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DUPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
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DUPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
CONTEÚDO: FABIANA SCARPA D’ANGELO
CURADORIA: PEDRO SULTANO
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 4 EXPERIMENTO DE MESELSON-STAHL ... 4 A REPLICAÇÃO DO DNA ... 5 MUTAÇÕES DO DNA ... 8 REPARAÇÃO DO DNA ... 9 REFERÊNCIAS ... 104
INTRODUÇÃO
Uma das mais marcantes características dos organismos vivos é a capacidade de reprodução por várias gerações dando continuidade aos traços herdados através do moléculas que carregam informação genética: o ácido desoxirribonucleico, DNA.
Composto por uma sequência de subunidades monoméricas ligadas covalentemente chamadas nucleotídeos, o DNA é uma molécula tridimensional que fornece instruções não só para a formação de outros componentes celulares, mas também serve de molde para produção de moléculas idênticas, fundamental para a perpetuação da espécie e processos menos complexos, como a cicatrização de uma lesão.
A unidade básica do DNA consiste em uma fita composta por quatro subunidades monoméricas dispostas de forma precisa, o que é fundamental para a codificação da informação genética. O entrelaçamento de duas dessas fitas, que recebem o nome de cromátides, forma a dupla hélice de DNA. A divisão da célula visando a formação de um “clone”, depende, portanto, da duplicação prévia dessas de cada uma das fitas. A estrutura do DNA disposto em “dupla-hélice”, proposto por Watson e
Crick, abriu portas para a pesquisa desse processo de duplicação.
EXPERIMENTO DE
MESELSON-STAHL
O modelo de replicação do DNA foi descrito em 1958 por Meselson e Stahl. Inicialmente, três modelos de replicação foram propostos: conservativo, semi conservativo e dispersivo. O modelo semiconservativo, que corresponde ao que foi comprovado pelos pesquisadores, consiste na utilização de cada fita de DNA como molde para a formação de uma idêntica. Como resultado tem-se duas moléculas de DNA com uma fita original e uma fita nova.
Meselson e Stahl explicaram a replicação do DNA utilizando como modelo bactérias E. coli, as quase foram inicialmente cultivadas em um meio contendo o isótopo de nitrogênio N15, de modo a assimilarem
o isótopo às suas novas moléculas, inclusiva ao DNA. Posteriormente, as bactérias foram colocadas em um meio contendo um isótopo mais leve do nitrogênio, o N14, o qual seria incluído à
molécula de DNA bacteriana visto que seria o único nitrogênio disposto no meio. A observação da cultura de bactérias e a aferição da densidade do DNA por meio da centrifugação por gradiente de densidade,
5 permitiu a detecção de pequenas
diferenças de densidade, evidenciadas em “bandas”, como aquele entre o DNA marcado com N15 e o marcado com N14. A
partir de então, o DNA das quatro primeiras gerações de E. coli foi analisado. O DNA da geração 0 produziu uma única faixa de centrifugação correspondendo a presença do N15, único nitrogênio até
então disposto no meio. O DNA da próxima geração (Geração 1) também produziu uma única banda, no entanto, era superior e intermediária na densidade entre o N15 e N14, o que significa que as
moléculas de DNA feitas na primeira rodada de replicação eram híbridas de DNA leve e pesado, caindo por terra o modelo conservativo.
O modelo semiconservativo foi comprovado então na Geração 2 cuja centrifugação do NDA produziu duas bandas: uma estava na mesma posição que a banda intermediária da primeira geração, enquanto a segunda era superior, marcada apenas com N14. Sendo assim, o padrão de duas bandas distintas revelou a duplicação semiconservativa do DNA. Nas gerações seguinte (3 e 4), o modelo foi ainda reforçado pela observação das moléculas de DNA que apresentavam uma banda híbrida progressivamente mais fraca - representando uma fração menor do DNA total - e a banda leve
progressivamente mais forte – representando uma maior fração.
A REPLICAÇÃO DO DNA
Como mencionado anteriormente, para que uma célula forme outra idêntica, o conteúdo celular, inclusive o DNA, precisam ser idênticos em forma e número. Sendo assim, antes da divisão celular é preciso que haja a duplicação do DNA que, nos organismos eucariontes, ocorre no núcleo da célula durante a Fase S do ciclo celular. O processo de replicação do DNA pode ser dividido em três etapas:
1. Etapa de Iniciação
Esta primeira etapa consiste na abertura da molécula de DNA separando a estrutura de dupla hélice em duas fitas por meio do rompimento das pontes de hidrogênio, graças à ação da enzima helicase. Esse processo de abertura da dupla fita ocorre pelo reconhecimento de pontos específicos chamados de origem de
replicação. Esse reconhecimento é
realizado por um complexo multiproteico chamado Complexo
ORC (complexo de reconhecimento
de origem). A presença do ORC na origem serve para recrutar outras enzimas que darão continuidade ao processo.
6 A partir deste ponto de abertura da
dupla hélice formam-se as chamadas forquilhas de replicação cujo tamanho aumenta à medida que avança a separação das cadeias nas duas extremidades da forquilha.
A torção das fitas simples do DNA tornaria inviável a separação das cadeias pela helicase. Assim, temos as topoisomerases, enzimas com a função de diminuir a tensão das fitas de DNA desfazendo seu enovelamento por meio da quebra transitória de ligações fosfodiéster. Para evitar que as fitas de DNA molde voltem a se enovelar ou se embaracem à medida que estão sendo separadas, à elas se liga uma proteína chamadas SSB (do inglês, single strand DNA binding), cuja função é manter relativamente retos esses DNA simples impedindo o pareamento de bases complementares de suas próprias
cadeias.
2. Etapa de Elongação
As enzimas chamadas DNA
polimerases agregam sucessivos
nucleotídeos na extremidade 3' da cadeia em crescimento. As DNA
polimerases catalisam as ligações fosfodiéster que se produzem entre o OH do C3' da desoxirribose de um nucleotídeo e o fosfato ligado ao CS' do nucleotídeo recém-chegado. O segmento de DNA sintetizado a partir de uma origem de replicação é chamado de réplicon. O processo de replicação é concluído quando todos os réplicons se conectam. Os desoxirribonucleotidos de uma cadeia simples de DNA estão ligados entre si através de uma ligação fosfodiéster entre o carbono 3' do nucleotídeo anterior e o carbono 5' do nucleotídeo posterior. Deste modo, a cadeia de DNA apresenta uma extremidade livre, a 3' com um grupo hidroxilo e uma extremidade 5' livre com um grupo
fosfato. As cadeias ou fitas da dupla hélice estão dispostas de maneira antiparalelas, ou seja, com sentidos opostos, designando-se uma por 3’-5’ e a outra por 5’-3’, ligadas pelo estabelecimento de pontes de hidrogénio.
O segmento da cadeia-filha que cresce na direção 5' - 3' - cujo modelo é a cadeia progenitora 3' - 5 ' – é construída pela a agregação
7 extremidade 3' à medida que a
forquilha se desloca. No entanto, como mencionado anteriormente, a DNA polimerase atua somente no sentido 3´-5’, condição que, somada à disposição antiparalela das fitas de DNA, cria uma empasse visto que em cada forquilha os nucleotídeos de uma das cadeias correm na direção 5'-3' e os da outra o fazem na direção 3'-5', a primeira, ao se copiar, teria de gerar uma cadeia-filha na direção 3' -5', feito que nenhuma DNA polimerase pode realizar.
Como estratégia para driblar este empasse, a célula adota um processo de agregação descontínua para formar a outra cadeia-filha, que usa como molde a cadeia que corre na direção 5’-3’. Assim, formam-se pequenos fragmentos de DNA, chamados fragmentos de
Okasaki, que se ligam entre si à
medida que vão se formando. Para que a cadeia contínua comece a ser sintetizada, a DNA polimerase precisa se ligar à extremidade 3´da cadeia progenitora, a qual dispõe de uma pequena peça de RNA chamada primer, cuja formação é catalisada pela DNA primase. A
partir da formação do primer, a síntese da cadeia filha ocorre pela agregação sequencial de nucleotídeos na extremidade 3' dacadeia de crescimento seguindo a ordem marcada pelos nucleotídeos da cadeia de DNA que serve de molde.
Diferente da cadeia contínua que necessita de um só primer para sua síntese, a cadeia descontínua necessita que a DNA primase forma múltiplos primers, um para cada fragmento de Okasaki. A fita descontínua também é chamada de atrasada uma vez que cada fragmento de Okasaki começa a ser constituído depois que um segmento da cadeia contínua é sintetizado.
3. Etapa de Terminação
Esta etapa consiste no reconhecimento de sequências sobre as quais se fixam proteínas que bloqueiam o movimento de progressão das forquilhas de replicação. Quando a forquilha chega à extremidade de replicação, a cadeia contínua entra em contato com a cadeia descontínua, que avança na direção contrária.
8 Na fita contínua ou líder, a
replicação ocorre normalmente até o final da duplicação do molde. Na fita descontínua, porém, como ela está sendo sintetizada em sentido oposto, sua extremidade torna-se difícil de replicar. A solução é a ação das enzimas telomerases que sintetizam os telômeros, os quais são compostos de várias cópias de uma sequência consenso, assegurando assim que a fita descontínua seja replicada adequadamente até o término do processo de replicação. Os fragmentos de Okasaki das fitas descontínuas são unidas pela ação da enzima DNA ligase que solda a extremidade 3' dessas peças com a extremidade 5' dos fragmentos de Okasaki precedentes.
O local da terminação ocorre em uma região do DNA rica em G e T, denominada região Ter, que sinaliza o final do processo. Esta região apresenta sítios de ligação com a proteína Tus (substância de utilização do término), formando o complexo Ter-Tus, que bloqueia a forquilha de replicação pela inibição da atividade da helicase.
MUTAÇÕES DO DNA
O material genético encontra-se em constante perigo não somente por ação de agentes ambientais, mas também pelo próprio processo de replicação que está sujeito à erros. Quando as alterações do genoma envolvem um ou poucos nucleotídeos, denominam-se mutações gênicas. São exemplos de mutações:
• Mutações Pontuais: chamamos de
substituição a mutação que decorre da troca de um nucleotídeo por outro, dando lugar à um códon diferente e, consequentemente, à uma proteína com um aminoácido não correspondente.
• Mutações Frameshift: são
exemplos a deleção e a inserção de nucleotídeos. A eliminação ou o acréscimo de um nucleotídeo provoca situações mais graves, visto que não altera a leitura de um códon somente, mas altera o enquadramento dos códons no RNAm desde o local da mutação até o códon terminal, o que pode gerar uma proteína aberrante, ou até na interrupção de sua síntese já que muitas vezes pode haver um códon de terminação onde não deveria estar.
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REPARAÇÃO DO DNA
A ocorrência de um desses erros não necessariamente causará uma alteração, uma vez que pode ser reparada, isso porque para cada tipo de alteração do DNA existe um mecanismo de reparação especial dirigido por uma combinação de enzimas específicas.
Todas as polimerases apresentam atividade corretora, também chamada atividade hexonucleásica. Esta, ao contrário da atividade polimerásica que ocorre no sentido 3’-5’, ocorre no sentindo 5’-3’. Assim, a DNA polimerase, diante de um nucleotídeo erroneamente inserido, retrocede e o elimina. A DNA polimerase I de procariontes, apresenta ainda uma atividade corretora no sentido 5’-3’, ou seja, têm também a capacidade de corrigir erros à frente dela, o que também garante a retirada do primer ao final de replicação. Caso o mecanismo de reparação do próprio erro da Polimerase falhar, entra em ação um segundo mecanismo de reparação em que os nucleotídeos são removidos por uma nucleasse reparadora, a qual atua removendo os primers tanto na síntese contínua quando na descontínua. Sua ação dá-se pela quebra da ligação fosfodieéster entre o aminoácido colocado no local errado e aquele ao seu lado. A
reparação está completa quando a DNA polimerase beta sintetiza a peça faltando e a DNA ligase a une ao DNA cortado.
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REFERÊNCIAS
Bioquímica – Ácidos Nucleicos – Duplicação Semiconservativa (Professor Pedro Sultano). Jaleko Acadêmicos. Disponível em: <
https://www.jaleko.com.br>.
DE ROBERTIS, E. M. F. De Robertis Bases da Biologia Celular e Molecular. 4 ed. Rio De Janeiro: Guanabara Koogan, 2012.
LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 6ª Edição, 2014. Ed. Artmed.
