UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE SAÚDE COLETIVA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
TESE
ANCESTRALIDADE BIOGEOGRÁFICA, RAÇA/COR, DETERMINANTES SOCIAIS E SINTOMAS DE ASMA E ATOPIA EM UMA COORTE DO
MUNICÍPIO DE SALVADOR, BAHIA.
THIAGO MAGALHÃES DA SILVA
Salvador 2016
THIAGO MAGALHÃES DA SILVA
ANCESTRALIDADE BIOGEOGRÁFICA, RAÇA/COR, DETERMINATES SOCIAIS E SINTOMAS DE ASMA E ATOPIA EM UMA COORTE DO
MUNICÍPIO DE SALVADOR, BAHIA.
Tese submetida ao Programa de Pós Graduação em Saúde Coletiva do Instituto de Saúde Coletiva da Universidade Federal da Bahia, como pré-requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Saúde Pública, área de concentração Epidemiologia.
Orientador: Prof. Dr.º Maurício Lima Barreto.
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Rosemeire L. Fiaccone
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AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Antônio Ramos da Silva e Maria das Graças Magalhães da Silva, a quem serei eternamente grato por todo o amor, carinho e incentivo recebidos ao longo da minha jornada. Amo muito vocês!
A Cintia, minha amada companheira na vida e na ciência, agradeço por estar presente em todos os momentos. Seu apoio, sem dúvida, foi fundamental pra que eu chegasse até aqui.
Agradeço aos companheiros do quinto andar do ISC e agregados, em especial Gustavo Costa, Davide Rasella, Joilda Nery, Agostino Strina, Caroline Feitosa, Jackson Coceição, Enny Paixão, Daiane Machado e Pablo Oliveira, pela troca de aprendizado, pelas resenhas, risadas e discussões sempre bem humoradas sobre os mais diversos temas, inclusive os relacionados ao trabalho, eventualmente.
Agradeço também aos colegas de doutorado, em especial Cremildo Baptista, Luciano Nery, Luciana Cardim, Andrés Trotta, Luciana Jaqueline, Suzana Neri, Adriana Galdino e Luisa Lima, pela convivência, o aprendizado e o nervosismo compartilhado, sobretudo, nas disciplinas de Seminários!
A toda equipe de técnicos, estudantes, pesquisadores e docentes do SCAALA Salvador, sem o esforço dos quais o presente trabalho não seria possível. Agradeço em especial às professoras Camila Alexandrina Figueiredo, Neuza Alcântara Neves, Darci Santos, Letícia Santos e Laura Rodrigues, a Matildes Prado (in memoriam) e Gisel Fattore.
Ao professor Ronald Blanton, da Case Western Reserve University, EUA, pelos ensinamentos e pela contribuição essencial para a realização de parte importante da presente tese.
Ao professor Eduardo Tarazona e a toda equipe do Laboratório de Diversidade Genética Humana (LDGH) da UFMG. Agradeço especialmente a Fernanda Soares, Mateus Golveia, Gil Araújo, Moara Machado e Fernanda Kehdy pela recepção acolhedora e ensinamentos durante a minha curta mas proveitosa passagem pelo laboratório.
À prof.ª Rosimeire L. Fiaccone, pelas cobranças, ensinamentos e por se colocar sempre à disposição para ajudar e orientar na execução do presente trabalho.
Ao prof.º Maurício Lima Barreto, pela oportunidade oferecida e pela confiança em mim depositada para a realização da presente tese. Poder tê-lo como orientador foi, sem sobra de dúvidas, um grande privilégio.
Aos funcionários e ao corpo técnico-administrativo do Instituto de Saúde Coletiva da Universidade Federal da Bahia.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva, pela excelência acadêmica, os ensinamentos e o exemplo muito positivo de dedicação à docência e pesquisa.
Às professoras Sheila Alvim e Yukari Mise, pela orientação nos tirocínios docentes e pelos ensinamentos proporcionados. Meu muito obrigado.
A CAPES, pela concessão parcial da bolsa de doutorado.
A Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia e aos colegas da área de Genética do Departamento de Ciências Biológicas.
Aos Ministérios da Saúde, Ciência e Tecnologia e ao FINEP, pelo financiamento concedido para a execução do projeto EPIGEN-Brasil.
v RESUMO
A raça/cor é empregada como um eixo central na pesquisa biomédica e das iniquidades em saúde. Por outro lado, o aperfeiçoamento tecnológico tem permitido a estimativa cada vez mais acurada da ancestralidade biogeográfica individual. Visto que a raça/cor e a ancestralidade biogeográfica podem atuar como marcadores de exposições tanto a fatores genéticos quanto a determinantes não genéticos que afetam o status de saúde dos indivíduos, o conhecimento e a quantificação da relação existente entre raça/cor e ancestralidade, como também da relação entre essas variáveis e diferentes determinantes sociais da saúde, é de grande importância no campo da epidemiologia. Isso é especialmente destacado para desfechos cuja prevalência ou gravidade são desigualmente distribuídos entre grupos étnico-raciais distintos, a exemplo da asma e alergias. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo investigar as relações entre ancestralidade biogeográfica, raça/cor auto-relatada, determinantes sociais da saúde e asma e atopia. A tese foi estruturada em três capítulos, sendo que o primeiro foi desenvolvido a partir de um estudo caso-controle para dengue realizado nas cidades de Salvador e Fortaleza, enquanto que os dois últimos foram estudos transversais conduzidos na população integrante do Social Changes Asthma
and Allergy in Latin America (SCAALA) - Salvador. No primeiro artigo, que
avaliou a associação entre a ancestralidade biogeográfica e a raça/cor auto-relatada, verificou-se que a força dessa relação foi maior em Salvador do que em Fortaleza, embora significante nas duas cidades. Além disso, análises acerca da estruturação da diversidade genética revelaram uma maior estrutura genética presente em Salvador comparativamente a Fortaleza. No segundo artigo nós investigamos e comparamos a associação da ancestralidade biogeográfica e da raça/cor auto-relatada com diferentes variáveis sociodemográficas, ambientais e marcadores de infecções. Enquanto a ancestralidade biogeográfica e a raça/cor foram significativamente associadas com marcadores de infecções, apenas a ancestralidade biogeográfica foi um preditor para status socioeconômico e variáveis ambientais. O aumento da proporção de ancestralidade individual africana foi associado com condições socioeconômicas e ambientais mais precárias, com o contrário sendo observado para a ancestralidade europeia. Por fim, no terceiro artigo foi analisada a associação entre a proporção de ancestralidade individual africana e sintomas de asma, fenótipos de asma e atopia, considerando a influência de variáveis socioeconômicas, ambientais, infecções e fatores psicossociais. O aumento da proporção de ancestralidade africana foi negativamente associado com atopia, medida através do teste de reatividade cutânea (SPT), e positivamente associado com asma não atópica. Esses achados sugerem que eventuais fatores genéticos subjacentes à ancestralidade africana são mais prováveis de desempenhar algum papel na asma não atópica, o que precisará ser confirmado em estudos posteriores. Palavras-chave: ancestralidade biogeográfica, raça, asma, atopia, determinantes sociais da saúde
ABSTRACT
The race/color is a central axis in both biomedical and health inequities research. Nevertheless, technological improvements have allowed more accurate estimate of individual biogeographical ancestry. Since the race/color and biogeographical ancestry can act as proxies for both genetic and non-genetic factors which affect individual health status, knowledge of the relationship between race and ancestry as also study the relationship of these variables with different social determinants of health are of great importance in epidemiology. This is especially remarkable for outcomes whose prevalence and/or severity are unevenly distributed among racial groups, such as asthma and allergies. Thus, this study aimed to investigate the relationship between biogeographical ancestry, race/color, social determinants of health and asthma and atopy. The thesis was structured into three chapters, the first of which was developed from a case-control study for dengue carried out in the cities of Salvador and Fortaleza, while the last two were cross-sectional studies conducted in the cohort of Social Changes Asthma and Allergy in Latin America (SCAALA) - Salvador. In the first article, in which it was evaluated the association between biogeographical ancestry and race/color, it was found that the strength of this relationship was higher in Salvador than in Fortaleza, although significant in both cities. Furthermore, analyses of the structure of genetic diversity revealed greater genetic structure present in Salvador compared to Fortaleza. In the second article we investigated and compared the association of biogeographical ancestry and race/skin color with different sociodemographic and environmental factors and infection markers. While the biogeographical ancestry and race/color were significantly associated with infection markers, only biogeographical ancestry was a predictor of socioeconomic status and environmental variables. The increased proportion of individual African ancestry was associated with poor socioeconomic and environmental conditions, with an opposite pattern observed for European ancestry. Finally, in the third article we analyzed the association between the proportion of individual African ancestry and asthma symptoms, phenotypes of asthma and atopy, considering the influence of socioeconomic status, environmental conditions, infections and psychosocial factors. The increased proportion of African ancestry was negatively associated with atopy as measured by skin reactivity test (SPT) and positively associated with non-atopic asthma. These findings suggest that genetic factors underlying to African ancestry are more likely to play a role in non-atopic asthma, which need to be confirmed in further studies.
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LISTA DE FIGURAS
Artigo 1: The correlation between ancestry and color in two cities of northeast brazil with contrasting ethnic compositions
Figura 1 Triangular plots of ancestry as estimated in the program Structure………. 49 Figura 2 Comparison of ancestry estimates including an Asian or Amerindian population ……….. 50
Artigo 2: A ancestralidade biogeográfica, mas não a raça/cor autodeclarada, está associada às condições ambientais e sociais de uma população de um grande centro urbano da América Latina
Figura 1 Associação da proporção de ancestralidade individual africana com os diferentes desfechos investigados de acordo com a raça/cor autodeclarada... 79
Artigo 3: Associação da ancestralidade biogeográfica africana com fenótipos de asma e atopia em crianças latino-americanas
Figura 1 Modelos conceituais para SPT (A) e asma não atópica (B) testados pelo método KHB... 104
LISTA DE TABELAS
Artigo 1: The correlation between ancestry and color in two cities of northeast brazil with contrasting ethnic compositions
Tabela 1 Mean estimated genetic ancestry proportions including or excluding pseudoancestral populations……….. 46 Tabela 2 Effect of different African lineages on African ancestry estimates in Fortaleza and Salvador……….... 47 Tabela 3 Individual ancestry correlation (IAC) test for Salvador and Fortaleza………. 48 Tabela 4 Percent of marker pairs in LD………. 48 Tabela Suplementar 1 Differences between allele frequencies for unlinked autosomal SNPs in 3 different HapMap populations………. 51 Tabela Suplementar 2 Comparison of National Brazilian census and the study population……….. 56 Tabela Suplementar 3 Ancestry difference between color categories by Kruskall-Wallis test………... 56
Artigo 2: A ancestralidade biogeográfica, mas não a raça/cor autodeclarada, está associada às condições ambientais e sociais de uma população de um grande centro urbano da América Latina
Tabela 1 Distribuição dos valores medianos das proporções de ancestralidade biogeográfica de acordo com os fatores sociodemográficos, ambientais e infecções... 76
Tabela 2 Estimativa da razão de chances dos fatores sociodemográficos, ambientais e infecções em função da proporção de ancestralidade individual africana e europeia... 77 Tabela 3 Associação da raça/cor autodeclarada e dos tercis de ancestralidade africana com os fatores sociodemográficos, ambientais e infecções... 78
Tabela Suplementar 1 Comparação da distribuição dos fatores sociodemográficos, ambientais, infecções e das proporções de ancestralidade
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biogeográfica entre os indivíduos com e sem informação de raça/cor autodeclarada... 80
Tabela Suplementar 2 Concordância entre a raça/cor autodeclarada e os tercis de ancestralidade biogeográfica africana... 81
Tabela Suplementar 3 Estimativa da razão de chances dos fatores sociodemográficos, ambientais e infecções em função da proporção de ancestralidade individual africana e europeia apenas entre os indivíduos com informação completa para raça/cor (n = 878)... 81
Artigo 3: Associação da ancestralidade biogeográfica africana com fenótipos de asma e atopia em crianças latino-americanas
Tabela 1 Razão de chances de sIgE, SPT, Atopia e sintomas de asma de acordo com o aumento da proporção de ancestralidade individual africana... 103
Tabela 2 Razão de chances de asma não atópica e asma atópica de acordo com o aumento da proporção de ancestralidade individual africana... 103
Tabela 3 Efeito total e indireto da ancestralidade individual africana sobre a chance de SPT e asma não atópica na população investigada... 104
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
IC: Intervalo de Confiança (confidence intervals) LD: Desequilíbrio de ligação (linkage disequilibrium) MAF: alelo de menor frequência (minnor allele frequence) OR: Razão de chances (Odds ratio)
SCAALA: Mudanças sociais asma e alergia na América Latina (Social
Changes Asthma and Allergy in Latin America)
SNP: polimorfismo de nucleotídeo único (single-nucleotide polymorphisms) SPT: Teste cutâneo (Skin Prick Test)
TH1: Células T auxiliaries 1 (T helper 1) TH2: Células T auxiliaries 2 (T helper 2) IgE: Imunoglobulina E
MIAs: marcadores informativos de ancestralidade
IAC: correlação da ancestralidade individual (individual ancestry correlation) CHB: Chineses da etnia Han de Pequim, China
YRI: Iorubas de Ibadan, Nigéria
CEU: residentes de Utah, EUA, com ancestralidade da europeia setentrional e ocidental
KHB: método Karlson-Holm-Breen DNA: ácido desoxirribunocléico IL-4: interleucina 4
IL-10: interleucina 10 NAM: nativos americanos
DHF: febre da dengue hemorrágica (dengue hemorrhagic fever) IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
MKK: Massais de Kinyawa, Quênia LWK: Luhias de Webuye, Quênia
ASW: residentes de ancestralidade africana do sudoeste dos EUA
HGDP: Projeto de Diversidade do Genoma Humano (Human Genome
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CEPH: Centro de Estudos do Polimorfismo Humano (Centre d'Etude du Polymorphisme Humain)
HapMap: projeto internacional para o desenvolvimento de mapas de haplótipos do genoma humano
SUMÁRIO
RESUMO ... v
ABSTRACT ... vi
LISTA DE FIGURAS ... vii
LISTA DE TABELAS ... viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES ... x
INTRODUÇÃO ... 14
Problemática da asma e atopia ... 16
Evidências de diferenças étnico/raciais para asma e atopia ... 18
Estudos sobre a relação da ancestralidade biogeográfica individual com asma e atopia ... 19
REFERÊNCIAS ... 21
ARTIGO 1: THE CORRELATION BETWEEN ANCESTRY AND COLOR IN TWO CITIES OF NORTHEAST BRAZIL WITH CONTRASTING ETHNIC COMPOSITIONS ... 28
ABSTRACT ... 29
INTRODUCTION ... 30
MATERIALS AND METHODS ... 30
RESULTS ... 34
DISCUSSION ... 37
REFERENCES ... 41
ARTIGO 2: A ANCESTRALIDADE BIOGEOGRÁFICA ESTÁ ASSOCIADA ÀS CONDIÇÕES AMBIENTAIS E SOCIAIS DE UMA POPULAÇÃO DE UM GRANDE CENTRO URBANO DA AMÉRICA LATINA ... 57
RESUMO ... 58 INTRODUÇÃO ... 59 MÉTODOS ... 61 RESULTADOS ... 63 DISCUSSÃO ... 66 REFERÊNCIAS ... 71 ARTIGO 3: ASSOCIAÇÃO DA ANCESTRALIDADE BIOGEOGRÁFICA AFRICANA COM FENÓTIPOS DE ASMA E ATOPIA EM CRIANÇAS
xiii RESUMO ... 83 INTRODUÇÃO ... 84 METODOLOGIA ... 86 RESULTADOS ... 91 DISCUSSÃO ... 93 REFERÊNCIAS ... 97 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 105
INTRODUÇÃO
O conceito de raça é atualmente um dos mais controversos nos campos social e científico (1). A despeito disso, a raça/etnicidade é uma variável amplamente utilizada em pesquisas médicas e em estudos que buscam investigar as causas de iniquidades em saúde (2). Quando usada em tais estudos, a raça é frequentemente empregada como um substituto (proxy) para indicadores não mensuráveis entre grupos ou indivíduos, tais como status socioeconômico, estilo de vida, diferenças culturais, hábitos alimentares e características genéticas (3). Nesse contexto, indivíduos classificados como pertencendo a uma mesma categoria racial seriam, em tese, mais semelhantes entre si comparativamente a indivíduos pertencentes a outros grupos raciais/étnicos.
Uma questão fundamental nos estudos que avaliam a raça/etnicidade em relação a características de interesse para a saúde é como essa variável é mensurada. A autodeclaração em geral é recomendada como uma forma de garantir que a classificação racial reflita o background pessoal e cultural de cada participante (4). Para populações formadas pela intensa miscigenação de diferentes grupos ancestrais, a exemplo da população brasileira, a classificação racial/étnica é baseada quase que exclusivamente na cor da pele autodeclarada. Contudo, historicamente a cor dos indivíduos empregada no sistema de classificação racial brasileiro reflete também outras características fenotípicas, como textura do cabelo e formato dos lábios e nariz, atributos físicos ainda hoje levados em consideração para a autodefinição da raça/cor (5). Importantemente, a classificação racial no Brasil sempre foi fortemente influenciada também pela posição socioeconômica dos sujeitos, o que é exemplificado pela máxima “o dinheiro embranquece” (6). Nesse aspecto, a depender da classe ou posição social, indivíduos com características físicas semelhantes podem ser classificados em categorias de raça/cor distintas, ainda que essa prática tenha se tornado menos comum nas últimas décadas em comparação ao verificado no passado (5).
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Embora a cor da pele e outras características fenotípicas sejam influenciadas pela ancestralidade individual, a correlação das origens ancestrais dos indivíduos com esse fenótipo pode variar consideravelmente em populações miscigenadas. A depender do grau de estrutura genética presente na população, a correlação entre cor da pele e ancestralidade individual pode ser forte, fraca ou inexistente (7). Por esse motivo, a cor da pele pode não constituir um substituto confiável ou muito preciso da ancestralidade individual em populações miscigenadas. Uma alternativa a essa classificação tem sido o emprego dos chamados marcadores genéticos informativos de ancestralidade (MIAs). Os MIAs podem ser definidos como variantes genéticas cujas frequências alélicas variam significativamente entre populações com origens geográficas distintas (8). O emprego dos MIAs permite estimar as proporções do genoma individual que foram herdadas de cada uma das populações ancestrais envolvidas no processo de miscigenação, o que também é referido como ancestralidade biogeográfica ou ancestralidade genética (9).
Em epidemiologia, o estudo da relação entre cor da pele e ancestralidade biogeográfica é importante para a mensuração do grau de estrutura genética existente na população, o que pode ser um confundidor em estudos de associação genética (10). Ademais, embora as diferenças genéticas entre as populações continentais que representam os grupos raciais classicamente reconhecidos sejam pequenas (7), diferenças significantes entre esses grupos têm sido observadas para um subconjunto de variantes genéticas associadas com susceptibilidade a doenças, adaptação ambiental e metabolismo de fármacos (11-13). Desse modo, a ancestralidade biogeográfica pode ser utilizada para identificar fatores genéticos de risco para doenças complexas, sobretudo para desfechos que demonstram prevalências diferenciais entre os grupos ancestrais que contribuíram para a formação da população miscigenada (14). Asma e atopia são exemplos de desfechos que se enquadram nessa categoria (15). Contudo, a ancestralidade biogeográfica atua também como um proxy para status socioeconômico e exposição a variáveis ambientais e fatores psicossociais que afetam
decisivamente a condição de saúde dos indivíduos. Embora pouco investigado, o conhecimento do padrão de associação entre a ancestralidade biogeográfica e esses diferentes fatores é fundamental para evitar que sejam atribuídos a variantes genéticas diferenças para o risco de doença que são devidas a fatores não genéticos que covariam com a ancestralidade.
Problemática da asma e atopia
A asma está entre as doenças crônicas mais comuns em todo o mundo, atingindo aproximadamente 300 milhões de pessoas (16). A asma é uma condição heterogênea, constituindo a apresentação final de diferentes processos patológicos que estão associados com backgrounds genéticos e exposições ambientais distintos (17). A atopia, por sua vez, é um importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças alérgicas, tais como asma, dermatite atópica e alergias alimentares (18). Operacionalmente a definição de atopia é baseada na elevação nos níveis séricos de IgE específicos para alérgenos acima de um determinado limiar ou pela positividade no teste de reatividade cutânea a esses alérgenos (19). Pelo menos dois fenótipos distintos de asma podem ser distinguidos com base no status de atopia dos indivíduos: asma atópica (ou alérgica) e asma não atópica. Atualmente tais definições são utilizadas de maneira ampla na concepção e análise de estudos sobre os determinantes genéticos, ambientais e imunológicos da asma (20). A asma atópica é caracterizada pela ativação de células Th2 CD4+, as quais promovem respostas mediadas por IgE, ativam mastócitos e desencadeiam um aumento do número de eosinófilos e hiperreatividade brônquica (21). Já na asma não atópica os testes de reatividade cutânea aos aeroalérgenos são negativos e os níveis séricos de IgE são normais ou baixos (22). Além disso, pacientes com asma não atópica apresentam um perfil mais neutrofílico nas células isoladas do escarro induzido (23), sugerindo que os mecanismos imunológicos subjacentes aos fenótipos de asma atópica e não atópica são verdadeiramente diferentes. Dessa forma, os fatores de risco
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ambientais e genéticos para os fenótipos de asma atópica e não atópica, muito provavelmente, devem ser também distintos entre si (24)
As prevalências de asma e atopia têm aumentado nas últimas décadas, sobretudo em países industrializados, havendo evidências dessa mesma tendência em populações urbanas de países em desenvolvimento (25). Estudos conduzidos em diferentes populações brasileiras, por exemplo, têm relatado prevalências de sintomas de asma compatíveis com os níveis epidêmicos observados nos países desenvolvidos (26). As causas para essas tendências temporais não são inteiramente compreendidas, mas elas podem resultar de mudanças no padrão de exposições ambientais e estilo de vida associados com o processo de urbanização (27). Uma explicação relativamente bem aceita, sobretudo para o aumento da prevalência da asma atópica, é a hipótese da higiene, segundo a qual a redução de infecções por patógenos durante a infância impediria o estabelecimento de uma rede imunoregulatória necessária para controlar processos inflamatórios que predispõem para alergias e outras doenças inflamatórias (28). Entretanto, na América Latina e nos países em desenvolvimento de um modo geral, a fração de asma atribuível a atopia é consideravelmente baixa em comparação ao verificado nos países desenvolvidos. Estima-se, por exemplo, que a asma não atópica responda por mais de 80% de todos os casos de asma na América Latina (29). Além disso, achados do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a exposição a diferentes patógenos na infância foi negativamente associada à atopia, mas não a sintomas de asma (30-32). Isso indica que em nossa população a hipótese da higiene possa operar apenas em relação ao estado de atopia dos indivíduos. Trabalhos desse mesmo grupo de pesquisa têm identificado fatores de risco distintos para os diferentes fenótipos de asma, com a asma não atópica sendo associada com variáveis indicadoras de pobreza (baixo nível de escolaridade materna), exposição a sujidade (baixa frequência de limpeza da casa e presença de roedores no domicílio) e infecções respiratórias (33). Por fim, fatores psicossociais relacionados aos pais ou responsáveis (transtornos psiquiátricos menores e discriminação racial reportada) e às próprias crianças (problemas comportamentais) têm
sido associados com sintomas de asma em nossa população (34-36). Importantemente, tanto os fatores previamente associados com atopia (infecções helmínticas e carga de infecção por patógenos), quanto com asma não atópica (pobreza, exposição a sujidade e problemas psicossociais) podem estar associados também com a ancestralidade biogeográfica individual, constituindo potenciais confundidores nas análises que objetivem correlacionar a ancestralidade genética com esses desfechos.
Evidências de diferenças étnico/raciais para asma e atopia
A prevalência de sintomas de asma e de alergias varia entre populações de diferentes países, bem como entre grupos étnicos/raciais dentro de um mesmo país. Nos EUA, por exemplo, os descendentes de porto-riquenhos e mexicanos exibem a maior (26%) e a menor (10%) prevalência de asma, respectivamente (37). Além disso, maiores níveis de prevalência, morbidade e mortalidade são observados entre populações de afroamericanos comparativamente aos euroamericanos (38). Interessantemente, os levantamentos globais acerca da prevalência de sintomas de asma demonstram que essa condição é mais comum em países industrializados e desenvolvidos, com maior ancestralidade europeia, portanto, do que em regiões menos desenvolvidas do globo, a exemplo do continente africano (15). Essas contradições observadas para a prevalência de asma entre indivíduos com ascendência africana dentro e fora da África poderiam ser explicadas por potenciais interações entre fatores genéticos e ambientais. Choudhry e colaboradores, por exemplo, demonstraram que a ancestralidade genética interage com o status socioeconômico para modificar o risco de asma: entre porto-riquenhos com baixo nível socioeconômico, uma maior proporção de ancestralidade europeia foi positivamente associada à asma, enquanto que para os pacientes com status socioeconômico elevado a ancestralidade africana foi positivamente associada à asma (37).
Uma hipótese interessante e que de certa forma dá sustentação à ideia de que a ancestralidade africana pode ser um fator de risco para asma e
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Le Souef e colaboradores (39). De acordo com esses autores, a exposição a altas cargas de infecção, principalmente por helmintos, dos ancestrais do homem moderno que viviam nas regiões tropicais do planeta levou a uma seleção genética que favoreceu variantes associadas com respostas pró-inflamatórias aumentadas. Posteriormente, com a diáspora africana e a migração desses ancestrais para regiões mais frias do globo, onde a exposição a infecções helmínticas era muito menor, esses variantes genéticos pró-inflamatórios passaram a ser negativamente selecionados, o que explicaria as frequências diferenciais para esses polimorfismos atualmente observadas entre populações continentais distintas (39, 40). De fato, uma maior frequência de polimorfismos dos genes da IL-4 e da IL-10 associados com aumento da produção de IgE, por exemplo, é observada entre populações africanas comparativamente a europeias (41). A emergência desses variantes genéticos pró-inflamatórios compensatórios em populações humanas que coevoluíram com pesadas cargas de organismos indutores de imunoregulação é prevista também pela hipótese dos “Velhos Amigos” (42). A perda de contato com esses organismos pelo estilo de vida moderno levaria a uma predisposição a respostas inflamatórias exacerbadas e constituiria um fator de risco para doenças inflamatórias crônicas. Isso é referido como a segunda lei da evolução ocorrida na dependência dos “Velhos Amigos” (43). De acordo com essas hipóteses, portanto, indivíduos com maior ancestralidade africana teriam um background genético que predispõe à ocorrência de doenças alérgicas e inflamatórias, mas que só se manifestaria sob condições ambientais específicas.
Estudos sobre a relação da ancestralidade biogeográfica individual com asma e atopia
Diferentes estudos analisaram a associação entre a ancestralidade biogeográfica individual e asma em populações miscigenadas. Com exceção de um estudo conduzido nas Ilhas Canárias (44), os demais relataram associações significantes entre as proporções de ancestralidade individual e os desfechos investigados. A ancestralidade africana foi positivamente associada com asma entre afroamericanos e em populações latinas
(mexicanos e porto-riquenhos) (38, 45-47). Pelo menos um estudo investigou a associação entre ancestralidade africana e asma em populações latino-americanas (Brasil e Colômbia), tendo sido relatada uma associação positiva em ambas (48). A ancestralidade europeia, por sua vez, foi positivamente associada a maior severidade de asma entre méxico-americanos (49) e um variante genético comum entre europeus foi associado com asma em afro-americanos pelo método de mapeamento por miscigenação (admixture mapping) (50). A associação da ancestralidade africana com atopia tem sido menos investigada e os resultados não têm sido muito consistentes: enquanto alguns estudos reportaram associações significantes e positivas (48, 51), outros não confirmaram esses achados (52, 53).
Uma importante limitação de boa parte desses estudos diz respeito às variáveis utilizadas para o controle de eventuais efeitos de confundimento da associação entre ancestralidade biogeográfica e asma. Ainda que a maioria dos estudos tenha incluído ao menos uma variável proxy de status socieconômico nas análises multivariadas, alguns ajustaram apenas para sexo e idade (45, 48). Ademais, um único estudo incluiu fatores psicossociais (discriminação racial) entre as covariáveis nas análises (46). A importância de se considerar o efeito de fatores psicossociais que podem covariar com a ancestralidade, a exemplo da discriminação racial percebida, é que eles podem alterar a carga alostática do indivíduo, o que representa a sequela psicológica de exposição ao estresse. Embora o processo não seja completamente compreendido, as sequelas patofisiológicas seriam mediadas através dos sistemas neuroendócrino e/ou imunológico (54). De fato, entre afroamericanos, por exemplo, a discriminação racial percebida tem sido relatada como um fator de risco para diferentes desfechos, como hipertensão e outras doenças cardiovasculares (55). Adicionalmente, sintomas de estresse, ansiedade e depressão experimentados pelos pais ou responsáveis podem influenciar no risco de asma através de mudanças comportamentais e emocionais que afetariam as práticas de cuidados e produziriam ambientes estressantes, com reflexo sobre os sistemas imunológico e neuroendócrino
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e de outros fatores psicossociais no risco de asma e atopia não pode ser negligenciado nos estudos que se proponham a investigar a associação entre a ancestralidade biogeográfica e esses desfechos. Contudo, em virtude da potencial associação da ancestralidade biogeográfica com determinantes sociais da saúde pertencentes a diferentes dimensões (socioeconômica, ambiental e psicossocial), associações espúrias podem resultar de uma ou mais variáveis de confundimento não observadas. Em outras palavras, confundimentos residuais não devem ser completamente descartados como explicações das associações observadas entre a ancestralidade biogeográfica e desfechos de interesse para a saúde, mesmo naqueles estudos que consideram a influência de múltiplos confundidores nas análises (58).
Assim, o presente trabalho teve por objetivos: 1) analisar a relação entre a ancestralidade biogeográfica individual e a raça/cor autodeclarada em duas capitais do nordeste brasileiro (Salvador e Fortaleza), avaliando também a estruturação da diversidade genética presente nessas populações; 2) avaliar e comparar o padrão de associação da ancestralidade biogeográfica e da raça/cor autodeclarada com variáveis indicadoras de pobreza, exposição à condições ambientais precárias e infecções entre os participantes do projeto
Social Change Asthma and Allergy in Latin America (SCAALA) - Salvador; e
3) analisar a associação da ancestralidade biogeográfica africana com sintomas de asma e atopia entre crianças e adolescentes do projeto SCAALA-Salvador, considerando a influência de fatores socioeconômicos, ambientais e psicossociais potencialmente relacionados à ancestralidade.
Cada um desses objetivos foi desenvolvido na forma de um artigo científico, estando a presente tese estruturada em capítulos que se referem a esses três artigos.
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ARTIGO 1: THE CORRELATION BETWEEN ANCESTRY AND COLOR IN TWO CITIES OF NORTHEAST BRAZIL WITH CONTRASTING ETHNIC COMPOSITIONS
Running title: Color and genetic ancestry in Northeast Brazil
Thiago Magalhães da Silva*1, M R Sandhya Rani*2, Gustavo Nunes de Oliveira Costa1, Maria A Figueiredo1, Paulo S Melo3, João F Nascimento3, Neil Molyneaux2, Maurício L. Barreto1, Mitermayer G Reis4, M Glória Teixeira1, and Ronald E Blanton2
1
Federal University of Bahia, Institute for Collective Health, Salvador, Bahia, Brazil 2Case Western Reserve University, Center for Global Health, Cleveland, Ohio, USA 3State University Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, Brazil
4Case Western Reserve University, Department of Genetics, Cleveland, Ohio, USA 4Oswaldo Cruz Foundation, Gonçalo Moniz Research Center, Salvador, Bahia, Brazil *Contributed equally.
Corresponding Author: Ronald E. Blanton MD, MSc
Centre for Global Health and Diseases, Case Western Reserve University Biomedical Research Building
2109 Adelbert Rd. Cleveland, OH 44106 Telephone: (216) 368-4814
Fax: (216) 368-4825; E-mail: reb6@case.edu
Artigo publicado na European Journal of Human Genetics. 2015. 23(7):984-9.
29 ABSTRACT
The degree of admixture in Brazil between historically isolated populations is complex and geographically variable. Studies differ as to what the genetic and phenotypic consequences of this mixing have been. In Northeastern Brazil, we enrolled 522 of residents of Salvador and 620 of Fortaleza whose distributions of self-declared color were comparable to those in the national census. Using the program Structure and principal components analysis there was a clear correlation between biogeographic ancestry and categories of skin color. This correlation with African ancestry was stronger in Salvador (r = 0.585; p <0.001) than in Fortaleza (r = 0.236; p <0.001). In Fortaleza, although self-declared blacks had a greater proportion of European ancestry, they had more African ancestry than the other categories. When the populations were analyzed without pseudoancestors, as in some studies, the relationship of "race" to genetic ancestry tended to diffuse or disappear. The inclusion of different African populations also influenced ancestry estimates. The percentage of unlinked ancestry informative markers in linkage disequilibrium, a measure of population structure, was 3-5 times higher in both Brazilian populations than expected by chance. We propose that certain methods, ascertainment bias and population history of the specific populations surveyed can result in failure to demonstrate a correlation between skin color and genetic ancestry. Population structure in Brazil has important implications for genetic studies, but genetic ancestry is irrelevant for how individuals are treated in society, their health, their income or their inclusion. These track more closely with perceived skin color than genetic ancestry.
Key words: pseudoancestor, skin color, genetic ancestry, individual ancestry correlation test, race, ethnicity
INTRODUCTION
In the Americas, the mixture of historically separated populations is more the rule than the exception. This is the case for the Brazilian population, which is the result of more than 500 years of social, commercial and physical contact between Europeans, Native Americans and Africans 1. These peoples met and mated with each other in distinct ways that varied across the continental expanse of the country, giving rise to a multiethnic and highly admixed population 2. In Brazil, skin color has been used as a phenotypic surrogate for biogeographical ancestry in the scientific literature, but with recognition of the influence of socioeconomics, familial origin and ethnic identity 3. This system for classification of human diversity is not arbitrary, but based on a generally shared group of terms where skin tone is the major defining characteristic. These categories are also meant in part to recognize descent of individuals from one or several distinct biogeographical populations or races. Some genetic studies, however, have concluded that in Brazil, skin color has no correlation with ancestry as estimated by molecular markers 4,5. Other studies, by contrast, have demonstrated a significant association between self-declared color/ethnicity and genetic ancestry 6,7.
In the present study we evaluate the correlation between self-reported skin color and genetic ancestry, and describe the patterns of genetic structure and admixture stratification in two cities from the Northeast region of Brazil: Fortaleza, capital of the state of Ceará and Salvador, capital of the state of Bahia. The two capitals are 1,300 km apart, and have different demographic histories with respect to African slavery and European immigration. We evaluate the effect of methodological approach on the distribution of ancestry estimates with and without the inclusion of different parental populations.
MATERIALS AND METHODS Sample collection
31
Venous blood samples (10 ml) were collected as part of 2 community-based, multistate studies designed to identify epidemiologic and genetic risk factors for dengue hemorrhagic fever (DHF). For each case, 4 neighbors were enrolled who did not have DHF. Each program was conducted at different times and with different research teams, but used the same protocols and questionnaires under the direction of one of the authors (MGT). In 2004, 522 subjects were enrolled from Salvador and in 2005, 620 from Fortaleza. Color was self-assigned in answer to the question “What is your color/race?” Answers were recorded based on the 4 color categories used by the Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, the government agency responsible for the National Census. The categories are white, brown, black and yellow/indigenous. In Salvador and Fortaleza, respectively, only 11 (2.1%) and 3 (0.7%) individuals self-classified as yellow or indigenous. One individual did not provide a color designation. These individuals were not considered for analyses due to the lack of statistical power. The ascertainment method was not based on a random design, but the samples were from a community-base study and their distribution is consistent with the distribution of their racial categories as identified in the national census. We, therefore, compared the distribution of the white, brown and black self-identified categories in our study samples (Supplemental Table 2) to the 2010 Brazilian census for each city (www.sidra.ibge.gov.br, accessed 3-28-2013).
Written informed consent was obtained from all participants and/or their guardians. The study was approved by the ethical review boards of University Hospitals of Cleveland, the Oswaldo Cruz Foundation, Bahia, and the National Commission on Ethics in Research, Brazilian Ministry of Health.
DNA processing and genotyping
Genomic DNA was extracted from buffy coats stored at -20°C using QIAamp Flexigen kit (Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer’s instructions. All samples were diluted to a final concentration of 100 µg/ml and DNA concentration was measured with the Qubit dsDNA BR assay kit (Life Technologies, Grand Island, NY). The samples were genotyped by Illumina GoldenGate assay (Illumina, Inc., San Diego) for 728 SNPs in the interferon
alpha pathway, 10 SNPs in genes with known associations with DHF and 30 published ancestry informative markers (AIMs). Linkage disequilibrium (LD) was calculated with the program Haploview 8 with the r2 cut-off threshold set at 0.1. From the Illumina genotype dataset, we identified 237 unlinked SNPs common to all study and HapMap populations evaluated. The list of SNPs with their rs numbers, chromosome, alleles and minor allele frequencies (MAF) and population allele frequency differences are provided in Supplemental Table 1. All variants (SNPs and their respective rs) used in this study are adequately cataloged in public databases, such as the dbSNP polymorphism-repository (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).
For Illumina genotyping, 250 µg of DNA/well were arrayed in 96 well plates and processed using Illumina’s microbead array technology. Genotypes of 5 replicates and three trios were used to guide the clustering and calculate error rates. The trios consisted of multiethnic families from Brazil and the US not ascertained through their dengue status and composed of father, mother and child. Two investigators called the genotypes independently using either Illumina's GenCall v.6.2 or GenomeStudio software. An initial quality control identified and eliminated samples and SNPs that failed genotyping according to protocols. Markers with GenCall scores less than 0.25 were excluded.
Data analysis
We used the program Structure v.2.3.3 9 for Bayesian model-based estimates of the proportion of ancestry for each subject. The major populations of origin in Brazil are European, African and Amerindian, so, three subpopulations (k=3) were modeled. Quantitative genetic ancestry was estimated for individuals by including contemporary descendents of approximate populations of origin (pseudoancestors). From the Hapmap dataset, 60 unrelated individuals of northern and western European origin (CEU), 60 Yoruba individuals from Ibadan, Nigeria (YRI) and 60 Han Chinese from Beijing (CHB) were selected at random and used as pseudoancestors. The CHB population was included as pseudoancestors for Amerindians, since
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the number of markers shared with the available Native American datasets is smaller. The CHB population has been shown to have similar allele frequencies to Native Americans 10-12. Additionally, 64 individuals from different indigenous tribes in Latin America of the HGDP-CEPH Diversity Panel (NAM) were used as Amerindian reference population with 108 markers common to all datasets 13
For Structure analyses, the admixture model was employed assuming correlated population allele frequencies with a burn-in period of 10,000 and 100,000 iterations. Summary statistics indicated convergence and results from duplicate runs were consistent. Triangle plots of the genomic proportions of European, African and Asian ancestry of each individual were made using the program C-space 14. To determine how different African lineages could influence ancestry estimates for these Brazilian populations, in some analyses the Yoruba data set was replaced by one of the following samples: 60 Maasai from Kinyawa, Kenya (MKK), 60 Luhya from Webuye, Kenya (LWK) or 47 individuals of African ancestry from Southwestern USA (ASW).
Differences between median values of individual ancestry according to self-reported skin color were evaluated using the Kruskal-Wallis test. We evaluated the correlation between self-reported skin color (coded as 0 - white; 1 - brown and 2 - black) and individual ancestry as estimated by Structure using Spearman’s rho nonparametric test. Statistical analyses were performed using SPSS software version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, II, USA) or the VassarStats Website (http://vassarstats.net/index.html) adopting a significance level of 5%.
Principal components analysis (PCA) was performed using SNPRelate in the R software R 15. Admixture stratification was evaluated using the Individual Ancestry Correlation (IAC) Test 16. We tested for correlations between biogeographical ancestry values estimated using the program Structure for SNPs on even and odd chromosomes. A significant correlation between estimates obtained with the 2 panels indicates reliability of the individual biogeographical ancestry estimates and supports that the variation in admixture proportions among the individuals is not due to chance 17. AIMs
were defined as unlinked SNPs whose difference between MAFs for any two parental populations was ≥ 0.3 10,18
. The proportion of pairs of unlinked AIMs in linkage disequilibrium was determined using the likelihood ratio test for linkage disequilibrium in the Arlequin 3.1 software package 19 with 10,100 permutations for each nominal association tested.
RESULTS
SNP characteristics
The rate of success and informativeness for genotypes was 77% in Salvador (genotyped prior to completion of the HapMap project) and 96% for Fortaleza. Replication and Mendelian error rates were 0.001 and 0.003, respectively. Of the 237 unlinked SNPs common to all of the datasets there were 59 with MAF differences between the CEU and YRI populations of >0.3, 61 for the CHB and YRI populations and 43 for the CHB and CEU populations. The mean pairwise MAF difference between AIMs for the CEU, YRI and CHB HapMap populations ranged from 0.40 - 0.46 (Supplemental Table 1).
Population Characteristics
There was no statistically significant difference between the distribution of self-identified color categories of the participants in this study and the 2010 national census for their cities. In Fortaleza, 4% of the population self-identified as black compared to 28% in Salvador. Both cities were approximately 50% brown and the remaining portions were white.
Bayesian clustering for ancestry
In the absence of the reference populations, the estimated ancestry proportions were distributed across most of the triangular ancestry space for the 2 populations (Figure 1a and 1b). Although there is overlap, groups based on self-declared color/ethnicity are differently distributed across this space, especially in Salvador with blacks and whites distributed more on opposite halves. When pseudoancestors are included (1c and 1d), the Hapmap populations cluster tightly near different vertices. Self-declared whites in both
35
blacks are closer to the YRI population as expected. In Salvador these trends were more pronounced than in Fortaleza. In Fortaleza, much of the self-declared blacks shifted toward the CHB group.
Ancestry proportions differed significantly depending on whether pseudoancestors were included or not (Table 1). Including pseudoancestors, in Fortaleza, those who self-identified as black had more African ancestry than the other 2 categories of skin color, although this was not the major ancestral component for blacks. In Salvador, individuals that self-identified as black showed 56.4% average African ancestry, which was more than twice that observed for those who self-identified as white (20.0%; Table 1). For the component of European ancestry, in turn, individuals who declared themselves white showed an average of 70.4%, twice that observed among black individuals in Salvador. Although less than 4% of individuals in Fortaleza and Salvador claimed yellow or indigenous as their primary ethnicity, more of the population in Fortaleza had Amerindian genetic ancestry than in Salvador, as indicated by greater similarity with the CHB sample. Without pseudoancestors, the proportions could be over-estimated or underestimated relative to values when they were included, and the overall character of the cities changes markedly (Table 1). Since the data were not normally distributed, ancestry for each color category (estimated using pseudoancestors) was analyzed by the Kruskall-Wallis test (Supplemental Table 3). The median values for African and European ancestry among the groups was significantly different both for the population of Salvador and Fortaleza. The Asian/Amerindian ancestry in Salvador was significantly lower for blacks compared to both whites and browns, whereas in Fortaleza this component was significantly higher for blacks and browns compared to whites, but did not differ significantly between blacks and browns.
Effect of African lineages and African genetic ancestry estimates
The greatest genetic diversity in human populations is observed on the African continent 20. To determine the effect of including different African populations as pseudoancestors, we used representatives of the 4 African
lineages represented in the Hapmap dataset: Yoruba, Maasai, Luhya and the African-Americans from southwestern US. Consistent with the history of African diaspora to the Americas 21, Bantu populations, such as the Luhya, and near relatives, the Yoruba were genetically more similar to each other and to African descendents in the New World 22 (Table 2). Using the Maasai or African Americans as pseudoancestors produced African ancestry estimates for all 3 Brazilian ethnicities that were more extreme than when LWK or YRI populations were used. In Fortaleza, however, this variation was greater than observed in Salvador (using ASW, for example, the proportion of African ancestry among blacks in Fortaleza ranged from over 40% compared to that observed using YRI. In Salvador this variation was only 16%).
PCA ancestry estimates
The genetic structure of populations of Salvador and Fortaleza was evaluated using PCA (Figure 2). The population of Salvador was distributed continuously between European and African pseudoancestors, with little overlap with the Asians. When the categories of self-reported skin color are considered, self-identified whites tend to cluster near the Europeans, and those self-reported as black, extending and overlapping with the Africans. For the population of Fortaleza, much of the population overlaps with that of Europeans regardless of self-reported color, although the self-identified blacks show closer ancestry with the African pseudoancestors than the other groups. There is also greater extension and some overlap with the Asians. Substituting the CHB by an Amerindian sample and using 108 markers produce similar ancestry distributions (Figure 2c and 2d).
Individual Ancestry Correlation Test
For the population of Fortaleza a significant correlation was observed only between estimates for the African axis of ancestry using non-syntenic markers. The Salvador population, however, showed significant correlations between biogeographical ancestry estimates calculated with markers from odd
37
not Asian (Table 3). These results were supported by the analysis of pairs of 92 unlinked AIMS in linkage disequilibrium, which showed an excess of pairs of markers in LD in both populations compared to that expected by chance (Table 4). For Salvador, however, the proportion of pairs of loci in LD was higher (18.8%) than that observed in Fortaleza (12.7%), and both were higher than for source populations (~5%).
Correlations between self-reported skin color and individual biogeographical ancestry
Skin color was coded as an ordinal variable roughly corresponding to melanin content (white – 0; brown – 1; black - 2), and was used to determine how well this variable correlated with estimated genetic ancestry as determined by the program Structure. There was a significant positive correlation between self-declared skin color and the individual African ancestry proportions both for the population of Fortaleza and Salvador. In Salvador, however, the correlation was stronger (rho = 0.585; p < 0.001) than in Fortaleza (rho = 0.236; p < 0.001). A negative correlation was observed between skin color and the proportion of European ancestry, whereas Salvador again had a stronger correlation (rho = -0.485; p < 0.001) than Fortaleza (rho = -0.263; p < 0.001). The correlation between self-reported skin color and Amerindian ancestry was significantly negative for Salvador and significantly positive for Fortaleza population, although weaker than that observed for the African and European ancestries (rho = -0.181; p < 0.001 and r = 0.170; p < 0.001, respectively).
DISCUSSION
Across widely separated regions in Brazil, all groups have shown significant admixture, but how this is manifest in the population remains controversial. Some papers have suggested that despite massive migration over centuries there is little population structure and that structure is unrelated to the categories of skin color used by the National Census 4-7,23,24. By contrast, this paper is only one of many showing that Brazil can exhibit marked
population structure, and self-identified skin color is generally consistent with the dominant or relative ancestral contribution 25-31. In this study, for both cities, blacks were twice as African as others in the surrounding population and whites more European, while the browns were intermediate. However, within localities, the designation of skin color may be relative to the ancestral mixture of one's neighbors. Yet, in Fortaleza, mean African ancestry for the self-declared black population was 25%, while in Salvador this proportion averaged 56%. The percentage of brown individuals in both of these cities was similar at near 50%, but the distribution of their ancestry in Salvador showed the mixture to be predominantly European and African, while in Fortaleza it was European and Amerindian, based on similarity to the Han Chinese pseudoancestors 32 and the CEPH Amerindian database. The small contribution of indigenous ancestry to the makeup of the population of Salvador has also been documented elsewhere 33. The differences between Fortaleza and Salvador to the effect of African lineages in the ancestry estimate could be explained by the geographical origins of Africans who were brought to these two cities during the slave trade. Fortaleza, like most of the Brazilian territory, received slaves coming mostly from the west coast of Central Africa (Bantu populations), especially from the Angola, Congo and Mozambique 34,35. Salvador, in turn, received an intense slave trade from harbors in Ghana and Nigeria in the Gulf of Benin in the late 16th and early 17th. In addition, the slave traffic from west coast of Central Africa was supposedly intensified in Salvador in the early 19th 36,37. This most diverse make-up of African gene pool in Salvador could explain the lower variation observed in the African ancestry estimate for this population.
The mixture of two populations with divergent skin color should over several generations lead to the dissociation of genes for color from other loci in the genome. The extent to which skin color remains linked to unrelated and unlinked genetic elements reflects the time since admixture, repeated introduction from one or both parental populations and assortative mating 18,38. The process of miscegenation between European, Indigenous and African
