ORGANIZAÇÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS. Antônio Costa de Oliveira Disciplina de Marcadores Moleculares/Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento 2015

ORGANIZAÇÃO GÊNICA EM

EUCARIOTOS

Antônio Costa de Oliveira Disciplina de Marcadores

Moleculares/Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento

Organização de genoma

eucariotos

• Estrutura da cromatina • Organização Genômica

Cromatina e Heterocromatina

• Histonas

Organização Física do genoma:

Cromatina

• Eucromatina – geneticamente ativa;

• Heterocromatina –geneticamente inativa; • Célula humana= 2 m de DNA em um

núcleo de 5 micra;

• Um cromossomo humano em média contem ~ 4 cm e na metáfase possui ~2 micra de comprimento

Bandeamento G (tratamento

proteolítico + Giemsa)

Organização Genômica

• Procariotos

– A maioria do genoma é codificante

– Pequena porção não codificante é composta por sequências regulatórias

• Eucariotos

– A maioria do genoma é não codificante (95%)

• Sequências regulatórias • Introns

Genoma de eucariotos

• Genomas de Eucariotos são muito mais complexos;

• Analisados por estudos de cinética de reassociação do DNA

Organização de Sequências

• Características únicas do eucariotos • Sequências de cópia simples (genes)

– Integridade de genes individuais pode ser interrompida; – Podem haver múltiplas e idênticas cópias de sequências

particulares;

• Sequências Repetitivas

– Pequenos/grandes blocos de DNA que não apresentam função conhecida em benefício da planta/organismo eucarioto (podem codificar para proteínas).

• Genomas de plantas são compostos por ILHAS de genes rodeadas por OCEANOS de DNA

repetitivo.

• O DNA repetitivo é composto por retroelementos que são altamente metilados, enquanto genes em geral não o são.

Paisagem do Genoma

DNA repetitivo

• Dois tipos

– Repetido em tandem

• DNA satélite

Sequencias repetitivas

• DNA repetitivo – pode contar mais de 50% do genoma humano;

• DNA satellite – conteúdo variável de G+C; • Repetições em tandem/dispersos;

• SINEs –short interspersed elements

– Alu family – 200 ~300 pb x 105 _{s copias;}

Sequencias repetitivas

• LINEs (long interspersed elements)

– LI family – 6400 pb x 10.000 copias

• NORs (nucleolus organizer regions)

– 18S & 28S r DNA gene clusters

• VNTRs (variable number of tandem repeats)

Transposable elements

Classes: I & II • Class I TEs: Retrotransposons

– Transpose through a “copy & paste” mechanism – Generally do not insert inside genes

– LTR retrotransposons:

• have LTRs (long terminal repeats) and TSD (target site duplication)

Transposable elements

Classes: I & II • Class II TEs: DNA transposons

– Transpose through a “cut & paste” mechanism – Insert close to, or inside, genes

– Have TIRs (terminal inverted repeats) and TSD (target site duplication)

– Leave “footprints” after excision

– Transposase required for transposition

• If TE codes for transposase: Autonomous element • If not: Non-autonomous element

Other transposable elements

• Helitrons

– Transpose through a rolling circle-like mechanism – Have CT .. AC as conserved sequences

– Have palindromic sequences that form a secondary structure (loop) that signals end of transcription

– Mutations in loop-forming sequences allow for Helitrons to “_{pick up” genes or gene fragments}

– Can code for a helicase domain

• Pack-MULEs

– Mutator-like elements

Simple Sequence Repeats

• Sequências curtas que são repetidas em em cópias idênticas ou relacionadas no genoma; • DNA satélite – diferente conc. de G +C;

• Microsatélites – di –hexanucleotídeos repetidos em tandem;

Cinética de reassociação do DNA

• Aumento do genoma = aumento do número de genes? • Método de desnaturação de DNA dupla-fita (calor a 100

o_C);

• Mede-se a absorbância a 260 nm (ssDNA absorve 40% mais a 260 nm)

• Aquecimento lento –absorbancia aumenta dramaticamente entre dois pontos de temperatura (Tm=melting

temperature); • Conteúdo de GC – influencia a Tm • %GC Tm • 40 87 o_C • 60 95 o_C • Renaturação (hibridização)

Cinética de reassociação do DNA

• Natureza do genoma – avaliado pelo inverso do processo de desnaturação • dC/dt = -kC2

– C = concentração de DNA que é fita simples no

tempo t e k é a constante de reassociação Cot value= O produto de Co e t, dando um

índice útil de renaturação do DNA

C₀t _½ = 1/k (concentração x tempo de metade da reação)

Cinética de reassociação do DNA

• Componente rápido (25% do DNA, valor de Cot _½ de 0,0013 e frequência de 500.000.

• Componente intermediário (30% do DNA, valor de Cot _½ de 1,9 e frequência de 350. • Componente lento (45% do DNA, valor de

Frações do genoma refletem a

paisagem genômica

• Componente rápido – elementos repetitivos em grande número

• Componente médio – elementos presentes em menor número de cópias, mas ainda repetitivos; famílias gênicas

Complexidade de genomas

• C₀ do DNA é 12 pg

– 3000 de cada sequência em uma bactéria com genoma de 0,004 pg;

– 4 copias de cada sequência de um genoma eucarioto de 3 pg;

– O mesmo C₀ promoverá uma concentração de

3000/4 = 750 x menor do que cada sequência bacteriana.

Um novo conceito

• Fração conservada x fração variável –

baseado na idéia de que genes e elementos repetitivos estão sobre pressões de seleção diferenciados

Hibridação cruzada de sondas

(fração conservada do genoma)

Grasses as a unique genetic system

Trends in Genetics, 1993

Jinsheng Lai et al. Genome Res. 2004; 14: 1924-1931

Figure 1 Graphic representation of the alignment, position, and polarity of all predicted genes within the selected chromosomal intervals of maize, sorghum, and rice

Retrotransposons e outros

elementos repetitivos (fração não

conservada)

• Dez dos 20 elementos estavam inseridos dentro de outro retroelemento e cinco destes estavam

inseridos dentro de LTRs.

• Natureza interdispersa, grande número de

cópias,presença ao redor da maioria dos genes de

milho - sugere que este é o padrão de organização

Retrotransposon Invasion of the Maize

adh1 Region

Retrotransposon Invasion of the Maize

adh1 Region Science:274,765 Opie-Opie-11 Ji-Ji-11 Grande-Grande-zm1zm1 Ji-Ji- 66 Huck-Huck-11 Cinful-2 Cinful-2 Ji-Ji-5solo5solo Ji-Ji-44 Opie-Opie- 33

Ji-Ji-2solo2solo Ji-Ji-33

Opie-Opie-22 Milt Milt Huck-Huck-22 Reina Reina Cinful-1 Cinful-1 Opie-Opie- 44 10 kb 10 kb adh1-F adh1-F 8 8 Kake-Kake-11 Victim Victim Rle Rle 2 2 44 1 1 33 55 66 77 99 Tekay Tekay Fourf Fourf LINE LINE LINE LINE LINE LINE 2 2

Kake-Sintenia x ausência de sintenia (comparação entre espécies) Modelo de similaridades entre gramíneas incluem a

natureza, tamanho, posição e orientação de genes (Bennetzen, 1997)

A B CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ a a b b b c c d d

a b a b b

A B

A composição e organização de segmentos intergênicos nas gramíneas (Bennetzen, 1997)

Conclusões (SanMiguel et al., 1996)

• Genomas complexos de animais e

plantas(tais como o humano e o do milho) apresentam retroelementos como a sua

principal classe de DNA repetitivo interdisperso.

O paradoxo do valor C

• C-value – A quantidade total de genoma haplóide de cada espécie;

• Conflito entre aumento do tamanho do genoma e sua complexidade .

• Sequências simples – repetitivas

Filo Espécie Genoma (bp) Algas P. salina 6.6 x 105 Mycoplasma M. Pneumoniae 1.0 x 106 Bacterias E. coli 4,2 x 106 Musgo D. discoideum 5,4 x 107 Nematoides C. elegans 8,0 x 107 Insetos D. melanogaster 1,4 x 108 Pássaros G. domesticus 1.2 x 109 Anfíbios X. laevis 3,1 x 109 Mamíferos H. sapiens 3,3 x 109 Gramíneas O. sativa 4,0 x 108 Gramíneas T. aestivum 16 x 109 Gramíneas Z. mays 3,0 x 109

Wheat Corn Grass Rice

Uma pequena porção do genoma é

composto por genes

Potato Canola Tomato Soy Moss Arabidopsis Human Espaco gênico DNA repetitivo

Tamanho de Genomas vs.

Número de genes

Obesidade Genômica

• Aumento irreversível do tamanho dos genomas?

Modelo de integração e recombinação gerando o elemento Sabrina LTR-2 - LTR-3 (Shirasu et al., 2000)

LTR-2 LTR-3

Figure 4 Possible integration and recombination events gen-erating Sabrina unit LTR-2 — LTR-3. Two Sabrina elements are shown in dark and bright gray with the arrows denoting the LTRs. Nonelement DNA is in black with the ovals representing 5-bp direct repeats flanking Sabrina LTR-2 and LTR-3. The broken ar-row line shows a deduced intraelement recombination event; dotted lines indicate corresponding positions; thin black lines denote a nested Sabrina insertion.

Genoma de eucariotos

• Número e tipos de genes em um genoma • Identificação potencial de ORFs –

complicado pela presença de introns (várias ORFs em um gene);

• Estimativa do número de genes por sua expressão em RNA (ESTs) ou proteína;

Organização de sequências de cópias

simples

• Short period interspersion – sequencias de 300 -1200 pb aparecem como ilhas entre sequencias curtas repetitivas;

• Long period interspersion – cópias de

sequencias de 2-6 kpb aparecem como ilhas entre sequencias repetitivas.

Exons e introns

• 1977 – genes eucarioticos podem ser interrompidos;

• Gene estrutural é muito maior do que a sequência representada no mRNA;

• EXONS – sequências representadas no mRNA maduro;

• INTRONS – sequências intervenientes que são removidas quando o transcrito primário é

Exons e introns

• Gene estrutural – região entre os pontos

correspondendo as bases terminais 5’e 3’do mRNA maduro.

• Gene estrutural – uma unidade de

transcrição incluindo regiões regulatórias associadas: um promotor, outras regiões regulatórias upstream, o gene e um

Exon shuffling

• Exon shuffling hypothesis (Gilbert 1977);

– Crossing over ocorre em posições aleatórias, mas homólogas em uma frequência que depende do

comprimento do DNA. Como exons ocupam 1% do GH, e introns 24%, a maioria dos CO ocorre entre exons e não dentro deles.

• Exons as protein domains;

• Exon recombination via transposable elements;

• Pseudogenes –um gene inativo que se originou de um gene ativo. Originam-se por duplicação e

Exons e introns

• Ordem das partes é mantida ( genes são partidos e não dispersos);

• Um gene interrompido retém a mesma

estrutura em todos os tecidos, sendo ou não expresso;

• Introns de genes nucleares geralmente tem codons de terminação e não tem função

Exons e introns

• Genes muito longos são resultado de introns muito longos e não codificam para longos produtos;

• Não há correlação entre tamanho do gene e número de exons;

• Em mamíferos, insetos e pássaros o gene em média é ~5x o tamanho do seu mRNA.

Genes podem ser isolados pela

conservação dos exons

• Uma região contendo um gene com função conservada entre espécies deve ter:

– 1) deve possuir uma ORF;

– 2) provavelmente tem sequências relacionadas em outras espécies

Uma sequência de DNA =

múltiplas proteínas?

• Mutações em diferentes exons de um gene falham em complementar uma a outra;

• Mutações em introns que afetam

processamento comportam-se como do mesmo grupo

• Alternative splicing = processamento alternativo

Analise em larga escala de isoformas proteicas indica que o splicing alternativo tende a inserir ou deletar dominios proteicos completos mais frequentemente do que o esperado

Número de genes

• Precisamos definir a densidade de genes; • S. cereviseae

– Average ORF = ~1,4 kb

– Espaço médio entre genes = ~600 pb

– ~70% das regiões seqûenciadas são ocupadas por ORFs

– Genoma/comprimento de um gene = número de genes

Número de genes

• Famílias gênicas – Um grupo de genes

descendendo por por duplicação e variação de um mesmo gene ancestral;

• Superfamília – uma relação expressa na forma de uma organização geral comum entre genes cuja função não é aparentemente relacionada

(imunoglobulinas como parte de uma superfamília envolvendo moléculas de adesão celular);