REB Volume 1 (1): 1-15, 2008.
Revista Eletrônica de Biologia
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___________________________________________________________________ Análise do Efeito da Metformina na Morfologia da Placenta de Ratas Wistar, com e
sem Diabetes Mellitus, Induzidas por Aloxana
Gabriela V.Moreira; Ticiana V. Oliveira; Magali Zampieri1; Mércia T. Toledo 2
1 Departamento de Ciências Médicas. 2 Departamento de Ciências Fisiológicas. Centro de Ciências
Médicas e Biológicas. Pontifícia Universidade Católica de São Paulo. Campus Sorocaba. e-mail: [email protected]
Resumo
Diabetes Mellitus é uma doença associada a um defeito na secreção e/ou na ação da insulina. Um
dos tipos de diabetes que pode ser desenvolvido é o Diabetes Melitus Gestacional (DMG), a qual é causada por uma mudança no metabolismo corpóreo da mulher, associado a um aumento dos níveis hormonais. A placenta é um órgão vital para o crescimento e desenvolvimento fetal e mudanças estruturais ou funcionais podem acarretar complicações no desenvolvimento fetal. A metformina é uma das drogas que recentemente está sendo indicada para mulheres com predisposição ao desenvolvimento do DMG, pois diminui a resistência periférica á insulina, sem aumentar a secreção de insulina pelas células beta. O presente estudo avaliou as possíveis alterações morfológicas e morfométricas dos tecidos placentários de ratas prênhes induzidas ao Diabetes Mellitus por aloxana e tratadas com metformina durante a prenhez. Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais: Controle (C), Diabéticas (D) e Metformina (M). Os dados revelaram que ratas normais quando tratadas com metformina (M) apresentam um ganho de peso menor durante a prenhez quando comparadas com o ganho de peso do grupo controle (C). O grupo diabéticos também apresentou menor ganho de peso, justificado pelo grau de gravidade do diabetes.A análise comparativa do peso fetal e placentário dos controle (C) e tratados com metformina (M) demonstra que os fetos e placentas de ratas (M) apresentaram um peso maior do que fetos/placentas de ratas (C). Na análise morfométrica das placentas dos diferentes grupos experimentais observamos que nos grupos diabéticos houve diminuição da espessura da decídua basalis, aumento da espessura do espongiotrofoblasto e da região labiríntica. Nos animais controles tratados com metformina a decídua não apresentou alterações na espessura, porém o espongiotrofoblasto e a região labiríntica apresentaram-se compactada. Podemos concluir que o tratamento de ratas controles com metformina durante a prenhez pode comprometer os mecanismos de troca materno-fetal promovidas por alterações do tecido placentário.
Palavras-chaves: Diabetes Mellitus, metfomina, aloxana, alterações placentárias
Abstract
Diabetes Mellitus is a desease associated with a defect in the secretion and/or the action of the insulin. One of the types of diabetes that it can be developed is Gestational Diabetes Mellitus, which is caused by a change in the corporeal metabolism of the woman, associated with an increase of the hormonal levels. The placenta is vital for the growth and fetal development and structurals or functionals changes can cause embryo complications. Metformine a drug that recently are being indicated for women with a predisposition to the development of the DMG. This drug reduce sanguine glucose concentration without increasing the secretion of insulin for the cells beta by reductim of insulin resistance, in this study was evaluated the possibles morphologic and morfometric changes in placental tissues when induced to diabetes mellitus for aloxanne and rats treated with metformine during pregnancy. The
animals had been distributed in 3 experimental groups: Control (C), Diabetic (D) e Metformin (M). The results showed when normal rats treated with metformin (M) have a reduced weight compared with the gain of weight of the control group (C). The group also had lower diabetic weight gain, justified by the degree of seriousness of the diabetes. When we compare the embryo and placent weigth of rats (C) with (M), the weigth of embruo/placent at the group (M) are more havy than group (C). Morphometric analysis of the placentas of different experimental groups found that the diabetic group had decreased thickness of the decídua basalis, increased thickness of the region and spongiotrophoblast labyrinth. In animals treated with metformin the decídua had no change in thickness, but the spongiotrophoblast and labyrinth region had been compressed. We can conclude that treatment of rats with metformin during pregnancy can compromise the mechanisms of maternal-embryo exchange promoted by changes in the placental tissue.
Keywords: Diabete Mellitus, metformine, aloxanne, placenta tissue.
1) Introdução
Diabetes Mellitus é uma doença associada a um defeito na secreção e/ou na ação da insulina, causando uma intolerância a carboidratos e pode ser caracterizada por um grupo de alterações genéticas e de diferentes patologias clínicas (Mauad et al, 1998)
Atualmente, cerca de 246 milhões de pessoas no mundo são diabéticas, sendo que a doença é a quarta principal causa de morte em países desenvolvidos (Eurodiab Ace Study Group, 2000]. Isso pode ser atribuído às mudanças no perfil populacional, tais como hábitos alimentares, atividade física diminuída e mudança na expectativa de vida (Albuquerque, 2007).
Segundo a International Diabetes Federation (IDF), estima-se que até o ano de 2025 o número de pessoas portadoras de diabetes seja de 300 milhões [4]. É certo que o Diabetes será um dos grandes problemas de saúde do século XXI, pois a Organização Mundial de Saúde prevê que a doença pode ser responsável pela primeira diminuição da expectativa de vida nos últimos 200 anos (Eurodiab Ace Study Group, 2000).
No Brasil, o índice de portadores desta síndrome é de 7,6% da população (Torquato et al., 2003), sendo que cerca de 50% das pessoas desconhecem sua condição (Lerco et al., 2003).
Hoje, o diabetes está inserido entre as sete doenças com maior número de mortes e morbidez em diversas populações mundiais, devido às suas complicações micro e macrovasculares (Gomes, et al., 2005)
O Diabetes Melitus Gestacional (DMG) é uma das patologias clinicas mais comuns na gravidez. Acomete cerca de 7,2% das gestações (Schmidt et al, 2000).
A gestação é caracterizada por mudança significativa no metabolismo corporal, associada a aumento dos níveis hormonais (Basualdo, 2003), principalmente a hormônios placentários, como o estrogênio, prolactina, progesterona, cortisol e lactogênio placentário (HLP), que causam diminuição da sensibilidade à insulina (Lopez et al., 1996; Maganha et al., 2003). Em uma gestação normal, para manter o suprimento adequado de glicose ao feto e a mãe, ocorre uma maior secreção pancreática de insulina (Lopez et al., 1996).
A placenta é um órgão vital para o crescimento e desenvolvimento fetal, pois transporta oxigênio e nutrientes, além de proteger contra possíveis traumas. Mudanças estruturais ou funcionais podem acarretar em complicações fetais (Desoye, et al., 2003), tais como macrossomia, malformações congênitas e até mesmo morte do concepto (Mauad filho, et al., 1998).
Estudos experimentais mostram que o depósito de glicogênio na placenta de ratas diabéticas pode causar uma imaturidade do órgão. Esse resultado aponta para uma troca de nutrientes, entre mãe e feto, insuficiente para o crescimento, sendo a ocorrência desses desvios explicados por alterações histoquímicas das placentas (Calderon et al., 1999). A função de células trofoblásticas disponibiliza glicose ao feto e o desarranjo desta camada celular pode prejudicar esse fornecimento (Cross, 2005), já que esta camada metaboliza nutrientes, redirecionando-os ao feto (Toledo, 2003).
Atualmente a única medicação indicada, oficialmente, para gestantes diabéticas gestacionais é a insulina humana, embora alguns estudos recentes jsugiram a utilização de outras drogas. A metformina é uma das drogas que recentemente vem
sendo uasada para mulheres com predisposição ao desenvolvimento do DMG e para o tratamento de ovários policísticos, síndrome associada à resistência a insulina [15]. A metformina é uma biguanida que não causa hipoglicemia e diminui a concentração de glicose sangüínea sem aumentar a secreção de insulina pelas células beta. Promove a diminuição da resistência periférica à insulina [16,17]. Essa droga aumenta o número e a afinidade dos receptores de insulina [18]. Além disso, parece não afetar o transporte placentário de glicose, porém foi observado em neonatos de mães tratadas com este antidiabético oral a ocorrência de icterícia, hipoglicemia e macrossomia [15].
Quanto ao uso da metformina na gravidez alguns experimentos realizados em ratos e coelhos não indicaram danos fetais graves e tão pouco evidências de danos à fertilidade [17].
A aloxana é uma droga utilizada para a indução do Diabetes Mellitus que atua na destruição das células beta (β) do pâncreas mantendo sua função exócrina, provocando o estado diabetogênico algumas horas após a injeção, sendo que após 24 horas o Diabetes Mellitus se instala por completo nos animais [5].
O objetivo do presente estudo foi avaliar as possíveis alterações morfológicas e morfométricas dos tecidos placentários de ratas prenhas induzidas ao Diabetes mellitus por aloxana e tratadas com metformina durante a prenhez.
Este trabalho contribuiu para o entendimento do metabolismo gestacional, controle glicêmico e os possíveis prejuízos causados por alterações na glicemia para o desenvolvimento feto-placentário.
2. Materiais e Métodos
2.1 Local de pesquisa
Os experimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório de Fisiologia e Farmacologia do C.C.M.B – PUC-SP, Campus Sorocaba, sob a supervisão dos técnicos do mesmo.
2.2 Animais
Foram utilizadas 14 ratas (Wistar) prenhes, adultas (90 dias), sadias ao exame clinico, pesando entre 150g e 300g. Os animais foram submetidos ao procedimento de cruza, segundo o método de harém descrito por BACKER (1991) [19] na proporção de quatro fêmeas para um macho, onde foram consideradas prenhes as fêmeas em que houve detecção de espermatozóides na análise microscópica do esfregaço vaginal. A presença de espermatozóides indicou o primeiro dia de gravidez (dia zero) e as ratas não prenhes foram descartadas. Os animais foram mantidos com acesso livre a dieta normoprotéica (17% de proteína) e água.
2.3 Grupos Experimentais
Após a confirmação da prenhez, os animais foram divididos em 3 grupos experimentais: Controle (C), Diabéticas (D)e Controle Metformina (M), sendo o grupo controle composto de 5 animais, o grupo diabético de 3 animais e o grupo Metformina de 6 animais. Para isso, os animais foram escolhidos aleatoriamente por sorteio simples.
2.4 Indução do Diabetes Mellitus
A indução do diabetes experimental foi realizada após 12 horas de jejum alimentar, sendo permitida somente a ingestão hídrica [16], a partir do 10° dia de prenhez, os grupos D e DM foram induzidos ao Diabetes mellitus, por meio de injeção intraperitonial (i.p.) de aloxana em dose única de 42 mg/kg, [5] diluída em solução aquosa a 8%. Foram utilizados no estudo somente os animais que apresentaram glicemia igual ou superior a 200mg/dL [20], sendo a confirmação do estado diabetogênico realizado após 24 horas decorrentes da indução [5].
O grupo Controle (C) recebeu, por meio de injeção intraperitonial, uma solução de NaCl 0,9% em dose única de 42mg/kg (i.p.) como placebo.
Decorridos 30 minutos dos tratamentos os animais foram alimentados normalmente com ração para roedores (17% proteínas) [5].
2.5 Tratamento com Metformina
Apenas o grupo M foi tratado com Metformina a 1g/dL, ministrada via oral por meio dos bebedouros. Foi oferecida na água ad libitum aos animais [16]. Todos os
animais foram separados em caixas individuais, para que não fossem ministradas doses diferentes da medicação.
2.6 Parâmetros analisados
Todos os grupos experimentais tiveram seus pesos monitorados a cada 48 horas e a glicemia foi medida antes, durante o tratamento com metformina e com aloxana e no dia do sacrifício do animal, para avaliar os níveis glicêmicos no estado alimentar.
O controle da glicemia dos animais foi realizado por meio de coleta de sangue pela secção da extremidade distal da cauda e sua leitura foi feita utilizando fitas reagentes e glicosímetro Prestige IQ (Blood Glucose Monitors System).
Os animais que foram a óbito ou tiveram reabsorção total dos fetos foram descartados da pesquisa.
No 20º dia de prenhez, após anestesia de hidrato de cloral na dose única de 400mg/kg, os animais foram sacrificados por meio de deslocamento cervical, sendo colocados em tábuas cirúrgicas para a remoção dos fetos e das placentas. Após a separação das placentas e dos fetos, os mesmos foram pesados e três amostras de placenta foram separadas para a preparação do material histológico.
2.7 Procedimentos Histológicos
As placentas foram fixadas em solução de Formol 10% e incluídas em parafina, de onde foram obtidos cortes histológicos de 5 µm, corados com Hematoxilina e Eosina (HE) e Acido periódico de Schiff (PAS) para análise histológica do material [14].
2.8 Morfologia placentária
A análise histomorfológica da placenta foi feita por meio da obtenção de imagens no aumento de 100x em microscopia de luz, utilizando–se o software de aquisição e armazenamento de impressão das imagens microscópicas (IMAGE pró-LIGHT), num total de 3 placentas de cada animal, totalizando 30 imagens/animal.
As imagens foram analisadas sob o mesmo aumento microscópico, verificando-se a integridade dos tecidos placentários: decídua basalis, espongiotrofoblasto e labirinto.
2.9. Morfometria placentária
Foi realizado um perfil linear da espessura das camadas teciduais placentárias, decídua basalis, espongio trofoblasto e labirinto onde foram coletadas imagens microscópicas obtidas em aumento de 100x, tomando-se sempre o cuidado de calibrar o aparelho de captura e análise da espessura para objetiva de mesmo tamanho.
2.10 Análise estatística
Os dados foram avaliados segundo método de análise de variância não paramétrico aplicando-se o teste de Kruskall-Wallis, seguido de teste de Dunn’s de múltiplas comparações utilizando-se software Prisma. (GraphPad Software Incorporated, 1999 licença nº 63 – A11876 – 136) [21].
3. Resultados e Discussão
Os níveis glicêmicos, os dois grupos experimentais não induzidos ao diabetes não apresentaram alterações na glicemia, todas as medidas obtidas foram inferiores a 200 mg/dl (Tabela 1). Já no grupo diabéticos (D) induzidos por aloxana a glicemia variou de moderada à grave, sendo considerada grave acima de 400mg/dl.
Tabela 1: Controle glicêmico dos grupos experimentais Grupos experimentais
Glicemia (mg/dl)
Antes Após 48 horas Sacrifício
Animais Controles 93,0 59,0 29,0 85,0 87,0 45,0 80,0 44,0 42,0 Animais Diabéticos 73,0 225,0 413,0 93,0 280,0 365,0 116,0 155,0 205,0 Animais Controle Metformina 79,0 64,0 51,0 85,0 67,0 89,0 71,0 75,0 99,0 80,0 71,0 68,0 35,0 34,0 38,0 30,0 29,0 26,0
A placenta é uma unidade altamente especializada, constituída de três regiões morfológica e funcionalmente distintas. A decídua alcança período de diferenciação máxima ao 10° dia, com células deciduais importantes na implantação e nutrição do embrião. Essas células produzem fatores que controlam a invasão trofoblástica e protegem o embrião da rejeição pelo sistema imune materno.
O Espongiotrofoblasto caracteriza-se por zona basal com presença de células trofoblastica gigantes (CTGs). As células trofoblásticas estão envolvidas na secreção de hormônios, incluindo HCG (gonadotrofina coriônica humana) e progesterona necessários a manutenção da espessura do endométrio uterino e fatores angiogênicos de crescimento vascular e endotelial contribuindo para o remodelamento tecidual. A região Labiríntica é constituída de células labirínticas cuja função é de promover e mediar transferência de nutrientes entre o espaço sanguíneo materno e o fetal.
Os dados revelaram que ratas normais quando tratadas com metformina (M) apresentam um ganho de peso menor durante a prenhez quando comparadas com o ganho de peso do grupo controle (C), como mostra a Fig. 2. O grupo diabéticos também apresentou menor ganho de peso, justificado pelo grau de gravidade do diabetes (acima de 400mg/dl).
A análise comparativa do peso fetal e placentário dos controle (C) e tratados com metformina (M) demonstra que os fetos e placentas de ratas (M) apresentaram um peso maior do que fetos/placentas de ratas (C), resultado observado na Figura 3 (p<0,05).
Figura 2. Análise comparativa do ganho de peso dos grupos controle (C), diabético (D) e Controles Metformina (M). Resultados expressos em Média + EPM. *** p = 0, 0002 (p<0,05). Número de animais controle (n = 5), diabéticos (n = 3) e controle metformina (n = 6).
P e s o C o n t r o l e s / D i a b é t i c o s / M e t f o r m i n a
P. Inicial C P. Final C P. Inicial D P. Final D P. Inicial M P. Final M
0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 P e s o ( g ) * * * * * *
Fig. 3. Análise comparativa entre o peso dos fetos controles (FC) das placentas controle (PC), fetos do grupo diabético e suas respectivas placentas (PD) e fetos metfomina (FM) com placentas metformina (PM). Resultados expressos em Média + EPM. Número de fetos controle (n = 51), fetos diabéticos (n = 15) e fetos metfomina (n=49). ***p = 0,0001.
Na análise morfométrica das placentas dos diferentes grupos experimentais observamos que nos grupos diabéticos houve diminuição da espessura da decídua basalis , aumento da espessura do espongiotrofoblasto e da região labiríntica (p<0,05).
Nos animais controles tratados com metformina a decídua não apresentou alterações na espessura, porém o espongiotrofoblasto e a região labiríntica.
p e s o fe to /p la c e n ta
FC PC FD PD FM PM 0 1 2 3 4p
e
s
o
(
g
)
***
***
apresentaram-se compactados (p<0,05).
Figura 4. Análise comparativa da espessura dos tecidos placentários dos grupos experimentais, decidua controle (DC), diabética (DD) e metformina (DM); espongio controle (EC), diabético (ED) e metformina (EM) e labirinto controle (LC), diabético (LD) e metformina (LM). Resultados expressos em Média + EPM, ***p<0,0001. Número de animais controle (n = 5 ) , diabéticos (n = 3) e metformina (n=6).
Na figura 5 verificamos as camadas teciduais placentárias de ratas controles: decídua (D), espongiotrofoblasto (EP) e labirinto (L), sacrificadas ao 20° dia de prenhez. Nos grupos controles verificamos que a placenta apresenta decídua integra, presença de células trofoblasticas Gigantes (CTGs) e células trofoblásticas em grande número na região do espongiotrofoblasto com lacunas maternas (LM). No labirinto verificamos a presença de vilos fetais (VF) delimitados e grande número de células labirínticas, corados por hematoxilina e eosina.
O tratamento com metformina foi realizado nos grupos controles e diabéticos. Os 8 animais diabéticos que receberam o tratamento com metformina durante a prenhez vieram a óbito, após 72 horas pós-tratamento. Este fato sugere que a administração da droga durante a prenhez pode promover mudanças intensas na glicemia do animal. Nos animais controles foram tratados diariamente com metformina na água de beber e ao final da prenhez após análise morfológica placentária verificamos que houve desarranjo nas camadas teciduais decidua e no espongiotrofoblasto (figura 6). A decídua apresentou espessamento, fibrose e infiltrado inflamatório agudo (INF), característica de processo de inflamação. No espongiotrofoblasto verificamos a presença de área com infarto celular e lesões
A n á l i s e c o m p a r a t i v a e s p e s s u r a p l a c e n t a s DC DD DM EC ED EM LC LD LM 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 g r u p o s e x p e r im e n t a is e s p e s s u ra ( µµµµm )
vasculares importantes que possivelmente comprometem a superfície de troca materno/fetal.
Figura 5: Imagem representativa morfologia Placentária Grupo Controle 20° dia. Decídua (D), Espongotrofoblasto (EP) e Labiritnto (L) (Aumento 100x) (Coloração HE).
Figura 6: Imagem representativa morfologia Placentária Grupo Controle 20° dia. Decídua (D), Espongotrofoblasto (EP) e Labiritnto (L) (Aumento 100x) (Coloração HE).
Na figura 7 verificamos moderada deposição de glicogênio nas camadas decídua e espongiotrofoblasto e labirinto corados em tom de arroxeado. Nas placentas de ratas diabéticas há intensa deposição de glicogênio principalmente na região da decídua, que apresenta-se com aumento de sua espessura, bem como
D EP L LM VF Infarto e fibrose ↓
Desarranjo do labirinto com infarto L D EP
INF
intensa deposição de glicogênio no citoplasma das células trofoblásticas do espongiotrofoblasto (Figura 8).
Figura 7: Imagem representativa da deposição de glicogênio por PAS nas camadas teciduais. Placentárias (Seta). Grupo Controle 20° dia. Decídua (D), Espongotrofoblasto (EP) e Labiritnto (L) (Aumento 100x) (Coloração PAS).
Figura 8: Imagem representativa da deposição de glicogênio por PAS nas camadas teciduais. Placentárias (Seta). Grupo Diabético 20° dia. Decídua (D), Espongotrofoblasto (EP) e Labiritnto (L) (Aumento 100x) (Coloração PAS).
D EP L D EP L
4. Conclusão
Para indução do diabetes utilizamos a dose de aloxana padronizada em literatura e utilizada rotineiramente nos laboratórios de Diabetes Experimental do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Ciências Médicas da UNESP de Botucatú, SP, sob supervisão da Profª Drª Marilza V.C.Rudge.
Cerca de 20 fêmeas vieram a óbito antes mesmo da confirmação do diabetes. A prenhez confirmada por esfregaço vaginal, muitas vezes não seguiu adiante nos grupos de diabéticas graves, havendo 100% de reabsorção fetal em 50% do grupo diabético.
Podemos concluir que o tratamento de ratas controles com metformina durante a prenhez pode comprometer os mecanismos de troca materno-fetal promovidas por alterações do tecido placentário, principalmente no espongio e labirinto. O tratamento com metformina no grupo diabético promoveu alterações irreversíveis na glicemia materna induzindo assim hipoglicemia severa ocasionando morte das fêmeas antes mesmo do término do procedimento experimental.
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