Universidade
Católica de
Brasília
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
STRICTO-SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA
Mestrado
DETERMINAÇÃO DO LIMIAR DE LACTATO E DO
MÁXIMO ESTADO ESTÁVEL DE LACTATO EM
CAMUNDONGOS ob/ob NA NATAÇÃO
Autor: Wesley Salazar de Almeida
Orientadora: Profª. Drª. Carmen Sílvia Grubert Campbell
2009
WESLEY SALAZAR DE ALMEIDA
DETERMINAÇÃO DO LIMIAR DE LACTATO E DO MÁXIMO ESTADO ESTÁVEL DE LACTATO EM CAMUNDONGOS ob/ob NA NATAÇÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Educação Física da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Educação Física
Orientadora: Profª. Drª. Carmen Silvia Grubert Campbell
Brasília
Dissertação de autoria de Wesley Salazar de Almeida, intitulada
“Determinação do limiar de lactato e do máximo estado estável de lactato em camundongos ob/ob na natação”, requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Educação Física, defendida e aprovada em 06/10/2009, pela banca examinadora constituída por:
__________________________________ Profª. Drª. Carmen Sílvia Grubert Campbell
__________________________________ Prof Dr Herbert Gustavo Simões
__________________________________ Prof. Dr. Ronaldo de Carvalho Araujo
__________________________________ Prof. Dr. Ricardo Jacó de Oliveira
Brasília
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sua benignidade, porque ela é para sempre, e por ter cuidado de cada passo que executo em minha vida.
Ao meu pai, Domingos, e à minha mãe, Ivaldeci, por me ensinarem a ser a pessoa que sou, e por estarem sempre ao meu lado.
Às minhas irmãs Kênia, Kelly e Kelma, e ao meu cunhado João pelo carinho.
À minha esposa, Laila, pelo companheirismo, dedicação, pelo amor a mim demonstrado e comprovado, por me encorajar a prosseguir e pela cooperação neste trabalho. Muito obrigado. Te amo muito, nega!
Ao meu sogro Alfeu, à minha sogra Maria pela torcida, pelo carinho e compreensão.
Ao meu avô, de quem tanto sinto falta, e a minha avó.
Aos meus tios, primos e amigos-irmãos que apesar de reclamarem, compreenderam a minha ausência e torciam pela minha conquista.
À Profª. Drª. Carmen Silvia Grubert Campbell, pela oportunidade, amizade e excelente orientação.
Ao Prof. Dr. Herbert Gustavo Simões, pela atenção. Vocês fazem parte da minha família e o meu carinho, respeito e admiração por vocês serão para sempre!
Ao Prof. Dr. Ronaldo de Carvalho Araújo, pelas rápidas orientações e por nos presentear com a amostra do estudo.
Aos companheiros de pesquisa Rafael, Verusca, Anderson, Carlos (Cacá) e Thiago, que tanto me ensinaram. Aos alunos de IC júnior pelas colaborações.
Ao Prof. Dr. Ricardo Jacó de Oliveira, pela confiança, apoio e pela atenção despendida quando necessário.
À CAPES e ao PROCAD, pela Bolsa de Estudos que permitiu a realização deste sonho.
Ao Grupo de Estudos do Desempenho Humano e das Respostas Fisiológicas ao Exercício, pelo crescimento pessoal, profissional, pela amizade
e pelas contribuições diárias.
“Não basta escrevermos nossas prioridades na agenda do escritório, na agenda da cabeceira e no espelho do banheiro; é necessário escrevê-la num pedaço de papel e colocá-lo no bolso para
ler muitas vezes ao dia”
RESUMO
ABSTRACT
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 10
2 OBJETIVOS ... 12
3 REVISÃO DE LITERATURA ... 13
3.1 Obesidade ... 13
3.2 Camundongos obesos (ob/ob) ... 14
3.3 Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) ... 15
3.4 Avaliação Aeróbia ... 16
3.4.1 Limiar anaeróbio (LAn)... 17
3.4.2 Lactato sanguíneo ... 17
3.4.3 Máximo Estado Estável de Lactato (MEEL) ... 18
3.4.4 Limiar de Lactato (LL) ... 19
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 21
4.1 Amostra ... 21
4.2 Genotipagem... 21
4.4 Procedimentos dos testes... 23
4.5 Adaptação ao meio líquido ... 24
4.6 Protocolos de teste ... 24
4.6.1 Teste incremental (TI) ... 24
4.6.2 Determinação do limiar de lactato (LL) ... 25
4.6.3 Determinação do máximo estado estável de lactato (MEEL) ... 27
4.7 Coletas e dosagens sanguíneas ... 27
4.8 Análise estatística e procedimentos matemáticos ... 28
5 RESULTADOS ... 29
6 DISCUSSÃO ... 32
7 CONCLUSÃO... 38
1 INTRODUÇÃO
A obesidade é uma doença com alta prevalência mundial, afetando cerca de 300 milhões de pessoas no mundo (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003). Apresenta-se como uma desordem intimamente associada a um estilo de vida sedentário, má alimentação e fatores genéticos (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, 1998; SHEPARD et al., 2001; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; WYATT et al., 2006), desencadeando assim outras doenças como hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus tipo 2 e doença arterial coronariana (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, 1998; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; PEREIRA et al., 2003; WYATT et al., 2006).
Sabe-se que uma das formas de tratamento não-medicamentoso da obesidade é o exercício físico, por promover aumento do gasto energético (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, 1998; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; ROSS et al., 2004; JANSSEN et al., 2005). Entretanto, ainda há muito a ser estudado acerca de qual intensidade de exercício promove maiores benefícios no controle do peso. Porém, muitas pesquisas são de difícil realização em humanos, por envolverem procedimentos mais invasivos ou perdurarem por um longo período de tempo. Desta forma, pesquisas envolvendo modelos animais para tais análises são de grande importância.
Um modelo animal que pode ser utilizado para o estudo da interação entre obesidade e exercício físico são os camundongos C57BL/6J, que apresentam mutação no gene da leptina (ob/ob) (LINDSTRÖN, 2007). A leptina é um hormônio produzido pelo tecido adiposo branco e está envolvida no controle metabólico, tendo função anorexígena (KRAEMER et al., 2002; SANDOVAL e DAVIS, 2003; GALE et al., 2004). Todavia, há uma carência de estudos analisando protocolos de avaliação aeróbia nestes animais, que são utilizados como um modelo de obesidade. Tais estudos podem auxiliar a entender melhor o efeito de diferentes intervenções aplicadas para o controle da obesidade.
vias metabólicas de produção de energia por meio do máximo estado estável de lactato (MEEL) (HAVERTY et al., 1988; GOBATTO et al 2001; FERREIRA et al., 2007; CUNHA et al., 2009) e do limiar de lactato (LL) (CUNHA et al., 2008(a); 2008(b); CUNHA et al., 2009), entre outros métodos.
O MEEL é definido como a maior carga de trabalho mantida por um longo período de tempo sem grandes alterações na [lac] (HAVERTY et al., 1988; BILLAT et al., 2003; FERREIRA et al., 2007), sendo considerado padrão ouro na avaliação aeróbia. Assim, refere-se ao equilíbrio entre a produção e a remoção de lactato durante o exercício, podendo ser determinado a partir de repetidas sessões de testes retangulares. Já o limiar de lactato (LL) é identificado pelo aumento abrupto na [lac] durante uma única sessão de teste incremental (HAVERTY et al., 1988), tornando-se assim mais vantajoso e menos oneroso.
2 OBJETIVOS
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Obesidade
A obesidade é uma doença com alta prevalência mundial, principalmente entre as sociedades ocidentais. De acordo com a Organização mundial da saúde (2003) um bilhão de pessoas em todo mundo apresentam sobrepeso e cerca de 300 milhões são obesos. Segundo Wyatt et al. (2006) o sobrepeso e a obesidade afetam aproximadamente 60% da população adulta nos EUA. No Brasil, segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, em 2003, o sobrepeso afetava 41,1% dos homens e 40% das mulheres, e a obesidade afetava 8,9% dos homens e 13,1% das mulheres adultas do país.
Esta desordem é complexa e multifatorial, estando associada a um estilo de vida sedentário, má alimentação e fatores genéticos (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, 1998; SHEPARD et al., 2001; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; WYATT et al., 2006), podendo ser desencadeada tanto na infância como na vida adulta (OGDEN et al., 1997; 2006; BUNDRED et al., 2001; JANSSEN et al., 2005; WYATT et al., 2006). Adicionalmente, o acúmulo de gordura corpórea pode resultar no desenvolvimento de outras doenças crônicas como diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial sistêmica e doença arterial coronariana, todas com alto índice de morbimortalidade (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, 1998; PEREIRA et al., 2003; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; WYATT et al., 2006).
Uma das formas de tratamento não medicamentoso da obesidade é a prática do exercício físico regular, cujos aspectos têm ganhado destaque na literatura. Isto porque o exercício físico promove o aumento do gasto energético e, uma vez associado a uma dieta adequada, otimiza a redução do peso gordo (NATIONAL INSITUTES OF HEALTH, 1998; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; ROSS et al., 2004; JANSSEN et al., 2005). Entretanto, apesar do grande número de pesquisas demonstrando os efeitos do exercício para o controle da obesidade, ainda há muito a ser estudado principalmente no que diz respeito à intensidade de exercício que resulte em maiores benefícios.
concluídas. Assim, sua realização torna-se, muitas vezes, de difícil aplicação em humanos, por gerar possíveis desconfortos e demandar grande disponibilidade de tempo, o que pode acabar por ocasionar a deserção do voluntário. Desta forma, ocorrem atrasos nas pesquisas e/ou redução do tamanho da amostra pesquisada, o que dificulta a comprovação dos efeitos da intervenção aplicada.
Uma das possíveis alternativas para pesquisas que envolvam procedimentos mais invasivos é a realização das mesmas em modelos animais, que, além disso, torna possível a análise dos resultados em um período de tempo relativamente curto. Tais resultados podem auxiliar na prescrição de intensidade do exercício para humanos, que contribuam para um melhor controle de doenças como a obesidade. Segundo Bahia (2001) os modelos animais têm seus limites, entretanto são indispensáveis no estudo de doenças genéticas humanas, permitindo o estudo de uma síndrome ao longo do tempo, por exemplo a obesidade, no caso do gene ob de camundongos, que codifica a leptina.
Portanto, a padronização de protocolos de avaliação aeróbia em modelos animais é fundamental para a análise dos efeitos das diferentes intensidades de exercício. Alguns estudos investigaram diversos protocolos em diferentes modelos animais, como ratos wistar em exercício de natação (GOBATTO et al., 2001; MANCHADO et al., 2006; CUNHA et al., 2008(a); 2008(b) CUNHA et al., 2009) e corrida em esteira (CARVALHO et al., 2005; MANCHADO et al., 2006;) e camundongos na corrida em esteira (BILLAT et al., 2005; FERREIRA et al., 2007). Contudo, não é de nosso conhecimento estudos que tenham analisado a determinação de protocolos de avaliação aeróbia em camundongos obesos (ob/ob).
3.2 Camundongos obesos (ob/ob)
A leptina é um hormônio expresso principalmente pelo tecido adiposo branco e que está envolvido no controle metabólico. Este hormônio está associado às reservas de gordura estocadas no corpo e tem função anorexígena. A leptina regula a ingesta calórica a partir da transmissão de sinais elétricos ao núcleo arqueado do hipotálamo, que por sua vez sinaliza uma rede neural responsável pela homeostase, causando sensação de saciedade e alterações no gasto energético, o que provoca redução do tecido adiposo (MASUZAKI et al., 1997; FRIEDMANN e HALAAS, 1998; NEGRÃO e LICÍNIO, 2000; HOUSEKNECHT e PORTOCARRERO, 2000; RESELAND et al., 2001; FONSECA 2007; SGAI, 2007).
A deficiência de leptina, como ocorre nos camundongos ob/ob, ainda está relacionada com a resistência à insulina, fazendo com que estes animais também apresentem diversos aspectos do diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
(LINDSTRÖN, 2007; SGAI, 2007). De fato, segundo alguns autores, a ação da leptina tem forte relação com o aumento da sensibilidade à insulina e, conseqüentemente, com o controle da hiperglicemia crônica (SCHWARTZ et al., 1996; GALE et al., 2004).
Deste modo, a padronização de protocolos de avaliação aeróbia nos camundongos ob/ob permitiria o estudo do efeito de diferentes intensidades de exercício sobre o controle da obesidade e também do DM2.
3.3 Diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
Os camundongos obesos (ob/ob) por apresentarem mutação para o gene da leptina, desenvolvem diversos aspectos do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Por ser um hormônio diretamente envolvido no controle metabólico, a
mutação do gene da leptina ocasiona resistência à insulina, tornando os camundongos C57BL/6J hiperglicêmicos e hiperinsulinêmicos, em determinados estágios da vida.
leptina tem forte relação com o aumento da sensibilidade à insulina e, conseqüentemente, com o controle da hiperglicemia crônica (Zhang et.al., 1994; Gale et. al., 2004; Cunningham et al., 1999; Schwartz et. al., 1996).
Estudos investigando os efeitos da administração de leptina exógena em animais com mutação para o gene da leptina verificaram redução do peso corporal, menor consumo alimentar e controle das condições causadas pela resistência à insulina (Mostyn et. al., 2001; McMahon et. al., 2001; Friedman e Hallas, 1998; Gale et. al., 2004; Duarte et.al., 2001).
Segundo Gale et. al. (2004) e Duarte et.al. (2001) a administração da leptina exógena reverte o quadro de obesidade e reduz a ingestão alimentar em camundongos ob/ob. Também reverte o quadro de hiperinsulinemia, hiperglicemia e reduz o peso corporal (NEGRÃO e LICÍNIO, 2000; RESELAND et. al., 2001; DUARTE et.al., 2001). Desta forma, a utilização deste modelo animal (camundongos C57BL/6J ob/ob) e a determinação de protocolos de avaliação aeróbia nos mesmos, possibilita a realização de estudos sobre aspectos relacionados ao DM2, de maneira especial aqueles envolvendo a
interação com o exercício físico.
3.4 Avaliação Aeróbia
3.4.1 Limiar anaeróbio (LAn)
O LAn é descrito como sendo a intensidade de exercício a partir da qual ocorre uma alteração nos substratos utilizados como principal fonte de energia, com uma transição metabólica entre os sistemas aeróbio/anaeróbio (WASSERMAN e McILROY, 1964; SVEDAHL e MacINTOSH, 2003). Assim, o LAn, que representa uma intensidade de exercício de baixo estresse metabólico (MEYER et al., 2005), torna-se uma ferramenta de grande importância para determinação de intensidades do exercício que promovam benefícios para diferentes populações.
O termo LAn tem gerado grandes debates no meio cientifico, por ser uma nomenclatura geral, que pressupõe a não interação entre as vias metabólicas. Assim, alguns pesquisadores sugerem que outras terminologias sejam mais adequadas para as definições operacionais, com base nas diversas formas de detectar a intensidade do exercício associada ao LAn (SVEDAHL e MacINTOSH, 2003). Duas das formas mais utilizadas para isto são baseadas nas alterações da concentração de lactato sanguíneo ([lac]). São elas: o máximo estado estável de lactato (MEEL) (HAVERTY et al., 1988; GOBATTO et al., 2001; BENEKE, 2003; FERREIRA et al., 2007; CUNHA et al., 2009), e o limiar de lactato (LL) (CUNHA et al., 2008(a); 2008(b); CUNHA et al., 2009).
3.4.2 Lactato sanguíneo
pela maior parte da remoção de lactato durante e após-exercício, embora órgãos como rins, intestino, fígado e coração também auxiliem nesta função.
3.4.3 Máximo Estado Estável de Lactato (MEEL)
O máximo estado estável de lactato (MEEL) está associado ou representa o equilíbrio entre a produção e a remoção de lactato, sem grandes mudanças na sua concentração sanguínea durante o exercício. Desta forma, poder-se-ia supor que quando o individuo realiza o exercício por um longo período de tempo, em intensidade relativa ao MEEL, não ocorreria fadiga e a sua principal fonte de energia seriam as gorduras oxidadas pelo sistema aeróbio (HECK et al., 1985). Assim, segundo Marquezi et al. (2006), quando a intensidade do exercício excede a capacidade metabólica aeróbia, há um aumento na [lac], com redução do pH, o que acabaria por levar o indivíduo à fadiga e, possivelmente, ao fim do exercício. Ainda, para Billat et al. (2003), o MEEL é definido como a maior carga de trabalho mantida por um longo período de tempo sem grandes alterações na [lac], definição esta também defendida por outros autores (HAVERTY et al., 1988; BENEKE et al., 2000; 2001; BENEKE, 2003; FERREIRA et al., 2007).
para interpretação do MEEL, considerando a análise dos 20min finais de exercício.
Além disso, Beneke, (2003) com estudos em humanos, comparou três diferentes protocolos: 1) análise da [lac] nos 20min finais de um teste de 30min com carga retangular e adotando como critério para a identificação do MEEL uma variação não superior a 0,05mM.min-1; 2) análise da variação na [lac] entre o décimo e o vigésimo minuto de um teste retangular com duração de 20min, adotando como critério variação não superior a 0,05mM.min-1; 3) análise da variação na [lac] entre o décimo e o vigésimo minuto de um teste retangular com duração de 20min, adotando como critério variação não superior a 0,02mM.min-1. Não sendo observadas diferenças significativas no MEEL identificado pelos três protocolos aplicados.
Uma desvantagem do MEEL, embora seja considerada uma técnica padrão ouro para a determinação de intensidade de treinamento, é que esta requer maior dispêndio de tempo e maior custo com material, por serem necessárias várias sessões de teste. Desta forma, o Limiar de Lactato, uma técnica que permite determinar o LAn em uma única sessão de teste, torna-se uma alternativa viável e menos onerosa.
3.4.4 Limiar de Lactato (LL)
O limiar de lactato (LL) pode ser definido como a zona de transição entre as vias metabólicas aeróbia/anaeróbia, e determinado pela ocorrência do abrupto aumento na curva da [lac] durante um teste incremental (TI) com carga progressiva. Para Robergs et al. (1990), o LL identifica a zona de transição metabólica durante um TI, utilizando para tal a análise da [lac] em sangue venoso ou arterializado. A coleta geralmente e feita no lóbulo da orelha, sangue capilarizado em humanos (ROBERGS et al., 1990) e da porção distal da cauda em roedores (HOFF, 2000). Uma das vantagens de se determinar o LL por um TI de cargas progressivas é a praticidade, menor custo com material e menor número de visitas ao laboratório.
influência de um sobre o outro (Figura 1). Ainda, como proposto por Moreira et al. (2008) e Cunha et al. (2009), é possível identificar o LL a partir de ajustes matemáticos desta curva, utilizando-se para isto a função polinomial de segunda ordem (Figura 3).
Apesar de vários estudos investigando diferentes tipos de protocolos como forma de determinar o MEEL e LL, e das vantagens de se utilizar modelos animais, como forma de obtenção dos resultados em um menor período de tempo, há, para nosso conhecimento, uma ausência na literatura de estudos analisando tais parâmetros em camundongos obesos (ob/ob), especialmente na natação, que é uma forma de exercício muito utilizada para estudos com modelos animais.
A determinação do MEEL e LL na natação neste modelo animal poderá ser útil em novos estudos analisando diferentes intensidades de exercício, que podem gerar importantes resultados para a compreensão de aspectos associados à obesidade, elucidando melhor os benefícios do exercício físico, como alternativa para a prevenção e o controle da obesidade e doenças crônicas a ela associada.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Amostra
Amostra foi composta por 18 camundongos sedentários da linhagem C57BL/6J, de ambos os sexos, sendo 8 animais com mutação do gene da leptina (ob/ob) e 10 heterozigotos (ob/OB). Os animais foram alimentados com ração balanceada padrão (Labina, Purina®), tiveram acesso à água “adlibitum”
e foram mantidos em gaiolas coletivas com temperatura ambiente controlada a 23ºC, em um ciclo claro-escuro de 12 horas.
4.2 Genotipagem
Para a seleção dos animais, procedimentos de genotipagem foram realizados a partir de biópsias de ~3mm da extremidade da cauda dos camundongos, para posterior extração do DNA gênomico.
O procedimento de genotipagem iniciou-se com a digestão da amostra em 700µL de tail buffer e 35µL de proteinase K (10mg/mL), submetendo-a à
preparação e à agitação constante de 850rpm em temperatura de 55ºC no agitador térmico Thermomixer, por aproximadamente 15 horas. A extração do
DNA gênomico iniciou-se com a amostra totalmente digerida. Quando retirada do Thermomixer, a amostra permaneceu envolta em gelo por 10min e foram
adicionados 300µL de solução de NaCl saturado e homogeneizado naturalmente, com posterior centrifugação a 4ºC, com 1400 rpm, por 20min.
Desprezou-se o precipitado, transferindo o sobrenadante para um tubo de 2mL e incubando com 5µL de RNase (4mg/mL) a 37ºC, por 15min, ao qual foi adicionado 1mL de isopropanol 100% para precipitar o DNA. Posteriormente, a amostra foi submetida à centrifugação por 30min a 4ºC e 1400rpm. Logo após, retirou-se o sobrenadante e precipitou-se o DNA em 500 µL de etanol a 70%, onde foi homogeneizado. Novamente, foi centrifugado por 5min a 4ºC e 1400rpm, com o sobrenadante novamente rejeitado e deixando o precipitado secar por no mínimo 1 hora.
procedimento foi realizado para melhor dissolver o precipitado e também para promover melhor homogeneização posteriormente).
4.3 Amplificação do gene OB
Para a identificação do gene ob, foi aplicada uma reação em cadeia de polimerase (PCR), com primers específicos para o gene OB (OBS e OBAS), mutado ou não, no intuito de amplificá-lo para os próximos procedimentos. A
sequência do primers OBS (sense) é: 5’ CCC TGC TCC AGC AGC TGC 3’; e a
do OBAS (antisense) é : 5’ CAT GAT TCT TGG GAG CCT GG 3’: O protocolo
utilizado foi o seguinte:
O fragmento amplificado pela reação foi analisado por eletroforese em gel de agarose 3% contendo brometo de etídeo (0,05µg/mL) e a banda esperada era de 355 pares de bases nitrogenadas. Após a verificação da integridade do DNA e amplificação do gene por PCR, as amostras foram submetidas à diálise sobre pequenas membranas próprias de DNA posicionadas sobre água milli-Q autoclavada, visando eliminar parte dos reagentes utilizados na reação.
Após a diálise, promoveu-se uma digestão pela enzima de restrição Ddel, a 37ºC por 12h, sendo utilizados ~3,5µg da amostra dialisada, 2,0µL de tampão REACT 3 (10x), 1,0µL de Ddel (3,5U/ µL) e água milli-Q autoclavada para um volume final de 20µL. Os resultados foram analisados novamente por eletroforese nas mesmas condições anteriores.
Todo o processo de separação dos animais heterozigotos e ob/ob para a formação dos grupos foi realizado de acordo com a genotipagem (Figura 1).
1 µg do DNA extraído
5,0 µL de Tampão de PCR (10x) 2,5 µL de MgCl2 (50mM)
2,0 µL de dNTPs (10mM) 1,0 µL de primer OBS (50ƞg/µL) 1,0 µL de primer OBAS (50ƞg/µL)
0,5 µL deTaq DNA polimerase (5U/µL) X µL de H2O milli-Q autoclavada 50µL total
Programa para OB
1. 94ºC por 4min 2. 80ºC por 5s 3. 94ºC por 50s 4. 56ºC por 50s
5. 72ºC por 1min e 20s
As amostras tiveram suas concentrações analisadas no espectrofotômetro.
Figura 1: Amostras provenientes da digestão do fragmento do gene OB pela enzima Ddel em gel de agarose 3%. Banda 145 ou 159 pares de base (PB)
sendo as primeiras e 48 e 59 pb como as ultimas em todos os animais. Os animais que apresentam uma banda adicional de 103 pb, são aqueles que apresentam mutação em um ou nos dois alelos (ob/ob ou ob/OB). O marcador utilizado foi o de 100pb.
4.4 Procedimentos dos testes
Os animais foram separados em 2 grupos experimentais: a) camundongos ob/ob idosos (8 animais, 10 meses de vida; 77,3 ± 6,5 g) e b) camundongos ob/OB idosos (10 animais; 10 meses de vida; 29,1 ± 3,1g).
4.5 Adaptação ao meio líquido
Os camundongos realizaram 20 minutos de exercício de natação em um aquário de vidro com raias individuais e temperatura da água mantida à 30ºC, cinco dias por semana, durante duas semanas, visando minimizar possíveis alterações que não fossem decorrentes do exercício físico realizado no meio líquido.
4.6 Protocolos de teste
4.6.1 Teste incremental (TI)
4.6.2 Determinação do limiar de lactato (LL)
O LL foi determinado por inspeção visual (LLv) do ponto de inflexão da curva da [lac] pela carga (Figura 2; MC LELLAN, 1985).
Além disso, a razão entre [lac] e a carga de trabalho (QLac = razão [lac]/%Peso Corporal) foi plotada contra a carga de trabalho (%PC) para cada estágio do TI a fim de possibilitar, através de ajuste matemático, o uso de uma função polinomial de segunda ordem. Esta, originou uma equação de segundo grau que, após ser derivada, permitiu a identificação da intensidade de exercício correspondente a (crase) ao %PC correspondente ao ponto mais baixo da curva da Qlac pela carga de trabalho, considerado como LLp (Figura 3) (MOREIRA et al., 2008; CUNHA et al., 2009).
4.6.3 Determinação do máximo estado estável de lactato (MEEL)
Para determinação do MEEL, foram realizadas de três a cinco sessões de exercícios retangulares em dias intercalados com pausa de 48h. A carga das sessões variou entre 2 e 6% do PC. Os testes consistiram de 20 minutos de natação, com pausa de 1 minuto a cada 5 minutos para coleta sanguínea. Para a identificação do MEEL, o critério adotado foi variação de até 0,05mM.min-1 nos últimos 10 minutos de exercício, como proposto para humanos (Figura 4; BENEKE, 2003).
Figura 4 – Exemplo de determinação do Máximo Estado Estável de Lactato para um animal ob/ob idoso.
4.7 Coletas e dosagens sanguíneas
Após assepsia local com álcool, foram cortados os 2mm distais da cauda dos animais. A primeira gota de sangue foi descartada para evitar contaminação. O sangue foi coletado por meio de capilares de vidro heparinizados e calibrados para 10µl. As amostras foram depositadas em microtubos (Eppendorf®) contendo 20µl de solução de fluoreto de sódio a 1% e armazenadas em gelo até o momento da dosagem, realizada através de método eletro-enzimático em um equipamento da marca Yellow Springs Instruments (Ohio, USA 2700-STAT), para determinação da concentração de
4.8 Análise estatística e procedimentos matemáticos
5 RESULTADOS
As características dos dois grupos estudados estão representadas na tabela 1. Diferenças significativas foram encontradas entre os grupos para o peso corporal e a carga máxima alcançada no TI.
Tabela 1 - Caracterização da amostra (n=18)
Animais Nº animais Idade (meses) Peso (g) Glicemia (mg.dL-1)
Carga máxima TI (%PC) ob/ob idosos 8 10 77,3 ± 6,5# 128 ± 33 6,0 ± 1,2# ob/OB idosos 10 10 29,1 ± 3,1 107 ± 17 4,6 ± 1,0
# p≤0,05 em relação ao grupo ob/OB idoso
O percentual do peso corporal, carga absoluta e concentração de lactato correspondentes ao LLv, LLp e MEEL estão apresentados na tabela 2.
Tabela 2 - Valores médios e desvio padrão (±DP) do limiar de lactato pelos métodos de limiar de lactato polinomial (LLp), visual (LLv) e máximo estado estável de lactato (MEEL).
LLv LLp MEEL
%PC Carga (g) [lac] %PC Carga (g) [lac] %PC Carga (g) [lac] ob/ob
idosos 5,3±1,0
#
3,7±0,9# 6,2±2,0 5,3±1,0# 3,9±0,7# 5,8±1,6 4,3±0,5# 3,3±0,6# 5,6±1,9 ob/OB
idosos 3,6±0,9 1,0±0,3 4,6±1,2 3,9±1,1 1,1± 0,3 4,9±1,2 3,2±0,4 0,95±0,1 6,4±2,2*
*p ≤ 0,05 em relação ao LLv; # p≤ 0,05 em relação ao grupo ob/OB idosos;. PC: peso corporal; [lac]: concentração de lactato sanguíneo.
Nas análises intra-grupos, não houve diferenças quanto ao %PC, bem como para a carga absoluta entre o LLv, LLp e MEEL. Contudo, a [lac] no grupo ob/OB idosos foi maior no MEEL quando comparado ao LLv (p<0,05).
A figura 5 ilustra as curvas médias dos grupos ob/ob e ob/OB para os protocolos LLv, LLp e MEEL.
Figura 5 – Determinação do limiar de lactato visual (LLv); limiar de lactato polinomial (LLp) e máximo estado estável de lactato (MEEL), com base nos resultados médios dos grupos ob/OB (painéis A, B e C) e ob/ob (painéis D, E e F) para a amostra de camundongos estudada.
6 DISCUSSÃO
Os achados do presente estudo demonstraram que os protocolos de inspeção visual (LLv) e ajuste polinomial (LLp) permitiram a identificação do LL em camundongos ob/ob e ob/OB e que a intensidade de exercício correspondente aos limiares não diferiu daquela observada no MEEL. Tal achado é importante, pois em uma única seção de teste de carga progressiva (TI) torna-se possível determinar o LL. Isso torna viável que futuros estudos analisem qual intensidade de exercício relativa ao LL é capaz de estabelecer melhores benefícios para o controle da obesidade e do DM2. A aplicação da
técnica de Bland e Altman (1986) ainda confirmou a alta concordância entre os protocolos utilizados no presente estudo (Figura 6).
Considerando que estudos envolvendo procedimentos invasivos, altas cargas de estresse ou longos períodos de intervenção são muitas vezes de difícil realização em humanos, a alternativa de utilização de modelos animais são de grande importância para pesquisas que envolvam estes procedimentos (BAHIA, 2001; VOLTARELLI et al., 2002; CUNHA et al., 2009). Portanto, por apresentarem respostas fisiológicas semelhantes aos humanos, vários estudos são realizados em roedores, de forma a contribuir para a melhor compreensão das adaptações e alterações fisiológicas ocorridas em resposta ao exercício físico.
Ainda, os achados de Augusto et al. (2004) demonstraram, a partir da análise do músculo sóleo que animais C57BL/6J apresentam predominantemente fibra tipo 2 a. Considerando-se que as fibras tipo 2 a são primordialmente fibras glicolíticas que, no geral, são recrutadas em exercícios de maior intensidade e de curto período de tempo, entrando em fadiga mais rapidamente, estes animais de fato poderiam apresentar uma menor capacidade aeróbia se comparados a outros roedores. Desta forma, pode-se levantar a hipótese de que esta maior carga absoluta e relativa ao PC, observada nos limiares e no MEEL para os animais ob/ob possa realmente se dever ao maior volume de peso gordo nestes animais, que atuaria como agente facilitador de uma maior flutuabilidade.
A identificação de um %PC correspondente ao LL na natação torna possível a prescrição de intensidades de treinamento físico, a partir de uma simples mensuração do PC do animal, o que é de fácil aplicação nas pesquisas. Em relação aos aspectos da obesidade, Braga et al. (2006) demonstraram em seu estudo que a prática de exercícios físicos em intensidades correspondentes ao MEEL e ao LL pode otimizar a perda de peso. Ao analisarem o efeito do treinamento com carga correspondente a 5%PC de ratos Wistar, carga esta correspondente ao LL e ao MEEL para estes animais (GOBATTO et al., 2001; MANCHADO et al., 2006; CUNHA et al., 2008(a); 2008(b); CUNHA et al., 2009), os autores observaram redução do PC e significativa melhora na captação e oxidação de glicose e síntese de glicogênio
in vitro, podendo, desta forma, contribuir ainda para minimizar os riscos de
doenças associadas ao sobrepeso e à obesidade.
Quando analisados os animais individualmente os valores de %PC, cargas absolutas e [lac] no LLv, LLp e MEEL foram semelhantes à média realizada para cada grupo ob/ob e ob/OB (Figura 5).
Dentre os diversos protocolos já citados para a determinação do MEEL (BENEKE, 2003; MANCHADO et al., 2006; FERREIRA et al., 2007; CUNHA et al., 2009) destaca-se o de Beneke (2003), que, utilizou como critério para determinação do MEEL em humanos a intensidade de exercício correspondente a uma variação na [lac] menor ou igual a 0,05 mM.min-1 nos 10min finais de um teste com duração de 20min. Este mesmo critério para a determinação do MEEL, que envolve menor tempo de teste (20min) e menor número de coletas sanguíneas, foi empregado no presente estudo com camundongos. Apesar de pesquisas mais recentes analisando tal parâmetro o presente estudo optou pelo protocolo de Beneke (2003) para humanos, por adotar menor variação na [lac] adotando desta forma uma maior rigidez nos critérios dedeterminação do MEEL.
Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo na literatura a investigar a possibilidade de determinação do LL na natação em um modelo animal de obesidade (camundongos ob/ob). O LL é um importante parâmetro utilizado para a prescrição de intensidades de exercício para indivíduos saudáveis e também para populações especiais (LIMA et al., 2008; BRAGA et al., 2006) . Deste modo, a padronização de protocolos para a determinação do LL em camundongos ob/ob permitirá futuros estudos analisando o efeito de diferentes intensidades de exercício sobre diversas respostas fisiológicas, alguns de difícil realização em humanos. Ainda, no que se refere à interação exercício x obesidade, a identificação do LL nestes animais possibilita futuros estudos sobre o efeito do treinamento físico em diferentes intensidades e, consequentemente, analisando diferentes vias metabólicas, sobre o controle da obesidade e de outras doenças a ela associadas.
No presente estudo o protocolo de TI empregado foi uma adaptação daquele utilizado por Cunha et al. (2009), que preconizava incrementos de 1%PC a cada estágio, até a exaustão voluntária. A necessidade de adaptação foi detectada a partir da realização de testes piloto, nos quais a manutenção dos incrementos de 1%PC a partir do 4º estágio levava os animais a suportar um menor número de estágios e dificultava a determinação do LL em alguns casos.
presente estudo, enquanto que na esteira, a [lac] em média foi de ~3,9mM, indo ao encontro dos resultados de Ferreira et al. (2007).
Ainda segundo Manchado et al. (2006), esta diferença na [lac] pode ser ergômetro-dependente. Tal hipótese é confirmada por Beneke (2001) e Voltarelli et al. (2002), que relatam que o equilíbrio entre a produção e a remoção do lactato depende da modalidade de exercício ou da biomecânica do mesmo, estando diretamente relacionada com a potência e a massa muscular envolvidas no exercício. Tais achados realçam a importância da especificidade da avaliação funcional e do treinamento.
Além de estar associado ao desenvolvimento de doenças crônicas (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2003; WYATT et al., 2006), o acúmulo de gordura corpórea pode ser um dos fatores responsáveis pela menor aptidão aeróbia observada, muitas vezes, em indivíduos com sobrepeso e obesidade. Entretanto, no presente estudo, embora não tenham sido observadas diferenças na [lac] entre os dois grupos estudados, os animais do grupo ob/OB idosos apresentaram menor %PC e menor carga absoluta que o grupo ob/ob idosos no LLv (3,6% vs 5,3%; 1,0g vs 3,7g), LLp (3,9% vs 5,3%; 1,1g vs 3,9g) e MEEL (3,2% vs 4,3%; 0,95g vs 3,3g) (Tabela 2).
7 CONCLUSÃO
Os protocolos propostos no presente estudo permitiram a identificação do LL na natação por inspeção visual e por ajuste polinomial em camundongos obesos, com mutação no gene da leptina (ob/ob) e em camundongos não-obesos (ob/OB). A intensidade de exercício correspondente ao LL determinado pelos diferentes protocolos apresentou concordância com a intensidade relativa ao MEEL, sem diferenças para o %PC. E ainda que as cargas em %PC no LLv, LLp e MEEL relativas a carga final no TI foram semelhantes, indicando a aplicabilidade dos mesmos. Assim, por investigar protocolos de avaliação aeróbia em animais obesos, os achados do presente estudo poderão auxiliar novas pesquisas sobre os efeitos de diferentes intensidades de exercício relativas ao LL e aspectos relacionados à obesidade, cujos resultados poderiam contribuir para possíveis intervenções para a população.
Sugere-se novos estudos analisando a sensibilidade deste tipo de avaliação às adaptações decorrentes do treinamento crônico em animais obesos (ob/ob), bem como em animais não obesos (ob/OB), em diferentes idades.
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