antioxidantes (RAFIEIAN-KOPAEI et al., 2014).
Além disso, o papel protetor do leito vascular exercido pelas HDL é ainda reforçado pelo seu potencial de remoção de lipídeos oxidados da LDL, inibição da fixação de moléculas de adesão e monócitos ao endotélio e estimulação da liberação de óxido nítrico (TRAN‐DINH et al., 2013). Essas diferentes contribuições das lipoproteínas no processo aterogênico devem-se em grande parte ao tipo de modificações que as lipoproteínas sofrem durante o metabolismo, como, por exemplo, reações de oxidação ou glicação (HUSSAIN, 2014).
Figura 1 Transporte de lipídeos.
Apesar de desempenhar funções fisiológicas importantes, o aumento do LDL (≥ 160 mg/dl) que é popularmente conhecido como “colesterol ruim” e, quando acompanhado por um aumento dos níveis de CT (≥ 200mg/dl) e TG (≥150 mg/dl) na corrente sanguínea, caracteriza um tipo de dislipidemia chamada de hiperlipidemia. Já o HDL, o “colesterol bom”, auxilia na captação do excesso de colesterol circulante e transporte ao fígado para eliminação via bile (OTUNOLA et al., 2010; XAVIER et al., 2013).
Níveis excessivos de TG e LDL circulantes, associados a níveis insuficientes de HDL, prejudicam o transporte de colesterol na corrente sanguínea, fazendo com que este seja depositado na parede arterial causando dano endotelial e aumentando a permeabilidade da membrana (LIN et al., 2009). Retidas, as partículas de LDL sofrem oxidação, tornando-se imunogênicas e agravando o processo de agressão ao endotélio vascular. Como resposta, monócitos migram para o espaço subendotelial onde se diferenciam em macrófagos e captam o LDL-oxidado (LDL-ox). Os macrófagos são ativados, juntamente com outras células inflamatórias, como células T, levam à evolução da placa aterosclerótica e amplificação da inflamação através da secreção de citocinas e enzimas proteolíticas (Figura 2) (XAVIER et al., 2013).
Figura 2 Formação da placa aterosclerótica.
2.2 Hiperlipidemia
A hiperlipidemia é um tipo de dislipidemia que é caracterizada por um aumento nos níveis
de lipídeos e ou lipoproteínas. O acúmulo de lipídeos causa diversas alterações dentre as principais se destacam a deposição de lipídeos no endotélio, causando oxidação do LDL e formação de células espumosas, ativação e recrutamento de células imunes, além de produção de EROS e dano tecidual, todos estes processo unidos contribuem para a formação do trombo e progressão para aterosclerose (VAN DIEPEN et al., 2013).
A hiperlipidemia é reconhecida como um dos principais fatores de risco para o surgimento da aterosclerose e desenvolvimento de doenças cardiovasculares (RERKASEM et al., 2008). A aterosclerose promove um acúmulo de leucócitos e plaquetas nas paredes das artérias e é caracterizado pela presença de inflamação crônica (HANSSON KH, 2005; ROCHA; LIBBY, 2009). Além do mais, estudos epidemiológicos apontam que níveis excessivos de colesterol LDL podem levar ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, mesmo na ausência de outros fatores de risco como fatores genéticos e ambientais (SOZEN; OZER, 2017).
Embora os mecanismos não estejam bem definidos, a associação entre hiperlipidemia e aterosclerose vem sendo demonstrada por várias décadas, e recentemente têm recebido bastante atenção na prática clínica. A descoberta de que o LDL e outros lipídios são pró-aterogênicos por se depositar na parede da artéria e sofrer oxidação dando origem às células espumosas, e também que a imunogenicidade dos macrófagos ativados gerando um processo inflamatório, representam mecanismos pelos quais a hiperlipidemia causa aterosclerose (ZÁRATE et al., 2016; FALUDI et al., 2017; FENG et al., 2018). A partir de então, a redução dos níveis de lipídios passou a ser uma das prioridades na manutenção da saúde da população (STEINBERG, 2005). Embora a relação entre hiperlipidemia e doenças cardiovasculares seja conhecida, atualmente sabe-se que ela também pode causar doenças renais, diabetes tipo 2, hipertensão e hipotireoidismo (KARR, 2017).
O depósito de lipoproteínas na parede arterial ocorre de maneira proporcional à concentração destas lipoproteínas no plasma (FALUDI et al., 2017). Além disso, a presença contínua de hipercolesterolemia é necessária para a manutenção e progressão da lesão, pelo menos no caso de lesões relativamente precoces. Dessa forma, a hiperlipidemia como iniciadora do processo aterosclerótico e a inflamação como resposta à lesão vascular causada pelo acúmulo de lipoproteínas são fatores complementares na patogênese da aterosclerose (STEINBERG, 2002).
Além da inflamação e estresse oxidativo, em órgão periféricos, um excesso no conteúdo intracelular de lipídeos e seus derivados promove dano e altera a homeostase e a função celular. O acúmulo de lipídios em tecidos não adiposos como figado, rim e o coração têm um efeito citotóxico chamado de lipotoxicidade (BOBULESCU, 2010). Este processo está associado ao desenvolvimento de resistência à insulina, geração de EROs, alterações de vias de sinalização e liberação de mediadores pró-inflamatórios e pró-fibróticos que causam danos às organelas e induzem apoptose (IZQUIERDO-LAHUERTA; MARTÍNEZ-GARCÍA; MEDINA-GÓMEZ, 2016)
A lipotoxicidade causa inflamação, fibrose e disfunção no fígado, como demonstrado em esteatose hepática não-alcólica (HIRSOVA et al., 2016) e no rim (IZQUIERDO-LAHUERTA; MARTÍNEZ-GARCÍA; MEDINA-GÓMEZ, 2016). No coração, foi encontrada uma associação entre disfunção e acúmulo de lipídeos em modelos murinos (GOLDBERG; TRENT; SCHULZE, 2013) o que mostra uma outra forma de relação entre a hiperlipidemia e as doenças cardiovasculares diretamente relacionada ao tecido cardíaco, ainda não totalmente esclarecida em humanos.
2.3 Poloxamer-407 como indutor da hiperlipidemia
O indutor de hiperlipidemia utilizado neste estudo foi o Poloxamer-407 (P407). Este modelo já é bem estabelecido na literatura (JOHNSTON, 2004), e causa um aumento nos níveis de CT, TG e LDL (CHAUDHARY; BROCKS, 2013). Os níveis séricos máximos desses lipídios ocorrem após 36 horas de injeção intraperitoneal de P407, e a administração contínua desse composto leva ao desenvolvimento de aterosclerose (PALMER; EMESON; JOHNSTON, 1998).
O P407 é um surfactante não iônico hidrofílico da classe mais geral de copolímeros conhecidos como poloxâmeros.O principal mecanismo envolvido na indução de hiperlipidemia por P407 é a inibição da enzima lipase lipoproteica (LP), que é responsável pela hidrólise dos triglicerideos, o que aumenta os níveis de TG circulantes. A indução de hiperlipidemia por P407 também pode ser devida à estimulação na atividade da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA), uma enzima chave para a síntese de colesterol. Além disso, podem ser inibidas as enzimas lipase hepática (HL) e colesterol-7α-hidroxilase (C7αH), responsáveis pela hidrólise de TGs e síntese de ácidos biliares, respectivamente (Figura 3) (JOHNSTON; PALMERS, 1993; JOHNSTON; KOROLENKO; SAHEBKAR, 2017).
Figura 3 Mecanismo de ação do P407
Fonte: Elaborada pelo autor
2.4 Adenosina e adenosina desaminase no metabolismo lipídico e hiperlipidemia
A adenosina é produzida a partir do ATP via NTPDase (CD39), que converte ATP em ADP e AMP, e da 5’nucleotidase (CD73), que hidrolisa ADP em adenosina (Figura 4) (DI VIRGILIO et al., 2001). O aumento de LDL na circulação causa a liberação de ATP pelas células endoteliais que resulta em liberação de espécies reativas de oxigênio EROs e ativação de linfócitos, macrófagos, neutrófilos e plaquetas. Essa cascata de eventos resulta em uma modulação da atividade das enzimas purinérgicas e produção de adenosina (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003).
A adenosina é liberada pelas células dependendo da sua concentração intracelular ou pode ser proveniente da degradação do ATP extracelular devido à ação das ectonucleotidases. A adenosina exibe potentes ações anti-inflamatórias e imunossupressoras através da inibição da proliferação de células T, a secreção de citocinas e a migração de leucócitos através da barreira endotelial (KOBIE et al., 2006). Além disso, a adenosina atua como um sinal de feedback negativo para contrariar a estimulação imunológica mediada por ATP, prevenindo a inflamação descontrolada e diminuindo os danos colaterais para os tecidos saudáveis (GESSI et al., 2007). A adenosina se liga à receptores purinérgicos específicos chamados de receptores P1, que são subdivididos em A1, A2A, A2B e A3 (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003). Em contrapartida, o excesso de adenosina extracelular e a subsequente ativação excessiva destes receptores, pode contribuir para a imunossupressão ao alterar o desenvolvimento e a função dos linfócitos, comprometendo a resposta imune (LEIVA et al., 2017).
O controle dos níveis de adenosina é feito pela enzima adenosina desaminase (E.C 3.5.4.4, ADA). Esta enzima possui um importante papel na resposta imune e inflamatória devido a regulação da adenosina. O controle da sinalização adenosinérgica também pode ser exercido através da via de recuperação de adenosina por transportadores de nucleosídeos, seguida por fosforilação à AMP pela adenosina quinase ou desaminação à inosina pela ADA (HASKÓ; CRONSTEIN, 2004).
A ADA é amplamente distribuída em quase todos os tecidos de mamíferos (POURSHARIFI et al., 2009) e sua atividade é importante para a proliferação e regulação da função de linfócitos, especialmente linfócitos T efetores e T regulatórios (Tregs). Um aumento da atividade da ADA sérica e plasmática aumenta a produção de citocinas pelos monócitos e neutrófilos (PASSOS et al., 2018). Em humanos, existe na forma de duas isoenzimas classificadas como ADA1 e ADA2, cada uma com suas próprias características, como peso molecular, propriedades cinéticas e distribuição tecidual (SHAROYAN et al., 2006). Diferentes tipos de ADA se encontram na superfície de diferentes subgrupos de células imunes. Na superfície dos linfócitos T e natural killer (NKT) se encontra ADA 1, enquanto em células dendríticas (DCs), neutrófilos, monócitos/macrófagos, NKT, e CD26+ Tregs, se encontra a ADA 2. No soro e no plasma, se encontra predominantemente ADA 2 proveniente de monócitos e DCs (PASSOS et al., 2018).
A ADA regula a resposta imune, portanto alterações em sua atividade estão associadas à distúrbios imunológicos. Esta enzima é considerada um marcador inespecífico da imunidade mediada por células, inflamação (VINAPAMULA et al., 2015) e ativação imune (KÄLVEGREN; FRIDFELDT; BENGTSSON, 2010). Alterações na ADA sérica tem sido associadas com doenças em que há envolvimento da imunidade celular tais como infecções (PASSOS et al., 2018), doenças inflamatórias (VINAPAMULA et al., 2015) e metabólicas (OTTOBELLI CHIELLE et al., 2016). A elevação da ADA no soro no contexto das doenças metabólicas indica a presença de um processo inflamatório e possivelmente também estimula a resposta imune. A regulação dos níveis de adenosina tem um impacto direto na sua disponibilidade para interagir com seus receptores.
O metabolismo e a sinalização da adenosina estão envolvidos tanto no metabolismo de lipídeos quanto na resposta imune à hiperlipidemia. A interação da adenosina com seus diferente receptores P1 em diferentes tecidos possui diferentes efeitos. Quando interagindo com receptores A1, a adenosina inibe a lipólise no tecido adiposo, reduzindo os níveis de lipídios na circulação prevenindo os danos causados por estes. Em macrófagos, a adenosina via A2A estimula o efluxo de colesterol e inibe a formação das células espumosas. A ativação dos
receptores A2A e A2B pela adenosina tem efeito anti-inflamatório sob os macrófagos e mantem a homeostase do colesterol. O receptor A3 parece não ter um papel definido no metabolismo de lipídeos (LEIVA et al., 2017).
Figura 4 Sistema purinérgico na superfície de uma célula imune ativada.
A liberação de ATP por células imunes ativadas desencadeia uma produção aumentada de adenosina através da via CD39/CD73 e subsequente aumento de atividade da ADA. Fonte: Imagem elaborada pelo autor.
2.5 Inflamação associada à hiperlipidemia
O processo inflamatório está associado a uma modulação da resposta do sistema imune através da ativação de células como linfócitos, neutrófilos e plaquetas, os quais são responsáveis pela liberação de ATP no meio extracelular, assim como outras citocinas e quimicionas, mediadores estes responsáveis pela sinalização inflamatória. Dentre os mediadores capazes de modular as ações destas células, destacam-se os nucleotídeos e nucleosídeos de adenina (DI VIRGILIO et al., 2001), que representam uma importante classe de moléculas extracelulares, especialmente durante o processo inflamatório que, ao interagirem com receptores purinérgicos na superfície celular, sinalizam vias de grande importância, que medeiam diversos efeitos biológicos como a contração do músculo liso, agregação plaquetária, resposta imune, inflamação e modulação da função cardíaca (Figura 5) (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003).
Na resposta inflamatória ativada, os linfócitos T efetores são ativados e passam também a secretar as citocinas pró-inflamatórias como, TNF-α e β, Interleucina-2 (IL-2) e IFN,
que causam uma maior ativação de macrófagos, ativação vascular e inflamação (CHARAKIDA et al., 2009). O IFN-, TNF-α e IL-1 estimulam a proliferação das células musculares lisas e a síntese de colágeno, as quais se agregam às células espumosas, completando a formação da placa ateromatosa (MASSBERG et al., 2002; ROCHA; LIBBY, 2009).
Os linfócitos T citotóxicos participam da resposta imune atacando as células musculares lisas, quando as mesmas estão apresentando fragmentos lipídicos associados a proteínas de classe I do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC- I), levando à apoptose dessas células (GENG et al., 1997). Os linfócitos B podem ocorrer na camada adventícia e no tecido conectivo e são os responsáveis pela síntese dos anticorpos anti-LDL oxidado (HANSSON KH, 2005). Os anticorpos anti-LDL oxidado desempenham uma função imunoprotetora contra o desenvolvimento da aterosclerose, pois neutralizam e catabolizam o LDL oxidado (HULTHE et al., 2001; MATSUURA et al., 2006).
Durante o processo inflamatório, fatores pró-inflamatórios (TNF, IL-1, IL-6 e IL- 18) induzem a expressão dos genes hepáticos a sintetizarem proteínas de fase aguda (proteína C reativa, amilóide A sérica e fibrinogênio); fatores endoteliais trombóticos (PAI-1); e fatores específicos associados com doenças autoimunes, tais como o anticorpo anti-cardiolipina. Alguns fatores inflamatórios são sintetizados localmente por células mononucleares que invadem a parede do vaso ou são produzidos pelos hepatócitos, estimulados por citocinas como a IL-6 liberada pelos macrófagos ativados (BALANESCU et al., 2010).
Os linfócitos têm as suas funções de proliferação prejudicadas quando os níveis séricos de colesterol estão aumentados (CHYU et al., 2014; HEDRICK, 2015). Além disso, subtipos diferentes de linfócitos desempenham papéis distintos no contexto da hiperlipidemia e inflamação, os linfócitos T efetores estão ligados ao desenvolvimento da aterosclerose, e as células T reguladoras (Treg) estão envolvidas à proteção em relação a aterosclerose. No entanto, a hipercolesterolemia aumenta a apoptose de células Treg e diminui suas funções (MAGANTO-GARCÍA et al., 2011; MAILER et al., 2017). A função das células Tregs é reforçada pela adenosina, portanto baixos níveis de adenosina contribuem para a formação de placas ateroscleróticas (DEAGLIO et al., 2007).
Os neutrófilos também são células imunes, com papel importante na inflamação estéril (DRECHSLER et al., 2010), além de inflamações mediadas por patógenos, a qual seu papel fagocítico ja é bem descrito. Evidências mostram que a ativação dos neutrófilos induzida por hipercolesterolemia e sua infiltração arterial indicam seu envolvimento no aparecimento de aterosclerose (DÖRING et al., 2015). Quando ativados, estes estão associados à liberação de enzimas como a mieloperoxidase (MPO), que catalisa a formação de intermediários reativos de
oxigênio. O aumento da atividade da MPO está relacionado o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (ARATANI, 2018).
Figura 5 Papel das células na formação da lesão aterosclerótica.
Fonte: Adaptado de (BADIMON et al.2018).
2.6- O papel das plaquetas na hiperlipidemia
As plaquetas são as principais responsáveis pela coagulação sanguínea e manutenção da hemostasia, intervindo rapidamente quando a integridade do vaso é afetada. Essa intervenção é facilitada pela sua localização próxima a parede do vaso (HOLINSTAT, 2017). Além dessas funções, sabe-se que as plaquetas possuem papel importante durante outros processos fisiopatológicos, incluindo imunidade e inflamação (VON HUNDELSHAUSEN; WEBER, 2007).
Sob condições patológicas, como a aterosclerose, a lesão vascular resulta em hiperatividade plaquetária e consequentemente pode levar a formação de trombo oclusivo, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral (YEUNG; LI; HOLINSTAT, 2018). Assim, o papel das plaquetas na aterogênese vai desde a iniciação da ativação endotelial até à progressão das lesões ateroscleróticas, que resultam muitas vezes em graves complicações tromboembolíticas ( Figura 6) (MASSBERG et al., 2002).
Dessa forma, a hiperlipidemia pode estar associada a um aumento da reatividade plaquetária, pois quando estas células ficam aderidas ao endotélio comprometido pelo acúmulo de LDL-ox, elas são ativadas e promovem a liberação de citocinas e quimiocinas que contribuem na manutenção do processo inflamatório (MASSBERG et al., 2002; PAWELCZYK et al., 2015). Corroborando com esse conhecimento, pesquisas utilizando ratos
hipercolesterolêmicos demonstram um significativo aumento de infiltração de leucócitos e da aterogênese pela ativação da adesão plaquetária (MASSBERG et al., 2002).
Figura 6 Papel das plaquetas na formação do trombo.
Fonte: Adaptado de (HOLINSTAT, 2017)
2.7 Produção de espécies reativas de oxigênio na hiperlipidemia
Radicais livres são espécies químicas reativas que possuem um elétron desemparelhado em uma órbita externa. Existem vários tipos de radicais livres, os derivados do oxigênio são conhecidos como EROs e têm papéis fisiológicos importantes como a destruição de patógenos e sinalização celular. No entanto, um desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a defesa antioxidante gera estresse oxidativo (RAHMAN, 2007).
Além de induzir um processo inflamatório, a hiperlipidemia também causa um processo de lipoperoxidação, que consiste na incorporação de um radical livre nos ácidos graxos da membrana celular. A lipoperoxidação é resultado do ataque do radical hidroxila da cadeia acil do ácido graxo dos fosfolipídeos e TGs e possui efeitos deletérios na função celular (HAUCK; BERNLOHR, 2016). Os efeitos da lipoperoxidação sob as células e tecidos compreendem tanto as mudanças na composição e arquitetura da membrana quanto a produção de EROs, podendo causar morte celular e lesão tecidual (HAUCK; BERNLOHR, 2016; SOZEN; OZER, 2017).
As gorduras saturadas presentes na dieta causam alterações na composição lipídica das membranas plasmáticas, devido a produção excessiva de EROs que pode levar à lesão e morte celular. Além dos efeitos na membrana, esse processo também pode gerar danos às proteínas e ao DNA, provocando diversas alterações na função celular (SCHNEIDER; REISCHAK DE OLIVEIRA, 2009). O dano à estrutura proteica pode alterar sua atividade biológica, sendo que
no caso de enzimas, pode resultar em modificação de sua atividade catalítica (DEAN et al., 1997).
Uma consequencia importante do estresse oxidativo é a carbonilação proteica que resulta de modificações pós-translacionais de residuos de lisina, histidina e cisteína e está envolvido na disfunção da mitocôntria e retículo endoplasmático. Essas modificações afetam o sítio catalítico das proteínas e as interações entre elas e geralmente representam uma modificação de perda de função. A proteina carbonil é considerada um marcador estresse oxidativo e oxidação protéica, podendo ser observada em tecidos metabolicamente ativos (HAUCK; BERNLOHR, 2016). Outro marcador clássico de estresse oxidativo que mede a peroxidação lipídica é chamado de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), que indicam dano lipídico pela quantificação de malondialdeído (MDA), uma espécie reativa formada durante a peroxidação dos ácidos graxos insaturados (DALLE-DONNE et al., 2006; CZERSKA; MARKERY; OKSYDACYJNEGO, 2015)
Organismo possui uma defesa antioxidante composta de mecanismos que combatem os radicais livres e evitam os danos causados por eles. Eles podem reduzir significantemente os danos adversos causados por oxidantes, desintegrando-os antes que eles reajam com os alvos biológicos e prevenindo reações em cadeia ou impedindo a ativação de oxigênio em produtos altamente reativos (AZZI; DAVIES; KELLY, 2004; RATNAM et al., 2006). Apesar da existência de mecanismos de defesa antioxidantes altamente regulados para lidar com o dano oxidativo, a exposição crônica ou severa aos radicais livres pode causar falhas neste mecanismo.
As defesas antioxidantes que podem ser divididas em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos. Entre as principais enzimas responsáveis pela defesa antioxidante enzimática do organismo destacam-se: a superóxido dismutase (SOD) e a catalase (CAT). Através delas, as células reduzem os níveis do radical superóxido e de peróxidos de hidrogênio evitando assim, a formação do radical hidroxil (BOVERIS; CADENAS, 1997). A SOD é a enzima responsável pela dismutação do ânion superóxido, e a catalase é a enzima responsável pela conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, protegendo as células dos efeitos nocivos do peróxido de hidrogênio acumulado (PISOSCHI; POP, 2015).
Outro componente essencial da defesa antioxidante é a glutationa (GSH), um tri peptídeo responsável por eliminar EROs e que também está envolvido na síntese de DNA, proteínas e de algumas prostaglandinas (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). A GSH serve de cofator para a GST que atua na detoxificação de agentes químicos e eliminação de produtos da
lipoperoxidação, ao remover ROS e eliminar peróxidos lipídicos das células (PISOSCHI; POP, 2015).
Além das defesas antioxidantes enzimáticas, possuem grande relevância os antioxidantes não enzimáticos. Deste grupo destacamos o papel dos grupamentos tióis (-SH) e das vitaminas C e E (VALKO et al., 2007). Os tióis são as moléculas antioxidante muito importantes que contém grupos tióis (-SH) (GUMUSYAYLA et al., 2016). Os radicais livres causam a oxidação de grupos - SH em proteínas, os quais podem reduzir os elétrons para que o organismo possa ser protegido dos danos oxidativos causados por EROs (GUMUSYAYLA et al., 2016) ( Figura 7).
Figura 7 Sistema de defesa antioxidante enzimático e não enzimático.
Fonte: Imagem elaborada pelo autor.
2.8 Importância dos polifenóis
Polifenóis são produtos naturais derivados de plantas compostos por uma variedade de moléculas, que podem ser classificadas em diversas categorias, de acordo com suas características químicas. Os flavonoides, por exemplo, são uma classe importante de polifenóis, sendo metabolitos secundários que ocorrem naturalmente em plantas, e encontrados em grande parte em alimentos e bebidas, como frutas, verduras, cereais, chá, café e vinho tinto (SELEEM; PARDI; MURATA, 2017). São classificados de acordo com a sua estrutura e a sua natureza química dependendo de sua classe estrutural, grau de hidroxilação, outras substituições e
conjugações e ainda do grau de polimerização (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002; KUMAR; PANDEY, 2013).
Estes compostos não podem ser sintetizados pelo metabolismo humano e, portanto, devem ser adquiridos através da alimentação. Estima-se que a ingestão diária varie entre 23 mg a 1 g de flavonoides (PETERSON; DWYER, 1998). Em um estudo realizado por (ARABBI; GENOVESE; LAJOLO, 2004), mostrou que os alimentos comumente ingeridos pelos brasileiros e que são as principais fontes de flavonóides são a laranja (70%), alface (9%) e tomate (2,5%).
A aborção dos flavonoides oriundo dos alimentos dependerá das suas propriedades fisico-químicas, tais como tamanho molecular, configuração, lipofilicidade e solubilidade. O flavonoide pode ser absorvido no trato gastrointestinal ou ir para o cólon antes da absorção. Após absorvidos, os flavonóides são conjugados no fígado em glucoronidato ou sulfato conjugado ou metabolizados em compostos fenólicos menores (KUMAR; PANDEY, 2013). Esses metabolitos circulam no sangue, sendo excretados na bile e na urina, tanto em ratos quando em seres humanos (MORAND et al., 1998).
A utilização de compostos naturais como bioflavonoides têm apresentado diversas aplicações na saúde, podendo agir como adjuvantes no tratamento de diversas doenças, devido as suas amplas atividades biológicas, baixos índices de efeitos colaterais e o seu baixo custo. Estudos recentes envolvendo polifenóis demonstraram propriedades significantes, dentre elas se destacam as ações antioxidantes e anti-inflamatórias. Além disso, sabe-se que dietas ricas em flavonoides promovem uma redução na progressão da aterosclerose (SIASOS et al., 2013; GANESHPURKAR; SALUJA, 2017)
A curcumina (1E, 6E) -1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1,6-heptadieno-3,5-diona (Figura 8) é um polifenol e um pigmento natural bioativos isolado do açafrão-da-índia. Os efeitos antioxidante, anti-inflamatório, antidiabético entre outros têm sido vastamente estudados. Por isto, seu uso tem sido indicado no tratamento de diversas doenças crônicas como diabetes, hipertensão e aterosclerose (SHIN et al., 2014; SHOME et al., 2016b).
A rutina (3,3’,4’,5,7-pentahidroxiflavona-3-ramnoglucosideo) (Figura 9) é um flavonoide presente no trigo e em vegetais folhosos e frutas cítricas, o qual tem mostrado uma ampla gama de aplicações farmacológicas, como atividade antidiabética, anti-inflamatória, antioxidante e anticonvulsivante. Em pesquisas atuais foram demonstrados seus benefícios farmacológicos para o tratamento de várias doenças crônicas, como câncer, diabetes, hipertensão e hiperlipidemia (AL-REJAIE et al., 2012; AL-DHABI et al., 2015).
Figura 9 Estrutura química da rutina.
Os polifenois no geral compartilham algumas ações dentre elas, ações hipolipemiantes, antioxidante e anti-inflamatórias. Os mecanismos pelos quais estes polifenois agem no organismo para desempenhar estas função são variados, sendo que alguns deles ja estão bem descritos na literatura e incluem a inibição da síntese e absorção lipídica, formação de células espumosas, aumento do receptor de LDL, das lipoproteína de alta densidade (HDL) enzimas metabolizadoras de ácido, respectivamente lipase lipoproteica, enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA), lipase hepática (HL) e enzimas colesterol-7α-hidroxilase (C7αH), em relação a regulações no metabolismo lipidico, assim como podem agir como antioxidantes levando a diminuiçao de EROs, alem de atuarem na redução do processo inflamatório atraves da produção de citocinas anti-inflamatórias, diversos mecanismos pelos quais estes polifenois agem estão mostrados na figura 10 (JACOB et al., 2007; SIASOS et al., 2013; ZINGG; HASAN; MEYDANI, 2013).
Figura 10 Ação dos polifenóis na regulação lipídica, inflamação e estresse oxidativo.
Fonte: Imagem elaborada pelo autor. EROs: Espécies reativas de oxigênio; IL: Interleucina; LDL: Lipoproteina de baixa densidade; NF-kB: Fator nuclear kappa B.
4. ARTIGO E MANUSCRITO
4.2 Manuscrito submetido à revista Biomedical Journal
Curcumin and rutin prevent liver and kidney oxidative damage in rats with induced hyperlipidemia
Alessandra G. Manzonia,b, Jossiele W. Leitempergerb,c, Tamiris R. Storckc, Daniela F. Passosa,b, Viviane M. Bernardesa,b Vania L. Loro b,c, Daniela B. R. Leal a,b*.
a Laboratório de Imunobiologia Experimental e Aplicada (LABIBIO), Departamento de
Microbiologia e Parasitologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil.
b Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica, Centro de Ciências Naturais e
Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil.
c Laboratório de Toxicologia Aquática, Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular,
Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil.
Abstract
Background: Hyperlipidemia is characterized by lipid abnormalities, resulting in a
pro-inflammatory and pro-oxidative profile, representing a major risk factor for atherosclerosis. Curcumin and rutin are polyphenols with substantial antioxidant, anti-inflammatory, and lipid-lowering potential.
Material and methods: We evaluated oxidative damage biomarkers and the antioxidant
defense in hepatic and renal tissue homogenates of rats. Adult Wistar male rats were pretreated with saline, curcumin (50mg/kg) and rutin (50mg/kg) per gavage, for 30 days. Acute hyperlipidemia was induced by intraperitoneal administration of Poloxamer-407 (500 mg/kg). Thirty-six hours later, the animals were euthanized, blood was drawn, and the organs were retained for antioxidant and oxidant tests. Biochemical parameters were evaluated in serum. Antioxidant (SOD, CAT, GST, T-SH, and NPSH) and oxidant (carbonyl protein, TBARS) parameters were evaluated in liver and kidney tissues.
Results In untreated hyperlipidemic rats, there was a significant increase in the oxidative
markers and a reduction in the activity of SOD, CAT, and GST in liver and kidney tissues. Also, elevated uric acid and albumin levels in serum were observed. Pretreatment with rutin and curcumin prevented the decreased in the activity of SOD and CAT in the liver and kidney.
The reduction in GST was prevented by rutin in both organs and by the rutin-curcumin association in the kidney.
Conclusion: We have shown the preventive effects of curcumin and/or rutin against the
oxidative damage caused by hyperlipidemia, suggesting that the use of these compounds as adjuvant therapies may benefit patients with hyperlipidemia.
Keywords: hyperlipidemia, rutin, curcumin, oxidative stress.
1 INTRODUCTION
Hyperlipidemia is a disease regarded as the accumulation of total cholesterol (TC), accompanied by an increase in the levels of low-density lipoprotein cholesterol (LDL) and serum triglycerides [1]. This condition promotes an increase in lipid abnormalities, endothelial dysfunction, oxidative stress, accumulation of leukocytes and platelets in the walls of the arteries, and chronic inflammation, and represents a risk factor for atherosclerosis [2–4].
Accumulation of lipids in non-adipose tissues results in lipotoxicity, which is associated with an inflammatory process and oxidative stress. Lipotoxicity is known to affect several organs such as the liver, spleen, heart, and kidneys [5,6]. The liver is a central organ in the metabolism of fatty acids, which accumulate in this organ through hepatocellular uptake from plasma or by de novo biosynthesis. The removal of fatty acids from the liver occurs either through intracellular oxidation or by release within the LDL lipoprotein into the circulation [7]. In the kidney, lipotoxicity induces changes in the renal lipid metabolism and favors insulin resistance and the generation of oxygen reactive species, which are important contributing factors to chronic kidney dysfunction and acute renal failure [8].
Dietary saturated fats cause alterations in the lipid composition of the plasma membranes, which may lead to cell injury. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) indicate lipid damage by quantifying malondialdehyde (MDA), a secondary product of lipid peroxidation [9,10]. In addition, oxidative stress can cause damage to proteins and DNA, causing several alterations in cell function, thereby causing tissue damage [11]. Regarding enzymes, the damage to the protein structure may alter its catalytic activity [12]. The formation of the carbonyl protein seems to be a common phenomenon during oxidation, and its quantification can be used to measure the extent of the oxidative damage [13].
The main antioxidant defense mechanisms in the body can be divided into two groups, enzymatic and non-enzymatic. Enzymatic systems involve the glutathione redox cycle
enzymes, particularly glutathione peroxidase [5,14]. Other antioxidant defense enzymatic systems include the superoxide dismutase (SOD), dependent on Cu2+ and Zn2+ as cofactors, which catalyzes the dismutation of the superoxide radical in hydrogen peroxide and oxygen, as well as catalase (CAT), which converts hydrogen peroxide into water and molecular oxygen. Non-enzymatic antioxidants, such as tocopherol, ascorbic acid, carotenoids, total sulfhydryl content (T-SH), and non-protein thiols (NPSH) are also of relevance [15,16].
The use of natural compounds has various applications in the maintenance of health, due to their ample biological activities and low cost. Rutin and curcumin have shown a wide range of pharmacological applications, due to their antioxidant, anti-inflammatory, and hypolipidemic properties. More recent studies have proposed their use in the treatment of inflammatory diseases such as atherosclerosis [17–20].
Hyperlipidemia is associated with inflammation and oxidative stress, which are important elements in the development of liver and kidney diseases. Since rutin and curcumin have potent antioxidant and anti-inflammatory action that may improve hepatic and renal oxidative damage [21,22], it is relevant to evaluate the potential preventive effects of these natural compounds in a model of hyperlipidemia.
In this study, we sought to investigate the effect of rutin and curcumin, as well as their association, in the liver and kidney of rats with induced hyperlipidemia. While there are several studies evaluating the beneficial effects of curcumin and rutin in different diseases, to the best of knowledge there are no previous studies on the association of these two compounds in this context. Thus, we investigated their effects on oxidative damage biomarkers and the antioxidant defense in the liver and kidney to contribute to the knowledge on this pathology, as well as to seek new adjuvant therapies for hyperlipidemia.
MATERIALS AND METHODS 2.1 Reagents
Coomassie Brilliant Blue G-250, Malondialdehyde bisdimethylacetal (MDA, 99%, Aldrich 108383), (-) epinephrine (+) bitartrate salt (Sigma E4375), and 2-thiobarbituric acid (sodium derivative, Aldrich S564508) were obtained from Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA), Poloxamer-407 (P407) was bought from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Physiological solution (0.9g NaCl/100 mL distilled water) was acquired from Fresenius KABI (Brazil). curcumin and rutin were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Analytical grade and highest purity were ensured for all chemicals used in the experiments.
Experimental animals consisted of conventional and heterogenic adult male Wistar rats (250-300g) from UFSM Central Vivarium. The animals were kept at a constant temperature (23±21°C) on a 12-hour light/dark cycle with freely available food and water. All procedures involving the animals were approved by the Ethics Committee on the Use of Animal at the Federal University of Santa Maria (Protocol number: 1006200117, dated 01/2017).
2.3 Experimental design
Animals were pretreated with curcumin and/or rutin at a dose of 50 mg/kg for 30 days, by gavage. The choice of the dose was determined according to previous studies [23,24]. Following 30 days of treatment, acute hyperlipidemia was induced by a single intraperitoneal injection of 500 mg/kg Poloxamer-407 (dissolved in sterile 0.9% NaCl solution) [25]. The same volume of the vehicle will be given to the rats belonging to the non-hyperlipidemic groups. Euthanasia was performed 36 hours after induction. The study was designed with eight groups of five or six animals each: S: Saline + without induction of hyperlipidemia (n=5); R: Rutin 50mg/kg + without induction of hyperlipidemia (n=6); C: Curcumin 50mg/kg + without induction of hyperlipidemia (n=6); R + C: Curcumin 50mg/kg + Rutin 50mg/kg + without induction of hyperlipidemia (n=6); H+S: Saline + induction of hyperlipidemia (n=5); H+R: Rutin 50mg/kg + induction of hyperlipidemia (n=6); H+C: Curcumin 50mg/kg + induction of hyperlipidemia (n=6); H+RC: Curcumin 50mg/kg + Rutin 50mg/kg + induction of hyperlipidemia (n=6).
2.4 Pretreatment with Rutin and/or Curcumin
The animals belonging to the groups designated for pre-treatment were given rutin and/or curcumin and saline for a period of 30 days. However, this group was excluded from the study because it did not present a significant difference in the enzymatic activities compared to S.
2.5 Induction of hyperlipidemia by poloxamer 407 (P407)
Animals randomly assigned to the hyperlipidemic groups received 500 mg/kg of P407 dissolved in sterile 0.9% NaCl solution via intraperitoneal (i.p.) injection [25]. The non-hyperlipidemic rats received the same volume of vehicle alone (cold, sterile 0.9% NaCl solution). The animals were anesthetized with isoflurane and euthanized 36 hours post-induction, followed by blood drawing by cardiac puncture.
2.6 Separation of blood serum
For serum separation, the blood samples were collected in tubes without anticoagulant and centrifuged at 1400×g at room temperature for 15 min. The surplus serum samples were frozen for later analyses.
2.7 Biochemical parameters
Serum levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), albumin, alkaline phosphatase, creatinine, and uric acid were evaluated in a semi-automatic analyzer (TPAnalyzer Plus®, Thermoplate) using commercial kits (Bioclin/Quibasa).
2.8 Preparation of tissues homogenates
Liver and kidney were collected and homogenized on ice in 1 mL Tris HCl buffer (50mM pH 7.4). Samples were further centrifuged at 3000×g for 10 min at 4°C and the supernatants were kept in microtubes at −80°C for posterior assays.
2.9 Protein carbonyls
The concentration of protein carbonyls was measured by reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) following the method of Levine et al. [26]. The results were expressed as nmol of protein carbonyl/mg of protein.
2.10 Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)
Lipid peroxidation was estimated by measuring TBARS generated during an acid-heating reaction according to a method described previously by Draper [27]. The absorbance was measured at 532nm in a microplate reader. Malondialdehyde (MDA) was used as standard and results were expressed as nmol MDA/mg protein.
2.11 Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities
SOD activity was assessed by testing the inhibition of the radical superoxide reaction in the presence of adrenalin. Quantification was performed by monitoring adrenochrome formation at 480nm. The intermediate in this reaction is superoxide, which is scavenged by SOD. Results were expressed as U SOD/mg of protein. One unit of SOD is defined as the enzyme amount that inhibits by 50% of autoxidation of adrenalin [28]. CAT activity was measured by monitoring the decrease in H2O2 absorbance at 240nm [29]. The enzymatic
activity was expressed as μmol/min/mg protein.
2.12 Total thiols (T-SH) and non-protein thiols (NPSH)
Total thiol or total sulfhydryl groups (T-SH), which consists in the reduction of 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) in pH 7.0. The results were expressed in nmol T-SH/ mg of protein. Tissue non-protein thiols (NPSH) were determined by the method of Ellman [30], with some modifications. Results were expressed as nmol SH/ mg of protein.
2.13 Glutathione S-Transferase (GST) activity
GST activity was analyzed as described previously by Habig [31]. Absorbance was monitored at 340nm and the enzyme activity was further calculated by using the molar
