UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Educação Física
Daniele Jardim Feriani
ADAPTAÇÕES CARDÍACAS E AUTONÔMICAS AO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO OU RESISTIDO ASSOCIADO À ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA POR
BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA EM RATOS INFARTADOS
São Paulo 2016
UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Educação Física
Daniele Jardim Feriani
ADAPTAÇÕES CARDÍACAS E AUTONÔMICAS AO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO OU RESISTIDO ASSOCIADO À ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA POR
BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA EM RATOS INFARTADOS
Dissertação apresentada ao Programa Pós-Graduação Stricto-Sensu em Educação Física da Universidade São Judas Tadeu como requisito parcial à obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Érico Chagas Caperuto Coorientador: Prof. Dr. Bruno Rodrigues
São Paulo 2016
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Universidade São Judas Tadeu
Bibliotecária: Daiane Silva de Oliveira - CRB 8/8702
Feriani, Daniele Jardim
F356a Adaptações cardíacas e autonômicas ao treinamento físico aeróbico ou resistido associado à estimulação colinérgica por brometo de piridostigmina em ratos infartados/Daniele Jardim Feriani. - São Paulo, 2016.
94f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Érico Chagas Caperuto.
Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, 2016.
1. Exercícios físicos - Aeróbicos. 2. Infarto do miocárdio.3. Treinamento. I. Caperuto, Érico Chagas. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Educação Física. III. Título
EPÍGRAFE
“Sou, por meu gosto pesquisador. Experimento toda a sede de conhecer e a ávida inquietude de progredir, do mesmo modo que a satisfação que toda aquisição proporciona."
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação ao meu avô Walter de Mattos Jardim, que ao longo da minha vida me proporcionou todo o suporte necessário aos estudos, e me ensinou a realizar minhas conquistas de forma honesta e digna.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, sobretudo, a Deus.
Sou grata aos meus pais, Elizeu Feriani e Silvia Regina Jardim Feriani, e à minha irmã Juliane Jardim Feriani, por fazerem o máximo possível para me ajudar, cada um dentro de suas belas características, e por nunca terem me deixado desamparada.
Agradeço ao Bruno Rodrigues, por ter acionado o gatilho do amor pela pesquisa científica que havia em mim, e por ser minha fonte de inspiração.
Agradeço ao Érico Chagas Caperuto por me acolher de prontidão e braços abertos quando foi preciso, e às professoras Eliane Florêncio Gama, Alessandra Medeiros e Iris Callado Sanches pelas importantes considerações sobre meu trabalho. Também deixo registrado meu agradecimento aos integrantes do Laboratório do Movimento Humano (USJT) e do Laboratório de Hipertensão Experimental do Instituto do Coração (InCor/HC/FMUSP).
Há ainda muitas pessoas que ao longo desse trajeto acadêmico me auxiliaram, seja de forma técnica ou pessoal. Porém, eu seria injusta se as nomeasse e, por ventura, esquecesse de citar alguém, visto que algumas pessoas me ajudaram no início do processo, entretanto isso não as faz menos importante das que me ajudaram no final. De qualquer maneira, essas pessoas especiais já têm minha gratidão e contam com meu auxílio recíproco.
Sou grata à vida por esta oportunidade. Não aprendi somente conhecimentos acadêmicos neste caminho. Aprendi, algumas vezes de forma árdua, outras de forma alegre, a lidar com diferentes tipos de pessoas, a me conhecer mais, e a buscar sempre ser alguém melhor.
Agradeço o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) para a realização deste trabalho, sob número do processo 2014/03908-6.
SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS RESUMO 1. INTRODUÇÃO...16 1.1. Doenças Cardiovasculares ... 16
1.2. Controle Neuroendócrino da Pressão Arterial ... 17
1.3. Infarto do Miocárdio ... 20
1.4. Exercício Físico na Reabilitação Cardiovascular ... 23
1.5. Treinamento Físico Aeróbico ... 23
1.6. Treinamento Físico Resistido ... 25
1.7. Brometo de Piridostigmina ... 28 1.8. Justificativa ... 31 2. OBJETIVOS ... 33 2.1. Geral ... 33 2.2. Específicos ... 33 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 34 3.1. Animais e Grupos ... 34 3.2. Sequência Experimental ... 34 3.3. Procedimentos Experimentais ... 35
3.3.1. Indução do Infarto do Miocárdio ... 35
3.3.2. Tratamento com Brometo de Piridostigmina ... 35
3.3.3. Teste de Esforço, Teste de Carga Máxima e Treinamento Físico ... 36
3.3.4. Avaliações Ecocardiográficas ... 37
3.3.5. Canulação e Registro da Pressão Arterial ... 38
3.3.6. Avaliação da Sensibilidade do Barorreflexo ... 38
3.3.7. Duplo Bloqueio Farmacológico ... 39
3.3.8. Avaliação da Modulação Autonômica ... .39
3.3.9. Atividade da Acetilcolinesterase... 40
3.3.10. Análise Estatística ... .41
4. RESULTADOS ... .42
4.2. Capacidade Física ... 43
4.3. Consumo de Água e de Brometo de Piridostigmina ... 44
4.4. Atividade da Acetilcolinesterase ... 45
4.5. Avaliações Ecocardiográficas ... 45
4.5.1. Variáveis Morfométricas ... 45
4.5.2. Função Ventricular ... 48
4.6. Variáveis Hemodinâmicas ... 51
4.7. Variáveis Autonômicas Cardiovasculares ... 55
4.8. Modulação Autonômica ... 57
5. DISCUSSÃO ... 59
6. CONCLUSÃO ... 75
LISTA DE ABREVIATURAS
C Grupo Controle
IS Grupo Sedentário + Infarto
IP Grupo Sedentário + PIR + Infarto
ITA Grupo TF aeróbico + Infarto
ITAP Grupo TF Aeróbico + PIR + Infarto
ITR Grupo TR + Infarto
ITRP Grupo TR + PIR + Infarto
DCV Doenças cardiovasculares
IM Infarto do miocárdio
IC Insuficiência cardíaca
VE Ventrículo esquerdo
FC Frequência cardíaca
VFC Variabilidade da frequência cardíaca
PA Pressão arterial
PAS Pressão arterial sistólica PAD Pressão arterial diastólica
PAM Pressão arterial média
ACh Acetilcolina
PIR Brometo de Piridostigmina
TF Treinamento físico
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Peso Corporal Final ... 42
Figura 2. Teste de Esforço Máximo Inicial e Final ... 43
Figura 3. Teste de Carga Máxima Inicial e Final ... 44
Figura 4. Área de Infarto ... 45
Figura 5. Massa do Ventrículo Esquerdo ... 46
Figura 6. Diâmetro do Ventrículo Esquerdo em Sístole ... 47
Figura 7. Diâmetro do Ventrículo Esquerdo em Diástole ... 47
Figura 8. Fração de Encurtamento do Ventrículo Esquerdo ... 48
Figura 9. Velocidade de Encurtamento Circunferencial ... 49
Figura 10. Relação E/A... 49
Figura 11. Tempo de Relaxamento Isovolumétrico ... 50
Figura 12. Índice de Desempenho Miocárdico ... 50
Figura 13. Pressão Arterial Sistólica ... 51
Figura 14. Pressão Arterial Diastólica ... 52
Figura 15. Pressão Arterial Média ... 52
Figura 16. Frequência Cardíaca ... 53
Figura 17. Índice de Taquicardia Reflexa ... 54
Figura 18. Índice de Bradicardia Reflexa ... 54
Figura 19. Tônus Simpático ... 55
Figura 20. Tônus Vagal ... 56
RESUMO
Apesar dos avanços tecnológicos e científicos na prevenção e na intervenção durante um evento isquêmico agudo, ou mesmo em seu tratamento crônico, o infarto do miocárdio (IM) continua fazendo muitas vítimas em todo mundo. O desequilíbrio autonômico em favor da maior ativação do sistema nervoso simpático, e redução do parassimpático, propicia uma importante elevação na mortalidade, bem como parece estar associado a outras alterações nos pacientes após o IM, incluindo as alterações metabólicas, hormonais e imunológicas. O treinamento físico (TF) aeróbico é uma importante estratégia na prevenção e no tratamento das doenças cardiovasculares, principalmente associado às adaptações funcionais e do sistema nervoso autonômico. Apesar de, nos últimos anos, alguma atenção ter sido empregada ao treinamento físico resistido (TR) para pacientes com IM ou insuficiência cardíaca, as evidências acerca de seus benefícios ainda são escassas e os mecanismos pelos quais sua realização poderia atenuar as respostas cardiovasculares e autonômicas, bem como a mortalidade após o IM, permanecem pouco divulgados. Por outro lado, a estimulação colinérgica por brometo de piridostigmina (PIR) tem apresentado efeitos positivos clínica e experimentalmente, na resposta cardiovascular após o exercício máximo em pacientes com insuficiência cardíaca, bem como melhorada modulação vagal, redução da área de IM e aumento da angiogênese após a ligadura da artéria coronária de ratos. No entanto, associações entre estas estratégias nas alterações cardíacas autonômicas e funcionais provocadas pelo IM têm sido pouco estudadas e merecem atenção. Sendo assim, o objetivo deste estudo consistiu em avaliar os efeitos do TF aeróbico ou resistido, associados ao tratamento com PIR, nas respostas ventriculares, hemodinâmicas e autonômicas do IM. Para isso, ratos Wistar machos foram divididos nos seguintes grupos experimentais: controle Sham (C); infartado sedentário (IS); infartado sedentário + PIR (IP); infartado + TF aeróbico (ITA); infartado + TF aeróbico + PIR (ITAP); infartado + TR (ITR); infartado + TR + PIR (ITRP). A cirurgia de infarto ocorreu por meio da ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda. Os protocolos de TF e tratamento com PIR foram realizados por 90 dias. A área de IM, semelhante entre os grupos no início do protocolo (~38±5%), foi reduzida pelo TF aeróbico e pelo tratamento com PIR tanto isolado quanto associado aos treinamentos (IS: 45±4; IP: 30±2; ITA: 29±3; ITAP: 28±3; ITRP: 33±3%). Quanto à capacidade física, os animais infartados e sedentários apresentaram redução da capacidade aeróbica, bem como do desempenho no teste carga máxima. No entanto, o TF aeróbico e resistido minimizou tal prejuízo. A fração de encurtamento do ventrículo esquerdo, representante da função sistólica, foi melhorada nos grupos IP, ITA, ITAP e ITRP (C: 38±3; IS: 16±2; IP: 27±2; ITA: 35±2; ITAP: 38±1; ITRP: 28±2%). Nestes mesmos grupos, também ocorreu redução da frequência cardíaca (C: 325±3; IS: 356±8; IP: 322±8; ITA: 317±7; ITAP: 306±7; ITRP: 319±5bpm). A função diastólica, demonstrada pela relação E/A, obteve melhora com o fármaco e o TF aeróbico (C: 1,7±0,2; IS: 2,9±0,4; IP: 1,6±0,1; ITA: 1,5±0,3; ITAP: 1,6±0,2). Os grupos IP, ITA e ITAP apresentaram redução do tônus simpático (C: 46±4; IS: 68±6; IP: 50±3; ITA: 42±2; ITAP: 43±3bpm) e aumento do tônus vagal (C: 56±5; IS: 23±4; IP: 44±6; ITA: 49±4; ITAP: 50±4bpm). Estes grupos, bem como o grupo ITRP, reduziram a frequência cardíaca intrínseca (C: 375±10; IS: 344±14; IP: 307±5; ITA: 300±12; ITAP: 294±5; ITRP: 300±6bpm). Além disso, o TF aeróbico isolado e associado ao PIR também foi eficaz em melhorar a resposta taquicárdica (C: 3,30±0,14; IS: 1,70±0,18; IP: 2,37±0,39; ITA: 3,20±0,21; ITAP: 3,18±0,56bpm/mmHg) e bradicárdica (C: -2,10±0,30; IS: -0,60±0,08; IP: - 1,27±0,10; ITA: -2,10±0,10; ITAP: -1,98±0,23bpm/mmHg). A modulação autonômica cardiovascular também foi beneficiada pelo TF aeróbico e pelo tratamento com PR, podendo ser observada pelo desvio padrão do intervalo de pulso (C: 11,5±0,7; IS: 5,3±0,4; IP: 12,1±0,8; ITA: 9,2±0,3; ITAP: 11,4±0,8ms), variância do intervalo de pulso (C: 136±16; IS:
35±7; IP: 149±8; ITA: 125±12; ITAP: 144±10ms²) e banda de baixa frequência da pressão arterial (C: 3,5±0,4; IS: 6,9±1,1; IP: 4,5±0,3; ITA: 4,0±0,08; ITAP: 3,3±0,3mmHg²). Sendo assim, os dados do presente estudo sugerem que independentemente do tratamento com PIR, o TF aeróbico foi eficaz em promover benefícios hemodinâmicos, ventriculares e autonômicos em ratos submetidos ao IM. Por outro lado, quando o TR foi associado à inibição da acetilcolinesterase, benefícios adicionais foram obtidos na função sistólica e na FC dos animais estudados. Dessa forma, é possível que, pelas características intrínsecas de cada tipo de TF, os ratos infartados submetidos ao TR possam ter sido mais beneficiados com o tratamento com PIR em relação aos animais não tratados e treinados.
Palavras chave: Infarto do miocárdio; Função cardíaca; Função autonômica; Treinamento físico; Estimulação colinérgica.
ABSTRACT
Despite technological and scientific advances in prevention and intervention during an acute ischemic event, or even your chronic treatment, myocardial infarction (IM) continues to make many victims worldwide. The autonomic imbalance in favor of greater activation of the sympathetic nervous system, and reduced parasympathetic provides a significant increase in mortality, and appears to be associated with other changes in patients after IM, including metabolic, hormonal and immunological changes. The physical training (TF) aerobic is an important strategy in the prevention and treatment of cardiovascular diseases, mainly associated with functional adaptations and autonomic nervous system. Although in recent years, some attention has been employed to resistance exercise training (TR) for patients with IM or heart failure, evidence about its benefits are still scarce and the mechanisms, by which their achievement could attenuate cardiovascular and autonomic responses and mortality after IM, remain poorly disclosed. Furthermore, cholinergic stimulation pyridostigmine bromide (PIR) has shown clinical positive and experimentally, cardiovascular response after maximal exercise in patients with heart failure, as well as improved vagal modulation, reducing IM area and increased angiogenesis after ligation of coronary artery of rats. However, associations between these strategies in autonomic and functional cardiac changes caused by IM have been little studied and deserve attention. Thus, the aim of this study is to evaluate the effects of aerobic or resistance TF, associated with treatment with PIR, the ventricular response, hemodynamic and autonomic IM. To this end, male Wistar rats were divided into the following experimental groups: Sham control (C); infarcted sedentary (IS); sedentary infarcted + PIR (IP); infarcted + aerobic TF (ITA); infarcted + aerobic TF + PIR (ITAP); infarcted + TR (ITR); infarcted + TR + PIR (ITRP). The myocardial surgery occurred through ligation of the left anterior descending coronary artery. The TF treatment protocols and PIR were carried out for 90 days. The IM area, similar in both groups at the beginning of the protocol (~38±5%) was reduced by aerobic TF and treatment with PIR both isolated as associated with training (IS: 45±4; IP: 30±2; ITA: 29±3; ITAP: 28±3; ITRP: 33±3%). As for the physical, the infarcted animals and sedentary decreased aerobic capacity and performance at maximum load test. However, aerobic and resistance TF played such injury. The shortening fraction of the left ventricle, representative of systolic function has been improved in the IP group, ITA, ITAP and ITRP (C: 38±3; IS: 16±2; IP: 27±2; ITA: 35±2; ITAP: 38±1; ITRP: 28±2%). These same groups also occurred reduction in heart rate (C: 325±3; IS: 356±8; IP: 322±8; ITA: 317±7; ITAP: 306±7; ITRP: 319±5bpm). Diastolic function, demonstrated by the E/A ratio, obtained improvement with drug and aerobic TF (C: 1,7±0,2; IS: 2,9±0,4; IP: 1,6±0,1; ITA: 1,5±0,3; ITAP: 1,6±0,2). The IP, ITA and ITAP groups decreased sympathetic tone (C: 46±4; IS: 68±6; IP: 50±3; ITA: 42±2; ITAP: 43±3 bpm) and increased vagal tone (C: 56±5; IS: 23±4; IP: 44±6; ITA: 49±4; ITAP: 50±4bpm). These groups, as well as ITRP group reduced the intrinsic heart rate (C: 375±10; IS: 344±14; IP: 307±5; ITA: 300±12; ITAP: 294±5; ITRP: 300±6bpm). Moreover, aerobic TF alone and associated with PIR was also effective in improving tachycardic response (C: 3,30±0,14, IS: 1,70±0,18; IP: 2,37±0,39; ITA: 3,20±0,21; ITAP: 3,18±0,56bpm/mmHg) and bradycardia (C: -2,10±0,30; IS: - 0,60±0,08; IP: -1,27±0,10; ITA: -2,10±0,10; ITAP: -1,98±0,23bpm/mmHg). Cardiovascular autonomic modulation was also benefited by the TF aerobic and the treatment with PIR, it can be observed by the standard deviation of the pulse interval (C: 11,5±0.7; IS: 5,3±0,4; IP: 12,1±0,8; ITA: 9,2±0,3; ITAP: 11,4±0,8ms), the variance pulse interval (C: 136 ± 16; IS: 35± 7; IP: ± 149 8; ITA: 125 ± 12; ITAP: 144±10ms²) and low frequency band blood pressure (C: 3,5±0,4; IS:6,9±1,1; IP: 4,5±0,3; ITA: 4,0±0,08; ITAP: 3,3±0,3mmHg²). Thus, the data from
this study suggest that regardless of treatment with PIR, aerobic TF was effective in promoting hemodynamic, ventricular and autonomic benefits in the IM rats submitted. On the other hand, when TR was associated with inhibition of acetylcholinesterase, additional benefits were obtained in systolic function and FC of the animals studied. Thus, it is possible that the intrinsic characteristics of each type of TF, the infarcted rats submitted to TR may have more benefit from treatment with PIR compared to untreated animals and trained.
Key words: Myocardial infarction; Cardiac function; Autonomic function; Physical training; Cholinergic stimulation.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doenças cardiovasculares
Em 1996, a Organização Mundial da Saúde publicou um índice global de doenças, listando as principais causas de morte em 1990 e fazendo uma projeção das causas para 2020. Em 1990, a doença isquêmica cardíaca encontrava-se na quinta posição e, de acordo com a projeção, passará para a primeira em 2020 (MURRAY e LOPEZ, 1996).
Essa projeção já começou a se confirmar, visto que atualmente as doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de mortalidade no mundo (WHO, 2011), e responsáveis por ocasionar em torno de 300 mil mortes anuais no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). Adicionalmente, dentre as DCV, a que apresenta maior percentual de mortalidade é a doença arterial coronariana (GO et al., 2013).
Ao se tratar de DCV, é válido citar os fatores de risco que as ocasionam. A cidade de Framingham, em Massachusetts, foi selecionada para ser o local de um estudo cardiovascular de grande proporção. Inicialmente foram selecionados 5.209 residentes saudáveis entre 30 e 60 anos de idade para uma avaliação clínica e laboratorial extensiva, e a cada 2 a 4 anos esta população e suas gerações descendentes foram reavaliadas. As diversas publicações provenientes deste estudo identificaram como fatores de risco da aterosclerose e suas manifestações clínicas: o tabagismo, níveis elevados de colesterol LDL, baixos de HDL, hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus, obesidade, síndrome metabólica, consumo excessivo de álcool, sedentarismo e história familiar (POLANCZYK, 2005).
1.2. Controle neuroendócrino da pressão arterial
É válido fazer uma abordagem sobre os mecanismos regulatórios da pressão arterial (PA), visto que a pressão sanguínea em níveis adequados e constantes é fator determinante de boa perfusão tecidual. Além disso, o conhecimento de tais mecanismos auxilia na compreensão das complicações agudas e crônicas do IM.
Ao longo de um dia ocorrem alterações importantes de fluxo, devido aos diferentes comportamentos do indivíduo. Entretanto, essas modificações não provocam grandes mudanças nos níveis pressóricos, pois há complexos mecanismos interagindo para manter a PA dentro de uma faixa com pouca variação (IRIGOYEN et al., 2005).
São diversos os mecanismos reguladores da pressão. Há os de resposta rápida e moderadamente rápida, obtidos via pressorreceptores, quimiorrecptores, receptores cardiopulmonares e também pela ação de hormônios circulantes; e o mecanismo de longa duração, no qual os rins são os reguladores (FAVARATO e LUZ, 2003).
O controle momento a momento da PA é efetuado por mecanismos neurais e hormonais que ajustam os desvios dos níveis basais da pressão, para mais ou para menos. A resposta neural é imediata na correção desses desvios, mas seu efeito pode prolongar-se por minutos ou horas por meio da ação de mecanismos hormonais (AIRES, 2008).
Os pressorreceptores arteriais (barorreceptores ou mecanorreceptores) são o mecanismo mais importante de controle reflexo da PA. Estão localizados na crossa da aorta e no seio carotídeo e são constituídos por terminações nervosas livres situadas na camada adventícia, que funcionam como mecanorreceptores sensíveis à distensão circunferencial da parede do vaso e/ou tensão determinadas pela variação da pressão intravascular (IRIGOYEN et al., 2005). Durante elevações da PA, a deformação da parede excede a deformação na situação basal durante todo o ciclo cardíaco, sendo gerados numerosos potenciais de ação na
sístole e na diástole. Já quando ocorre queda da pressão, o vaso é pouco distendido, sendo reduzida consideravelmente a gênese de potenciais de ação (AIRES, 2008).
Quanto aos mecanismos neurais, quando a PA se eleva acima dos valores basais, a distensão vascular é aumentada, bem como a atividade aferente dos nervos depressor aórtico e sinusal que, por sua vez, estimulam neurônios do núcleo do trato solitário do bulbo. Esses neurônios estimulam locais específicos do bulbo, gerando aumento do tônus vagal ao coração, reduzindo a frequência cardíaca (FC) e o tônus simpático aos vasos. Além das respostas neurais, os barorreceptores também controlam a liberação de vários hormônios que participam da manutenção dos níveis basais de pressão. Durante a queda mantida da PA e hipovolemia, há maior liberação de adrenalina, noradrenalina, e vasopressina, bem como aumento dos níveis plasmáticos de renina. Já quando ocorre aumento da PA e hipervolemia, menos catecolaminas adrenais são liberadas, permitindo redução da liberação de renina e vasopressina, e aumento dos níveis plasmáticos de ocitocina e do peptídeo atrial natriurético (AIRES, 2008).
O sistema renina-angiotensina também faz parte da regulação neuro-hormonal da PA comandada pelos barorreceptores. A angiontensina II é o produto biologicamente ativo mais potente desse sistema. Tal componente promove a contração direta das células do músculo liso vascular, aumenta a contratilidade do miocárdio, estimula a produção de aldosterona e a liberação de catecolaminas da medula adrenal e terminações nervosas simpáticas, aumenta a atividade do sistema nervoso simpático, além de regular o transporte de sódio por células epiteliais no intestino e nos rins (KOBORI et al., 2007).
Em relação aos quimiorreceptores, eles estão localizados em corpúsculos carotídeos e aórticos e são constituídos por células capazes de detectar alterações da pressão parcial de oxigênio (pO2), pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2) e concentração hidrogeniônica
(pH) do sangue. Além de promover respostas ventilatórias, a estimulação dos quimiorreceptores periféricos também gera alterações no sistema cardiovascular, proporcionando não somente a manutenção da composição química do sangue em níveis ideais, mas também adequando a perfusão sanguínea para os tecidos. Sendo assim, quando ocorre aumento ou queda de pO2, pCO2 e/ou pH, os quimiorreceptores são estimulados e geram respostas homeostáticas para corrigir essas variações (IRIGOYEN et al., 2005).
Há três grupos de receptores cardiopulmonares, que são ativados por mudanças na pressão das câmaras cardíacas. O primeiro grupo, localizado nas junções veno-atriais, é ativado pelo enchimento e contração atriais. Esses receptores promovem reflexamente aumento da FC devido à elevação da atividade simpática para o nodo sino-atrial. O aumento da FC auxilia na manutenção do volume cardíaco relativamente constante durante aumentos no retorno venoso. O segundo grupo de receptores cardiopulmonares possui aferências não-mielinizadas que trafegam pelo vago. Quando ativadas, reduzem a atividade simpática e aumentam a atividade vagal para o coração. A modulação na atividade simpática comandada por esses receptores é importante na regulação da resistência vascular renal. Já o terceiro grupo transita junto aos aferentes cardíacos simpáticos até a medula espinhal. São aferentes mielinizados e não mielinizados ativados por estímulos mecânicos ou por substâncias produzidas/liberadas no próprio miocárdio. Os poucos estudos sobre a ação dos aferentes espinhais no controle reflexo da circulação indicam que os mecanorreceptores espinhais sinalizam a pressão de perfusão e/ou o fluxo sanguíneo nas coronárias, induzindo potente vasodilatação durante situações isquêmicas (IRIGOYEN et al., 2005; AIRES, 2008).
Já a homeostase do volume dos fluidos corporais e a regulação em longo prazo da PA estão relacionadas via mecanismo de feedback rim/fluidos corporais. O componente central desse mecanismo é o efeito da PA na excreção renal de sódio e água, chamado de mecanismo
natriurese/diurese pressórica. Por meio dele, a manutenção da pressão em longo prazo é alcançada pelo controle da excreção renal de sódio e água. O aumento prolongado da PA provoca maior excreção de sódio e água, enquanto sua queda faz com que diminua a excreção renal dos mesmos, para assim a pressão retornar ao valor normal (AIRES, 2008).
1.3. Infarto do miocárdio
O infarto do miocárdio (IM) não é um evento instantâneo e sim resultado da aterosclerose de algum dos ramos da artéria coronária, uma doença classificada como multifatorial, com característica evolutiva, lenta e crônica que resulta em respostas celulares e moleculares deletérias (GOTTLIEB et al., 2005).
A formação da placa aterosclerótica inicia-se com a disfunção endotelial, que aumenta a permeabilidade da camada íntima arterial às lipoproteínas plasmáticas, favorecendo a retenção das mesmas no espaço subendotelial e levando à oxidação. Também ocorre o surgimento de moléculas de adesão leucocitária na superfície endotelial, sendo os macrófagos repletos de lipídeos, o principal componente das estrias gordurosas. A placa aterosclerótica plenamente desenvolvida possui um núcleo lipídico rico em colesterol e uma capa fibrosa rica em colágeno. A ruptura dessa capa expõe material lipídico que leva à formação de um trombo sobrejacente (SBC, 2007).
A aterosclerose pode ter início na fase fetal, intrauterina, progredir lentamente na adolescência e se agravar na idade adulta (MC GILL et al., 2000). No envelhecimento, o aumento da exposição ao estresse e as mudanças nas vias de sinalização alteram a biologia dos cardiomiócitos, ocorrendo acúmulo de resíduos metabólicos e organelas que bloqueiam a reciclagem intracelular e aumentam a possibilidade de ocorrer apoptose (SHIH et al., 2011).
Sendo assim, o IM é definido como a morte celular miocárdica devido a uma isquemia prolongada. A morte celular não é imediata após o período isquêmico, leva um período de em torno vinte minutos, e todo o processo que conduz a um infarto cicatrizado demora geralmente 5 a 6 semanas (THYGESEN et al., 2012).
Após o IM, o sistema cardiovascular dá início a mecanismos compensatórios, sendo eles expansão da área de infarto, ativação neuro-humoral, hipertrofia miocárdica e dilatação ventricular global. A expansão precoce da zona de infarto está relacionada com a subsequente dilatação do ventrículo esquerdo, visto que o estresse parietal aumentado é redistribuído para preservar o volume de ejeção (MANN, 2005).
O ventrículo esquerdo (VE) dilata-se progressivamente e assume uma forma mais esférica com contorno elíptico. Num primeiro momento, a dilatação ventricular pode ser considerada benéfica, pois mantém o volume por meio do mecanismo de Frank-Starling. Entretanto, passa a ser prejudicial, visto que exerce demandas adicionais sobre o miocárdio sobrevivente devido ao aumento da tensão da parede, fazendo com que ele deixe de manter a hemodinâmica em condições de normalidade (YOUSEF et al., 2000).
Vários processos moleculares e celulares geram prejuízo do quadro clínico, incluindo a apoptose de miócitos cardíacos, particularmente na zona peri-infarto, autofagia e redução na capacidade proliferativa de novos cardiomiócitos (SHIH et al., 2011).
A perda de células em curso e a incapacidade de substituir as células perdidas podem contribuir para a deterioração da função cardíaca. Quanto maior a massa ventricular envolvida em um evento isquêmico, seu débito cardíaco, volume sistólico, pressão arterial e função de bombeamento do VE diminuem, enquanto a pressão diastólica final do VE tende a aumentar (JORGE et al., 2011; RODRIGUES et al., 2012). Em longo prazo, o volume ventricular esquerdo é um marcador sensível da disfunção ventricular pós-infarto, e o volume sistólico
final do VE é um dos mais importantes preditores independentes de prognóstico (YOUSEF et al., 2000).
Na tentativa de manter o débito cardíaco pós-infarto, também ocorrem mudanças autonômicas, como desequilíbrio simpatovagal com predominância do sistema nervoso simpático e diminuição da sensibilidade barorreflexa que, com o passar do tempo, podem conduzir à insuficiência cardíaca (IC) com arritmogênese (MOUSA et al., 2014).
Estudos realizados com modelo animal evidenciam o prejuízo da função autonômica após a oclusão da artéria coronária. O IM crônico resulta em maior disfunção barorreflexa, redução da variabilidade da frequência cardíaca total e da modulação parassimpática, bem como aumento da modulação simpática (MOSTARDA et al., 2010; BARBOZA et al., 2012).
O processo inflamatório concomitante a elaboração de citocinas também são partes integrantes da resposta a uma lesão tecidual e desempenham um papel ativo após o IM. De acordo com Nian et al. (2004), as citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6) são liberadas logo após a lesão isquêmica aguda e podem regular a sobrevivência dos miócitos ou apoptose. No entanto, as citocinas quando expressas em alta concentração induzem anormalidades no metabolismo cardíaco e podem levar à IC (DIWAN et al., 2003).
Sabendo-se, então, como o organismo funciona em condições de normalidade para manter a homeostase, e também quais são os mecanismos compensatórios realizados pelo sistema cardiovascular após o IM, será abordada a influência do treinamento físico e da intervenção farmacológica nessa condição patológica.
1.4. Exercício Físico na Reabilitação Cardiovascular
Segundo a Sociedade Brasileira de Cardiologia (2005), a reabilitação cardiovascular compreende atividades que garantam aos pacientes acometidos por DCV as melhores condições física, mental e social, permitindo que eles retornem a uma vida ativa e produtiva. Inicialmente, o exercício físico não fazia parte dos programas de reabilitação, por ser considerado perigoso para esses pacientes. Entretanto, após a observação de grande perda da capacidade funcional dos pacientes acometidos e sua baixa condição de voltar às atividades cotidianas, os efeitos do treinamento físico (TF) passaram a ser estudados e, posteriormente, essa prática foi inserida nos programas de reabilitação cardiovascular.
O exercício físico presente na reabilitação permite redução das taxas de mortalidade cardíaca e por todas as causas, contribui para a diminuição da ocorrência de outros eventos coronarianos, e melhora o controle dos fatores de risco bem como a qualidade de vida (RICARDO e ARAÚJO, 2006). A recomendação para cardiopatas envolve exercício aeróbico de intensidade moderada, complementado por exercícios resistidos e aqueles para a melhoria da flexibilidade (THOMPSON, 2005).
1.5. Treinamento Físico Aeróbico
Está estabelecido que o TF aeróbico é uma ótima estratégia para o tratamento de pacientes com doença arterial coronariana, acometidos ou não por um IM. Uma meta-análise, pautada em 48 estudos randomizados e controlados (8940 pacientes), evidenciou que programas de reabilitação cardiovascular baseados em exercícios aeróbicos reduziram todas as causas de mortalidade em 20% e mortalidade por doença cardiovascular em 26% em pacientes após um IM, angina pectoris e/ou doença arterial coronariana (TAYLOR et al., 2004).
Em outro estudo de metanálise, baseada em 34 estudos, foi demonstrado que a realização de exercícios aeróbicos resultou em uma diminuição estatisticamente significativa de novos infartos, na mortalidade cardiovascular e naquelas por qualquer outra causa. Também foi verificado que mesmo que o TF tenha sido praticado por um curto período (1 a 3 meses), essa prática foi de grande eficiência, pois os benefícios globais observados persistiram para além do período de intervenção ativa após o IM (LAWLER et al., 2011).
Uma das adaptações positivas ao TF aeróbico, geralmente associada à redução da mortalidade, é a do sistema nervoso autonômico. La Rovere et al. (2002) avaliaram pacientes infartados submetidos a 4 semanas de treinamento aeróbico, comparados com um grupo infartado controle. O grupo treinado obteve melhora da sensibilidade barorreflexa e apresentou equilíbrio autonômico direcionado para um aumento da atividade vagal. Além disso, todos os pacientes foram acompanhados por 10 anos, e foi observado que o grupo treinado teve melhor sobrevida, fato que foi associado à melhora vagal.
Experimentalmente, o TF aeróbico foi eficaz em gerar adaptações positivas na hemodinâmica, na função cardíaca e autonômica, bem como em reduzir a mortalidade de ratos infartados (BARBOZA et al., 2012).
No que diz respeito aos aspectos inflamatórios, Adamopoulos et al. (2001) investigaram os efeitos do TF aeróbico sobre a atividade sérica de marcadores inflamatórios periféricos associados com a disfunção endotelial em vinte pacientes (59±2 anos) com IC crônica de moderada a severa. O protocolo de treinamento consistiu em 12 semanas de bicicleta ergométrica (30 minutos; 5 vezes por semana; 70-80% FC máx.). Foi concluído que o treinamento melhorou o quadro inflamatório periférico, por meio da ativação de leucócitos e da migração dessas células a partir da circulação para as áreas inflamadas.
Em estudo com ratos infartados, Rodrigues et al. (2014) mostraram que três meses de treinamento aeróbico foram benéficos para a modulação autonômica, melhora esta mantida após um mês de destreinamento e associada com o perfil inflamatório reduzido no ventrículo esquerdo e no tecido adiposo dos animais treinados.
Crescentes evidências indicam que o exercício iniciado logo após o IM pode melhorar a função cardíaca, pelo aumento do volume sistólico máximo, fração de ejeção e atenuação da deterioração contrátil do VE, além de poder atenuar a deterioração da função cardíaca. Esses efeitos benéficos podem estar associados com a proliferação de cardiomiócitos, angiogênese, atenuação da apoptose em cardiomiócitos, melhora da função dos miofilamentos e da manipulação do cálcio intracelular (CHEN et al., 2014).
Dessa forma, o TF aeróbico vem sendo considerado uma importante ferramenta no tratamento do IM, principalmente no que se refere à redução da resposta inflamatória crônica e melhora da modulação autonômica, reduzindo assim o trabalho cardíaco, o risco de arritmias fatais e aumentando a sobrevida nos indivíduos acometidos.
1.6. Treinamento Físico Resistido
Em 2007, a American Heart Association atualizou seu parecer sobre as justificativas para prescrição do treinamento resistido (TR) para pacientes com DCV. Esse tipo de treinamento, quando prescrito corretamente e supervisionado, promove aumento da força e resistência muscular, da capacidade funcional e da qualidade de vida, tanto em indivíduos saudáveis como em cardiopatas (WILLIAMS et al., 2007).
Tem sido demonstrado que o exercício resistido permite estabilidade cardiovascular em pacientes com doença coronariana ou insuficiência cardíaca, sem aparentes prejuízos na
função ventricular ou aumento exacerbado na PA. De forma complementar, a PA em repouso também parece ser influenciada pelo TR crônico, apresentando leve redução tanto para a PA sistólica quanto para a diastólica (UMPIERRE e STEIN, 2007).
Uma meta-análise realizada por Cornelissen et al. (2011) evidenciou que o TR dinâmico pode diminuir significativamente os níveis pressóricos, aumentar o VO2 máximo, além de diminuir a gordura corporal e os triacilgliceróis plasmáticos. Em relação à redução do risco cardiovascular, um estudo de Tanasescu et al. (2002) mostrou que a prática semanal de 30 minutos ou mais de TR está associada à diminuição no risco para ocorrência de IM e/ou doenças cardiovasculares.
Alves et al. (2014) avaliaram os efeitos de oito semanas de TR em ratos com insuficiência cardíaca. O treinamento foi eficaz em promover melhoras no ganho de força, na função hemodinâmica, na deposição de colágeno e no perfil inflamatório desses animais . Ao avaliar ratos infartados submetidos a três meses de TR dinâmico , Grans et al . ( 2014) observaram que , apesar de o treinamento naõter ocasionado mudanças expressivas na funçaõ ventricular, foi eficaz em reduzir o estresse cardíaco global e melhorar de forma significativa a modulação autonômica cardíaca e vascular dos animais.
Já no estudo realizado por Vona et al. (2009), foram comparados os efeitos do exercício aeróbico, combinado e resistido na função endotelial de pacientes com IM recente. Como resultado, o TR foi, de forma semelhante aos demais, eficiente em melhorar a função endotelial desses pacientes.
Pu et al. (2001) ressaltaram a segurança do treinamento resistido para pacientes com IC crônica. Ao longo e após 10 sessões de treinamento, não foram observadas isquemia sintomática, arritmias, comprometimento hemodinâmico, e problemas na função cardíaca.
Como benefícios, houve aumento da força e resistência muscular e da distância percorrida no teste de caminhada de 6 minutos.
Em uma revisão de literatura que avaliou estudos sobre exercícios resistidos para indivíduos com doença arterial coronariana ou IM, foram encontrados como benefícios da prática o aumento da capacidade física, da força muscular, melhora do estado emocional e da qualidade de vida, sem ocorrência de riscos provenientes do treinamento. Dessa forma, os autores concluíram que os exercícios resistidos são uma estratégia positiva nos programas de promoção de saúde para pacientes coronarianos, tornando melhor a reabilitação social, física e psicológica para esses pacientes (OLIVEIRA et al., 2008).
É válido ressaltar a importância da realização do TR pela população idosa, visto que o envelhecimento ocasiona decréscimo da força muscular proveniente de mecanismos musculares, neurológicos e ambientais. O déficit de força pode causar diminuição da velocidade da marcha e aumentar o risco de quedas. Os sistemas responsáveis pelo equilíbrio também são alterados com o envelhecimento, deixando os idosos mais suscetíveis a problemas funcionais. Visto, então, que a força e a potência são necessárias na maior parte das atividades da vida diária, o TR se mostra importante para o aumento de força, melhora funcional, e consequente aumento da independência dos praticantes (DE ARAÚJO et al., 2010).
Sendo assim, o treinamento resistido tem sido considerado seguro e eficaz para indivíduos cardiopatas, gerando, além de benefícios na força muscular, melhoras hemodinâmicas e autonômicas.
1.7. Brometo de Piridostigmina
A busca por fármacos com ação cardioprotetora, capazes de reduzir a ocorrência de eventos cardíacos em pacientes coronariopatas e/ou infartados, é de grande relevância. Nesse sentido, a utilização de inibidores da acetilcolinesterase, como o brometo de piridostigmina (PIR), tem se mostrado eficiente (ANDRONE et al., 2003).
O PIR é um agente anticolinesterásico utilizado há muitos anos para tratar a miastenia gravis (MAGGI e MANTEGAZZA, 2011) e tem efeitos conhecidos na profilaxia contra intoxicação por organofosforados (KEELER et al., 1991).
Caracterizando esse fármaco, de acordo com o Banco de Drogas, trata-se de um parassimpaticomimético e inibidor reversível de colinesterase. A piridostigmina inibe a acetilcolinesterase na fenda sináptica por competir com a acetilcolina (ACh) para fixação da acetilcolinesterase, retardando a hidrólise da ACh, aumentando assim a eficiência da transmissão colinérgica na junção neuromuscular e prolongando os efeitos da ACh. Esse fármaco é fracamente absorvido a partir do trato gastrointestinal, seu metabolismo consiste em hidrólise por colinesterases e pelo fígado, e sua excreção é renal.
Em relação ao sistema cardiovascular, a estimulação colinérgica por PIR tem proporcionado melhorias autonômicas e hemodinâmicas. Recentemente, foi avaliada a influência do tratamento com esse fármaco por 7 dias (0,14 mg/ml/dia) na função autonômica de ratos após o IM. O grupo infartado tratado melhorou a frequência cardíaca intrínseca e o tônus vagal, bem como reduziu o tônus simpático e a área de infarto em relação ao grupo infartado placebo (DE LA FUENTE et al., 2013). Adicionalmente, um estudo de Lataro et al. (2013) demonstrou que a administração em longo prazo de PIR aumentou o tônus vagal cardíaco e reduziu o tônus simpático, atenuando o remodelamento cardíaco e a disfunção ventricular esquerda durante a progressão da IC em ratos.
Yu et al. (2011) mostraram que o tratamento com piridostigmina (30 mg/kg/dia) melhorou a densidade capilar e aumentou a angiogênese após o IM em ratos. Também por meio de estudo com modelo animal, Durand et al. (2014) concluíram que a administração desse fármaco iniciada imediatamente após o IM é uma intervenção farmacológica importante para proteger as alterações no desequilíbrio autonômico cardíaco.
Já em relação ao exercício físico, em alguns pacientes, o PIR corrigiu a frequência cardíaca de recuperação, previamente anormal, aumentou a variabilidade da frequência cardíaca e diminuiu a densidade de arritmias ventriculares após um teste de esforço (SERRA et al., 2009).
Estudo de Androne et al. (2003) caracterizou os efeitos da inibição da acetilcolinesterase com PIR no tônus parassimpático em pacientes com IC crônica. Para isso, avaliaram 20 indivíduos ambulatoriais (55±3 anos), com IC crônica estável. Foi administrada de forma oral uma dose única de 30 mg de PIR e uma de placebo em dias diferentes. Os resultados mostraram que a recuperação da frequência cardíaca em 1 minuto após o exercício foi significativamente maior após a administração de PIR do que após a de placebo, sendo sugerido pelos autores que o fármaco aumenta o tônus parassimpático em pacientes com insuficiência cardíaca.
Para explorar os efeitos do PIR, Castro et al. (2006) avaliaram o que este fármaco ocasiona nos parâmetros eletrocardiográficos após exercício máximo na cardiopatia isquêmica. A amostra foi composta por 14 pacientes com doença coronariana que foram submetidos a teste máximo de exercício cardiopulmonar em esteira, duas horas após a administração oral de placebo ou PIR (45 mg). Foram mensurados os intervalos RR (um batimento cardíaco) e intervalos QT (tempo que decorre desde o princípio da despolarização até o fim da repolarização dos ventrículos) ao longo das derivações eletrocardiográficas no
primeiro e no terceiro minuto da recuperação ativa do exercício. Como resultado, o PIR reduziu o intervalo QT no primeiro minuto de recuperação ativa, quando comparado ao placebo, e dois pacientes que apresentavam frequência cardíaca de recuperação (1 minuto) abaixo dos valores normais tiveram correção desta variável após a ingestão de PIR.
Aprofundando no perfil hemodinâmico e autonômico, Serra et al. (2009) avaliaram o efeito do PIR sobre as respostas fisiológicas integradas para o exercício dinâmico na insuficiência cardíaca. A amostra foi composta por 23 pacientes com IC crônica (48±12 anos), submetidos a três testes de exercício cardiopulmonar máximo em esteira, em dias diferentes. O primeiro ensaio foi usado para adaptação e determinação da tolerância ao exercício, e os outros testes foram realizados após administração oral de PIR (45 mg, 3 vezes/dia, durante 24 horas) ou placebo, em ordem aleatória. Os resultados do estudo supracitado demonstraram que o PIR reduziu a atividade da colinesterase, inibiu a resposta cronotrópica durante o treino em até 60% do esforço e melhorou a frequência cardíaca de reserva e frequência cardíaca de recuperação no primeiro minuto após o exercício. O pulso de oxigênio, um indicador indireto de volume sistólico, foi maior sob o uso do PIR durante o exercício submáximo, concluindo que a mesma foi bem tolerada pelos pacientes com insuficiência cardíaca, levando à melhora do perfil hemodinâmico durante o exercício.
Nesse sentido, o brometo de piridostigmina parece ser um fármaco de escolha interessante por melhorar a função autonômica e sua resposta ao exercício em pacientes infartados ou com insuficiência cardíaca, além de induzir alterações autonômicas e estruturais importantes em animais submetidos à oclusão da artéria coronária.
1.8. Justificativa
Apesar dos avanços tecnológicos e científicos na prevenção e na intervenção durante um evento agudo, ou mesmo em seu tratamento crônico, o IM continua fazendo muitas vítimas em todo mundo e contribuindo negativamente para as estatísticas em saúde pública (GO et al., 2013). O desequilíbrio autonômico em favor da maior ativação do sistema nervoso simpático, e redução do parassimpático, propicia uma importante elevação na mortalidade (LA ROVERE et al., 1998), bem como parece preceder outras alterações nos pacientes após o IM, incluindo as alterações metabólicas, hormonais e imunológicas. Além disso, a redução do componente vagal parece ser um fator adicional importante na exacerbação da resposta inflamatória após IM (LAWLER et al., 2011).
Sabidamente, o TF aeróbico é uma importante estratégia, de relativa facilidade metodológica, na prevenção e no tratamento das DCV, principalmente associado às adaptações funcionais e do sistema nervoso autonômico. Apesar de, nos últimos anos, alguma atenção ter sido empregada ao TR para pacientes com IM ou IC, as evidências acerca de seus benefícios ainda são escassas. No entanto, embora os efeitos do TF aeróbico, e mais recentemente do TR, sejam conhecidos no tratamento das DCV, os mecanismos pelos quais suas realizações poderiam atenuar as respostas cardiovasculares e autonômicas, bem como a mortalidade após o IM, permanecem pouco divulgados.
Por outro lado, a estimulação colinérgica por brometo de piridostigmina tem apresentado efeitos positivos clínica e experimentalmente. A utilização desse fármaco melhorou a resposta cardiovascular após o exercício máximo (TALEBI-GARAKANI e SAFARZADE, 2013) em pacientes com insuficiência cardíaca, bem como melhorou a modulação vagal, reduziu área de IM e aumentou a angiogênese após a ligadura da artéria coronária de ratos (BROOKS e WHITE, 1987; HORNBERGER e FARRAR, 2004;
RODRIGUES et al., 2007). No entanto, associações entre estas estratégias, TF (aeróbico ou resistido) e administração de PIR, nas alterações cardíacas autonômicas e funcionais provocadas pelo IM têm sido pouco estudadas e merecem atenção. Dessa forma, a realização deste estudo pode ter um impacto clínico relevante, esclarecendo mecanismos de prevenção e/ou atenuação dos efeitos adversos de um evento isquêmico.
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar os efeitos do TF aeróbico ou resistido, associados ao tratamento com brometo de piridostigmina, nas respostas ventriculares, hemodinâmicas e autonômicas do infarto do miocárdio em ratos.
2.2. Específicos
Estudar os efeitos do TF aeróbico ou resistido, associados ao tratamento com brometo de piridostigmina, nas seguintes variáveis:
- aspectos morfométricos e funcionais cardíacos; - perfil hemodinâmico e frequência cardíaca;
- sensibilidade barorreflexa, tônus vagal, tônus simpático e frequência cardíaca intrínseca; - modulação autonômica cardíaca e vascular.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais e Grupos
Foram utilizados ratos Wistar machos (aproximadamente 240g) provenientes do biotério da Universidade São Judas Tadeu (USJT). O presente projeto obteve a aprovação da Comissão de Ética em Uso de Animais de Experimentação (CEUA/USJT – n. 008/2013). Os animais foram mantidos agrupados, em ambiente com temperatura (22o – 24 oC) e com luz controlada em ciclo de 12 horas (claro:escuro). Água e comida foram oferecidas de modo irrestrito, sendo que a dieta era normoproteica (12% de proteínas).
Os animais foram submetidos ao IM ou cirurgia fictícia (Sham) e, após 1 semana de IM, foram treinados/tratados por 3 meses. Os animais dos grupos infartados incluídos nesse estudo deveriam apresentar área de infarto entre 30-45%, avaliada ao ínicio do protocolo experimental através do ecocardiograma. Foram exluídos do estudo 9 animais, 6 por apresentarem uma área de infarto menor e 3 com área de infarto maior que a faixa percentual citada acima. Dessa forma, os animais foram randomizados e alocados nos seguintes grupos experimentais: controle Sham (C, n=9); infartado sedentário (IS, n=12); infartado sedentário + PIR (IP, n=10); infartado + TF aeróbico (ITA, n=9); infartado + TF aeróbico + PIR (ITAP, n=9); infartado + TR (ITR, n=9); infartado + TR + PIR (ITRP, n=9). Durante o protocolo, foram observadas 3 mortes no grupo IS e 1 no grupo IP. Assim, as avaliações propostas no presente estudo contaram com um n=9 por grupo experimental.
3.2. Sequência Experimental
A sequência experimental está descrita a seguir:
Sham TE TE TCM IM TCM 1 semana 1 semana 3 meses ECO, ECO, TE e TCM Tratamento / TF Avaliações hemodinâmicas e autonômicas 34
Na qual: IM – infarto do miocárdio; TE – teste de esforço máximo; TCM – teste de carga máxima; ECO – Avaliação ecocardiográfica; TF – treinamento físico (aeróbico ou resistido).
3.3. Procedimentos Experimentais
3.3.1. Indução do Infarto do Miocárdio
Os animais foram anestesiados com uma mistura de Cetamina (80 mg/Kg) e Xilazina (12 mg/Kg) por via intraperitoneal. Foram submetidos à respiração artificial em pressão positiva (Harvard Aparattus©, Model 683, Holliston, MA) e a artéria coronária descendente anterior esquerda foi ocluída a aproximadamente 1 mm de sua origem, abaixo da extremidade do átrio esquerdo (fio mononylon 6.0). Posteriormente, a incisão torácica foi fechada (fio mononylon 5.0) e o pneumotórax retirado. Os músculos afastados foram reposicionados e a pele suturada (fio mononylon 4.0). Os animais receberam 30000 UI de Benzilpenicilina Benzatina (Penretard, Cibran, Tanquá, RJ, Brasil, i.m.) e foram colocados em ambiente aquecido para recuperação (LA ROVERE et al., 1998; PONIKOWSKI et al., 2001; MOSTARDA et al., 2010; MILL et al., 2011; RODRIGUES et al., 2012).
A cirurgia Sham consistiu em procedimentos semelhantes aos anteriormente descritos, exceto pela ligadura da artéria coronária. A mortalidade dos animais foi acompanhada após a recuperação da cirurgia de IM ou Sham até o final do protocolo. Conforme citado acima, Durante o protocolo, foram observadas 3 mortes no grupo IS e 1 no grupo IP. Assim, as avaliações propostas no presente estudo contaram com um n=9 por grupo experimental.
3.3.2. Tratamento com Brometo de Piridostigmina
O tratamento foi realizado através da administração de solução de Brometo de Piridostigmina (0,14 mg/mL) por via oral na água de beber, permitindo que os animais ingerissem em torno de 40 mg/Kg/dia do fármaco (SOARES et al., 2004) durante 3 meses.
3.3.3. Teste de Esforço, Teste de Carga Máxima e Treinamento Físico
Todos os grupos fizeram adaptação tanto na escada quanto na esteira, pois realizaram testes de esforço máximo e de carga máxima. A adaptação na escada ocorreu em escada adaptada para ratos, com aproximadamente 54 degraus verticais de 0,5 cm de espaço entre eles. Os animais foram colocados nos degraus inferiores e foram adaptados ao ato de escalar, sem nenhuma carga. No topo da escada os animais encontraram uma gaiola (20x20x20 cm) onde descansaram por 120 segundos. Este procedimento foi realizado por 4 dias até que os animais escalassem voluntariamente a escada 3 vezes consecutivas.
Quanto à adaptação na esteira, os animais foram adaptados em esteira ergométrica, 10 minutos a 0,3 km/h, durante 4 dias. Os grupos foram submetidos a um protocolo de teste de esforço máximo (TE) e um teste de carga máxima (TCM) ao início, aos 45 dias e ao final dos programas de TF aeróbico e resistido.
O TE consistiu em colocar o animal correndo na esteira a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo que esta carga foi incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até que o animal atingisse a exaustão (BROOKS e WHITE, 1987). Este protocolo de TE apresenta correlação significativa com a medida do consumo direto de oxigênio em ratos machos, conforme evidenciado por Rodrigues et al. (2007), o que nos confere validade e fidedignidade para prescrição e controle do TF. Após o teste inicial, os grupos que realizariam o treinamento aeróbico foram submetidos a um protocolo de TF em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva e intensidade de 60-75% da velocidade máxima atingida no TE (FLORES et al., 2010; MOSTARDA et al., 2012).
Já para a determinação da carga máxima, os animais deveriam realizar no máximo 8 escaladas com cargas progressivas. Na escalada inicial foi aplicado 75% do peso corporal do animal, que foi progressivamente aumentado por um adicional de 15% nas subidas subsequentes. Esse procedimento foi sucessivamente repetido até que a carga alcançasse um peso que não permitisse que o rato escalasse (SANCHES et al., 2014). O treinamento consistiu em 15-20 escaladas por sessão, com descanso de 1 minuto entre cada escalada (GRANS et al., 2014). A intensidade foi moderada (40% a 60% do teste de carga máxima), como recomendado para pacientes com doença cardiovascular (WILLIAMS et al., 2007).
Ambos os treinamentos foram realizados por 3 meses, 5 dias por semana.
3.3.4. Avaliações Ecocardiográficas
As avaliações ecocardiográficas foram realizadas ao início (para a determinação da área de IM inicial e inclusão dos animais no estudo) e ao final dos protocolos de tratamento/treinamento (para determinação dos parâmetros de morfometria, função sistólica e diastólica). Essas avaliações foram realizadas no Laboratório de Hipertensão Experimental do Instituto do Coração (InCor/HC/FMUSP), sob a direção da Profa. Dra. Maria Cláudia Irigoyen, e seguiram as recomendações do Comitê de Padronização do Modo M da Sociedade Americana de Ecocardiografia (SAHN et al., 1978). Na avaliação final foram analisados parâmetros de morfometria cardíaca (massa do ventrículo esquerdo, diâmetros sistólico e diastólico do ventrículo esquerdo), área de infarto, função sistólica (fração de encurtamento e velocidade de encurtamento circunferencial), função diastólica (relação entre as ondas E e A, e tempo de relaxamento isovolumétrico),e função global (índice de desempenho miocárdico), previamente padronizados pelo nosso grupo de estudos (SOARES et al., 2004; BRAGA et al., 2008; MALFITANO et al., 2010; JORGE et al., 2011; RODRIGUES et al., 2011; BARBOZA
3.3.5. Canulação e Registro da Pressão Arterial
Ao final dos protocolos, os animais foram anestesiados com uma mistura de Cetamina (80 mg/Kg) e Xilazina (12 mg/Kg) por via intraperitoneal e foi realizada a implantação de cateteres de polivinil na veia jugular (para administração de drogas) e na artéria carótida (para registro direto da PA e FC). Cada animal foi mantido em uma caixa individual padrão durante a realização das avaliações hemodinâmicas sistêmicas que iniciaram 24 horas após a canulação. Com o animal acordado, a cânula arterial foi conectada a uma extensão de 20 cm, permitindo livre movimentação do animal pela caixa, durante todo o período do experimento. Esta extensão foi conectada a um transdutor eletromagnético de pressão (Kent Instruments) que por sua vez, estava conectado a um pré-amplificador (Stemtech). Sinais de PA foram gravados durante um período de 30 minutos em um microcomputador equipado com um sistema de aquisição de dados (DATAQ Instruments, DI-158U), permitindo análise dos pulsos de pressão, batimento-a-batimento, com uma frequência de amostragem de 2KHz por canal para estudo dos valores de PA e FC (FLORES et al., 2010; MOSTARDA et al., 2010; JORGE et al., 2011; BARBOZA et al., 2012; RODRIGUES et al., 2013).
3.3.6. Avaliação da Sensibilidade do Barorreflexo
Após o registro da PA, com os animais em condições de repouso, a sensibilidade dos pressorreceptores foi testada através de doses crescentes da infusão de fenilefrina (0,25μg, 0,5μg, 1,0μg, 2,0μg, 4,0μg e 8,0μg) e de nitroprussiato de sódio (0,5μg, 1,0μg, 2,0μg, 4,0μg e 8,0μg). A sensibilidade barorreflexa foi avaliada pelo índice calculado através da divisão de variação da FC pela variação da PAM. Essas drogas foram injetadas randomicamente entre os animais, iniciando-se a sessão com um ou outro fármaco. Para análise da sensibilidade dos pressorreceptores, o pico máximo ou mínimo da PAM foi comparado aos valores de PAM do
período controle. Da mesma forma, a variação máxima da FC foi comparada com os valores de FC do período controle, imediatamente antes da injeção das drogas, para posterior quantificação das respostas. A sensibilidade barorreflexa foi avaliada pelo índice calculado através divisão da variação da FC pela variação da PAM (FLORES et al., 2010; MOSTARDA et al., 2010; JORGE et al., 2011; BARBOZA et al., 2012; RODRIGUES et al., 2013).
3.3.7. Duplo Bloqueio Farmacológico
Após a avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores e com o retorno da FC e da PA a valores próximos dos obtidos no registro basal, foi realizada a injeção de atropina (3 mg/kg) e a PA e a FC foram registradas por 8 minutos. Ainda sob efeito da atropina, foi realizada a injeção de propranolol (4 mg/kg) e a PA e a FC foram registradas por 8 minutos. Com o duplo bloqueio farmacológico atingiu-se a FC intrínseca. No dia seguinte, foi repetido o mesmo procedimento descrito anteriormente invertendo-se a sequência das injeções dos fármacos (bloqueio invertido). O tônus simpático (TS) foi calculado pela subtração da máxima FC alcançada após bloqueio do parassimpático com atropina menos a FC intrínseca, observada após o duplo bloqueio (atropina + propranalol). Já o tônus vagal (TV) foi calculado pela subtração da mínima FC atingida após o bloqueio simpático com propranalol, menos FC intrínseca, observada após o duplo bloqueio (atropina + propranalol) (FLORES et al., 2010).
3.3.8. Avaliação da Modulação Autonômica
A variabilidade da FC e da PAS foi avaliada no domínio do tempo (variância) e no domínio da frequência usando o modelo autoregressivo. Em resumo, neste método, séries temporais do intervalo de pulso e da PAS foram divididas em segmentos de 350 batimentos com sobreposição de 50%. Um espectro foi obtido para cada um dos segmentos via o recurso
de Levinson-Durbin, com a ordem modelo escolhido de acordo com critério do Akaike, variando entre 10 e 14. Os componentes oscilatórios dos espectros foram quantificados em 2 faixas de frequência: baixa frequência (LF: 0,20-0,75 Hz) e alta frequência (HF: 0,75-4,0 Hz). A potência do espectro foi calculada para cada componente reconhecível nas faixas de LF e HF integrando-se os espectros dos componentes. A potência foi expressa como a intensidade de LF e HF. Os segmentos que apresentaram oscilações muito lentas (<0,1 Hz), que contribuem para mais de 70% da variabilidade total, foram considerados não estacionários e descartados do estudo (MOSTARDA et al., 2010; MALFITANO et al., 2010; RODRIGUES et al., 2013).
3.3.9. Atividade da Acetilcolinesterase
Para determinar a magnitude da inibição de acetilcolinesterase pelo tratamento com o PIR, amostras de 200 µl de sangue foram centrifugadas a 5000rpm durante 15 min e 100 µl de plasma foram congeladas a -20º C. A atividade de acetilcolinesterase foi determinada pelo método colorimétrico com o Kit para Atividade de Acetilcolinesterase (AChE)
(Sigma-Aldrich
®
) de acordo com as instruções do fabricante. Este ensaio é uma versão otimizada dométodo de Ellman em que a tiocolina, produzida pela AChE, reage com 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) para formar um produto colorimétrico (412 nm) proporcional à atividade da AChE presente na amostra. Uma unidade da AChE é a quantidade de enzima que catalisa a produção de 1,0 µmole de tiocolina por minuto à temperatura ambiente com pH 7,5. Este kit tem um intervalo linear de 10-600 unidades / L de atividade da AChE.
3.3.10. Análise Estatística
Foi utilizado o Software SPSS (versão 20.0 para Windows; SPSS Inc., Chicago, EUA). Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. Depois de confirmar que todas as variáveis contínuas foram normalmente distribuídas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, o teste de análise de variância (ANOVA) de duas vias e para medidas repetidas foi devidamente aplicado para análise dos dados, seguidos do post-hoc de Bonferroni. Valores de p<0,05 foram considerados significativos.
4. RESULTADOS
4.1. Peso corporal
Ao início dos protocolos, o peso corporal foi semelhante entre os grupos (~240±15g). Ao final do estudo, o peso corporal foi menor nos grupos IP, ITA, ITAP e ITRP em relação ao C (Figura 1). Além disso, os grupos ITAP e ITRP apresentaram peso corporal reduzido em relação ao grupo IS. Já os grupos ITR demonstrou elevação dessa variável se comparado aos grupos IP, ITAP e ITRP.
Figura 1. Peso corporal ao final dos protocolos nos grupos Controle Sham (C), Infartado Sedentário (IS), Infartado + PIR (IP), Infartado + TF Aeróbico (ITA), Infartado + TF Aeróbico + PIR (ITAP), Infartado + TR (ITR) e Infartado + TR + PIR (ITRP). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. IS; ‡ P<0,05 vs. IP; ¥ P<0,05 vs. ITAP; § P<0,05 vs. ITRP.
4.2. Capacidade Física
Na Figura 2 está evidenciada a velocidade máxima atingida no teste de esforço inicial e final. Ao início, a velocidade estava reduzida em todos os grupos infartados em comparação ao grupo C. Após os protocolos, os animais dos grupos IS e IP reduziram a velocidade máxima em relação aos animais C; enquanto que os do grupo ITA e ITAP apresentaram melhor capacidade física quando comparados a suas avaliações iniciais e aos grupos C, IS, IP, ITR e ITRP. Os grupos ITR e ITRP também mostraram melhora em relação às avaliações iniciais e ao grupo IS.
Figura 2. Teste de esforço máximo avaliado ao início e final do protocolo nos grupos Controle Sham (C), Infartado Sedentário (IS), Infartado + PIR (IP), Infartado + TF Aeróbico (ITA), Infartado + TF Aeróbico + PIR (ITAP), Infartado + TR (ITR) e Infartado + TR + PIR (ITRP). # P<0,05 vs. Inicial; * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. IS; ‡ P<0,05 vs. IP; £ P<0,05 vs. ITA; ¥ P<0,05 vs. ITAP.
Os resultados do teste de carga máxima inicial e final estão expressos na Figura 3. Inicialmente, a carga máxima foi menor em todos os grupos infartados em relação ao C. No teste final, o valor da carga máxima do grupo IS foi menor se comparado ao grupo C; enquanto que o treinamento físico resistido e a ingestão da PIR permitiram que tal queda não
fosse detectada nos grupos IP, ITA, ITAP, ITR e ITRP, que também apresentaram maiores valores que em seus respectivos testes iniciais. Vale salientar que os grupos ITA e ITAP tiveram um aumento na carga atingida no teste de carga máxima em relação ao grupo IS. Entretanto, conforme esperado, os grupos que efetuaram treinamento resistido apresentaram maior carga que os animais treinados aerobicamente.
Figura 3. Teste de carga máxima avaliado ao início e final do protocolo nos grupos Controle Sham (C), Infartado Sedentário (IS), Infartado + PIR (IP), Infartado + TF Aeróbico (ITA), Infartado + TF Aeróbico + PIR (ITAP), Infartado + TR (ITR) e Infartado + TR + PIR (ITRP). # P<0,05 vs. Inicial; * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. IS; ‡ P<0,05 vs. IP; £ P<0,05 vs. ITA; ¥ P<0,05 vs ITAP.
4.3. Consumo de Água e de Brometo de Piridostigmina
Não houve diferenças significativas no consumo de água entre os grupos C, IS, IP, ITA, ITAP, ITR e ITRP (51±7, 55±7, 54±8, 51±5, 55±4, 53±6 e 52±8 ml/dia, respectivamente). A ingestão de piridostigmina foi similar nos grupos IP, ITAP e ITRP (8±3, 7±2 e 8±2 mg/dia), correspondendo a aproximadamente 30 mg/Kg por dia.
4.4. Atividade da Acetilcolinesterase
A atividade da acetilcolinesterase estava aumentada no grupo IS (1111,3±99 unid/L) quando comparado ao grupo C (855,0±33 unid/L). Além disso, os grupos tratados com piridostigmina (IP: 479,6±31, ITAP: 462,7±49 e ITRP: 425,9±17,6 unid/L) apresentaram redução dessa variável quando comparados ao grupo C, bem como em relação ao grupo IS, ITA (883,5±86 unid/L) e ITR (746,8±20,4 unid/L).
4.5. Avaliações Ecocardiográficas
4.5.1. Variáveis Morfométricas
Os grupos incluídos no estudo apresentaram área de infarto inicial de,
aproximadamente 38±5% nos grupos experimentais. O tratamento farmacológico e o treinamento aeróbico permitiram redução da área de infarto ao final do protocolo (Figura 4).
Figura 4. Área de infarto avaliada ao início e final do protocolo nos grupos Controle Sham (C), Infartado Sedentário (IS), Infartado + PIR (IP), Infartado + TF Aeróbico (ITA), Infartado + TF Aeróbico + PIR (ITAP), Infartado + TR (ITR) e Infartado + TR + PIR (ITRP). † P<0,05 vs. IS; ¥ P<0,05 vs. ITAP.
