PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
JÉSSICA LUCIO DA SILVA
Londrina 2016
COMPARAÇÃO DO EFEITO DO LASER DE BAIXA
POTÊNCIA EM DIFERENTES COMPRIMENTOS DE ONDA E
DENSIDADES DE ENERGIA EM CÉLULAS
JÉSSICA LUCIO DA SILVA Cidade ano
AUTOR
Londrina 2016COMPARAÇÃO DO EFEITO DO LASER DE BAIXA
POTÊNCIA EM DIFERENTES COMPRIMENTOS DE ONDA E
DENSIDADES DE ENERGIA EM CÉLULAS
OSTEOBLÁSTICAS
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação na publicação (CIP)
Universidade Norte do Paraná - UNOPARBiblioteca CCBS/CCECA PIZA Setor de Tratamento da Informação
Silva, Jéssica Lúcio da
S586c Comparação do efeito do laser de baixa potência em diferentes comprimentos de onda e densidades de energia em células osteoblásticas. / Jéssica Lúcio da Silva. Londrina: [s.n], 2016.
70f.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Reabilitação). Universidade Norte do Paraná.
Orientadora: Profa. Dra. Deise A. A. Pires Oliveira.
1- Terapia laser de baixa potência - dissertação de mestrado - UNOPAR 2- Viabilidade celular 3- Microscopia de fluorescência 4- Osteogênese 5- Reabilitação. I- Oliveira, Deise A. A. Pires; orient. II- Universidade Norte do Paraná.
JÉSSICA LUCIO DA SILVA
COMPARAÇÃO DO EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA EM DIFERENTES COMPRIMENTOS DE ONDA E DENSIDADES DE ENERGIA
EM CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS.
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciência da Reabilitação, área de concentração em Ciências da Saúde como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
_________________________________________ Profa. Dra. Deise A. A. Pires Oliveira
(Orientadora)
Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
_________________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
(Membro Interno)
Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
_________________________________________ Profa. Dra. Luciana Prado Maia
(Membro Externo)
Universidade Oeste Paulista - UNOESTE
Dedico esse trabalho a minha família, sem o apoio de vocês esse sonho não se tornaria realidade!
AGRADECIMENTOS
Muitos foram os que contribuíram para a realização deste trabalho, mas primeiramente gostaria de agradecer a Deus e a Nossa Senhora por ter conduzido meu caminho e minhas escolhas para conseguir chegar até aqui, por estarem sempre do meu lado me dando forças e por nunca ter me permitido desistir.
A minha família, faltam palavras para agradecer vocês. Minha mãe Rosalina, meu pai Valdecir, meu irmão Fabricio, pelo amor incondicional, carinho e paciência em mais uma etapa da minha vida, por cada palavra de incentivo e motivação para eu continuar construindo um futuro sólido. Vocês sempre foram minha base e saber que poderia contar com vocês tornou tudo menos difícil, Obrigada por sempre acreditarem que eu era capaz. Amo vocês!
A minha orientadora, Profª. Deise A. A. Pires Oliveira, obrigada por ter me permitido descobrir o encantamento da pesquisa na área da cultura celular e por me aceitar como sua orientanda. Foi um prazer enorme aprender com você durante esses anos. Muito obrigada pela oportunidade, paciência e confiança durante a nossa caminhada, por dividir seu conhecimento comigo e tornar esse sonho possível. Agradeço de coração.
Ao Profº. Rodrigo Franco de Oliveira por estar sempre dispostos a me auxiliar partilhando do seu conhecimento, contribuído de forma importante e especial neste trabalho.
A Profª. Luciana Prado Maia por ter aceito o convite em fazer parte da banca e contribuir da melhor maneira para o crescimento do trabalho.
Aos meus professores da Universidade Estadual do Norte do Paraná (UENP) que despertaram em mim o interesse pela pesquisa, principalmente a Laís que desde o início me ajudou nessa conquista.
Ao meu namorado Thiago, obrigada por me apoiar incondicionalmente, por me incentivar a dar o melhor de mim, por nunca ter me deixado desanimar, por ter aturado minhas crises de mau humor, por estar sempre ao meu lado nos momentos bons e nos mais difíceis também.
As minhas amigas Viviane, Flávia, Bruna, Jéssica, Michele e Milena, por sempre torcerem por mim e entenderem a minha ausência durante esse tempo. Pode ser que inúmeras vezes vocês ficaram chateadas por isso, mas mesmo
assim sempre insistiram em manter contato, vocês são as melhores. Em especial a minha equipe de trabalho da APAE que sempre me ajudou e apoiou em todos os momentos.
As meninas do LACCEL (Ana, Mayra, Priscilla, Stheace, Mariana, Larissa, Flávia, Monique, Adriele e Glaciane) nossa convivência foi extremamente prazerosa, obrigada por todo o apoio, auxílio, conversas e caronas, desejo todo sucesso do mundo a cada uma de vocês.
A todos colegas do mestrado, professores do Programa de Ciências em Reabilitação e funcionários UEL/UNOPAR ao apoio oferecido ao longo dessa jornada e por manter a qualidade do programa.
Enfim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para o meu crescimento humano, social e intelectual.
"Enquanto você sonha, você está fazendo o rascunho do seu futuro."
RESUMO
Introdução: A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) vem sendo amplamente
utilizada, se destacando como um recurso na área da saúde por acelerar o processo de consolidação e reparo ósseo. Além de ser uma técnica simples, por apresentar uma ação menos invasiva e por ter um efeito positivo sobre diferentes tipos de células. Considerando-se que os osteoblastos são as células responsáveis pela formação do osso, é possível que a TLBP exerça um efeito biomodulador sobre elas. Objetivo: O objetivo do estudo foi comparar a resposta do laser 830nm e 904nm em células osteoblásticas analisando a proliferação celular e estrutura do Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático. Métodos: As células osteoblásticas (OFCOLII) foram plaqueadas em placas TPP de 96 poços e mantidas por 24 horas para sedimentação, posteriormente irradiadas em três tempos (24, 48 e 72 horas) e divididas em 4 grupos: não irradiado (controle), irradiado a 2J/cm² - 830nm (93 segundos), irradiado a 6J/cm² - 904nm (36 segundos) e irradiado a 50mJ/cm² - 904nm (2 segundos). Todo o experimento foi realizado em triplicata. A proliferação celular foi avaliada por meio do ensaio MTT, 24 horas após cada irradiação, em seguida realizava-se a microscopia de fluorescência do melhor tempo determinado pelo MTT, utilizando os corantes Rodamina Faloidina (Citoesqueleto) e DioC6 (Retículo Endoplasmático). Resultados: No tempo de 48 horas o laser 50mJ/cm² - 904nm promoveu um
aumento significativo na proliferação celular quando comparado ao 6J/cm² e 2J/cm² - 830nm. Ao comparar as diferentes densidades de energia entre os grupos nos determinados tempos, o grupo irradiado com 50mJ/cm² apresentou melhores resultados em relação ao grupo controle no tempo 24 horas (p<0,05), 48 horas (p<0,001), entre o grupo 2J/cm² no tempo 48 horas (p<0,001) e entre o grupo 6J/cm² no tempo 48 horas (p<0,01) e 72 horas (p<0,05). Quanto a microscopia de fluorescência evidenciou no retículo endoplasmático uma intensa atividade reticular na dose de 2J/cm² - 830nm enquanto o citoesqueleto demonstrou efeito biomodulatório com uma perfeita distribuição dos filamentos de actina no citoplasma na dose 50mJ/cm² - 904nm. Conclusão: A irradiação a laser de baixa potência estimula tanto a proliferação quanto o metabolismo celular principalmente no tempo 48 horas em cultura de células osteoblásticas (OFCOLII), porém o 904nm (50mJ/cm²) apresentou efeito biomodulador mais eficaz.
Palavras-chave: Reabilitação. Terapia Laser de Baixa Potência. Viabilidade
ABSTRACT
Introduction: The Low Level Laser Therapy (LLLT) has been widely used as a
health resource for accelerating the process of bone healing and repair, as well as being a simple technique because it has a less invasive action and has an effect positive on different cell types. Considering that osteoblasts are the cells responsible for bone formation, it is possible that the LLLT exerts a biomodulatory effect on them. Objective: The objective of the study was to compare the response of laser 830nm and 904nm in osteoblastic cells analyzing cell proliferation and structure of the cytoskeleton and Endoplasmic Reticulum.
Methods: Osteoblastic cells (OFCOLII) were plated on 96-well TPP plates and
maintained for 24 hours for sedimentation, afterraded in three times (24, 48 and 72 hours) and divided into 4 groups: non-irradiated (control), irradiated at 2J/cm² - 830nm (93 seconds), irradiated at 6J/cm² - 904nm (36 seconds) and irradiated at 50mJ/cm² - 904nm (2 seconds). The whole experiment was carried out in triplicate. The cell proliferation was evaluated by means of the MTT assay, 24 hours after each irradiation, and the fluorescence microscopy of the best time determined by MTT was performed using Rhodamine Phalloidin (Cytoskeleton) and DioC6 (Endoplasmic Reticulum) dyes. Results: In the 48 hour laser 50mJ/cm² - 904nm caused a significant increase in cell proliferation compared to 6J/cm² and 2J/cm² - 830nm. When comparing the different power densities between groups in certain times, the group irradiated with 50mJ/cm² showed better results than the control group at time 24 hours (p <0.05), 48 hours (p <0.001) between the group 2J / cm² time 48 hours (p <0.001) and between group 6J/cm² time 48 hours (p <0.01) and 72 hours (p <0.05). Fluorescence microscopy showed intense reticular activity at the dose of 2J/cm² - 830nm in the endoplasmic reticulum while the cytoskeleton showed a biomodulatory effect with a perfect distribution of the actin filaments in the cytoplasm at 50mJ/cm² - 904nm.
Conclusion: Irradiation at low level laser stimulates both proliferation and the
cellular metabolism mainly in time 48 hour culture of osteoblastic cells (OFCOLII), but 904 nm (50mJ/cm²) showed more efficient biomodulator effect.
Keywords: Rehabilitation. Low Level Laser Therapy. Cell viability. Fluorescence
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AsGa – Laser Arseneto de Gálio
AsGaAl – Laser Arseneto de Gálio e Alumínio ATP - Adenosina Trifosfato
Cm – Centímetro
dE – Densidade de Energia DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DIOC6 - Iodeto de 3,3'-dihexyloxacarbocyanine
ELISA – Enzyme-linked Immunosorbent Assay FA – Fosfatase Alcalina
HeNe – Hélio Neônio
HLLT - High Level Laser Therapy J – Joules
LLLT - Low Level Laser Therapy
LASER - Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LBP – Laser de Baixa Potência
MTT - 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue
mJ – Milijoule mm - Milímetro nm – Nanômetros
PBS - Solução tampão Fosfato-Salino PA - Paraformaldeídeo
RE – Retículo endoplasmático RNA - Ácido Ribonucleico SFB – Soro Fetal Bovino
TLBP – Terapia Laser de Baixa Potência OP - Osteopontina
OC – Osteocalcina W – Watts
λ - Comprimento de onda μL – Microlitro
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Células que compõe o tecido ósseo ...19
Figura 2: Ilustração de funcionamento do laser ...21
Figura 3: Espectro eletromagnético para o comprimento de onda...22
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características técnicas do equipamento ...35 Tabela 2: Análise entre os grupos (efeitos de diferentes densidades de energia de irradiação) ... 38 Tabela 3: Análise dos efeitos das diferentes densidades de energia entre os grupos ...39
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 15 2 OBJETIVOS ... 17 2.1 GERAL ... 17 2.2 ESPECÍFICOS ... 17 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 18 3.1 TECIDO ÓSSEO ... 18 3.2 LASER ... 20
3.3 EFEITOS DO LASER DE BAIXA POTENCIA E A SUA AÇÃO A NÍVEL CELULAR ... 24
3.4 LASER DE BAIXA POTÊNCIA E SEUS EFEITOS NA OSTEOGÊNESE ... 25
3.5 INSTRUMENTOS DE AVALIAÇÃO ... 26
3.5.1 AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR ... 26
3.5.2 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA ... 27
3.5.3 CITOESQUELETO E RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO ... 27
4 ARTIGO ... 30
5 CONCLUSÃO GERAL ... 48
6 REFERÊNCIAS ... 49
7 ANEXOS ... 55
ANEXO A Normas para submissão na revista Laser in Medical Science ... 55
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1 INTRODUÇÃO
O osso é um tecido complexo sob contínua remodelação formado por uma matriz orgânica e células ósseas específicas, dentre elas os osteoblastos que são funcionalmente as células mais importantes no osso responsáveis pelo seu processo de formação[1,2].
Segundo Wu et al.[3] a Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) pode
apresentar um efeito benéfico sobre a reparação da fratura óssea devido os níveis crescentes de fosfatase alcalina (FA), densidade mineral óssea e a formação da matriz óssea, além de estimular a proliferação celular, a formação de nódulos ósseos e a expressão dos genes osteocalcina (OC) e osteopontina (OP).
Bayat et al.[4] apontam em seus estudos que a TLBP estimula a formação
de nódulos ósseos em osteoblastos, promovendo a aceleração da consolidação da fratura e a resistência óssea, criando novos vasos sanguíneos, aumentando a deposição de fibras colágenas e promovendo uma maior proliferação celular no local irradiado.
Os efeitos biomoduladores da TLBP na reparação óssea são diretamente dependentes dos parâmetros aplicados pelo laser no qual há uma diversidade destes influenciando as culturas celulares acarretando tanto os efeitos positivos como os negativos, levando a redução no número de células, alterações morfológicas (retrações), danos no DNA e morte celular. No entanto, ainda não foram determinados os parâmetros ideais (comprimento de onda, tempo de exposição, densidade de energia e densidade de potência)[5,6], no entanto,
sabe-se que dosabe-ses mais baixas aumentam a taxa de proliferação e outras funções celulares, enquanto doses mais elevadas podem apresentar efeitos destrutivos[7].
Nessas circunstâncias, a TLBP vem se destacando como uma nova abordagem na área da saúde por acelerar o processo de consolidação e reparo ósseo nos casos de fraturas e até mesmo em doenças como a osteoporose[8,9],
além de ser uma técnica simples, por apresentar uma ação menos invasiva, bem como um efeito biomodulador sobre diferentes tipos de células[10].
16 proliferação e diferenciação celular, esta vem se tornando uma técnica de grande interesse clínico sobre patologias que afetam diretamente o sistema esquelético, possibilitando um menor tempo de recuperação e minimizando os problemas causados pelo tratamento convencional. Mas afinal, qual seria o melhor parâmetro a ser utilizado para acelerar o reparo ósseo? Qual a ação da TLBP nas células osteoblásticas? Diante disso, o objetivo do estudo foi comparar o efeito dos lasers AsGa (904nm) e AsGaAl (830nm) nas diferentes densidades de energia e comprimentos de onda em células osteoblásticas verificando a viabilidade celular e as estruturas celulares (Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático).
17
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Comparar o efeito dos lasers 904nm e 830nm em diferentes densidades de energia em células Osteoblásticas (OFCOLII) verificando a viabilidade e estrutura celular como o Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático.
2.2 ESPECÍFICOS
Comparar o efeito da Terapia a Laser de Baixa Potencia nas diferentes densidades de energia em cultura Osteoblástica;
Comparar o efeito da Terapia a Laser de Baixa Potencia nos diferentes comprimentos de onda 904nm e 830nm em cultura Osteoblástica;
Avaliar os efeitos da Terapia Laser de Baixa Potencia sobre a viabilidade celular;
Analisar as estruturas celulares como Retículo Endoplasmático e Citoesqueleto das células Osteoblásticas;
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3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 TECIDO ÓSSEO
O osso é um tecido complexo que desempenha funções importantes no corpo, dentre elas a locomoção, apoio e proteção aos tecidos moles, porém, independentemente de toda sua resistência os mesmos são muito susceptíveis as fraturas, ocorrendo milhões todo ano, sendo que 10% delas são decorrente de uma falha na cicatrização[11,12].
A composição e organização da matriz extracelular, juntamente com a combinação da massa óssea, a qualidade do osso e a maneira em que essas condições são reguladas são capazes de determinar a capacidade do osso de resistir às rupturas[12].
O tecido ósseo é composto por algumas proteínas e constituintes orgânicos da matriz extracelular que são responsáveis por regular algumas propriedades do tecido tais como a elasticidade e resistência, e essas propriedades são sensíveis as principais células que regulam a remodelação do osso, que são chamadas osteoblastos e os osteoclastos[1].
Os osteoblastos, ou células jovens caracterizam-se pelo local onde estão situados, encontram-se na periferia das trabéculas, exibindo uma enorme importância graças a sua funcionalidade, sendo responsável pela formação da matriz mineralizada e pela habilidade de sintetização das proteínas ósseas, mostrando-se fundamental no processo de formação óssea e reparação tecidual[10].
Já os osteoclastos, são células gigantes e multinucleadas, estabelecidas pela fusão de células mononucleares proveniente do tecido hematopoiético, capazes de promover a desmineralização e a degradação da matriz óssea, ou seja, a reabsorção do tecido ósseo[13].
19 A imagem a seguir mostra as células que compõem o tecido ósseo em um desenho esquemático.
Figura 1: Células que compõe o tecido ósseo
FONTE: http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch06/06_02.jpg Acesso em 13/07/2016
Há casos, em que o processo de consolidação das fraturas pode ser acelerado, favorecendo uma volta mais rápida das funções musculoesqueléticas. Nesta perspectiva, a fisioterapia vem utilizando métodos eletrofísicos para tratamento de lesões, como por exemplo, o ultrassom e o laser de baixa potência (LBP)[4,8].
Vários estudos[2,4,14,15] relatam que a TLBP favorece o crescimento e a
proliferação de osteoblastos, sendo um método considerável para pacientes que requerem uma rápida regeneração do tecido ósseo, expondo a sua grande relevância na área clínica.
De acordo com Huertas et al.[2] as células osteoblásticas (MG63)
irradiadas com laser AsGaAl, ʎ=940nm, com doses 3J/cm² e 4J/cm², em densidade de potencias diferentes de 1W e 1,5W, evidenciaram um aumento na diferenciação celular em ambas as doses, principalmente para 1W-3J/cm², bem como uma diminuição na expressão de marcadores antigênicos e diminuição na atividade fagocitária, indicando que a TLBP pode ser útil no tratamento da regeneração óssea através do seu efeito biomodulador sobre os osteoblastos favorecendo o seu crescimento.
20 Em um estudo realizado por Pires-Oliveira et al.[15] avaliando o efeito
biomodulador da TLBP em células osteoblásticas OFCOLII, utilizando o laser AsGaAl (830nm; 50 mW; 3J/cm²) observaram que o laser promoveu um aumento significativo no número de células irradiadas e alteração da atividade mitocondrial quando comparadas ao grupo controle principalmente nos tempos 48 e 72 horas.
3.2 LASER
Em 1917, Albert Einstein através de suas pesquisas buscando conhecer mais sobre os princípios físicos da emissão estimulada da luz, deu origem ao termo LASER - Light Amplification By Stimulated Emission of Radiation (amplificação de luz por emissão estimulada de radiação) que expressa exatamente como a luz é produzida[16,17,18].
A inclusão do laser como instrumento terapêutico tem sido acompanhado desde 1960 por meio de Theodore H. Maiman que com seus estudos concretou a teoria de Einstein publicando o primeiro trabalho sobre a emissão estimulada da luz utilizando um cristal de rubi na faixa vermelha do espectro eletromagnético emergindo a energia do laser[19,20].
O aparelho laser é formado por três elementos primordiais: Por um meio laser, que pode ser de dióxido de carbono, Argônio, Helio-Neônio (He-Ne), YAG, exímeros, de corantes, rubi e diodos semicondutores, como o Arseneto de Gálio (AsGa) e Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl), entre outros; por uma fonte de excitação, que pode ser uma lâmpada de flash ou um arco elétrico, e por dois espelhos. Dessa forma, o funcionamento desses três elementos resulta na emissão da luz[21], ocorrendo da maneira que será descrita a seguir na Figura 2.
Uma corrente elétrica, é capaz de realizar a excitação dos átomos, estes, uma vez excitados, começam a liberar fótons ao longo do eixo do cilindro, estimulando a emissão de outros fótons idênticos, sempre na mesma direção. A maior parte dos fótons são refletidos pelos espelhos, reforçando o processo de emissão estimulada, sempre produzindo uma grande quantidade de fótons idênticos. Os fótons emitidos que não estão paralelos ao eixo, saem pelas paredes laterais do cilindro, não participando do processo de reflexão e emissão
21 estimulada[16].
Figura 2: Ilustração de funcionamento do laser
Fonte: DAVIDOVICH, L. Os quanta de luz e a ótica quântica. Rev. Bras. Ensino Fís. 2015; 37(4): 4205-1 – 4205-12.
Como citado anteriormente, há uma grande variedade de lasers disponibilizados na literatura a fim de obter diferentes efeitos biomoduladores entre eles: Rubi, He-Ne, AsGa e AsGaAl, entre outros[19,22].
O Laser AsGa apresenta um comprimento de onda na região de 904nm e a duração do impulso geralmente de 100-200 nanossegundos, permite uma penetração profunda, sem efeitos indesejáveis como os efeitos térmicos, permitindo tempos de tratamento mais curtos[23]. Já o Laser AsGaAl vem sendo
utilizado por acelerar o processo regenerativo primário, melhorando a qualidade da estrutura óssea e mostrando um osso mais compacto[13].
Segundo Andrade, Lima, Albuquerque[24], Neves et al.[25], a radiação laser
apresenta propriedades únicas que a diferenciam de outras fontes luminosas, tais como:
A) Monocromaticidade: A luz laser é composta por fótons que apresentam
apenas um único comprimento de onda, sendo todos da mesma cor, portanto, apresentando uma luz pura.
22
B) Coerência: Deslocamento ordenado das ondas em relação ao tempo
com as suas amplitudes iguais, visto que as depressões e picos das ondas emitidas combinam-se perfeitamente no tempo e no espaço.
C) Colimação: Ou Unidirecionalidade, significa que os fótons são todos
paralelos, o que mantém a potência agrupada numa área pequena e desloca-se em grandes distâncias.
De acordo com Cavalcanti et al.[21] ao incidir no tecido uma parte da luz
não é penetrada, sendo ela refletida e a luz que penetra no tecido será dividida em três partes: uma será absorvida, uma será espalhada e outra parte será transmitida.
As diferenças entre os feixes de laser se dão pelo comprimento de onda (λ), que é determinado exclusivamente pelo meio que se encontra no interior da câmara de ressonância óptica[13], determinando o modo de interação laser-tecido
e o processo de absorção da radiação, definindo a profundidade de penetração e seus efeitos[11].
Dependendo do comprimento de onda a luz pode ser ainda classificada em visível ou vermelho (380 a 750nm) e invisível ou infravermelho (acima de 750nm) porém, há divergência de acordo com a literatura, mas sabe-se que cada comprimento de onda se comporta de maneira diferente a cada tecido[26].
Figura 3: Espectro eletromagnético para comprimento de onda
Fonte: http://teorianateia.com.br/2015/06/21/laser-estoura-sequencia-de-baloes/ acesso em: 27/07/2016
Quanto à dispersão da energia do laser, a mesma é inversamente proporcional ao comprimento de onda, quanto maior o comprimento de onda,
23 mais profunda é a penetração da energia no tecido[21].
Figura 4: Penetração do laser em relação ao comprimento de onda
Fonte: http://www.garnet.com.br/saibamais/laser_medicina.php acesso em: 14/09/2016
Outro fator importante é a densidade de energia (dE), a quantidade de energia por unidade de área entregue aos tecidos[21] que é dada em J/cm² que
designa o tempo de irradiação, e a sua potência apresentada em Watts (W)[22,27].
De acordo com a potência, a radiação laser pode ser classificada em: lasers de alta potência, conhecido como High Level Laser Therapy (HLLT) caracterizado por seus efeitos destrutivos sobre os tecidos sendo utilizados para cortar, coagular e cauterizar, e os lasers de baixa potência, ou lasers terapêuticos, sendo conhecido como Low Level Laser Therapy (LLLT) são mais comumente aplicados em processos de reparação tecidual, tais como traumatismos musculares, articulares, nervosos, ósseos, cutâneos, sendo bioestimuladores, agindo principalmente como aceleradores em processos cicatriciais[17,21,28].
Sabe-se que a efetividade da terapia a laser e seus respectivos efeitos biológicos encontram-se dependente do comprimento de onda, potência, dose e tempo[17].
Os parâmetros mais utilizados encontram-se nas fluências baixa, pois acredita-se que doses elevadas podem inibir o processo de reparo[29], causando
24 uso de doses elevadas com resultados satisfatórios no processo de reparação[18,30].
A TLBP tornou-se um método muito utilizada na maioria dos países e vem sendo estudada mundialmente, uma das razões da sua popularidade está relacionada à sua ação menos invasiva, atérmica, indolor, baixo custo[31] e com
tempo de aplicabilidade inferior aos demais recursos fisioterapêuticos[32], com
sua energia e comprimentos de onda capazes de penetrar nos tecidos[28],
portanto, sendo usada clinicamente para estimular a regeneração tecidual[2].
3.3 EFEITOS DO LASER DE BAIXA POTENCIA E A SUA AÇÃO A NÍVEL CELULAR
A ação da TLBP é um tema bastante discutido, pois é um recurso seguro que apresenta eficácia de tratamento e a nível celular caracteriza-se por seus efeitos biológicos relevantes, envolvendo a proliferação, síntese de colágeno, e a liberação de fatores de crescimento[15].
A nível celular, a TLBP promove modificações bioquímicas, bioelétricas e bioenergéticas, atuando no aumento da proliferação, metabolismo e maturação celular, na quantidade de tecido de granulação e na diminuição dos mediadores inflamatórios, conduzindo ao processo de cicatrização. A absorção da luz laser permite um aumento do metabolismo celular, caracterizado pela estimulação de fotorreceptores na cadeia respiratória mitocondrial, alterações nos níveis de ATP (Adenosina Trifosfato) celular, liberação de fatores de crescimento e síntese de colágeno. O limiar de sobrevivência da célula será determinado pelo seu estado fisiológico e sua localização no tecido[32].
Ao irradiar o laser com uma baixa dE, estará estimulando a membrana e mitocôndrias, induzindo a célula a biomodulação, na qual trabalhará em busca da normalização da região afetada, ao contrário, quando é oferecida uma alta dE a mesma se transformará em dano térmico causando danos a nível celular[13].
Dessa forma a irradiação no espectro infravermelho, estimulará os canais da membrana plasmática, resultando em mudanças na permeabilidade da membrana, temperatura e gradiente de pressão, alteração na atividade mitocondrial com redução da oxidação, gerando uma cascata de reações
25 bioquímicas[14], levando a um aumento da microcirculação, elevação das taxas
de produção de ATP, RNA (Ácido Ribonucleico) e a síntese de DNA (Ácido Desoxirribonucleico), melhorando a oxigenação celular, nutricional e regeneração[7].
3.4 LASER DE BAIXA POTÊNCIA E SEUS EFEITOS NA OSTEOGÊNESE
O efeito da TLBP sobre a regeneração óssea tornou-se um foco de muitas pesquisas, embora tenha disponibilizado na literatura resultados contraditórios tanto in vivo quanto in vitro[2,13], uma vez que, o seu efeito na cicatrização óssea ainda permanece controverso[34], e uma das justificativas de pesquisas sobre a
TLBP é devido ao seu potencial osteogênico[31] e também por proporcionar benefícios na terapia clínica ortopédica[5].
O mecanismo de reparação óssea, em condições normais, ocorre inicialmente por aumento da atividade osteoblástica, formando o tecido ósseo imaturo, matriz orgânica, seguido pelo acúmulo de sais de cálcio. O aumento desta atividade proliferativa é um resultado esperado, tendo em vista o efeito biomodulador da TLBP[11].
Todavia, o mecanismo preciso da TLBP não foi completamente explicada, entretanto, vários estudos in vitro têm demonstrado que a TLBP apresenta efeitos estimulantes sobre as células osteoblásticas acelerando o processo de reparação óssea[33,35,36].
De acordo com Fujimoto et al.[37] a TLBP estimula significativamente a
formação de nódulos ósseos através da aceleração da proliferação e diferenciação celular, dessa forma, ativando a atividade da FA e expressão da OC[38], sugerindo efeitos estimulantes na formação óssea, sendo uma técnica
propícia para o tratamento de fraturas[31,39].
Segundo Crisan et al.[33] utilizando um laser de diodo com λ: 830nm e uma
dE 3J/cm² em células osteoblásticas, verificaram um aumento significativo na proliferação de osteoblastos através do teste de MTT após irradiação.
De acordo com Silva et al.[39], estes relatam que a TLBP estimula a
proliferação celular, a formação de nódulos ósseos, a atividade da FA, e a expressão dos genes OC e OP na fase proliferativa, tendo em vista que a TLBP
26 exerce um efeito estimulador sobre a atividade osteoblástica e que a irradiação favorece a proliferação dos osteoblastos sendo responsáveis pela formação do osso.
Conforme Jawad et al.[5] indicaram que a irradiação a laser apresenta
efeito biomodulador no processo de cicatrização do osso, aumentando a vascularização, ocasionando a formação do tecido osteóide trabecular, acarretando um metabolismo mais rápido, e aumentando a reação de calo ósseo, o que leva à aceleração da regeneração do osso.
Dessa forma, fica evidente que a TLBP em osteoblastos estimula a produção de matriz, síntese de DNA em células cultivadas, e a formação de nódulos ósseos, sendo todas essas consequências também validadas por um estudo in vitro comprovando o efeito biomodulador da terapia sobre a regeneração óssea realizado por Alghamdi, Kumar, Moussa[7] expondo que a
biomodulação ocorre em dE entre 0,05 e 10J/cm², enquanto que as dE acima de 10J/cm² demonstram efeitos inibitório.
Portanto, a TLBP na osteogênese apresenta efeitos positivos sobre a proliferação e diferenciação celular. Em particular, é de grande interesse clínico para a regeneração óssea, visto que, o uso de drogas injetáveis e alguns medicamentos geram problemas e efeitos colaterais sistêmicos, a TLBP não apresenta impactos indesejados sobre o estado de saúde dos pacientes[40] mas,
como os mecanismos que agem sobre o osso ainda não foram completamente elucidados, o método exato de biomodulação celular através da laserterapia permanece obscuro, tornando-se o objetivo de numerosos estudos.
3.5 INSTRUMENTOS DE AVALIAÇÃO 3.5.1 AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
O MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) é um ensaio colorimétrico quantitativo utilizado para avaliar a viabilidade e proliferação celular, baseia-se na habilidade da enzima mitocondrial desidrogenase, encontrada somente em células viáveis, em clivar os anéis de tetrazólio do MTT, formando cristais roxo de formazana, os quais são
27 impermeáveis às membranas celulares, ficando então retidos no interior das células[41].
O produto de formazana roxo só será produzido pelas células que apresentam um metabolismo ativo, pois as células mortas perdem essa capacidade de conversão do MTT em formazana, portanto, a cor serve como um marcador para as células viáveis[42].
Os resultados obtidos podem ser lidos em um espectrofotômetro de digitalização (Leitor ELISA) capaz de medir um grande número de amostras com um alto grau de precisão[43].
3.5.2 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
A microscopia de fluorescência baseia-se nos mesmos princípios da microscopia óptica comum, diversificando-se na gestão e concepção relacionadas com a geração e comprimentos de onda de transmissão adequados os fluorocromos. Esta técnica foi desenvolvida para melhorar o contraste e a qualidade das imagens obtidas, contribuindo para as pesquisas científicas[44,45].
Por meio dessa técnica é capaz de visualizar moléculas específicas que retratam fluorescência na presença de luz de excitação ultravioleta ou radiação eletromagnética na faixa visível com baixo comprimento de onda. Quando as moléculas não são fluorescentes, elas são marcadas com corantes fluorescentes ou fluorocromo para torná-las visíveis, como por exemplo, a Rodamina Faloidina, usada para marcar os filamentos de actina do citoplasma[46] e o DioC6 para
analisar mudanças no retículo endoplasmático[29].
Esse procedimento possibilita obter imagens tridimensionais e processo de distribuição de moléculas específicas em células vivas, por isso é amplamente utilizada em várias áreas como biologia, fisiologia celular e medicina, além de ser uma técnica não invasiva, rápida e segura que obtém bons resultados[45,47].
3.5.3 CITOESQUELETO E RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
28 dinâmica e complexa que exerce funções celulares essenciais que abrange os processos de transporte e sinalização celular, além de ser primordial para determinar a morfologia da célula[48].
Essa estrutura é constituída por estruturas filamentosas estáveis que são os microfilamentos ou filamentos de actina e os filamentos intermediários composto em grande parte por proteínas, e estruturas dinâmicas tais como microtúbulos derivado de tubulina que podem montar e desmontar, distribuem-se rapidamente dentro da célula e resultam em funções celulares como o processo de diferenciação, determinação da forma da célula, a organização espacial das organelas celulares, tráfego intracelular da membrana, a modulação de receptores de superfície e a mitose[49,50].
Segundo Rodríguez et al.[50] o citoesqueleto pode afetar a diferenciação
celular, visto que os resultados do seu estudo mostram que a diferenciação osteogênica de células estaminas mesenquimais humanas foi acompanhada de alterações na organização e morfologia do citoesqueleto, dessa forma induzir mudanças na organização do citoesqueleto que regulam a organização dos filamentos de actina, são importantes para a função fisiológica dos osteoblastos. Já o retículo endoplasmático (RE) é uma rede interconectada de canais delimitados por membranas que se estendem a partir do núcleo para a periferia da célula[51] situada no citoplasma envolvida em muitos processos celulares
essenciais, como a síntese de proteínas, síntese de lipídios e o armazenamento de cálcio, realizando a manutenção da sua concentração no citoplasma[52].
Além de realizar a síntese de proteínas, essa organela participa do processo de sinalização celular. Em condições normais, estes dois processos são realizados de forma independente, porém, há casos em que se houver alteração em um desses processos pode influenciar o outro[52].
Dessa forma, o RE é encarregado por preservar um ambiente importante para proteínas destinadas as vias secretórias (proteínas de membrana ou secretadas pelas células) sendo que estas proteínas são sintetizadas e enoveladas, adquirindo sua forma nativa[53].
O estresse no RE é caracterizado por um desequilíbrio entre a demanda celular e função do retículo e há várias condições fisiológicas ou patológicas que podem causar esse estresse, tais como: alteração no fluxo de cálcio, elevada
29 secreção e síntese de proteínas, falha no processo de transporte e degradação de proteínas[53]. Um importante fator patogênico de várias doenças é a apoptose
causada pelo estresse do RE, em eucariotas multicelulares, esse estresse é detectado por três proteínas de sinalização que quando ativadas, iniciam uma cascata de ação corretiva[54].
Sendo assim, as células secretoras parecem ser mais susceptíveis ao estresse do RE, que além de levar a indução da apoptose, leva a uma perda da função celular. Quanto ao tecido ósseo, o RE está presente em pequena quantidade nos osteócitos sendo essenciais para a manutenção da matriz óssea e com a morte dessas células ocorre a reabsorção da matriz[53,54].
30
4 ARTIGO
COMPARAÇÃO DO EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA EM DIFERENTES COMPRIMENTOS DE ONDA E DENSIDADES DE ENERGIA
EM CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS
(Para submissão na revista Lasers in Medical Science)
Jéssica Lucio da Silva¹, Rodrigo Franco de Oliveira2, Cristina Pacheco Soares3,
Zélia M. A. Rosa4, Fernando Costa e Silva Filho5,Deise A. A. Pires Oliveira²
¹Fisioterapeuta, Mestranda em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina (PR).
² Fisioterapeuta, Prof.(a). Dr.(a). Titular do Programa de Mestrado e Doutorado em Ciências da Reabilitação – UEL/UNOPAR – Londrina – PR.
3 Bióloga, Prof.ª. Dra. Integral da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP)
no Departamento de Biologia Celular e Tecidual – São José dos Campos – SP.
4Laboratório Dinâmica de Compartimentos Celulares, UNIVAP-Instituto de
Pesquisa e Desenvolvimento, São José dos Campos-SP
5Laboratório Bioengenharia de Sistemas, UFRJ-Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Rio de Janeiro-RJ
Endereço para correspondência:
Deise Aparecida de Almeida Pires-Oliveira. Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde
Rua Marselha 591, Jardim Piza, CEP: 86.041-140, Londrina-PR. E-mail: deisepyres@gmail.com
31
RESUMO
A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) age sobre a remodelação óssea, porém, se faz necessário discernir parâmetros ideais para estimular as células osteoblásticas. O objetivo do estudo foi comparar o efeito dos lasers 830nm e 904nm em células Osteoblásticas analisando a viabilidade e estrutura celular como o Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático. As células Osteoblásticas foram plaqueadas em placas de 96 poços, divididas em 4 grupos: controle, irradiado a 2J/cm² - 830nm, irradiado a 6J/cm² - 904nm, irradiado a 50 mJ/cm² - 904nm, sendo irradiados a cada 24 horas (24, 48 e 72 horas). A proliferação celular foi avaliada pelo MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio], 24 horas após cada irradiação e a microscopia de fluorescência realizada no melhor tempo 48 horas, utilizando os corantes Rodamina-Faloidina e DIOC6 . No tempo de 48 horas o laser 50mJ/cm² - 904nm promoveu um aumento significativo na proliferação celular quando comparado ao 6J/cm² e 2J/cm² - 830nm. Ao comparar as diferentes densidades de energia entre os grupos nos determinados tempos, o grupo irradiado com 50mJ/cm² apresentou melhores resultados comparado ao grupo controle no tempo 24 horas (p<0,05), 48 horas (p<0,001), entre o grupo 2J/cm² no tempo 48 horas (p<0,001) e entre o grupo 6J/cm² no tempo 48 horas (p<0,01) e 72 horas (p<0,05). Na microscopia de fluorescência evidenciou no retículo endoplasmático uma intensa atividade reticular para a dose de 2J/cm², enquanto no citoesqueleto o efeito biomodulatório com uma perfeita distribuição dos filamentos de actina no citoplasma a 50mJ/cm². A TLBP estimula tanto a proliferação quanto o metabolismo celular principalmente no tempo 48 horas em cultura de células osteoblásticas, sendo o 904nm (50mJ/cm²) o que apresentou efeito biomodulador mais eficaz.
Palavras-chave: Reabilitação. Terapia Laser de Baixa Potência. Viabilidade
32
ABSTRACT
The low level laser therapy (LLLT) acts on bone remodeling, however, it is necessary to discern optimal parameters to stimulate osteoblast cells. The aim of the study was to compare the effect of lasers 830nm and 904nm in osteoblastic cells by analyzing the viability and cell structure as the cytoskeleton and Endoplasmic Reticulum. The osteoblastic cells were plated in 96-well plates were divided into 4 groups: Control, irradiated at 2J/cm² - 830nm, irradiated at 6J/cm²- 904nm, irradiating 50mJ/cm² - 904 nm, and irradiated every 24 hours (24, 48 and 72 hours): Cell proliferation was assessed by MTT [3- (4,5-dimethylthiazol) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide] 24 hours after each irradiation and fluorescence microscopy performed in the best time 48 hours, using Rhodamine phalloidin and DiOC6 dyes. At the time of 48 hours the laser 50mJ/cm² - 904nm caused a significant increase in cell proliferation compared to 6J/cm² and 2J/cm² - 830nm. When comparing the different power densities between groups in certain times, the group irradiated with 50mJ/cm² showed better results compared to the control group at time 24 hours (p <0.05), 48 hours (p <0.001) between the group 2J/cm² at time 48 hours (p <0.001) and between group 6J/cm² time 48 hours (p <0.01) and 72 hours (p <0.05). In the fluorescence microscopy, an intense reticular activity was observed in the endoplasmic reticulum at the dose of 2J/cm², while in the cytoskeleton the biomodulatory effect with a perfect distribution of the actin filaments in the cytoplasm at 50mJ/cm². The LLLT stimulates both proliferation and the cellular metabolism mainly in time 48 hour culture of osteoblastic cells, being 904 nm (50mJ/cm²) presented the most effective biomodulatory effect.
Keywords: Rehabilitation. Low Level Laser Therapy. Cell viability. Fluorescence
33
INTRODUÇÃO
Atualmente existem inúmeros recursos fisioterapêuticos que atuam no processo de regeneração, dentre os quais destaca-se o laser[¹], utilizado para
estimular a cicatrização óssea de diversas alterações que acometem o sistema esquelético com o intuito de evitar futuras complicações terapêuticas.[²]
Vários estudos in vitro relatam os efeitos positivos da TLBP (Terapia Laser de Baixa Potência), Crisan et al[³] mostraram um aumento significativo na
proliferação de osteoblastos após irradiação com laser 830nm a 3J/cm². De acordo com Silva et al[⁴] a TLBP estimula a proliferação celular, a formação de
nódulos ósseos, a atividade da fosfatase alcalina (FA), e a expressão dos genes osteocalcina (OC) e osteopontina (OP) na fase proliferativa, exercendo um efeito estimulador sobre a atividade osteoblástica favorecendo a proliferação dos osteoblastos responsáveis pela formação óssea.
No entanto, os mecanismos e os efeitos sobre a regeneração permanecem obscuros, não havendo um protocolo específico para o tratamento clínico[⁵,⁶] além de que o efeito da TLBP sobre a regeneração óssea depende dos
parâmetros utilizados[⁷], tais como comprimento de onda (λ), tempo de
exposição, densidade de energia (dE), modo de pulsação e potência de irradiação, porém a diversidade de parâmetros utilizados por diferentes autores e a falta de condições experimentais padronizadas, torna difícil comparar os resultados[⁸] indicando a necessidade de uma padronização para alcançar o
efeito desejado[9].
Dessa forma, a TLBP é considerada uma técnica altamente promissora, pois é de fácil aplicabilidade, não invasiva, indolor e não expõe nenhum efeito adverso, apresentando um impacto benéfico na qualidade de vida dos pacientes[9]; vem sendo amplamente utilizada com o objetivo de acelerar a
consolidação e a reorganização do tecido ósseo, pois apresentam a capacidade de aumentar a vascularização estimulando a formação do tecido osteóide trabecular, a formação de nódulos ósseos, promovendo um metabolismo mais rápido do tecido que irá levar a aceleração do processo de regeneração óssea[10].
Estudos que analisam os efeitos de diferentes doses e comprimentos de onda em células osteoblásticas são importantes para designar a autoconfiança
34 quanto aos parâmetros empregados na irradiação com laser para a estimulação e proliferação das células ósseas como uma estratégia de reparação de tecidos no ambiente clínico mesmo aplicando uma baixa dE, sendo uma alternativa promissora para acelerar o processo de recuperação de qualquer fragilidade relacionada ao sistema esquelético.
Diante disso, a fim de ampliar o entendimento quanto aos processos fisiológicos, parâmetros envolvidos e determinar as respostas das células ósseas através da irradiação da TLBP, o objetivo deste estudo foi comparar a resposta do laser 830nm e 904nm em células Osteoblásticas (OFCOLII) analisando a viabilidade e estrutura celular como o Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático.
MATERIAL E MÉTODOS
As análises realizadas no presente estudo utilizaram como material biológico as células OFCOLII, Mus musculus (Mouse, Balb/C) obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro – BCRJ – Brasil. O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), sob o protocolo de nº 462.478/2013.
CULTURA CELULAR
As células Osteoblásticas foram rotineiramente cultivadas em garrafas de 25cm³ (TPP, Switzerland, Europe) com DMEM (Dulbecco Minimum Essential Medium – Gibco BRL, Grandlsland, NY), contendo 5% (vol) de soro fetal bovino (SFB - Gibco BRL), 100 U/mL de penicilina, 100 mM/mL de estreptomicina e 0,25 μg/mL de fungicida (Gibco BRL), mantidas em uma estufa de CO2 em uma
atmosfera 5% a 37°C.
A cada quarenta e oito horas o meio era trocado, e quando as células apresentavam com 80% de semiconfluência, o meio era removido e a camada de células lavadas com solução tampão Fosfato-Salino (PBS). Em seguida, adicionava-se tripsina (Gibco BRL) em EDTA tamponado (Carlos Erba, ABC Lab, SP) até ocorrer o descolamento das células da garrafa. Uma solução com uma concentração de cerca de 1x104 células/mL foi preparada e convertida para cada
35 poço em placas de 96 poços TPP (Switzerland, Europe).
IRRADIAÇÃO A LASER
Após o processo de plaqueamento em placas de 96 poços, as células ficaram por 24 horas para sedimentação, posteriormente foram expostas a irradiação com o laser de baixa potência. Todos os poços irradiados foram separados entre si por dois poços vazios, com a finalidade de isolá-los dos outros poços irradiados para impedir a absorção de energia de poços vizinhos por meio da transmissão e reflexão da irradiação. Dessa forma, antes da irradiação o meio era removido e logo em seguida acrescentado 100μL de PBS translucido, com o objetivo de impedir qualquer interferência do mesmo.
Para irradiar as células Osteoblásticas, utilizou-se 2 comprimentos de onda distintos: 830nm AsGaAl (Thera Laser DMC Equipment Ltd., Brasil) e 904nm AsGa (KLD™ Biossistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda, Brasil), com as características descritas na tabela 1 a seguir. Quatro grupos foram estabelecidos: não irradiado (controle), irradiado a 2J/cm² - 830nm (93 segundos), irradiado a 50mJ/cm² - 904nm (2 segundos), irradiado a 6J/cm² - 904nm (36 segundos).
Tabela 1: Características técnicas do equipamento
A irradiação foi realizada em ambiente escuro com a caneta do laser em contato direto com a tampa da placa, recebendo uma irradiação diariamente e perpendicularmente nos intervalos de tempos 24, 48 e 72 horas, ou seja, as placas analisadas no tempo 48 e 72 horas tiveram respectivamente 2 e 3 irradiações. Antes da irradiação, o laser foi calibrado de acordo com o fabricante das instruções, usando um osciloscópio Agilent (Agilent Technologies, Inc.,
Laser Comprimento de onda Densidade de energia Potência Área do feixe de laser AsGaAl 830nm 2J/cm² 10mW 600µm AsGa 904nm 50 mJ/cm² e 6J/cm² 50mW 0,01cm²
36 Colorado Springs, CO). Todo o experimento foi realizado em triplicata.
TESTE DE CITOTOXICIDADE CELULAR (MTT)
A proliferação celular foi avaliada por meio do ensaio MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio], um método quantitativo utilizado para avaliar citotoxicidade, proliferação e ativação de células viáveis com precisão. Após 24 horas de cada irradiação realizou-se o teste de MTT de acordo com ensaio a seguir: foi retirado o meio de cultura de cada poço, adicionando 50 µl de MTT sendo incubado na estufa de CO2 durante 1 hora em uma atmosfera de
5% a 37°C. Em seguida, retirou-se o MTT e adicionou-se 50 µl de DMSO (Dimetil Sulfóxido) em cada poço. As placas foram mantidas novamente na estufa de CO2 durante 1 hora para a solubilização dos cristais de formazana e sua concentração quantificada espectroscopicamente utilizando um leitor de microplacas (leitor de ELISA - SpectraCount - Packard Instrument Company, EUA) a um comprimento de onda de excitação de 570 nm.
PROCEDIMENTOS PARA MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Para acompanhar os efeitos da irradiação do laser por meio da fluorescência, as células OFCOLll foram subcultivadas e irradiadas sobre lamínulas à densidade de 1x104 células/ml, em placas de 12 poços; 24 horas
após cada irradiação as lamínulas foram analisadas no microscópio de fluorescência, equipado com sistema fotográfico Leica (DLMB - Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).
Todos os corantes fluorescentes utilizados (DioC6 e Rodamina Faloidina)
foram adquiridos da Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). Antes das placas serem fotografadas, as células foram marcadas com os corantes fluorescentes em temperatura ambiente, a 37°C.
DioC6 (3,3'- iodeto de dihexyloxacarbocyanine) foi usado para analisar
alterações no retículo endoplasmático. As células foram lavadas com PBS, para a remoção do meio e incubadas com 10 µg/mL de DioC6 durante 30 min, em
seguida, imediatamente foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% PA (paraformaldeído - Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha) em
37 tampão PHEM 0.IM (PIPES 60 nM, 20 nM de HEPES, 10 nM EGTA e MgCl2 5 mM) durante 10 min, lavando novamente para eliminar o excesso de corante.
Para analisar mudanças nos filamentos de actina do citoesqueleto as células foram fixadas e marcadas com Rodamina Faloidina (1:100 - 1 hora) (filtro de excitação de 560nm e filtro de emissão de 590nm).
As lamínulas foram montadas em lâminas com N-propil galato (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha) e examinadas através de microscopia de fluorescência sendo fotografadas em triplicata, sendo analisado apenas o melhor tempo de 48 horas determinado a partir do MTT.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos em valores de Média e Desvio Padrão. As comparações entre os grupos foram feitas usando a Análise de Variância (ANOVA), seguido do teste post hoc de Bonferroni utilizado para determinar as diferenças significativas entre os grupos. O intervalo de confiança adotado foi de 95% e valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os valores foram analisados utilizando o pacote estatístico GraphPad Prism 4.0.
RESULTADOS
Os efeitos induzidos nas células OFCOLll irradiadas pelo laser nos comprimentos de onda e densidades de energia de λ=904nn: 50mJ/cm² e 6J/cm² e λ=830nm - 2J/cm² foram determinadas com o auxílio do teste de MTT e a marcação de fluorescência. Todos os grupos foram acompanhados a cada intervalo de 24 horas. O grupo não irradiado (controle) foi submetido às mesmas condições e análises.
O valor de crescimento celular baseado na dE e tempo está apresentado na Fig. I, onde foi possível constatar no tempo 24 horas que o 50mJ/cm² apresentou um aumento significativo quando comparado ao grupo controle, bem como 2J/cm² e 6J/cm². No tempo 48 horas, observou-se um aumento extremamente significante na proliferação celular utilizando 50mJ/cm² - 904nm
38 quando comparada ao laser 2J/cm² - 830nm que também expressou um crescimento considerável. Após 72 horas de irradiação, houve uma queda significante na viabilidade quando comparada com os tempos 24 e 48 horas.
O valor de crescimento celular baseado em cada densidade de energia está apresentado na Tabela 2, onde foi possível constatar que as células irradiadas com 50mJ/cm² apresentaram o melhor índice de crescimento no tempo 48 horas.
Fig. I Comparação da proliferação celular entre os grupos em relação ao tempo
Tabela 2: Crescimento Celular em relação ao tempo TEMPO
(h) Controle 50mJ/cm² 2J/cm² 6J/cm²
24 63,6(±2,5) 83(±9,5) 76,3(±4,1) 76,6(±9,07) 48 85(±2) 131,6(±17,5) 109,3(±1,5) 94,6(±3,05)
72 66,6(±1,5) 77,3(±1,5) 76(±2) 59,3(±11,9)
Valores apresentados em média e desvio-padrão (±).
Em relação à comparação das diferentes dE entre os grupos nos determinados tempos, observou-se que os melhores resultados foram nos
39 grupos irradiados com 50mJ/cm² - 904nm, sendo que em relação ao grupo controle o mesmo apresentou significância estatística no tempo 24 horas (p<0,05), 48 horas (p<0,001), entre o grupo 2J/cm² apresentou significância no tempo 48 horas (p<0,001) e ao comparar com 6J/cm² demonstrou significância no tempo 48 horas (p<0,01) e 72 horas (p<0,05). Também constatou significância com a intensidade 6J/cm² comparado com o grupo controle no tempo 48 horas (p<0,01) e 2J/cm² comparado com o grupo controle no tempo 48 horas (p<0,05), entre ambos os grupos 6J e 2J/cm² no tempo 72 horas (p<0,05) estando os dados detalhados na tabela 3
Tabela 3 Análise dos efeitos das diferentes densidades de energia entre os
grupos. Tempo (h) Controle vs. 6J Controle vs. 50mJ Controle vs.2J 6J vs. 2J 50mJ vs. 2J 6J vs 50 mJ 24 P> 0,05 P< 0,05* P> 0,05 P> 0,05 P> 0,05 P>0,05 48 P< 0,01* P< 0,001* P< 0,05* P> 0,05 P< 0,001* P<0,01* 72 P> 0,05 P>0,05 P> 0,05 P< 0,05* P>0,05 P<0,05* Nível de significância da Anova de dois fatores, pós-teste de Bonferroni.
* estatisticamente significante [p0,05]
Após serem analisados os resultados da viabilidade celular pelo MTT, foram avaliadas estruturas celulares específicas: Retículo Endoplasmático e Citoesqueleto através da microscopia de fluorescência, apresentados na figura II e III respectivamente.
Na análise do Retículo Endoplasmático após irradiação com o 830nm - 2J/cm² e 904nm - 50mJ/cm² e 6J/cm² constatou-se que no grupo controle (Fig IIA) a atividade reticular concentrou-se mais próximo da região perinuclear, enquanto no grupo irradiado a 830nm - 2J/cm² (Fig IIB) a atividade reticular foi mais elevada onde foi possível observar uma maior distribuição do retículo endoplasmático no citoplasma, com aumento no número de vesículas
40 demonstrando o seu ótimo efeito biomodulador sobre estrutura celular. No grupo irradiado com o laser 904nm - 6J/cm² (Fig IIC), houve um estreitamento na rede reticular, com uma concentração maior na região perinuclear em comparação com os outros grupos. No entanto, a irradiação com o 904nm - 50mJ/cm² (Fig IID) mostra que o grupo obteve uma distribuição homogénea da rede reticular, menos intensa quando comparada com o controle.
Fig. II Microscopia de fluorescência em Células OFCOLII marcadas com DioC6
para o Retículo Endoplasmático após a irradiação com laser 830nm e 904nm: (A) controle; (B) 830nm - 2J/cm²; (C) 904nm - 6J/cm² e (D) 904nm - 50mJ/cm².
Quanto ao citoesqueleto, constatou-se que no grupo controle (Fig IIIA), as fibras de actina apresentaram uma organização dos filamentos encontrando-se parcialmente paralelos, já no grupo irradiado com 830nm - 2J/cm² (Fig IIIB) há um menor número de filamentos; enquanto no grupo irradiado com 904nm - 6J/cm² (Fig IIIC) houve também uma diferença quando comparado com as outras imagens, porém, com uma menor quantidade de filamentos, em contrapartida, o grupo irradiado com 904nm - 50mJ/cm² (Fig IIID) mostra claramente numerosos filamentos de actina paralelos e perpendiculares com uma distribuição perfeita
A
B
C
D
41 no citoplasma da célula. Observa-se perfeitamente o efeito biomodulador do laser a partir da irradiação do 904nm - 50mJ/cm², apresentando uma maior organização e distribuição dos filamentos de actina em todo citoplasma quando comparado com os outros grupos.
Fig. III Microscopia de fluorescência em Células OFCOLII marcadas com
Rodamina Faloidina para o Citoesqueleto após a irradiação com laser 830nm e 904nm: (A) controle; (B) 830nm 2J/cm²; (C) 904nm 6J/cm² e (D) 904nm -50mJ/cm².
DISCUSSÃO
A TLBP exerce um efeito positivo sobre a proliferação e diferenciação em células osteoblásticas, sendo de grande interesse clínico para a regeneração óssea[11,12], assim o objetivo deste estudo foi comparar entre as doses e
comprimento de onda estudados, qual seria o mais adequado para o aumento da proliferação celular, favorecendo o processo de reparo tecidual, bem como verificar o efeito da TLBP sobre estruturas celulares específicas.
Pires-Oliveira et al.[13] ao realizarem um estudo irradiando o laser a 904nm
na dose de 50mJ/cm² e observaram uma aceleração no processo de reparo das
A
B
C
D
42 fraturas osteopênicas em ratos, especialmente na fase inicial da regeneração óssea devido ao aumento na taxa de crescimento celular. Resultados similares também foram observados em nosso estudo onde houve um aumento significativo na proliferação celular no grupo irradiado utilizando o laser AsGa λ=904 nm na dose de 50mJ/cm² no tempo 48 horas.
Segundo Pires-Oliveira et al.[13] a utilização do laser AsGa λ=904nm tem
expandido por apresentar uma máxima penetração quando comparado com outros tipos de laser, pois a irradiação emitida na faixa do infravermelho possui menor absorção e consequentemente maior capacidade de penetração nos tecidos, aumentando volume, resistência e mineralização óssea[5,15], justificando
os nossos resultados. Dessa forma se torna compreensível a recomendação para o uso do laser infravermelho 904nm no tecido ósseo, tornando-se um recurso imprescindível para terapia de reabilitação óssea.
Em relação ao comprimento de onda de 830nm, Coombe et al.[18]
analisaram o efeito da TLBP em células osteoblásticas (SAOs-2) utilizando o laser AsGaAl, λ=830nm nas densidades de energia 0.3, 0.5, 1, 2 e 4J/cm² e observaram que não houve mudanças na viabilidade celular, proliferação ou ativação significativa, não corroborando com os nossos resultados, pois o laser 2J/cm² a 830nm promoveu um crescimento celular considerável no tempo 48 horas em nosso estudo.
Quanto a densidade de energia, Mester[16] em seu estudo mostra que
baixas dE (1-4 J/cm²), são mais eficazes no tratamento, promovendo a redução da inflamação e dor em tecidos mais profundos, ou seja, nos nervos, receptores da dor, articulações, ligamentos, tendões e também nos músculos.
Demir et al.[14] compararam o efeito da estimulação elétrica com o efeito
do laser em feridas cirúrgicas no dorso de ratos. Ao aplicar o laser de AsGa, 904nm, dE 1J/cm² e potência de 6mW, observou-se que o laser foi significativamente eficaz na fase inflamatória em comparação com o grupo controle, evidenciando a ação positiva de um alto comprimento de onda e baixa densidade de energia, vindo de encontro com os nossos resultados que a dE 50mJ/cm² é uma dose baixa que se mostrou bom efeito biomodulador.
Stein et al.[17] observaram que a TLBP com comprimento de onda de
43 um efeito biomodulador positivo no crescimento e diferenciação celular destacando melhores resultados obtidos com a dE 1J/cm², corroborando com os nossos resultados em relação a dose baixa, porém, não em relação ao comprimento de onda que no nosso estudo foi na faixa do infravermelho.
Amid et al.[5] também relataram que a aplicação de uma baixa densidade
de energia, influência de forma positiva o crescimento celular, isso fica claro em nosso estudo pois a dose mais evidenciada foi de 50mJ/cm², considerada uma dose muito baixa, porém, acarretou um ótimo efeito biomodulador sobre a taxa de proliferação celular.
Já em relação ao tempo, Silva et al.[4] relatam que a maioria dos efeitos
bioestimulatórios da TLBP com comprimento de onda 830nm em células osteoblásticas ocorreu no tempo 48 horas após a irradiação, vindo de encontro com os nossos achados, pois no tempo 48 horas houve um maior crescimento celular em ambas as doses 50mJ/cm² (904nm) e 2J/cm² (830nm).
Para uma melhor compreensão quanto aos efeitos da irradiação do laser sobre as estruturas celulares, a microscopia de fluorescência foi exercida para averiguar o citoesqueleto e o retículo endoplasmático, sendo essas estruturas importantes para o processo de proliferação celular. Na análise do citoesqueleto a dE 50mJ/cm² foi mais significante quando comparada com as outras, gerando uma maior distribuição e organização dos filamentos de actina no citoplasma celular. No estudo de Carnevalli et al.[19] foi possível observar que ao irradiar o
laser λ=830nm a 2J/cm² em células CHO K-1 houve uma ligeira perturbação quanto a organização dos filamentos no citoesqueleto do grupo irradiado, influenciando o metabolismo e a proliferação celular.
Pires Oliveira et al.[20] ao realizar um estudo comparando o efeito da TLBP
e o ultrassom pulsado sobre o Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático de células fibroblásticas (L929), verificaram que ambos os equipamentos promoveram mudanças a nível celular, contudo o ultrassom foi mais eficaz do que a TLBP demonstrando maior atividade do Retículo com aumento na síntese de proteínas, porém, em relação a organização dos filamentos de actina a TLBP atingiu melhor resultado para as doses 50mJ/cm² e 6J/cm².
Quanto ao Retículo Endoplasmático, Pires-Oliveira et al.[21] utilizando o
44 (L929), observaram que as células marcadas com DioC6 apresentaram um aumento no número de vesículas sugerindo elevada síntese de proteína pós-irradiação na dose 50mJ/cm². Estes dados vêm de encontro com nossos achados, porém para o comprimento de onda 830nm indicando uma maior intensa atividade reticular.
Atualmente, há poucos estudos disponibilizados na literatura a respeito da ação da TLBP nas estruturas celulares, como o Citoesqueleto e Retículo Endoplasmático, durante o processo de biomodulação como foi possível evidenciar nos nossos resultados, observando uma maior organização dos filamentos de actina e uma elevação na síntese de proteínas, sendo assim, se faz necessário a realização de novos estudos para explicar o porquê dessas alterações sofridas nas estruturas durante o processo de biomodulação.
A diversidade de parâmetros de irradiação, dificulta realizar investigação in vitro e in vivo não possibilitando a comparação adequada entre os dados obtidos e determinar diretrizes clínicas própria para a TLBP apesar de vastos estudos disponíveis relatando os seus efeitos[22,23,24]. O uso de parâmetros
adequados seria útil para o processo de biomodulação, pois sabe-se que doses inadequadas acarretam efeitos adversos sobre a cultura celular[21]; portanto, a
importância desses parâmetros é fundamental para chegar à máxima proliferação celular possível. [25]
CONCLUSÃO
Estes resultados indicam que a irradiação com laser de baixa potência pode ser útil no tratamento de regeneração óssea através de um efeito biomodulatório sobre os osteoblastos favorecendo a sua maturação e crescimento, pois o uso da TLBP no comprimento de onda 904nm dose 50mJ/cm² apresentou um efeito biomodulador com aumento da proliferação celular, verificando uma melhor organização e distribuição dos filamentos do citoesqueleto. Assim, a TLBP mostra-se como uma técnica de tratamento eficaz na osteogênese, mesmo em uma baixa densidade de energia.
