Melhoramento genético e genômico. Maurício de Alvarenga Mudadu Embrapa Pecuária Sudeste

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Melhoramento

genético e genômico

Maurício de Alvarenga Mudadu

Embrapa Pecuária Sudeste

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Introdução

Plano da Aula

» Melhoramento genético e genômico

» Variantes genéticas e SNP

» SNP chip

» Controle de qualidade, formato de arquivos, softwares

» GWAS

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Embrapa Pecuária Sudeste

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Plano Diretor

Desenvolver tecnologias que visem à melhoria de

características sensoriais, funcionais, nutricionais

e de segurança do alimento ao longo da cadeia.

Desenvolvimento de tecnologias para a

melhoria da qualidade de produtos (carnes, leite,

peles) e de subprodutos da exploração pecuária.

(5)

Introdução

Como selecionar animais com carne macia?

(6)

Introdução

Melhoramento animal clássico

• Coletar fenótipos: qualidade de carcaça,

qualidade de carne, produção de leite

• Pedigree

• Calcular o valor genético estimado (VGE) e as

diferenças esperadas na progênie (DEPs):

• Características quantitativas são na maioria

das vezes controladas por muitos genes com

efeitos individuais pequenos

(7)

Introdução

Melhoramento animal Clássico

• Não se sabe quantos ou quais genes estão

atuando no fenótipo.

• Estima-se um valor genético aditivo.

• Metodologias estatísticas e matemáticas para

modelagem desses dados – regressões lineares,

método

BLUP (Best Linear Unbiased

Predictor).

• Método de seleção eficiente nos últimos 50

anos!

(8)

BLUP Simplificado (in a nutshell)

8

Fenótipo observado: Produção de leite

Efeitos Fixos: X: matriz

conhecida; Beta: parâmetros

ambientais (rebanho) _{Efeitos Aleatórios: Z: matriz} conhecida; u: parâmetros genéticos (pais)

(9)

BLUP Simplificado

9

Rebanhos (Herds):

1, 2 e 3

Pais (Sires):

A, B, C e D

Produção (Yeld)

Selecionar touros

com mérito

genético para, ex.:

produção de leite

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BLUP Simplificado

10

(11)

BLUP Simplificado

11

Henderson (1950) propõe as seguinte metodologia pra se encontrar os estimadores Beta-chapéu e u-chapéu :

R = Matriz identidade; G = R x 0.1; Ambas relacionadas à matriz variância-covariância de u e e.

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BLUP Simplificado

12

Beta(rebanhos): 1, 2 e 3

u (pais) : A, B, C e D

VGE -1,67/2 DEP

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Blup (Best Linear Unbiased Predictors)

• L -> Linear: os estimadores de u são funções lineares dos dados.

• U -> Unbiased: Não viciado. O valor médio dos estimadores é igual ao valor médio da quantidade sendo estimada.

• B -> Best: Os estimadores possuem um valor mínimo da média dos quadrados dos erros dentro da classe de estimadores sem viés.

• P -> Predictors: estimar os efeitos aleatórios (genéticos).

• Método de seleção eficiente!

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Problemas no melhoramento animal

para

qualidade de carne

:

• É custoso obter o fenótipo de um grande número

de animais – é preciso abater já em idade

madura.

• Obtém-se dados de animais jovens antes de

chegar a uma idade madura – perda de acurácia.

• Sem fenótipos dos descendentes fica complicado

fazer predições – como saber se um filho tem

mais mérito genético que o pai?

• Pouco se progrediu no melhoramento para

maciez de carne e eficiência alimentar.

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Coisas a se considerar:

• Método BLUP coloca todos os efeitos genéticos em um mesmo “saco”. Quais genes e ou alelos estão por trás do mérito genético?

• E se soubermos como mapear regiões no genoma

com efeito maior na característica? Há vantagens?

Vantagens:

• Não necessita fazer testes de progênie (usa-se a genotipagem no lugar).

• Pode-se diminuir intervalo de gerações (esperar menos para acasalar)

• Melhora a acurácia do valor genético dos animais.

(16)

Como mapear QTL:

• QTL : região do genoma que possui

um efeito maior na característica

quantitativa (ex:. carne macia,

produção de leite).

• Uso de

marcadores moleculares

para mapear essas regiões.

• Seleção assistida por marcadores

(SAM).

• Seleção genômica.

(17)

Genômica de Bos taurus

17 • Bovinos são indivíduos diplóides: 2 pares de cromossomos homólogos. • 2n = 60 (30 +30). • Diferenças genéticas entre indivíduos: diferenças no DNA. • Alelos: formas alternativas de um gene.

(18)

Marcadores moleculares

O que é um marcador?

• Um local físico e identificável em um cromossomo

cuja herdabilidade pode ser monitorada.

Tipos comuns de marcadores usados

em melhoramento animal:

• Microssatélites

• SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

(19)

Microssatélites

19

• Pequenas (menos de 100 pares de bases)

repetições em tandem de sequências de

DNA muito simples, geralmente 1 a 6 pares

de bases, por exemplo (CA)

_n

.

• Ferramenta primária para mapeamento

genético nos anos 90.

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Microssatélites

20

Ex.: ACACACAC, AGAGAGAG, TATTATTAT

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Microssatélites

21

Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP.

New York: Wiley-Liss; 1999.

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Microssatélites

22 QTL para contagem de carrapatos Adaptado de GASPARIN, G. et al Animal Genetics, v. 38, p. 453-459, 2007

(23)

Problemas com os

Microssatélites

23

• Custa-se muito genotipar

microssatélites.

• Por isso deixou-se de obter o poder

suficiente para caracterizar regiões do

genoma de forma satisfatória.

• Detectou-se apenas os efeitos maiores.

• Para o melhoramento de carne

poucos

(24)

SNPs (Single Nucleotide

Polymorphisms)

(25)

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

• Pode haver quatro alelos para cada SNP (4 nucleotídeos: A, C, T, ou G)

• Porém a grande maioria dos SNPs são bialélicos

• Extremamente abundantes no genoma (pelo menos 1,4 milhões no genoma humano)

• Nem sempre SNPs causam modificação na protéina, caso estejam em regiões codificadoras: na maioria das vezes são

sinônimos.

• Nem sempre SNPs são causais – mas podem estar em desequilíbrio (segregam junto) com um

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(27)

Pipeline para SNP calling

Digitar “SNP calling pipeline” no google: 1º link (estou com sorte).

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(29)

Cobertura do Chip

29

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31

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33

Como

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34

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35

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36

Imagens

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37

Call Rate e GC Score

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38

Call Rate e GC Score

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Call Rate e GC Score

Efeito do uso de diferentes “clusterfiles” na

qualidade dos SNP

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Call Rate e GC Score

Efeito do uso de diferentes “clusterfiles” na

qualidade dos SNP

(41)

41

TOP/BOT

• Formato “normalizado” para os genótipos: criado para identificar os alelos independente do genoma.

• Genótipos no formato: AA, AB, BB

• Muitas vezes uma nova versão do genoma inverte as fitas e o SNP “muda”.

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42

TOP/BOT

CASOS NÃO-AMBÍGUOS

•A->C TOP-ALLELE A : A BOT-ALLELE B: C •A->G TOP-ALLELE A : A BOT-ALLELE B: G •T->G BOT-ALLELE A : T TOP-ALLELE B: G •T->C BOT-ALLELE A : T TOP-ALLELE B : C

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43

TOP/BOT

CASOS AMBÍGUOS (A/T OU T/A) •A->T

•T->A

•A/T na posição 5’ do par unambíguo -> TOP : ALLELE A : A •A/T na posição 3’ do par unambíguo -> BOT : ALLELE A: T

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44

TOP/BOT

CASOS AMBÍGUOS (C/G OU G/C) •C->G

•G->C

•A/T na posição 5’ do par unambíguo -> TOP : ALLELE A : C •A/T na posição 3’ do par unambíguo -> BOT : ALLELE A: G

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45

TOP/BOT

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46

TOP/BOT

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Delineamento

762 novilhos (meio-irmãos)

32 touros (pais) selecionados para amostrar a

variabilidade da raça nelore

794 animais genotipados

Com chip HD

No total :

794 x 777.000 = 616 milhões de linhas Arquivo com ~23 Gigabytes

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The Pedigree

•Blue: sires •Green: sibs

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• Blue: sires • Green: sibs • Pink: mothers

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50

Estrutura dos Dados

Arquivos de saída do software da Illumina: Final Report .txt

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51

Estrutura dos Dados

Final Report.txt

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52

Estrutura dos Dados

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53

Plink

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54

PLINK

Arquivos de entrada Pedigree (.PED) Map (.MAP)

Bed – PED Binário (.BED) - Opcional

Outros opcionais (COVAR, BLOCKS, TAG SNPs, etc).

Gerei arquivos .ped e .map para cada cromossomo: X, Y, MIT, 1.. 29.

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55

PLINK

ARQUIVOS DE ENTRADA .PED

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56

PLINK

ARQUIVOS DE ENTRADA

Ex.: 14.ped

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57

R / Bioconductor

R : Linguagem para ánálise estatística de dados

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58

R / Bioconductor

Sample ID SNP_ID Genótipo GC_Score

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59

Controle de Qualidade

• Evitar aumento de falsos positivos e negativos nos estudos de associação.

• Tomar cuidado para não aumentar demais os valores de corte e assim aumentar a perda de informação.

• Verificar plots e gráficos manualmente. Efetuar primeiro filtro por indivíduo (amostra) e depois por SNP.

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60

Controle de Qualidade

Por Amostra

frequência de SNPs missing; (<0,05) heterozigocidade;

genotipos idênticos (mesma amostra). Call Rate = freq SNPs missing ( 0,95) Por SNP

frequência de SNPs missing (<0,05); Minor allele frequency MAF (>0,01)

Hardy-Weinberg Equilibrium HWE (usar?).

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61

Controle de Qualidade

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62

Controle de Qualidade

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63

Resultados QC

Por Amostra

7 amostras removidas (~1%) 789 mantidas

Por SNP

182.277 SNPs removidos (~25%) 560.629 SNPs mantidos (~75%)

Códigos em R para controle de qualidade gerados pelo Roberto Higa da Embrapa Informática -

(64)

64

Formato de arquivos e QC

» Estrutura dos dados – Bovine HD Illumina SNP chip. » Controle de qualidade

» Formatos de arquivos (.ped, long, etc.)

» QC no plink: http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/ » Haploview e desequilibrio de ligação

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Equilibrio de Ligação

Associação aleatória entre marcador e QTL

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Desequilibrio de Ligação

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Análises de associação genética

70

• Caracterizar a associação de múltiplos marcadores

genéticos a uma dada característica, por exemplo Área de Olho de Lombo.

• Análise de genes candidatos:

A. S. Foulkes., 2009; Springer, EUA

(71)

Análises de associação genética

71

•

Desequilíbrio de Ligação: marcadores SNP são

segregados junto com região causal

•

GWAS: expansão do estudo de gene candidato para o

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Associação e GWAS

Genomic approach:

Sk: matriz de genótipos até o k-ésimo SNP. Sjk é o vetor de efeitos aditivos do 1º ao o k-ésimo SNP e da 1ª té a j-ésima característica.

Como são o vetor Sk e a matriz Sjk ?

(73)

Associação e GWAS

Objetivo do teste de associação é utilizar um teste de análise de variância ANOVA, minimizar as somas dos quadrados do resíduo (E) -> obter um modelo biológicamente signficativo.

(74)

O problema dos múltiplos testes

Espera-se encontrar 5% de SNPs falso positivos: condicional à uma distribuição normal. Quanto é 5% de 770k?

Necessário correção - > diversos métodos:

• Bonferroni : dividir significância pelo número de SNP (muito conservador).

• Permutação. • FDR.

(75)

Inflacionamento dos p-valores

Inflacionamento dos p-valores pode significar algum problema nos dados. Verificar com QQ-plot.

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Outros problemas

Inflacionamento devido à estratificação da população. Necessário correção - > Genomic Control

(77)

77

Análises de Associação

Testes de associação

Single SNPs

Blocos em LD (cálculo de Haplótipos)

Uso do software PLINK pra rodar as análises de associação

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78

Análises de Associação

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79

Análises de Associação

• Eficiência alimentar (CAR)

• QQ-plot – verificar se p-valores seguem distrib. normal

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80

Análises de Associação

Manhattan Plot

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81

Análises de Associação

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82

Análises de Associação

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83

Análises de Associação

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84

Análises de Associação

UST: Uronyl 2 Sulfotransferase

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85

Análises de Associação

Valores negativos de Beta significam o valor, em quilogramas, que o animal deixa de comer (mas engorda o mesmo tanto).

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86

Análises de Associação

Cruzamento de genes que possuem SNPs associados (p<0.001) entre CAR, FC14 e EE. Via comum? KCNIP4 LOC.... LOC...

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87

Análises de Associação

KCNIP4 – Modulador de canais de potássio.

•Canais de potássio estão relacionados ao tipo de fibra muscular (disparo rápido e mais lento) e possivelmente à maciez de carne.

•Verificar o papel desses canais nas vias de biossíntese e metabolismo de gordura...

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88

Análises de Associação

Próximos passos, verificação de: •Sítios de ligação a miRNA

•Sítios de ligação a fatores de transcrição •Sítios para splicing alternativo

•Análises de pathways

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89

Análises de Associação

Rodar GWAS no PLINK.

•Correção de múltiplos testes •permutação

•Plink 1.9 •QXPAK

(90)

Redes Gênicas com AWM/PCIT e

Cytoscape

Maurício de Alvarenga Mudadu

Priscila Neubern de Oliveira

(91)

Introdução

Redes Gênicas:

• Na era pós genômica o desafio é o aproveitamento do grande volume de dados gerados pelas várias “omicas”.

• Genômicas, transcriptômicas, metabolômicas, etc. • Escapar da premissa “um gene -> uma proteína”

• Possibilidade: Geração de redes interligando o controle da expressão gênica (transcriptômica).

• Regulatory Gene Networks

• Interpretação holística de dados de expressão em um dado fenótipo.

• Uso de fatores de transcrição • Systems Biology

(92)

Introdução

Redes Gênicas:

(93)

Introdução

Redes Gênicas:

• Área de “Genômica” e/ou genética: GWAS

• Volume de dados de genótipagem grande nos últimos anos

• “Deixou a desejar” quanto a novas descobertas • Características quantitativas.

• Revistas passam a cobrar por explicações de mecanismos pelos quais um SNP pode modificar um fenótipo.

• Uso de dados de associação por SNP e teoria de redes gênicas

(94)

Introdução

(95)

Introdução

• AWM recupera 64% da variação genética com 3k SNPs e 91% da variação recuperada por 50k SNPs. • AWM: enriquecimento sem perda de informação genética.

• Estima-se que 200k SNPs sejam suficientes para recuperar toda a informação genética

(96)

(97)

Introdução

• GWAS de dados de metabólitos secundários + dados de crescimento. • Subredes formadas usando o software MCODE (genes NCAPG e GDF8).

(98)

(99)

Introdução

AWM – Association Weight Matrix

• Procedimento para explorar resultados de GWAS e em

conjunto com algoritmos de inferência de redes, gerar redes gênicas.

• Vários fenótipos correlacionados com o foco do estudo

(pelo menos 10). Stderror da estimativa de coeficientes de correlação é proporcional a (1/sqrt(# Fenótipos)).

• GWAS

• Controle de qualidade da genotipagem dos SNP

(inclusive filtro de MAF);

• Número de indivíduos genotipados – poder

estatístico do GWAS.

• Resultados do GWAS: p-valores e valores genéticos

aditivos para cada SNP

(100)

Metodologia

• A AWM é uma matriz (i x j) composta por números de

ponto flutuante (Reais) cujas linhas (i) são representadas por genes (mapeados por SNPs) e cujas colunas (j) são representadas por fenótipos.

• Cada célula da AWM representa um valor de associação de um dado SNP|Gene i a um dado fenótipo j.

(101)

(102)

Metodologia

• 6 passos para se gerar uma AWM, mas antes existe um passo inicial -> escolher o fenótipo chave:

• 1º. Seleção primária de SNP :

• Selecionar SNPs associados ao fenótipo chave a uma significância não muito estringente (5%

é suficiente).

• 2º. Explorar a dependência entre os fenótipos: • Descobrir qual é o número médio (Ap) de

fenótipos não-chave cujos SNP do passo 1º estão associados.

(103)

Metodologia

• 6 passos para se gerar uma AWM:

• 3º. Seleção secundária de SNP :

• selecionar SNPs associados a pelo menos Ap fenótipos.

• 4º. Fazendo uso do mapa genômico :

i) Localizar SNP -> dentro de região

codificadora(CDS)

ii) Localizar SNP -> distante de 2,5 Kbases de

região codificadora

iii) Localizar SNP -> distante de 1,5 Mbases de região codificadora

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Metodologia

• 6 passos para se gerar uma AWM:

• 5º. Mapear relação Um-SNP-um-Gene

• Genes representados por mais de um SNP

(condições i e ii do 4º passo)

• SNP com mais fenótipos “vence”

• SNP com menor p-value “vence”

• Genes representados por mais de um SNP

(condição iii do 4º passo)

• Selecionar o SNP representativo do

bloco em LD (menor p-valor médio entre os fenótipos).

(105)

Metodologia

• 6 passos para se gerar uma AWM: • 6º. Popular a AWM:

• Nome das Colunas: nome ou abreviação dos

fenótipos

• Nome das Linhas : SNP ID ou Gene Symbol

• Células: valor aditivo do SNP em cada

fenótipo

• “standartizado” -> dividir o valor aditivo

pelo desvio padrão em cada fenótipo

• stdev calculado na saída do GWAS e não da AWM.

• No caso do item iii) do 4º passo, colocar o

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Prática 1

• Passo 1 (Primary SNP Selection) • Arquivos no formato abaixo:

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Prática 1

(108)

Prática 1

• Passo 1

#### setwd para o diretorio correto

##### carregar tabelas resultados do GWAS no R gwas1 <- read.csv("gwas1.csv",header=F) gwas2 <- read.csv("gwas2.csv",header=F) gwas3 <- read.csv("gwas3.csv",header=F) gwas4 <- read.csv("gwas4.csv",header=F) gwas5 <- read.csv("gwas5.csv",header=F) gwas6 <- read.csv("gwas6.csv",header=F) gwas7 <- read.csv("gwas7.csv",header=F) gwas8 <- read.csv("gwas8.csv",header=F)

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Prática 1

• Passo 1

#### continuação....

AWM_A <-cbind(data.frame(gwas1$V1),data.frame(gwas1$V2),

data.frame(gwas2$V2), data.frame(gwas3$V2), data.frame(gwas4$V2), data.frame(gwas5$V2), data.frame(gwas6$V2), data.frame(gwas7$V2), data.frame(gwas8$V2))

AWM_P <-cbind(data.frame(gwas1$V1),gwas1$V3, gwas2$V3, gwas3$V3, gwas4$V3, gwas5$V3, gwas6$V3, gwas7$V3, gwas8$V3)

colnames(AWM_P)<-c("SNP_ID","PHEN1","PHEN2","PHEN3","PHEN4","PHEN5","PHEN6","PHEN7","P HEN8") colnames(AWM_A)<-c("SNP_ID","PHEN1","PHEN2","PHEN3","PHEN4","PHEN5","PHEN6","PHEN7","P HEN8")

(110)

Prática 1

• Passo 1 #### continuação.... rownames(AWM_P) <- AWM_P$SNP_ID rownames(AWM_A) <- AWM_A$SNP_ID AWM_P$SNP_ID <- NULL AWM_A$SNP_ID <- NULL ############################################ ##### Pre-step1 : escolher o fenotipo chave. ############################################

(111)

Prática 1

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Prática 1

• Passo 2

############################################ ##### Step2: Explorar a dependencia entre ##### fenotipos -> econtrar Ap ############################################ Step2Ap <- as.data.frame(t(as.data.frame(apply(Step1SNPs, 1, function(Step1SNPs) table(Step1SNPs<=0.05))))) Ap <- mean(as.numeric(Step2Ap[seq(2,nrow(Step2Ap),by=2),]$V2)) Step2SNP_IDs <- as.list(as.character(colnames(t(apply(Step1SNPs, table(Step1SNPs<=0.05)) ))))

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Prática 1

(114)

Prática 1

• Passo 3

############################################ ##### Step3: Selecao secundaria de SNP

############################################ Step3_select <- function(AWM_P){AWM_P<=0.05} Step3Ap <- t(apply(AWM_P,1,Step3_select))

SignificantPhenotypes <- apply(Step3Ap, 1, sum)

Step3Ap <- subset(SignificantPhenotypes, SignificantPhenotypes>=Ap) Step3Ap <- as.data.frame(Step3Ap)

Step3SNP_IDs <- as.list(as.character(rownames(Step3Ap))) Step3SNPs <- merge(Step1SNP_IDs, Step3SNP_IDs)

Step3SNPs <- t(as.data.frame(Step3SNPs)) rownames(Step3SNPs) <- Step3SNPs[,1]

(115)

Prática 1

• Passo 4 (Exploiting the genome map)

GenomeMap <- read.table("map_all_qc_except_hwREDUCED_geneoverlap_20130614.txt", header=F, row.names=1)

(116)

Prática 1

• Passo 4

############################################ ##### Step4: Fazendo uso do mapa genomico ############################################ GenomeMap <-

read.table("map_all_qc_except_hwREDUCED_geneoverlap_20130614.txt", header=F, row.names=1)

SNPsofInterest <- GenomeMap[rownames(Step3SNPs),]

Step4SNPclose <- subset(SNPsofInterest, SNPsofInterest$V5 <= 2500) Step4SNPfar <- subset(SNPsofInterest, SNPsofInterest$V5 > 1500000) Step4SNPclose_IDs <- as.list(rownames(Step4SNPclose))

(117)

Prática 1

• Passo 5

Mapping the

“one-SNP-one-gene” relationship

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Prática 1

• Passo 5

############################################ ##### Step5: Mapeando Um-Gene-Um-SNP

############################################ SignificantPhenotypes <- as.data.frame(SignificantPhenotypes) Step5SNPclose <- as.data.frame(SignificantPhenotypes[rownames(Step4SNPclose),]) rownames(Step5SNPclose) <- rownames(Step4SNPclose) Step5CloseGenes <- data.frame(Step4SNPclose$V8,Step5SNPclose[,1]) colnames(Step5CloseGenes) <- c("Gene_ID", "SignifPhenos")

(119)

Prática 1

• Passo 5 ############################################ ##### Step5: continuacao... ############################################ Step5CloseSorted <- Step5CloseGenes[order(Step5CloseGenes$SignifPhenos,decreasing=TRUE),] Step5CloseUnique <- subset(Step5CloseSorted, !duplicated(Step5CloseSorted$Gene_ID)) Step5FarSorted <- Step4SNPfar[order(Step4SNPfar$V8,decreasing=TRUE),] #Step5FarUnique <- subset(Step5FarSorted,!duplicated(Step5FarSorted$V8))

(120)

Prática 1

(121)

Prática 1

• Passo 6

############################################ ##### Step6: Popular a AWM

############################################

Step6SNPClose <- AWM_A[rownames(Step5CloseUnique),] Step6SNPFar <- AWM_A[rownames(Step5FarSorted),]

Step6SNPClose$SNP_ID <- rownames(Step6SNPClose)

rownames(Step6SNPClose) <- Step5CloseUnique$Gene_ID

Step6SNPFar$SNP_ID <- Step5FarSorted[(rownames(Step5FarSorted) %in% rownames(Step6SNPFar)),]$V8 Step6SNPClose$SYMBOL <-NULL Step6SNPFar$SYMBOL <-NULL Step6SNPClose$SYMBOL <- GenomeMap[as.character(Step6SNPClose$SNP_ID),]$V7 Step6SNPFar$SYMBOL <- GenomeMap[rownames(Step6SNPFar),]$V7 Step6Merged <-rbind(Step6SNPClose,Step6SNPFar) save.image(file=".RData")

(122)

Introdução

(123)

Introdução

PCIT:

• Redes de coexpressão gênica

• Correlação entre expressão de dois genes indica funcionamento de forma coordenada (padrões).

• Redes de coexpressão :

• Nós (nodes, vertices) = genes

• Conexões (edges) = linhas

(124)

(125)

Introdução

(126)

Introdução

(127)

Introdução

(128)

Introdução

(129)