UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA HIDRÁULICA E AMBIENTAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA CIVIL

Texto

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA HIDRÁULICA E AMBIENTAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA CIVIL

MARIANNA CORREIA ARAGÃO MILEO

SAXITOXINAS GTX 2,3, DC-GTX 2,3 E C 1,2 EM ÁGUA DE ABASTECIMENTO

PÚBLICO: ESTABILIDADE E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO

FORTALEZA 2014

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MARIANNA CORREIA ARAGÃO MILEO

SAXITOXINAS GTX 2,3, DCGTX 2,3 E C 1,2 EM ÁGUA DE ABASTECIMENTO PÚBLICO: ESTABILIDADE E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Civil da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Engenharia Civil. Área de concentração: Recursos Hídricos.

Orientador: Prof. Dr. José Capelo Neto.

FORTALEZA 2014

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MARIANNA CORREIA ARAGÃO MILEO

SAXITOXINAS GTX 2,3, DCGTX 2,3 E C 1,2 EM ÁGUA DE ABASTECIMENTO PÚBLICO: ESTABILIDADE E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Civil da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Engenharia Civil. Área de concentração: Recursos Hídricos.

Aprovada em: ___/___/______.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Prof. Dr. José Capelo Neto (Orientador)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________ Prof. Dr. André Bezerra dos Santos

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________ Prof. Dr. Ivanildo José da Silva Júnior Universidade Federal do Ceará (UFC)

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Aos meus pais, Maria do Socorro Correia de Aragão e Raimundo Nonato Brito de Aragão.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, o todo poderoso, por me inspirar e me dar forças em todos os momentos da minha vida.

Aos meus pais, Socorro e Nonato, por terem me proporcionado a melhor educação possível.

Aos meus avós, em especial, à minha avó Maria do Socorro de Oliveira Correia, pelo apoio e carinho.

Ao meu esposo, Paulo Graziane Mendonça Mileo, pelo incentivo em todos os momentos, motivação, companheirismo e cumplicidade.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio.

Ao meu orientador Prof. Dr. José Capelo Neto, pela excelente orientação, paciência e confiança no meu potencial, que tornaram possível a conclusão deste trabalho.

Aos professores participantes da banca examinadora Ivanildo José da Silva Júnior e André Bezerra dos Santos pelas colaborações e sugestões.

Aos companheiros do laboratório SELÁQUA, que de alguma forma contribuíram para a realização desta pesquisa.

Aos colegas da turma de mestrado, pelas reflexões e sugestões recebidas. Aos meus amigos pelo incentivo, apoio e amizade.

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“As nuvens mudam sempre de posição, mas são sempre nuvens no céu. Assim devemos ser todo dia, mutantes, porém leais com o que pensamos e sonhamos;

Tudo se desmancha no ar, menos os pensamentos.”

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RESUMO

A qualidade da água nos reservatórios para abastecimento vem sendo comprometida devido ao processo de eutrofização. A eutrofização propicia a proliferação das cianobactérias e consequentemente, cianotoxinas por elas produzidas e liberadas como metabólitos secundários. Após vários relatos de intoxicações fatais causadas por cianotoxinas no Brasil e no mundo, as autoridades sanitárias brasileiras deram mais atenção à problemática, culminando com a inclusão de limites máximos de concentração para a microcistina e para a saxitoxina na portaria de potabilidade do Ministério da Saúde 2914/2011. Entre os métodos descritos na literatura para a determinação de saxitoxinas, não foram encontrados relatos de validação para análise de Goniautoxina 2,3 (GTX 2,3), Decarbamoil-Goniautoxina 2,3 (dc-GTX 2,3) e N-sulfocarbamoil-Goniautoxina 2,3 (C 1,2) em amostras de água de reservatórios para abastecimento. Dentro deste contexto, este trabalho tem como objetivo validar uma metodologia analítica para identificar e quantificar GTX 2,3, dc-GTX 2,3 e C 1,2, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (CLAE-FLD). A validação foi executada de acordo com a Resolução 889/2003 da ANVISA. A toxina C 1,2 não se manteve estável e degradou-se rapidamente, impedindo a sua detecção e conclusão da sua validação. Para as toxinas GTX 2,3 e dc-GTX 2,3, a seletividade mostrou-se satisfatória, já que não houve interferentes nos tempos de eluição das toxinas. Verifica-se a linearidade a partir dos coeficientes de correlação superiores a 0,99, indicando a proporcionalidade entre as áreas dos picos e as respectivas concentrações. Os valores obtidos para os limites de detecção e quantificação do instrumento e do método apresentaram-se dentro do valor permitido pela referida portaria de potabilidade e estudos realizados por outros autores. Quanto a precisão e a exatidão, os valores obtidos não ultrapassaram o valor máximo obtido pelos estudos realizados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), com exceção dos valores obtidos para a exatidão nas menores concentrações. O método mostrou-se robusto na análise quanto a área do pico e apresentou sensibilidade a variação de temperatura na análise quanto ao tempo de retenção. A partir da verificação final dos resultados obtidos, tem-se que o método é válido para a determinação de GTX 2,3 e dc-GTX 2,3.

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ABSTRACT

The water quality in the reservoirs to supply has been compromised due to eutrophication. Eutrophication favors the proliferation of cyanobacteria and consequently cyanotoxins that are produced and released as their secondary metabolites. After several reports of fatal poisoning caused by cyanotoxins in Brazil worldwide, Brazilian health authorities have dedicated more attention to that issue. That led to the inclusion of thresholds to the concentration of microcystin and saxitoxin to the concierge of potability 2914/2011 of the Brazilian Ministry of Health. Among the methods described in the literature for the determination of saxitoxins, no reports were found for the validation of the analysis of Gonyautoxin 2,3 (GTX 2,3), Decarbamoyl-Gonyautoxin 2,3 (dc-GTX 2,3) and N-sulfocarbamoyl-Decarbamoyl-Gonyautoxina 2,3 (C 1,2) in water samples from public reservoirs. In this context, this work aims to validate an analytical methodology to identify and quantify GTX 2,3, dc-GTX 2,3 and C1,2, using high-efficiency liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD). Validation was performed in accordance with Resolution 889/2003 of ANVISA. The toxin C 1,2 has not remained stable and deteriorated rapidly, preventing its detection and completion of validation. For GTX 2,3 and dc-GTX 2,3 toxins, the selectivity was satisfactory, as there were no interfering in the elution times of the toxins. The linearity is satisfactory, as the linear coefficients presented a correlation greater than 0.99, indicating the proportionality between the peak areas and their concentrations. The values obtained for the detection and quantification limits of the instrument and method were within the allowed values by the referred concierge of potability and studies of other authors. As for precision and accuracy, the values did not exceed the maximum value obtained by studies conducted by the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA), with the exception of the values obtained for accuracy at low concentrations. The method proved to be robust in the analysis of the peak area and, in the analysis of the retention time, showed sensitivity to variations in temperature. From the final assessment of the results obtained, we conclude that the method is valid for the determination of GTX 2,3 and dc-GTX 2,3.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Mananciais do Ceará classificados pelos riscos oferecidos... 20 Figura 2 - Estrutura Química Goniautoxina 2 (GTX 2)... 23 Figura 3 - Relação entre a sensibilidade e seletividade de métodos analíticos para

identificação e quantificação de cianotoxinas... 25 Figura 4 - Método de Bioensaio em camundongos... 26 Figura 5 - Quadro comparativo do comportamento das saxitoxinas após oxidação

com periodato e peróxido... 29 Figura 6 - Procedimento de diluição do padrão para preparação da Solução Estoque

1... 40 Figura 7 - Procedimento de diluição das Soluções Estoque 1 de cada toxina para a

produção da Solução de trabalho MIX... 41 Figura 8 - Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência com detector de fluorescência

(CLAE-FLD)... 43 Figura 9 - Cromatogramas por CLAE obtidos pela matriz isenta de toxina (Branco)

e com presença de toxina (Mix) para C 1,2... 53 Figura 10 - Curvas analíticas obtidas para C 1,2 obtidas por curvas Mix + água

deionizada e Mix +Matriz... 54 Figura 11 - Diminuição da concentração do Estoque 1 de GTX 2,3 e dc-GTX 2,3 ao

longo do tempo... 55 Figura 12 - Diminuição da concentração do Mix de GTX 2,3 e dc-GTX 2,3 ao longo

do tempo... 56 Figura 13 - Cromatogramas por HPLC obtidos pela matriz isenta de toxina (Branco)

e com presença de toxina (Mix)... 56 Figura 14 - Curvas analíticas obtidas para GTX 2,3 e dc-GTX 2,3 obtidas por curvas

Mix + água deionizada e Mix +Matriz... 57 Figura 15 - Faixa de trabalho (relação área do pico x concentração) obtidas para GTX

2,3 e dc-GTX 2,3... 58 Figura 16 - Cromatogramas obtidos a partir da variação da Temperatura no teste da

Robustez: (a) Temperatura da coluna a 30 ºC e (b) Temperatura da coluna a 33 ºC... 62

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Estruturas Químicas das toxinas do grupo Saxitoxina... 22

Tabela 2 - Tabela dos limites de concentração máximos permitidos para cianotoxinas na água para consumo humano... 24

Tabela 3 - Quadro comparativo entre os métodos de derivatização pré e pós-coluna... 28

Tabela 4 - Matriz da combinação ensaiada dos fatores para determinação da robustez do método... 38

Tabela 5 - Reagentes utilizados... 39

Tabela 6 - Concentrações das toxinas presentes nos padrões... 40

Tabela 7 - Concentrações da Toxinas nas respectivas Soluções Estoque 1... 40

Tabela 8 - Concentrações da Toxinas nas respectivas Solução de trabalho MIX... 41

Tabela 9 - Caracterização Físico-química da Água ETA-GAVIÃO... 42

Tabela 10 - Condições cromatográficas utilizadas... 44

Tabela 11 - Gradiente de eluição utilizado no método... 44

Tabela 12 - Concentrações das toxinas para Seletividade... 45

Tabela 13 - Concentrações para as curvas analíticas (MIX + Matriz e MIX + Água deionizada)... 46

Tabela 14 - Concentrações utilizadas para Linearidade e Faixa de Trabalho... 47

Tabela 15 - Concentrações utilizadas para a determinação da precisão... 48

Tabela 16 - Coeficiente de variação máximo permitido (CV) para os testes de repetitibilidade de acordo com a concentração do analito... 48

Tabela 17 - Concentrações utilizadas para a determinação da exatidão... 49

Tabela 18 - Intervalos permitidos para o teste de exatidão de acordo com a concentração do analito (C) presente na amostra... 49

Tabela 19 - Condições normais e variáveis para a análise da robustez... 50

Tabela 20 - Combinação fatorial para a determinação da robustez... 51

Tabela 21 - Parâmetros das curvas analíticas obtidos pelas curvas Mix + água deionizada e Mix + Matriz para a GTX 2,3... 57

Tabela 22 - Parâmetros das curvas analíticas obtidos pelas curvas Mix + água deionizada e Mix + Matriz para a dc-GTX 2,3... 58

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Tabela 23 - Parâmetros da Faixa de Trabalho obtidos pelas curvas para a GTX 2,3 e dc-GTX 2,3... 59 Tabela 24 - Limites de detecção e quantificação do instrumento e do método para cada

toxina... 59 Tabela 25 - Resultados do parâmetro de precisão para a GTX 2,3 e dc-GTX2,3 em três

diferentes concentrações... 60 Tabela 26 - Resultados do parâmetro de exatidão para a GTX 2,3 e dc-GTX 2,3 em

seis diferentes concentrações... 60 Tabela 27 - Valores de efeitos obtidos a partir dos resultados de área do pico de acordo

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AOAC Association of Official Analytical Communities ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária CAGECE Companhia de Água e Esgoto do Ceará

CLAE-FLD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de Fluorescência

C Carbono

CE Comissão Européia

CEFAS Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science COGERH Companhia de Gestão dos Recursos Hídricos

CV Coeficiente de Variação dc-GTX Decarbamoil-Goniautoxina dc-STX Decarbamoil-Saxitoxina

DEHA Departamento de Engenharia Hidráulica e Ambiental DP Desvio Padrão

DPR Desvio Padrão Relativo ELISA Enzime-Linked Sorbent Assay ETA Estação de Tratamento de Água FLD Detector de Fluorescência FUNASA Fundação Nacional de Saúde GECOQ Gerência de Controle de Qualidade GTX Goniautoxina

HCl Ácido Clorídrico

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normatização e Qualidade Industrial IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LD Limite de Detecção

LDE Limite de Detecção do Equipamento LQ Limite de Quantificação

MBA Mouse bioassay

MRC Material de Referência Certificado MS Ministério da Saúde

Na Sódio

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NEO Neosaxitoxina

NSSP National Shellfish Sanitation Program PSP Paralytic Shellfish Poison

OMS Organização Mundial da Saúde

PE Pernambuco

PI Padrão Interno

pH Potencial Hidrogeniônico Ppb Partes por Bilhão

r Coeficiente de Correlação

SELAQUA Seção Laboratorial de Qualidade de Água STX Saxitoxina

Tr Tempo de Retenção

UFC Universidade Federal do Ceará

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Sumário

1. INTRODUÇÃO ... 15 2. OBJETIVOS ... 17 2.1 Objetivo Geral ... 17 2.2 Objetivos Específicos ... 17 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19 3.1 Eutrofização e Cianobatérias ... 19 3.2 Cianotoxinas ... 21 3.3 Legislação ... 23

3.4 Métodos de Detecção de cianotoxinas... 24

3.4.1 Bioensaios ... 25

3.4.2 Imuno-Ensaios (ELISA) ... 26

3.4.3 Técnicas Cromatográficas (CLAE) ... 27

3.5 Validação da metodologia analítica ... 30

3.5.1 Especificidade e Seletividade ... 30

3.5.2 Estabilidade ... 31

3.5.3 Linearidade ... 32

3.5.4 Faixa de Trabalho ... 33

3.5.5 Limites de Detecção e Quantificação ... 34

3.5.6 Precisão ... 35

3.5.7 Exatidão ... 36

3.5.8 Robustez ... 37

4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 39

4.1 Padrões, solução estoque 1, Solução de trabalho MIX e Reagentes ... 39

4.2 Obtenção e preparo da matriz ... 41

4.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Condições Cromatográficas ... 43

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4.4.1 Seletividade ... 45

4.4.2 Estabilidade da solução de trabalho MIX ... 46

4.4.3 Linearidade e Faixa de Trabalho ... 46

4.4.4 Limites de Detecção e Quantificação ... 47

4.4.6 Robustez ... 50 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 53 5.1 N-sulfocarbamoil-goniautoxina - C 1,2 ... 53 5.2 Gonautoxina 2,3 - GTX 2,3 e Decarbamoil-goniautoxina 2,3 - dc-GTX 2,3 ... 55 5.2.1 Estabilidade da Toxina ... 55 5.2.2 Validação do Método ... 56 5.2.2.1 Seletividade ... 56

5.2.2.2 Linearidade e faixa de trabalho ... 58

5.2.2.3 Limites de Detecção e Quantificação ... 59

5.2.2.4 Precisão e Exatidão ... 60

5.2.2.5 Robustez ... 61

6. CONCLUSÕES ... 63

7. RECOMENDAÇÕES ... 65

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1. INTRODUÇÃO

O destino de esgotos sem tratamento adequado em mananciais proporciona mudanças na qualidade da água tendo como consequências fenômenos indesejáveis, como a eutrofização. A eutrofização é considerada a principal causa da ocorrência de florações de cianobactérias devido ao enriquecimento das águas com nutrientes, principalmente nitrogênio e fósforo, provenientes de esgotos urbanos, efluentes provenientes de atividades agropastoris e industriais. Além disso, pH neutro a alcalino e temperaturas acima de 20 ºC também favorecem a ocorrência de florações nos ecossistemas aquáticos (CHORUS; BARTRAM, 1999). Segundo a COGERH (2008), 61% dos 126 açudes cearenses avaliados apresentaram-se eutrofizados com 10% acima dos valores de eutrofização.

As Cianobactérias, também conhecidas como cianofíceas ou algas azuis, são microrganismos procarióticos, uni ou pluricelulares. Sua ocorrência em mananciais de abastecimento representa perigo à saúde pública, pois estes microorganismos são responsáveis pela produção e liberação de toxinas em reservatórios de abastecimento público. As cianotoxinas, quando em excesso, causam intoxicações em seres humanos e em animais pela ingestão ou contato com água contendo a toxina e pelo consumo de peixes contaminados (BARROS, 2013).

O estudo das cianobactérias tem sido amplamente difundido e intensificado após a ocorrência de vários acidentes relacionados a intoxicações fatais com cianotoxinas. Um exemplo desses acidentes ocorreu em 1996, em uma clínica de hemodiálise em Caruaru (PE). Através da utilização da água contaminada por cianobactérias, especificamente cilindrospermopsinas e microcistinas, 61 pacientes faleceram após as sessões de hemodiálise nas quais eram submetidos (AZEVEDO, 1996). Assim, as autoridades sanitárias do país deram mais atenção à questão que se tornou um grande problema para a saúde pública, culminando com a sua inclusão na legislação que trata da potabilidade da água, como parâmetro de controle (FUNASA, 2003).

A comunidade fitoplanctônica nos reservatórios cearenses estudados apresentou dominância de cianobactérias em aproximadamente 90% da biomassa total. Em todos os açudes desse estado, à exceção do açude Cedro, a espécie Cylindrospermopsis raciborskii esteve presente em mais de 70% das amostras coletadas durante o estudo (BARROS, 2013). No reservatório Sítios Novos no Ceará, organismos fitoplanctônicos foram identificados, isolados e tiveram sua toxicidade avaliada. Esses organismos mostraram-se potenciais produtores de

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toxinas do grupo Saxitoxinas: STX e dcSXT para Cylindrospermopsis raciborskii e dcGTX para Planktothrix agardhii (LOPES, 2013).

Os métodos laboratoriais usados para detecção e identificação das toxinas presentes na água variam em grau de sofisticação e informações que fornecem. Dentre os mais utilizados estão o bioensaio, o teste ELISA (Enzime Linked Sorbent Assay) e CLAE-FLD (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por fluorescência). Apesar de serem métodos eficientes e rápidos, o teste ELISA e o bioensaio são pouco seletivos, não conseguindo identificar variantes de toxinas nem a quantidade exata das mesmas.

O mapeamento de toxinas comumente encontradas numa determinada localidade e a identificação com precisão das variantes de toxinas na amostra são importantes para otimização de tratamentos em contaminações posteriores. Portanto, a implantação de uma técnica que permita isolar, identificar e quantificar de forma rápida e precisa é fundamental para o monitoramento dessas substâncias e para a segurança da população abastecida.

O método proposto para detecção de cianotoxinas em amostras ambientais é a CLAE-FLD. Este método se constitui numa importante ferramenta de análise cujo propósito central é separação e identificação mais eficiente dos componentes da amostra.

A condição para que o método analítico proposto seja reconhecido internacionalmente, é a realização da validação para garantir que este método seja aceito em conformidade com as exigências legais ou com o fim proposto pelo método analítico (BARROS, 2002).

Segundo Lanças (2009), os parâmetros analíticos para validação são alterados de acordo com a finalidade da aplicação e estes são: seletividade, estabilidade, linearidade e faixa de aplicação, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez.

A partir da constatação da presença de cianotoxinas em vários reservatórios de abastecimento humano da região cearense pela CAGECE e COGERH (BARROS, 2013), é importante a análise das cianotoxinas na água destinada ao abastecimento da população, ou seja, água tratada via filtração direta.

Diante das dificuldades apresentadas pelos métodos de detecção atuais, os quais são demorados, imprecisos e onerosos, este trabalho tem como fim a validação da metodologia de detecção e quantificação das cianotoxinas Goniautoxina 2,3 (GXT 2,3), Decarbamoil-goniautoxina 2,3 (dc-GTX 2,3) e N-sulfocarbamoil-Decarbamoil-goniautoxina 2,3 (C 1,2) por CLAE-FLD via derivatização pré-coluna utilizando como matriz água tratada para abastecimento humano.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Proposta e validação de uma metodologia analítica para identificação, quantificação e análise de estabilidade de cianotoxinas em amostras de água tratada para abastecimento.

2.2 Objetivos Específicos

Identificação, quantificação e avaliação da estabilidade com o tempo das toxinas – Goniautoxina 2,3 (GXT 2,3), Decarbamoil-goniautoxina 2,3 (dc-GTX 2,3) e N-sulfocarbamoil-goniautoxina-2,3 (C 1,2) – por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por fluorescência (CLAE-FLD) via derivatização pré-coluna.

Validação do método analítico segundo os parâmetros seletividade, linearidade, faixa de trabalho, limites de detecção e quantificação, precisão, exatidão e robustez da resolução 899 de 23 de maio de 2003 da Anvisa.

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3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Eutrofização e Cianobatérias

A eutrofização é um dos fatores de degradação da qualidade das águas de rios e lagos e reconhecida como problema de poluição desde o início do século XX (CHORUS; BARTRAN, 1999). Constitui-se na multiplicação de plantas aquáticas, algas e cianobactérias, a níveis que interfiram na utilização da água para outros fins (VON SPERLING, 1996). Além das florações de plantas aquáticas, outros fatores indesejáveis provocados pela eutrofização são: proliferação de insetos, crescente mortalidade de peixes e consequentemente, maus odores.

As florações de cianobactérias são causadas pelo excesso de nutrientes, como nitrogênio e fósforo, oriundos de processos naturais e artificiais. Os processos naturais, lentos e contínuos, ocorrem pelo arraste dos nutrientes presentes no solo através das águas pluviais e superficiais. Os processos artificiais são acelerados e estão relacionados à industrialização, à ocupação desorganizada dos solos, ao lançamento de efluentes domésticos e ao uso inadequado de fertilizantes químicos na agricultura (ANTUNES, 2013).

As Cianobactérias são microrganismos procarióticos, uni ou pluricelulares, aeróbios, com reprodução assexuada e que utilizam a fotossíntese como modo de obtenção de energia para seu metabolismo. Recebem também a denominação “Algas Azuis” devido a presença do pigmento azulado ficocianina (OLIVEIRA; MOLICA, 2003).

A presença de pigmentos do tipo clorofila-a e a fotossíntese aeróbia aproximam as cianobactérias das algas e a estrutura procariótica e parede celular aproximam esses microorganismos das bactérias. Assim, é comum a referência destes microrganismos como microalgas cianofíceas (YOO et al., 1995).

O excesso desses microrganismos na água gera consequências negativas sobre a eficiência e custo de tratamento da água principalmente quando está relacionado a mananciais de abastecimento público (BARROS, 2013). Porém, a grande preocupação está relacionada com a produção e liberação de cianotoxinas por esses microorganismos.

As cianotoxinas podem ser produzidas e liberadas em qualquer estágio de crescimento celular das cianobactérias e, quando estas toxinas estão em excesso em reservatórios e mananciais, apresentam perigo à saúde pública, podendo causar intoxicações em seres humanos e em animais. Vários fatores como a carga de nutrientes, o tempo de retenção

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da água, a estratificação e a temperatura são fatores que influenciam na formação e crescimento das cianobactérias.

No Brasil, os reservatórios de água para abastecimentos apresentam condições necessárias para o desenvolvimento destes microorganismos durante todo o ano e por isso são necessárias medidas preventivas para controlar esta situação (FUNASA, 2003).

Segundo Sant’anna e Azevedo (2002), 20 espécies de cianobactérias tóxicas, no mínimo, já foram registradas, incluídas em 14 gêneros, em diferentes ambientes aquáticos brasileiros. De acordo com esses autores, a espécie Microcystis aeruginosa apresenta a distribuição mais ampla no Brasil e Anabaena é o gênero com o maior número de espécies potencialmente tóxicas (A. circinalis, A. flos-aquae, A. planctonica, A. solitaria e A. spiroides).

A comunidade fitoplanctônica nos reservatórios estudados no Ceará apresentou dominância de cianobactérias em aproximadamente 90% da biomassa total. Em todos os açudes desse estado, à exceção do açude Cedro, a presença de Cylindrospermopsis raciborskii foi maior que 70% das amostras coletadas durante o estudo (BARROS, 2013). No reservatório Sítios Novos no Ceará, organismos fitoplanctônicos foram identificadas, isoladas e tiveram sua toxicidade avaliada. Esses organismos se mostraram potenciais produtoras de toxinas causadoras de toxinas do grupo Saxitoxinas: STX e dcSXT para C. raciborskii e dcGTX para Planktothrix agardhii (LOPES, 2013).

A Figura 1 mostra a classificação dos mananciais utilizados pela CAGECE para abastecimento público no Ceará segundo os riscos oferecidos devido à densidade de cianobactérias, em 2010.

Figura 1 - Mananciais do Ceará classificados pelos riscos oferecidos

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3.2 Cianotoxinas

As cianotoxinas são metabólitos secundários produzidos pelas cianobactérias, e apresentam estrutura química e propriedades toxicológicas diversificadas (SIVONEN; JONES, 1999).

As cianotoxinas afetam a saúde humana de duas formas: através do contato direto com a pele ou através da ingestão de água ou alimentos contaminados. São classificadas pelo modo de ação, em: neurotoxinas (anatoxina-a, anatoxina-a(S), saxitoxinas (Paralytic Shellfish Poisoning – PSP)), hepatotoxinas (microscistinas, nodularina, cilindrospermopsina) e endotoxinas ou dermatotoxinas (lipopolissacarideos, lingbiatoxinas e aplisiatoxinas). (MONDARDO, 2009).

Os efeitos da contaminação com essas cianotoxinas variam de acordo com o tempo de ação de cada uma. As toxinas, que apresentam ação rápida ao entrarem em contato com o animal, causam a morte por parada respiratória após poucos minutos de contato. Estas são classificadas como alcaloides ou organofosforados neurotóxicos. As toxinas que atuam menos rapidamente são identificadas como peptídeos ou alcalóides hepatotóxicos. (FUNASA, 2003).

Cada espécie de cianobactéria pode produzir diferentes cianotoxinas ao mesmo tempo, mas alguns destes microorganismos produzem uma determinada toxina que caracterizará cada cepa.

As toxinas são produzidas dentro das células durante toda a fase de crescimento celular e são liberadas com o rompimento da célula, chamada “lise celular”. Isto acontece pela utilização de algicidas ou quando a célula está na fase senescente da floração (MONDARDO, 2009). As condições do meio aquoso, como pH e temperatura da água, podem favorecer ou não a existência dessas toxinas por dias ou até semanas (CHORUS; BARTRAM, 1999).

As toxinas PSP (do inglês, Paralytic Shellfish Poison) recebem a denominação de Saxitoxinas devido a presença neste grupo da toxina de elevada toxicidade e estabilidade, a STX (Saxitoxina), daí a mesma denominação para o grupo. São também produzidas por dinoflagelados dos gêneros Alexandrium, Gymnodinium e Pyrodinium em ambientes marinhos e de água doce (HARA et al., 2013). São chamadas “paralisantes” pelos efeitos que produzem no sistema nervoso em seres humanos ou animais por elas contaminados.

O grupo saxitoxina é formado por três subgrupos: Carbamato, N-sulfocarbamoil e decarbamoil. As toxinas do subgrupo carbamato são as mais potentes e dentre elas estão a Saxitoxina (STX), a Neo-saxitoxina (NEO) e a Goniautoxina (GTX1-4) (HARA et al., 2013).

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As saxitoxinas interferem na comunicação nervosa entre os neurônios e as células musculares, bloqueando os canais de sódio. Os sinais clínicos são principalmente tontura, adormecimento da boca e de extremidades, fraqueza muscular, náusea, vômito e sede. Os sintomas começam 5 minutos após a ingestão e a morte pode ocorrer entre 2 a 12 horas e em casos de intoxicação com dose não letal, os sintomas desaparecem de 1 a 6 dias (CARMICHAEL, 1994). Até o momento, nenhuma medicação foi aprovada para uso no caso de intoxicação por saxitoxinas, apenas para o tratamento sintomático, o que torna relevante a prevenção da intoxicação pelo monitoramento da presença de algas tóxicas (CUNHA, 2004).

O grupamento comum às saxitoxinas é uma estrutura tricíclica composta por uma tetrahidropurina ligada a dois grupos guanidínicos que possuem diferentes grupamentos característicos para cada subgrupo.Os componentes e as estruturas químicas de cada subgrupo das saxitoxinas estão listados na Tabela 1.

Tabela 1 - Estruturas Químicas das toxinas do grupo Saxitoxina Toxinas Carbamato Toxinas N-Sulfocarbamoil Toxinas Decarbamoil R1 R2 R3 R4 -H -H -H STXa GTXb dc-STXc -H -H -OSO3- GTX2 C1 dc-GTX2 -H -OSO3- -H GTX3 C2 dc-GTX3

-OH -H -H NEOd GTX6 dc-NEO

-OH -H -OSO3- GTX1 C3 dc-GTX1

-OH -OSO3- -H GTX4 C4

Fonte: LAWRENCE; NIEDZWIADEK (2001)

Nota: aSTX – Saxitoxina; bGTX – Goniautoxinas; cdc-STX – Decarbamoilsaxitoxinas; dNEO – Neosaxitoxinas

O isolamento de saxitoxinas começou há mais de um século e o desenvolvimento inicial das pesquisas foi lento. Essas toxinas são estáveis em condições ácidas, com a exceção dos componentes do grupo N – sulfocarbamoil, no entanto são instáveis e facilmente oxidadas sob condições alcalinas (MONS et al., 1998).

(27)

3.2.1 Goniautoxinas

Gonyautoxin 2 (GTX 2) (Figura 2) e Gonyautoxin 3 (GTX 3) são as toxinas mais abundantes nas amostras de extratos de moluscos, estando presentes em 75-85% do total na maioria das amostras analisadas (ANDRINOLO et al., 2002). Estas toxinas apresentam peso molecular de aproximadamente 396,36 g.mol-1, são altamente tóxicas e com estrutura molecular complexa. Dentre os vários isômeros de Goniautoxinas, a GTX 2,3 é o principal componente presente em mariscos nas zonas costeiras ao sul da China e ao longo da costa leste da América do Norte (ZHANG et al., 2013).

Figura 2 - Estrutura Química Goniautoxina 2 (GTX 2)

3.3 Legislação

Os sintomas de envenenamento por parte das principais cianobactérias em reservatórios de água potável se sobrepõem com uma série de outras doenças gastrointestinais, em grande parte, causadas por organismos causadores de doenças infecciosas. Ou seja, durante um surto de doença entérica, as bactérias e os protozoários são investigados em primeiro lugar, como a causa mais provável, e somente após a exploração exaustiva para detecção da causa, as toxinas são avaliadas. As primeiras suspeitas da contaminação são os produtos químicos agrícolas e poluentes industriais, depois os metais pesados, e por fim, as cianotoxinas (FALCONER; HUMPAGE, 2005).

Com o surgimento de dados epidemiológicos de intoxicação humana a partir de água de reservatórios de água potável, o estudo das cianobactérias e dos efeitos causados pelas suas toxinas tem sido amplamente difundido e intensificado. Depois do acidente ocorrido em uma clínica de hemodiálise na cidade de Caruaru-PE, em 1996, as autoridades sanitárias brasileiras deram mais atenção à questão que se tornou um grande problema para a saúde pública, culminando com a sua inclusão na legislação que trata da potabilidade da água, como parâmetro de controle (FUNASA, 2003).

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24

A portaria de potabilidade do Ministério da Saúde do Brasil (2914/2011) (BRASIL, 2011b) afirma que os riscos de contaminação da água para consumo humano com cianotoxinas devem ser minimizados com a realização do monitoramento de cianobactérias no ponto de captação do manancial superficial, identificando os diferentes gêneros e considerando, para efeito de alteração da frequência de monitoramento, o resultado da última amostragem. Quando à densidade de cianobactérias exceder 20000 células mL-1, deve-se realizar análise de

cianotoxinas na água do manancial, no ponto de captação, com frequência semanal (BRASIL, 2011b). As concentrações de cianotoxinas não podem ultrapassar os valores máximos permitidos para água tratada pela legislação dos limites de concentração para a microcistina e para a saxitoxina na Tabela 2.

Tabela 2 - Tabela dos limites de concentração máximos permitidos para cianotoxinas na água

para consumo humano

Parâmetro Unidade VMP*

Microcistinas µg L-1 1,0

Saxitoxinas μg equivalente STX.L-1 3,0

VMP*: Valor máximo permitido

3.4 Métodos de Detecção de cianotoxinas

Os métodos de detecção usados para identificar e quantificar as toxinas presentes na água variam em grau de sofisticação e informações que fornecem. Técnicas analíticas bastante sofisticadas podem ser empregadas para determinar precisamente a identificação e quantificação de toxinas presentes na água. Os critérios da seletividade e sensibilidade são importantes para a escolha do método (CHORUS; BARTRAM, 1999). A Figura 3 relaciona as técnicas analíticas com a seletividade vs. sensibilidade.

(29)

Figura 3 - Relação entre a sensibilidade e seletividade de métodos analíticos para identificação

e quantificação de cianotoxinas

Fonte: Chorus; Bartram (1999).

Nota: NMR – Ressonância Magnética Nuclear, MMPB – Detecção por GC/MS e LC ou LC/MS, MS – Espectrometria de Massa, LC/MS - Cromatografia Líquida acoplada ao espectrômetro de massas, TLC – Cromatografia de Camada Fina, CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiencia

As técnicas mais utilizadas pelas companhias de abastecimento para análise de cianotoxinas na água são: o bioensaio (alta seletividade, porém com baixa sensibilidade, de acordo com a Figura 2) e o teste ELISA (alta sensibilidade, porém com baixa seletividade, de acordo com a Figura 2). Essas duas técnicas demandam de muito tempo para serem executadas, além de não identificar todas as toxinas e não obter a quantidade exata das mesmas. Assim, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência pode ser a técnica mais viável para identificar e quantificar as toxinas, visto que, dependendo do detector utilizado, apresenta alta seletividade e sensibilidade.

3.4.1 Bioensaios

O método de bioensaio foi desenvolvido há mais de meio século atrás e foi utilizado como padrão pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para obtenção de medições precisas e rápidas das cianotoxinas.

(30)

26

Figura 4 - Método de Bioensaio em camundongos

Este método consiste na injeção intraperitonial (i.p.) de uma amostra contendo cianotoxina extracelular em camundongos, geralmente da espécie Mus Musculus (Figura 4). O animal permanece em observação por até sete dias. Neste período, observa-se o tempo necessário para a morte do animal e os sintomas manifestados. Depois do período de observação, é realizada uma autópsia no tecido e órgãos do animal e com os resultados obtidos a cianotoxina é identificada (SILVINO, 2014).

O bioensaio é um método simples de baixo custo pois não necessita de equipamentos sofisticados para sua execução, possibilita a aquisição de importantes informações sobre a toxicidade de uma cianotoxina. Diante dessas vantagens, o bioensaio em camundongos tem sido o método oficial na maioria dos países que regulam saxitoxinas em frutos do mar. No entanto, este método apresenta desvantagens de não distinguir entre diferenças na toxicidade entre cianotoxinas com pequenas diferenças em suas estruturas, necessitando de outras técnicas qualitativas e quantitativas associadas (ANTUNES, 2013). Além disso, a relação não linear entre o tempo de morte dos camundongos e os níveis de toxina e a oposição de muitos pesquisadores pelo grande sacrifício de animais são algumas das dificuldades na implantação do bioensaio como método utilizado para detecção.

3.4.2 Imuno-Ensaios (ELISA)

O método ELISA (Enzime Linked Sorbent Assay) baseia-se na detecção de cianotoxinas, principalmente microcistinas e nodularinas, por testes imunoensaios competitivos desenvolvidos a partir de anticorpos monoclonais e policlonais (CHORUS; BARTRAM, 1999). Este método apresenta como vantagens a sensibilidade às reações bioquímicas, além do fácil manuseio e possibilidade de realizar análise de várias amostras ao mesmo tempo.

Baseado em uma reação imuno-enzimática inversamente proporcional à concentração da toxina, este teste reporta valores de concentração total de microcistinas e nodularinas de uma amostra, eliminando a necessidade de uma ampla faixa de padrões analíticos (ANTUNES, 2013). O manuseio fácil e rápido, na forma de kits disponíveis

(31)

comercialmente, permite a sua aplicação com o mínimo de treinamento técnico e simples processamento da amostra. Além disso, as análises são de alto desempenho, com sensibilidade de detecção na faixa de ppb (μg.L-1) (RAPALA et al., 2002).

O método ELISA determina a concentração total da toxina, sem a distinção das diferentes variantes. Por isso, o resultado da análise deve ser complementado por métodos cromatográficos de forma a identificar com mais precisão pequenas quantidades de toxina. Outra desvantagem é que o método ELISA é uma técnica de custo elevado, inviabilizando a sua aplicação na avaliação da qualidade de águas em muitas situações.

3.4.3 Técnicas Cromatográficas (CLAE)

Segundo Lanças (2009), a Cromatografia é a técnica de separação na qual os componentes a serem separados para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura, são distribuídos em fase estacionária e fase móvel. A fase estacionária é fixa e apresenta grande área superficial e a fase móvel é um fluido que passa através da fase estacionária.

A classificação das técnicas cromatográficas varia quanto ao mecanismo de separação, à técnica empregada e ao tipo de fase móvel utilizada.

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou em inglês HPLC, High Performance Liquid Chromatography) é um método físico-químico para a separação dos compostos de interesse em uma mistura com resolução, eficiência e detectabilidade. Como fase estacionária são utilizadas colunas recheadas com resinas específicas, e as fases móveis são eluídas sob pressão.

As vantagens da CLAE são menor tempo de análise, alta resolução, resultados quantitativos, boa sensibilidade, versatilidade e automação. As desvantagens são alto custo na instrumentação e operação, pouco utilizada para análises qualitativas, falta de detector universal sensível e necessidade de experiência dos operadores (HARADA et al., 1999)

Os recheios das colunas utilizadas na CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos: Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos, partículas porosas ou peliculares, partículas esféricas ou irregulares e partículas com diferentes diâmetros.

Os detectores comumente utilizados são os de fluorescência, eletroquímico e índice de refração. Para o caso da saxitoxinas, o método para análise mais comumente empregado é o da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) de fase reversa com detector de fluorescência (FLD) (OSHIMA et al., 1995).

(32)

28

Neste método as toxinas são derivatizadas em substâncias fluorescentes antes da separação (Derivatização pré-coluna), método validado por Lawrence e Niedzwiadek (2001), ou após a separação (Derivatização pós-coluna), método validado por Oshima (1995).

Os métodos de derivatização pré e pós-coluna são comparados na Tabela 3, segundo Degrasse et al. (2011), com relação aos requisitos de instrumentação, facilidade cromatográfica para configuração, capacidade de separar as toxinas individuais, a interpretação dos dados, os perfis de toxinas esperados, a sensibilidade, a comparação com o MBA, o método de aceitação e implementação.

Tabela 3 - Quadro comparativo entre os métodos de derivatização pré e pós-coluna

Parâmetros Derivatização

Pré-coluna Pós-coluna

Instrumentação Extração com cartucho C18 Adição de equipamentos para a oxidação da toxina Nível de experiência e formação do operador Operador qualificado, especialmente para processamento de dados

Operador com conhecimento moderado

Configurações cromatográficas

Fácil configuração Moderada

Tempo de corrida 15 minutos 25 minutos

Aplicabilidade Para todas as toxinas comercializadas.

Para todas as toxinas comercializadas, exceto para

dc-NEO e GTX6 Interpretação dos dados Difícil. Várias PSPs têm

múltiplos produtos de reação da oxidação e algumas até têm os mesmos produtos de

reação

Simples

Comparação com bioensaio

Ótima correlação Boa correlação Aceitação do métodoa AOAC; CE (Off. J. Eur.

Commun.)

NSSP; AOAC em andamento Fonte: Modificado de DEGRASSE et al. (2011)

Segundo Lawrence e Niedzwiadek (2001), a derivatização pré-coluna é utilizada nos laboratórios para a determinação de saxitoxinas há quase 10 anos e isto deve-se a abrangência do método e da ótima correlação deste quando comparado com outros métodos.

(33)

A oxidação pode ser feita de duas formas: Oxidação com periodato e Oxidação com peróxido. Na Figura 5, mostra-se o comportamento das toxinas diante desses reagentes e os respectivos produtos formados após as oxidações com periodato e peróxido.

Figura 5 - Quadro comparativo do comportamento das saxitoxinas após oxidação com

periodato e peróxido

Fonte: Lawrence e Niedzwiadek et al. (2001)

Lawrence et al. (1995) utilizou em seus ensaios, a derivatização pré-coluna com periodato e peróxido de hidrogênio para a oxidação das amostras em condições alcalinas, e obteve uma correlação razoável (0,90) ao longo de uma gama de concentração de 40-500 microgramas/100 g (equivalentes saxitoxina) em comparação com bioensaios em camundongos.

A oxidação das cianotoxinas GTX 2,3 e dc-GTX 2,3 com peróxido de hidrogênio apresentam dois produtos de reação. Dos dois produtos de reação obtidos da dc-GTX 2,3, um era o mesmo produto principal obtido com GTX 1,4 após a oxidação com periodato (LAWRENCE et al., 1996)

(34)

30

3.5 Validação da metodologia analítica

Vários métodos analíticos são executados diariamente em laboratórios e para que os resultados obtidos sejam reconhecidos internacionalmente, uma estrutura internacional de medições deve ser implementada. Assim, normas internacionais, nacionais e sistemas de qualidade destacam a importância da validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de validação, para a obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso pretendido (BARROS, 2002).

A validação garantirá que a metodologia analítica seja exata e aceita em conformidade com as exigências legais ou com o fim proposto pelo método analítico. No Brasil, o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, INMETRO e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, ANVISA, disponibilizam guias para a validação de métodos analíticos. Estas guias são o documento DOQ-CGCRE-008 do INMETRO (BRASIL 2003b) e a Resolução ANVISA nº 899 (RIBANI et al., 2004).

A validação é um processo dinâmico e constante e este é constituído das fases de seleção, desenvolvimento e otimização do método, qualificação dos instrumentos, materiais e pessoal e experimentos e transferência do método. Um processo de validação bem definido e documentado evidencia de forma objetiva que o sistema e o método são adequados ao uso pretendido (BARROS, 2002).

A resolução da Anvisa é o guia mais adequado para a validação de técnicas cromatográficas para cianotoxinas, pois descreve uma metodologia que se aplica às técnicas analíticas diretamente associadas às políticas de proteção de saúde pública (ANTUNES, 2013). Segundo Lanças (2009), os parâmetros analíticos são alterados de acordo com a finalidade da aplicação. Os parâmetros analíticos para validação de métodos analíticos são: seletividade, linearidade e faixa de aplicação, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez.

3.5.1 Especificidade e Seletividade

A especificidade e a seletividade estão relacionadas a detecção do analito e esta pode ser influenciada por outros componentes. A diferença entre um método específico e

(35)

seletivo é que o primeiro produz resposta para apenas um analito e o segundo produz respostas para vários analitos, mas distingue a resposta de um analito dentre outros (MARTINS, 2013).

A seletividade é a capacidade que o método possui de medir um composto na presença de outros compostos, impurezas, produtos de degradação e componentes existentes na matriz (ARAGÃO et al., 2009).

Uma vez definidos e monitorados os interferentes de metabólitos e produtos de degradação, a etapa seguinte seria avaliação de interferentes não monitorados oriundos da matriz que afetam a detecção dos compostos de interesse, comprometendo a eficiência do método e caracterizando assim o efeito matriz (BARROS, 2002). O efeito matriz deve ser avaliado durante a validação de metodologias analíticas, pois é alvo de especulação em alguns métodos de identificação e quantificação, tais como: HPLC/FLU, HPLC/UV, HPLC/EC e HPLC-MS/MS (CASSIANO et al., 2009).

A seletividade é um importante parâmetro a ser investigado pois ela garante que a resposta obtida no método seja do composto de interesse. Assim, a seletividade é o primeiro parâmetro a ser realizado numa validação de método, pois se este não for assegurado, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão comprometidas (RIBANI et al., 2004).

Segundo Ribani et al (2004), a seletividade pode ser obtida a partir da comparação da matriz isenta do composto de interesse e da matriz adicionada com este composto, da comparação do espectro obtidos de diferentes detectores com o do padrão do composto de interesse e para matriz não isenta do composto de interesse, a comparação de duas curvas analíticas, sendo uma através da adição do composto de interesse na matriz e a outra sem a presença da matriz. Nesta última opção, o método é seletivo, se as curvas forem paralelas.

3.5.2 Estabilidade

Conforme Lanças (2009), a estabilidade refere-se ao tempo em que as soluções padrão contendo o composto de interesse podem ser utilizadas sem que haja reações de degradação. É medida analisando-se uma solução contendo o composto de interesse durante um certo período de tempo e nas mesmas condições nas quais é armazenada no laboratório.

A avaliação da estabilidade das solução-padrão é realizada em uma única concentração e, no mínimo, em duplicata (CASSIANO et al.,2009). Os valores para a estabilidade são avaliados quando o desvio padrão relativo, calculado a partir dos resultados obtidos, não exceder mais de 20% do valor da precisão do sistema (LANÇAS, 2009).

(36)

32

A estabilidade das soluções padrão da substância de interesse deve ser demonstrada sempre que não houver referências dos prazos de validade (BRASIL, 2011a).

3.5.3 Linearidade

A linearidade é o parâmetro que fornece resultados diretamente proporcionais à concentração do composto de interesse dentro de uma faixa de aplicação. Pode ser determinada por uma relação matemática entre a resposta obtida pelo método e a concentração ou massa do composto expressa pela Equação 1,

b x a y .  (1) onde: y = Resposta do método x = Concentração

a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade; b = interseção com o eixo y, quando x=0.

Esta relação matemática é expressa pela equação de reta chamada curva de calibração. Os coeficientes a e b da curva analítica são estimados a partir do método matemático conhecido como regressão linear. Além destes, calcula-se o coeficiente de correlação r, que permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximos de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados (RIBANI et al., 2004). A Anvisa recomenda um coeficiente de correlação (r) igual ou superior a 0,99.

Juntamente aos pontos para a curva de calibração, deve-se realizar a análise da amostra branco e da matriz isenta do analito, ou seja, a amostra zero (CASSIANO et al., 2009). Segundo Lanças (2009), algumas regras devem ser adotadas para a determinação da seletividade:

 O número mínimo de pontos aceitos são cinco. Os limites superior e inferior devem ser mantidos.

 As concentrações devem ser escolhidas na faixa de 50% a 150% do valor esperado na amostra em estudo.

 Os gráficos devem ser elaborados juntamente com a equação da reta, a análise de regressão e os dados de correlação e determinação.

(37)

O composto de interesse pode ser quantificado através dos seguintes métodos: Padronização externa e interna, adição de padrão e superposição de matriz (RIBANI et al, 2004). A padronização externa é utilizada para amostras que não necessitam de pré-tratamento e os padrões para calibração são obtidos pela adição de concentrações conhecidas do analito na matriz. A padronização interna é utilizada para análises em matrizes biológicas, quando não se trabalha com injeção direta de amostras e na preparação dos padrões de calibração com diferentes concentrações do analito, adiciona-se uma concentração fixa do padrão interno (PI). A padronização por adição de padrão é utilizada quando a matriz não é isenta do analito e consiste na adição de diferentes concentrações do analito à matriz, que já contém uma quantidade desconhecida do mesmo (CASSIANO et al., 2009). A superposição de matriz é utilizada para compensar o efeito de matriz ou de possíveis interferentes e consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar à da amostra, isenta da substância (RIBANI et al., 2004).

3.5.4 Faixa de Trabalho

A Faixa de Trabalho é definida como uma faixa de concentrações do composto de interesse na qual o método é aplicado. No limite inferior da faixa de concentração, os fatores limitantes são os valores dos limites de detecção e de quantificação. No limite superior, os fatores limitantes dependem do sistema de resposta do equipamento de medição (INMETRO, 2010). A determinação da Faixa de trabalho deve possibilitar a determinação da precisão, exatidão e linearidade exigidas (MARTINS, 2013).

A escolha da faixa de trabalho está correlacionada a concentração mais esperada da amostra e essa “concentração alvo” deve estar aproximadamente no centro deste intervalo. Os valores medidos próximos ao limite inferior da faixa de trabalho devem ser distinguidos dos brancos dos métodos e deve ser igual ou maior do que o limite de detecção do método (INMETRO, 2010)

A faixa de trabalho deve ser elaborada a partir de vários pontos de calibração. As diretrizes da Anvisa especifica um mínimo de cinco níveis de concentração que devem ser injetadas em ordem crescente de concentração, no mínimo três vezes cada, com estimativa do desvio padrão relativo (DPR) entre as injeções inferior a 5%. A IUPAC recomenda seis ou mais níveis de concentração (RIBANI et al., 2004).

(38)

34

3.5.5 Limites de Detecção e Quantificação

Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito, as determinações dos parâmetros Limite de Detecção (LD) e do Limite de Quantificação (LQ) tornam-se ainda mais relevantes para a validação do método (ANTUNES, 2013).

O Limite de Detecção é definido como a menor concentração do composto de interesse na amostra, que pode ser detectada, mas não quantificada, sob condições experimentais (RIBANI et al., 2004). O Limite de Quantificação é definido como a menor concentração do composto de interesse que pode ser quantificada com precisão e exatidão sob determinadas condições experimentais (BARROS, 2002).

Segundo Ribani et al. (2004), o LD pode ser determinado de três formas diferentes: o método visual, o método sinal-ruído e o método baseado em parâmetros da curva.

 Método visual: Utilizado para a detecção do LD utilizando a matriz adicionando as menores concentrações visíveis do composto de interesse.

 Método sinal-ruído: Utilizado em procedimentos analíticos que mostram o ruído da linha de base. Compara-se o sinal de amostras com as menores concentrações do composto conhecidas na matriz e a matriz isenta do composto de interesse. A relação sinal-ruído apropriada é 3:1 ou 2:1.

 Método baseado em parâmetros da curva analítica: Utilizando parâmetros da curva analítica, o LD é expresso pela Equação 2.

S

s

LD

3

,

3

(2) onde s é a estimativa do desvio padrão da resposta, que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação e S é o coeficiente angular da curva analítica.

O LQ pode ser determinado utilizando os mesmos métodos adotados para o LD, mas a relação sinal/ruído para este é de 10:1 e a equação que determina o LQ utilizando os parâmetros da curva analítica é expressa na Equação 3 (LANÇAS, 2009).

S

s

(39)

O LQ está relacionado com a precisão e exatidão, portanto se o nível de concentração do LQ decresce, a medição torna-se menos precisa e vice-versa. Para as técnicas cromatográficas e eletroforéticas, segundo Ribani et al. (2004), o método do sinal-ruído não é trivial, pois a curva analítica é construída com as áreas dos picos obtidos e não somente com o sinal do detector.

Em ensaios cromatográficos é necessário determinar ainda, o limite de detecção do equipamento (LDE). O LDE considera a razão entre sinal e o ruído do equipamento, expresso pelo valor da concentração do analito que produz um sinal de três a cinco vezes o valor desta relação (BRASIL, 2003).

3.5.6 Precisão

Denomina-se Precisão do método analítico, o grau de concordância entre resultados de medidas independentes em torno de um valor central, efetuadas várias vezes em uma amostra homogênea, sob condições pré-estabelecidas (BARROS, 2002). Este parâmetro é expresso em termos de desvio padrão e desvio padrão relativo, também conhecido com Coeficiente de Variação (CV) expresso na Equação 4.

100

(%)

x

s

CV

(4)

Onde s é a estimativa do desvio padrão da resposta e

x

é a média aritmética de um pequeno número de medições (média das determinações),

A precisão possibilita decidir se o método analítico é confiável ou não para o objetivo da análise (CASSIANO et al., 2009) e ela pode ser avaliada através da Repetibilidade, Reprodutibilidade e Precisão intermediária.

A Repetitibilidade ou Precisão intra-corrida é o resultado de medições sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de análise, tais como: procedimento, analista, instrumento, local e repetições em um curto intervalo de tempo (RIBANI et al., 2004). A precisão Intermediária é o resultado das variações dentro do laboratório como diferentes dias, analistas, equipamentos ou uma combinação destes fatores. A precisão intermediária é a mais representativa da variabilidade dos resultados em um único laboratório pois garantirá os mesmos resultados para o mesmo método no mesmo laboratório (RIBANI et al., 2004).

(40)

36

A reprodutibilidade é resultado para a precisão entre diferentes laboratórios. Os resultados são obtidos usando o mesmo método e mesmas amostras em diferentes laboratórios, diferentes analistas e equipamentos (RIBANI et al., 2004).

O US-FDA (United States Food and Drug Administration) recomenda que as amostras para a validação do método sejam preparadas na própria matriz e que os padrões sejam de referência analítica, com conhecida identificação e pureza. (CASSIANO et al., 2009).

A Precisão quanto à repetibilidade do método é determinada por nove ensaios, ou seja, três concentrações, baixa, média e alta, com três réplicas cada ou mínimo de seis determinações a 100% da concentração do teste. Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de dois dias diferentes de ensaios nas mesmas condições experimentais com analistas diferentes (BRASIL, 2003).

3.5.7 Exatidão

A Exatidão é o grau de concordância entre o valor obtido pelo método de uma série de resultados e o valor de referência (BARROS, 2002).

É utilizado para descrever os erros sistemáticos do método em questão e é melhor expresso com o desvio em porcentagem do valor de referência (CASSIANO, 2009). A exatidão é calculada a partir da Equação 5.

100

(%)

x

x

x

Exatidão

i (5) onde xi é o valor de concentração experimental e x é o valor de concentração teórica

da determinação.

Lanças (2009) afirma que valores baixos de exatidão são ocasionados por erros sistemáticos e estes provocam desvios ou tendências nos resultados. Estes erros sistemáticos são ocasionados por equipamentos não calibrados ou aferidos, interferentes na amostra, baixa recuperação na extração, medidas volumétricas incorretas, seringas contaminadas, dentre outros.

Conforme a Anvisa, a exatidão deve ser verificada a partir de, no mínimo, nove determinações, ou seja, três concentrações (baixa, média e alta) com três réplicas cada.

(41)

Segundo Ribani et al. (2004), os processos utilizados para avaliar a exatidão de um método são: materiais de referência, comparação de métodos, ensaios de recuperação e adição padrão.

 Materiais de Referência Certificados: Denominados de MRC, são materiais certificados com valores de concentração para cada parâmetro e uma incerteza associada. Esses MRCs são fornecidos por organismos, tais como: NIST (“National Institute of Standards and Technology” - USA), LGC (“Laboratory of the Government Chemist” - UK), USP e FAPAS (“Food Analysis Performance Assessment Scheme” - UK). É obtida comparando-se os valores obtidos pelo laboratório para a média e a estimativa do desvio padrão de replicatas da mesma amostra padrão com os valores certificados do material de referência (Ribani et al., 2004).

 Comparação de métodos: Comparação entre resultados do método em desenvolvimento e de um método de referência, avaliando o grau de exatidão do método testado em relação ao de referência. Esta abordagem assume que a incerteza do método de referência é conhecida (Ribani et al., 2004).

 Ensaios de Recuperação: A recuperação (ou fator de recuperação), R, é definida como a porcentagem da substância de interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é recuperada e passível de ser quantificada (Ribani et al., 2004).

 Adição Padrão: O mesmo método empregado para a seletividade, quando for difícil a obtenção da matriz sem a substância de interesse. Neste método, quantidades conhecidas da substância são adicionadas em diferentes níveis numa matriz da amostra, antes do procedimento de preparo da amostra, que já contenha quantidades da substância (Ribani et al., 2004).

3.5.8 Robustez

A Robustez é a medida da capacidade do método não sofrer alterações devido a pequenas variações que podem ocorrer nos parâmetros do método durante as análises (LANÇAS, 2009).

Estes testes de robustez são importantes para que o analista saiba quais fatores devem ser controlados durante a execução de um método. Vários fatores devem ser avaliados, tais como: pH, força iônica, concentração da fase móvel, temperatura da coluna, vazão da fase móvel, diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes), procedimentos envolvidos no preparo das amostras, etc. Se as alterações das condições de análise produzirem resultados

(42)

38

dentro dos limites aceitáveis de seletividade, exatidão e precisão, o método pode ser considerado robusto e tais variações podem ser incorporadas ao procedimento. Porém, constatando-se a susceptibilidade do método a tais variações, estas deverão ser adequadamente controladas, ou precauções deverão ser incluídas no procedimento (CASSIANO et al.,2009).

Para determinar a robustez de um método, o INMETRO recomenda o teste de Youden e Steiner (1975). Este teste permite não só avaliar a robustez do método, como também ordenar a influência de cada uma das variações nos resultados finais, indicando qual o tipo de influência de cada uma dessas variações. Por este teste são realizados oito ensaios com uma combinação fatorial dos efeitos de acordo com a Tabela 4 e verifica-se qual o efeito ou combinação de efeitos que apresentam variações.

Tabela 4 - Matriz da combinação ensaiada dos fatores para determinação da robustez do

método

Valor do fator Combinação ensaiada

1 2 3 4 5 6 7 8 A ou a A A A A a a A a B ou b B B b b B B B b C ou c C c C c C c C c D ou d D D d d d d D D E ou e E e E e e E E E F ou f F f f F F f F F G ou g G g g G g G G g Resultado s t u v w x Y z

Segundo Ribani et al (2004), para o método cromatográfico como CLAE, a robustez pode ser avaliada, por exemplo, variando o conteúdo de metanol na fase móvel em ± 2%, o pH da fase móvel em 0,1 unidades de pH ou a temperatura da coluna em ± 5 ºC. Se estas mudanças estiverem dentro dos limites de exatidão, precisão e seletividade aceitáveis, então o método possui robustez e tais variações podem ser incorporadas ao procedimento.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo de validação foi desenvolvido na Seção Laboratorial de Qualidade de Água (SELÁQUA) do Departamento de Engenharia Hidráulica e Ambiental da Universidade Federal do Ceará para Goniautoxina-2,3 (GTX 2,3), decarbomoil-Goniautoxina-2,3 (dc-GTX 2,3) e N-sulfocarbamoil-goniautoxina-2,3 (C 1,2).

O desenvolvimento das etapas experimentais e os equipamentos e materiais utilizados são descritos nos tópicos seguintes.

4.1 Padrões, solução estoque 1, Solução de trabalho MIX e Reagentes

Os reagentes utilizados para as análises, preparação das soluções de trabalho (Estoque 1 e MIX), oxidação das toxinas e método cromatográfico são detalhados na Tabela 5.

Tabela 5 - Reagentes utilizados

Reagentes Marca

Acetonitrila Merck

Ácido Acético Concentrado Sigma-Aldrich

Ácido Clorídrico Cinética Reagentes & Soluções

Ácido Periódico Vetec Química Fina

Formiato de Amônio Vetec Química Fina

Fosfato de Sódio Dinâmica Química Contemporânea Hidróxido de Sódio Dinâmica Química Contemporânea

Metanol Vetec Química Fina

Peróxido de Hidrogênio Vetec Química Fina Tiossulfato de Sódio Pentahidratado Synth

Ampolas contendo os padrões de GTX 2,3, dc-GTX 2,3 e C 1,2 foram fornecidas pelo Institute for Marine Bioscience, National Research Council (Halifax, Canadá) mantidas em solução de ácido clorídrico 0,003 M e ácido acético 0,01 M com volume aproximado de 0,5 mL.

A partir da diluição dos padrões em ácido clorídrico 0,003 M, como esquematizado na Figura 6, preparou-se as Soluções Estoque 1 de cada toxina em balões volumétricos de 10 mL. As concentrações em µg.L-1 das soluções Estoque 1, nas tabelas 6 e 7, foram calculadas a

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Figura 6 - Procedimento de diluição do padrão para preparação da Solução Estoque 1

Tabela 6 – Concentrações das toxinas presentes nos padrões Toxina Concentração Padrão

(µmol.L-1) Massa molar (g.mol

-1) Concentração

Padrão (µg.L-1)

GTX 2,3 157,6 395,4 62.315,0

dc-GTX 2,3 142,1 352,3 50.061,8

C 1,2 147,3 475,4 70.026,4

Tabela 7 - Concentrações da Toxinas nas respectivas Soluções Estoque 1

Toxina Concentração Padrão (µg.L-1) Alíquota do Padrão (µL) Volume Estoque 1 (µL) Concentração Estoque 1 (µg.L-1) GTX 2,3 62.315,0 420 9.926,7 2.636,6 dc-GTX 2,3 50.061,8 510 9.952,4 2.565,4 C 1,2 70.026,4 470 9.926,8 3.315,5

Segundo Lawrence e Niedzwiadek (2001), a validade da solução Estoque 1 é de 1 ano se essa solução for mantida no escuro e sob refrigeração a uma temperatura de aproximadamente 4 ºC. As condições de armazenamento da Solução Estoque garantirão que as toxinas permaneçam sem alterações em suas propriedades estruturais durante o período de trabalho com as mesmas.

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A Solução de Trabalho MIX foi preparada diluindo cerca de 1,3 mL das Soluções Estoque 1 de cada toxina em um balão volumétrico de 10 mL com ácido acético 0,1 mM de acordo com a Figura 7. A finalidade da preparação da Solução de Trabalho MIX é a praticidade na elaboração dos testes de validade com as duas toxinas numa mesma solução em concentrações menores. A concentração de cada toxina no MIX é apresentada na Tabela 8.

Figura 7 – Procedimento de diluição das Soluções Estoque 1 de cada toxina para a produção

da Solução de trabalho MIX

Tabela 8 - Concentrações da Toxinas nas respectivas Solução de trabalho MIX

Toxina Concentração Estoque 1 (µg.L-1) Alíquota Estoque 1 (µL) Volume Ácido Acético (µL) Concentração MIX (µg.L-1) GTX 2,3 2.636,6 1.300 7.400 342,7 dc-GTX 2,3 2.565,4 1.300 333,5 C 1,2 3.315,5 1.300 8.700 431,0

4.2 Obtenção e preparo da matriz

A metodologia de validação de GTX 2,3, dc-GTX 2,3 e C 1,2 por CLAE-FLD foi desenvolvida para avaliar a água tratada via filtração direta fornecida pela Estação de tratamento de água do Açude Gavião (ETA-GAVIÃO) da Companhia de Água e Esgoto do Ceará (CAGECE) localizada no município de Pacatuba.

Os dados da caraterização físico-química da água tratada são mostrados na Tabela 9 de forma a dar maior conhecimento físico-químico da matriz utilizada. Os procedimentos analíticos para a caracterização da matriz foram baseados nas metodologias descritas em APHA (2005).

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Referências

Outline : RECOMENDAÇÕES