AÇÃO SINÉRGICA DE PROTEASES PARA A OBTENÇÃO DE
HIDROLISADOS DE PROTEÍNA CONCENTRADA DE
FEIJÃO COM ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
R.J.S. de Castro
1, V.G. Cason
1, H.H. Sato
11-Departamento de Ciência de Alimentos – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos – CEP: 13083-862 – Campinas – SP – Brasil, Telefone: (19) 3521-2165 – Fax: (19) 3521-2153 – e-mail: (ruannjanser@hotmail.com)
RESUMO – Peptídeos com atividade antioxidante obtidos a partir da hidrólise enzimática de proteínas apresentam grande potencial de aplicação como compostos naturais e são apontados como possíveis substitutos de moléculas sintéticas. No presente trabalho, hidrolisados de proteína concentrada de três variedades de feijão foram obtidos utilizando as preparações comerciais de proteases Flavourzyme® 500L, Alcalase® 2.4L e Neutrase® 0.8L aplicadas de forma isolada ou combinadas em formulações binárias/ternárias na concentração de 50 U.mL-1, pH 7, 50°C, concentração de substrato 100 mg mL-1 durante 2h. Os resultados obtidos mostraram que a atividade antioxidante das proteínas das três variedades de feijão aumentou significativamente após a hidrólise enzimática. A utilização da mistura binária de Flavourzyme® 500L e Alcalase® 2.4L resultou em máxima atividade antioxidante dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão branco, carioca e preto quando avaliados utilizando os ensaios: inibição de radicais DPPH, atividade antioxidante total e poder redutor de Fe III.
ABSTRACT – Peptides with antioxidant activity obtained from the enzymatic hydrolysis of proteins have great potential application as natural compounds and are mentioned as possible replacements to synthetic molecules. In this study, hydrolysates of
bean protein concentrated
from threedifferent
varieties
were obtained using commercial proteases Flavourzyme® 500L, Alcalase® 2.4L and Neutrase® 0.8L applied individually or combined into binary/ternary formulations in concentration of 50 U mL-1, pH 7, 50°C, substrate concentration of 100 mg mL-1 for 2h. The results showed that the antioxidant activity of the proteins from the three varieties of beans increased significantly after enzymatic hydrolysis. The use of the binary mixture of Flavourzyme® 500L and Alcalase® 2.4L resulted in maximum antioxidant activity of the protein hydrolysates from white bean, carioca bean and black bean when evaluated using the assays: DPPH-radical scavenging, total antioxidant activity and Fe III reducing power assay.PALAVRAS-CHAVE: proteína concentrada de feijão, hidrólise enzimática, atividade antioxidante. KEYWORDS: bean protein concentrated, enzymatic hydrolysis, antioxidant activity.
1. INTRODUÇÃO
O feijão (Phaseolus vulgaris L.) é um dos alimentos mais produzidos e consumidos mundialmente. De acordo com a FAO (2016), estima-se que a produção mundial de feijão atingiu 23 milhões de toneladas em 2013, sendo o Brasil responsável por 13% dessa produção, cerca de três milhões de toneladas. Os maiores mercados consumidores incluem a América do Sul (9,3 kg/per capita/ano), Caribe (9,1 kg/per capita/ano), América Central (8,8 kg/per capita/ano) e África Central (8,0 kg/per capita/ano).
O feijão é considerado uma boa fonte de proteínas (16-33%), vitaminas, minerais e carboidratos complexos. As proteínas, em especial, apresentam funções vitais em grãos como o feijão. Elas podem ser classificadas de acordo com a sua atividade biológica, sendo responsáveis por funções de armazenamento, metabolismo de carboidratos, mecanismos de defesa, desintoxicação, crescimento, desenvolvimento e transporte (De La Fuente et al., 2012).
Processos envolvendo a hidrólise enzimática de proteínas têm sido estudados para a produção de peptídeos com atividade biológica. Peptídeos bioativos são definidos como frações específicas de proteínas, com sequência de aminoácidos que promovem um impacto positivo em várias funções biológicas, como atividade antioxidante (Bougatef et al., 2009).
Antioxidantes são considerados importantes nutracêuticos apresentando diversos benefícios à saúde, e são definidos como quaisquer substâncias que retardam ou inibem significativamente a oxidação de um substrato.
O
interesse crescente de pesquisadores para obtenção de moléculas antioxidantes a partir de fontes naturais em substituição às substâncias sintéticas coloca os peptídeos provenientes de proteínas hidrolisadas em posição de destaque (Senphan & Benjakul, 2014; Chi et al., 2015).Devido ao grande potencial de aplicação, o presente trabalho teve como objetivo principal o avaliar os efeitos da hidrólise enzimática de proteína concentrada de feijão branco, carioca e preto utilizando diferentes preparações comerciais de proteases e planejamento experimental de misturas e estudo da atividade antioxidante dos hidrolisados obtidos.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Proteases
Três preparações comerciais de proteases foram utilizadas neste estudo. As proteases comerciais Flavourzyme® 500L de Aspergillus oryzae, Alcalase® 2.4L de Bacillus licheniformis e Neutrase® 0.8L de Bacillus amyloliquefaciens foram adquiridas da Sigma Aldrich.
2.2 Substratos e obtenção da proteína concentrada de feijão
Para a obtenção da proteína concentrada de feijão e hidrolisados proteicos, foram utilizadas variedades de feijão branco, feijão carioca e feijão preto.
Os concentrados de proteína de feijão foram obtidos de acordo com o método descrito por Oseguera-Toledo et al., (2011). As amostras de feijão foram inicialmente trituradas em blender para obtenção de uma farinha. Amostras de 300 g da farinha de feijão foram misturadas com 3L de água destilada, separadamente, o pH foi ajustado para 9,0 com solução de NaOH 0,2 M e a mistura foi mantida sob agitação durante 1h a 35°C. A mistura foi centrifugada a 5.000 x g durante 15 min a 25°C, os sobrenadantes foram recolhidos e o pH foi ajustado para 4,3 com solução de HCl 1M. As amostras foram centrifugadas a 10.000 x g durante 20 min a 25°C e os precipitados resultantes foram recolhidos, congelados, liofilizados e armazenados a -20°C para posteriores análises.
2.3 Produção dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão
As três preparações de proteases comerciais foram utilizadas para a produção de hidrolisados de proteína concentrada de feijão utilizando planejamento experimental de misturas. Amostras de 50 mL das soluções de proteínas 100 mg mL-1 (p/v) e protease (50 U por mL de mistura reacional) foram incubadas em pH 7 a 50°C sob agitação de 100 rpm durante 2h. Após a hidrólise, as soluções foram submetidas a tratamento térmico (100°C por 20 min) para inativação das proteases. As amostras foram centrifugadas a 17.000 x g a 5°C por 20 min e os sobrenadantes contendo os peptídeos bioativos foram coletados, congelados e liofilizados para determinação da atividade antioxidante. A hidrólise enzimática utilizando o planejamento experimental de misturas englobou sete ensaios (Tabela 1).
Tabela 1 – Matriz do planejamento experimental de misturas para obtenção de peptídeos com
atividade antioxidante através da hidrólise enzimática de proteína concentrada de feijão utilizando diferentes preparações enzimáticas de proteases.
Ensaios Enzimas
Flavourzyme® 500L Alcalase® 2.4L Neutrase® 0.8L
1 1 0 0 2 0 1 0 3 0 0 1 4 1/2 1/2 0 5 1/2 0 1/2 6 0 1/2 1/2 7 1/3 1/3 1/3
2.4 Determinação da atividade antioxidante dos hidrolisados proteicos
Capacidade antioxidante total: A determinação da capacidade antioxidante total dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão foi realizada de acordo com o método descrito por Prieto et al. (1999), o qual baseia-se na reação de redução de Mo (VI) a Mo (V) pela amostra e subsequente formação do fosfato-Mo (V) que apresenta cor verde em pH ácido. A capacidade antioxidante total foi medida em função da absorbância (695 nm), onde maiores valores indicaram maior potencial antioxidante.
Inibição de radicais DPPH: A atividade antioxidante dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão avaliada pelo método DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) foi determinada de acordo com o descrito por Bougatef et al., (2009). A capacidade de inibição de radicais DPPH foi medida em função da redução percentual da absorbância (517 nm) em relação ao controle reacional.
Determinação do poder redutor de Fe III: A capacidade dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão em reduzir o ferro (III) foi determinada de acordo com o método descrito por Yildirim et al., (2001). O poder redutor de Fe III foi medido em função da absorbância (700 nm), onde maiores valores indicaram maior capacidade de redução.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A atividade antioxidante das proteínas concentradas de feijão branco, carioca e preto apresentou aumento após a hidrólise enzimática com as diferentes preparações comerciais de proteases (Tabela 1).
As amostras de proteínas hidrolisadas de feijão branco e carioca foram as que apresentaram maior aumento na capacidade de inibição de radicais DPPH quando comparadas às suas respectivas amostras não hidrolisadas. Os hidrolisados proteicos de feijão preto inibiram até 65% dos radicais DPPH, sendo este o maior valor de atividade antioxidante observado entre as amostras avaliadas. É possível observar o importante efeito sinérgico entre as diferentes enzimas, com destaque para a mistura binária de Flavourzyme® 500L (1/2) e Alcalase® 2.4L (1/2) (ensaio 4) que resultou na produção de hidrolisados proteicos com máxima atividade antioxidante, na maior parte dos casos, utilizando os métodos: redução de radicais DPPH, atividade antioxidante total e poder redutor de Fe III (Tabela 1).
Tabela 1 – Atividade antioxidante dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão branco, carioca e
preto e resultados para redução percentual de radicais DPPH, atividade antioxidante total e poder redutor de Fe III para os diferentes ensaios do planejamento experimental de misturas.
Redução do radical DPPH¹ (%)
Ensaios Branco Carioca Preto
Controle Não detectada 18,49 ± 1,06 57,03 ± 1,38
1 35,93 ± 4,49 10,83 ± 1,04 63,47 ± 1,48 2 36,35 ± 6,08 20,37 ± 0,71 60,25 ± 0,41 3 24,73 ± 3,05 28,21 ± 2,10 55,27 ± 0,88 4 45,31 ± 2,92 50,96 ± 1,87 60,38 ± 1,42 5 19,97 ± 4,51 33,75 ± 0,66 62,14 ± 0,68 6 39,55 ± 4,66 23,96 ± 0,61 65,23 ± 0,46 7 33,51 ± 0,55 42,69 ± 0,91 62,44 ± 1,25
Atividade antioxidante total (absorbância)²
Controle 0,458 ± 0,02 0,532 ± 0,06 0,545 ± 0,03 1 1,068 ± 0,06 0,881 ± 0,07 0,554 ± 0,02 2 0,985 ± 0,02 0,820 ± 0,01 0,515 ± 0,01 3 0,732 ± 0,07 0,787 ± 0,02 0,439 ± 0,04 4 0,890 ± 0,03 1,336 ± 0,07 0,693 ± 0,01 5 0,798 ± 0,02 1,091 ± 0,04 0,579 ± 0,02 6 0,828 ± 0,02 1,101 ± 0,02 0,547 ± 0,02 7 0,759 ± 0,01 1,086 ± 0,02 0,604 ± 0,01
Poder redutor de Fe III (absorbância)²
Controle 0,131 ± 0,00 0,375 ± 0,03 0,442 ± 0,01 1 0,342 ± 0,02 0,570 ± 0,02 0,474 ± 0,04 2 0,298 ± 0,01 0,649 ± 0,04 0,522 ± 0,02 3 0,334 ± 0,01 0,642 ± 0,03 0,367 ± 0,01 4 0,414 ± 0,01 0,851 ± 0,04 0,677 ± 0,01 5 0,405 ± 0,01 0,745 ± 0,01 0,622 ± 0,03 6 0,322 ± 0,02 0,669 ± 0,04 0,662 ± 0,02 7 0,369 ± 0,01 0,652 ± 0,01 0,675 ± 0,01
¹ Amostras avaliadasna concentração de 10 mg mL -1 para o método DPPH.
²Amostras de hidrolisados de proteína concentrada de feijão preto avaliadas na concentração de 10 mg mL-1 e as demais na concentração de 25 mg mL-1.
A preparação enzimática Flavourzyme® 500L é uma protease fúngica de A. oryzae e que contem atividades de endo- e exoproteases e cliva aminoácidos na extremidade C-terminal (Luna-Vital et al., 2014). Por outro lado, a Alcalase® 2.4L é uma endoprotease do tipo serina obtida a partir de B.
licheniformis que tem uma especificidade elevada por aminoácidos aromáticos (Doucet et al., 2003). A
combinação destas enzimas que possuem diferentes mecanismos de ação e especificidades apresentou um efeito positivo na produção de hidrolisados proteicos contento peptídeos com maior atividade antioxidante quando comparados aos hidrolisados produzidos com as enzimas de forma isolada.
Betancur-Ancona et al., (2014) estudaram a atividade antioxidante de proteína concentrada de de feijão hidrolisada utilizando as preparações enzimáticas de proteases Alcalase, Flavourzyme, pepsina, pancreatina e sistemas combinados contendo Alcalase-Flavourzyme e pepsina-pancreatina. A atividade antioxidante avaliada pelo método ABTS, mostrou que a proteína concentrada de feijão apresentou maior potencial quando hidrolisada utilizando a combinação de enzimas Flavourzyme-Alcalase, atingindo 8,1 mM de Trolox equivalentes por mg de amostra.
As variações na atividade antioxidante dos hidrolisados obtidos a partir das proteínas de feijão branco, carioca e preto e avaliadas pelos métodos redução de radicais DPPH, atividade antioxidante total e poder redutor de Fe III são apresentadas nas curvas de contorno nas Figuras 1, 2 e 3, respectivamente.
Figura 1 – Curvas de contorno para atividade antioxidante expressa como redução de radicais DPPH
dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão branco (a), carioca (b) e preto (c) em função das variáveis independentes do planejamento experimental de misturas.
Figura 2 – Curvas de contorno para atividade antioxidante expressa como capacidade antioxidante
total dos hidrolisados de proteína concentrada de feijão branco (a), carioca (b) e preto (c) em função das variáveis independentes do planejamento experimental de misturas.
Figura 3 – Curvas de contorno para atividade antioxidante expressa como poder redutor de Fe III dos
hidrolisados de proteína concentrada de feijão branco (a), carioca (b) e preto (c) em função das variáveis independentes do planejamento experimental de misturas.
> 44 < 44 < 39 < 35 < 31 < 27 < 23 < 19 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L > 50 < 50 < 41 < 36 < 31 < 26 < 21 < 16 < 11 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L > 64 < 64 < 62 < 60 < 58 < 56 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L a b c > 1,05 < 1,05 < 0,98 < 0,93 < 0,88 < 0,83 < 0,78 < 0,73 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L > 1,3 < 1,3 < 1,2 < 1,1 < 1 < 0,9 < 0,8 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L > 0,68 < 0,68 < 0,64 < 0,60 < 0,56 < 0,52 < 0,48 < 0,44 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L a b c > 0,40 < 0,40 < 0,37 < 0,35 < 0,33 < 0,31 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L > 0,85 < 0,85 < 0,78 < 0,73 < 0,68 < 0,63 < 0,58 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L > 0,65 < 0,65 < 0,57 < 0,52 < 0,47 < 0,42 < 0,37 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Neutrase® 0.8L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Flavourzyme® 500L 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Alcalase® 2.4L a b c
Para a capacidade de redução de radicais DPPH (Figura 1), a combinação das enzimas Flavourzyme® 500L e Alcalase® 2.4L permitiu a produção de hidrolisados proteicos de feijão branco e carioca com maior atividade antioxidante, já para a proteína concentrada de feijão preto, a combinação de Alcalase® 2.4L e Neutrase® 0.8L foi a mais adequada. Efeitos sinérgicos também foram observados entre as enzimas Flavourzyme® 500L e Alcalase® 2.4L na produção de hidrolisados proteicos de feijão carioca e preto com maiores valores de capacidade antioxidante total (Figura 2) e capacidade de redução de Fe III (Figura 3).
4. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos mostraram que a hidrólise enzimática utilizando diferentes preparações comerciais de proteases apresentou em efeito positivo sobre a atividade antioxidante de proteínas de feijão branco, carioca e preto. A aplicação da técnica de planejamento experimental de misturas permitiu determinar que a combinação de enzimas com diferentes mecanismos de ação e especificidades apresentou efeito sinérgico, resultando em maior atividade antioxidante dos hidrolisados proteicos.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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