DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISCIPLINA TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR
MÓDULO DIDÁTICO DE APOIO (MDA 2)
CULTIVO E MANUTENÇÃO DE MICRORGANISMOS UTILIZADOS NA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE.
2 1. Introdução
A produção de proteínas recombinantes em microrganismos é um processo-chave na biotecnologia e representa uma alternativa à obtenção de quantidade limitadas de proteínas nativas dos organismos de origem, onde geralmente se encontram em concentrações reduzidas devido a influência de fatores abióticos (ex.: sazonalidade), tornando o processo de obtenção muito dispendioso e, muitas vezes, inviável de implementação. A produção heteróloga de proteínas também é uma alternativa eficiente para eliminar isoformas proteicas. Estas isoformas podem ter diferentes propriedades físico-químicas, o que pode resultar numa indesejável variabilidade nas suas atividades biológicas. Além disso, o grau de pureza das proteínas nativas obtidas nas suas fontes de origem pode não ser suficiente para eliminar contaminações tóxicas, pirógenas ou infecciosas.
Os avanços da biologia molecular, a partir dos anos 70, tornou possível a produção de proteínas heterólogas em diferentes tipos de células hospedeiras. Atualmente, a tecnologia do DNA recombinante tornou-se a base das abordagens de engenharia genética, permitindo a produção de uma gama variada de proteínas em células que naturalmente não as produziam. Os primeiros produtos obtidos a partir dessa tecnologia a surgirem no mercado foram: fármacos (por exemplo, a insulina, interferons, vacina da hepatite B) e enzimas para o uso industrial (por exemplo, no tratamento de alimentos, detergentes, papel e outros produtos de higiene). A receita mundial dos 20 produtos farmacêuticos recombinantes mais vendidos atingiu cerca de 13 bilhões de euros em 2013 e 15 bilhões de euros em 2016.
A tecnologia do DNA recombinante vem permitindo a obtenção eficiente de proteínas heterólogas e a otimização dos processos de produção, quer seja pela obtenção de culturas super-produtoras através da engenharia metabólica, quer seja pelo desenvolvimento de novos processos cultivo, adequando os biorreatores às exigências da cultura recombinante.
3 2. Tecnologia do DNA recombinante
É um conjunto de técnicas que permitem identificar, isolar, multiplicar e combinar moléculas de DNA de diferentes organismos, considerando as propriedades do DNA. Dentre essas propriedades podemos destacar:
O DNA é a molécula repositória da informação genética;
É formada por duas cadeias de ácido desoxirribonucleico e que são complementares;
As duas cadeias orientam-se em direções opostas; Pode ser desnaturado e renaturado;
Pode ser sintetizado quimicamente, permitido adições de características específicas (marcações)
Dos avanços relacionados a tecnologia do DNA recombinante decorreram várias outras tecnologias que permitiram, a partir de organismos diferentes, novas combinações de material genético em laboratório, estabelecendo-se, assim, um princípio de intervenção humana capaz de, pela substituição das fronteiras naturais entre variedades de espécies e, potencialmente entre as próprias espécies, estabelecer fronteiras tecnológicas tendentes mais à uniformidade do que à biodiversidade característica do planeta. As pesquisas em torno do DNA recombinante, além da revolução instaurada no universo dos estudos da vida, permitiu o desenvolvimento de novas práticas técnico-científicas e o surgimento de uma nova área multidiciplinar - a biotecnologia.
A tecnologia do DNA recombinante pode ser aplicada:
No estudo dos mecanismos de replicação e de regulação da expressão gênica;
Na determinação das sequências de genes e consequentemente das proteínas que eles codificam;
No desenvolvimento de terapias gênicas; Nos diagnósticos médicos;
Na obtenção de transgênicos → animais ou vegetais mais produtivos, resistentes e capazes de gerar produtos de alto valor agregados (exemplo, fármacos);
No desenvolvimento de culturas microbianas visando a produção de proteínas recombinantes com aplicações biotecnológicas, tais como: a
4 insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades (Figura 1).
Na tecnologia forense → exames de paternidade, criminalistas e controle de qualidade.
Figura 1 – Etapas de produção de proteínas heterólogas a partir da tecnologia do DNA recombinante.
O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante foi fundamentado pela a descoberta das enzimas de restrição, das ligases, dos vetores de clonagem, pelo desenvolvimento de métodos de transformação e dos métodos de distinção de células transformadas e não transformadas.
A clonagem gênica é a técnica central da tecnologia do DNA recombinante. Ela consiste no isolamento e na replicação de moléculas idênticas do DNA de interesse, através da sua propagação em células hospedeiras apropriadas, possibilitando assim, a seleção do DNA recombinante. Os objetivos gerais do processo de clonagem são:
Separar e identificar genes específicos de uma mistura heteróloga de genes;
Amplificar / Aumentar o número de cópias de uma sequência pura de DNA;
5 Os principais componentes de um processo de clonagem gênica são: a) inserto; b) endonucleases de restrição; c) enzimas modificadoras; d) vetores e e) células hospedeiras.
A) Inserto
Corresponde ao fragmento do DNA de interesse ou gene a ser clonado, que pode ser obtido de diferentes fontes (DNA genômico, mitocondrial, plasmidial, e de fago) e por diferentes métodos (digestão enzimática; quebra mecânica controlada; síntese enzimática e síntese química);
B) Endonucleases de restrição
A primeira nuclease de restrição que clivou um sítio específico de DNA foi descoberta em 1970 por Hamilton Smith da Universidade de Johns Hopkins que acidentalmente observou que a bactéria Haemophilus influenzae clivava rapidamente o DNA de fagos. Esta atividade de degradação que foi subsequentemente observada em extratos da bactéria demostrando ser resultante da ação de uma nuclease de restrição (atualmente conhecida com HindII). As nucleases catalisam a quebra das ligações fosfodiésteres que unem os nucleotídeos de uma fita de DNA. Dependendo da região na qual ocorre o corte da fita, as nucleases podem ser divididas em endonucleases (corte interno) e exonucleases (corte a partir das extremidades).
As endonucleases de restrição são enzimas capazes de catalisar a clivagem tanto do DNA de interesse como do vetor em sítios específicos de reconhecimento, de modo que o DNA possa ser inserido no vetor. Essas enzimas também são divididas em várias classes dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As endonucleases de restrição do Tipo II (também denominadas “enzimas de restrição”) são as mais utilizadas na tecnologia do DNA recombinante. Elas podem ser monoméricas ou diméricas, dependentes de Mg2+ (como cofator) e que clivam o DNA no seu mesmo sítio de reconhecimento e ligação. Este sítio normalmente é uma
sequência palindrômica, isto é, a que possui um eixo de simetria onde a
sequência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando são lidas em direções opostas. Geralmente, essas sequências palindrômicas são
6 constituídas por 4, 6 ou 8 pares de bases (pb). As enzimas de restrição podem gerar fragmentos de DNA com:
a) extremidades coesivas. Exemplo: a enzima de restrição BamHI b) extremidades não coesivas: Exemplo: a enzima de restrição AluI Desde a primeira identificação, em 1970, as enzimas de restrição que cortam sequências específicas têm sido isoladas de centenas de cepas bacterianas e mais de 150 sítios diferentes de clivagem específica foram encontrados. A nomenclatura compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da bactéria que a produz, por exemplo, a enzima de restrição EcoRI, conforme o quadro abaixo:
.
C) Enzimas modificadoras
Outras enzimas também são importantes no processo de clonagem gênica e podem ser agrupadas em 2 grandes classes, dependendo do tipo de reação que catalisam:
Ligases
São enzimas reparadoras de quebras ou descontinuidades que podem surgir nas fitas individuais do DNA dupla fita. A DNA ligase age catalizando a formação de uma ligação fosfodiéster entre a hidroxila 3’ da extremidade de uma fita de DNA e um fosfato 5’ da outra extremidade (Figura 2) . Em E. coli essa enzima é codificada pelo gene lig.
Figura 2 – Ação da DNA ligase de eucariotos E Representa o gênero → Escherichia
co Representa a espécie → coli R Representa a estirpe → RY13
7 Na maioria dos procariotos (incluindo E. coli), a DNA ligase utiliza energia do cofator NAD+ (nicotinamida-adenina-dinucleotídeo) para formar a ligação fosfodiéster. Já as DNA ligases de eucariotos e de alguns vírus usam a energia do ATP para esse propósito.
Geralmente, as ligases são capazes de unir tanto extremidades coesivas quanto abruptas (cegas). No entanto, a DNA ligase de E. coli não é capaz de ligar naturalmente extremidades abruptas de DNA, exceto na presença de polietilenoglicol.
O mecanismo de reação da DNA ligase envolve três etapas:
1 Adenilação da DNA ligase - etapa na qual um grupo AMP é transferido para um resíduo de lisina (Lys) na enzima. Lembrando que, em E coli, esse AMP é derivado do NAD+. Já os vírus e os eucariotos usam ATP em vez do NAD+. Quando o NAD é utilizado nessa etapa, ocorre a liberação de nicotinamida mononucleotídeo (NMN) e quando o ATP é utilizado, ocorre a liberação de pirofosfato (PPi);
2 Ativação do fosfato 5’ no corte – nesta etapa, o AMP ligado a enzima é transferido ao grupo fosfato 5’ no corte, resultando na sua ativação; 3 Deslocamento do AMP – nesta etapa, o grupo 3’-OH faz um ataque
nucleofílico ao gruopo fosfato 5’ e desloca o AMP, produzindo uma ligação fosfodiéster para selar o corte.
8 Figura 3 – Etapas do mecanismo de reação da DNA ligase
Atualmente, a DNA ligase de bacteriófago T4 (denominada T4 DNA ligase) é ligase mais comumente utilizada em pesquisas envolvendo a tecnologia do DNA recombinante. Ao contrário da DNA ligase de E. coli, a T4 DNA ligase não utiliza NAD e sim, o ATP como um cofator.
Polimerases
São enzimas que catalisam a síntese de uma nova fita de DNA ou RNA a partir de uma fita molde preexistente. Exemplo: a Taq DNA polimerase – enzima que sintetiza DNA na presença de nucleotídeos, copiando uma molécula preexistente a partir de uma sequência iniciadora (Figura 4).
9 C) Vetores
São moléculas de DNA usadas para transferir o DNA exógeno (inserto) de um organismo para o genoma de outro organismo hospedeiro, visando a obtenção de um DNA recombinante ou a produção de um organismo transgênico. Os principais tipos de vetores são:
Plasmídeos São pequenas moléculas de DNA circular dupla fita que contém todos os elementos necessários para a sua replicação no interior da célula independente do cromossomo do hospedeiro (replicação autônoma).
Bacteriófagos ou fagos são vírus que infectam especificamente bactérias. Eles possuem estruturas simples. Os dois tipos principais de estruturas que os fagos apresentam são: cabeça e cauda (fago lambda) e filamentoso (fago M13). Os fagos podem ser de ciclo lítico ou lisogênicos. Os fagos lisogênicos, são os ideais para a clonagem, pois o DNA é replicado de maneira estável dentro da célula hospedeira juntamente com o gene de interesse, sem matar (lisar) a célula.
Cosmídeos → são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago (λ) associadas as do plamídeo bacteriano (ex., pBR322) Vetores para leveduras Podem ser divididos em: Vetores
integrativos (YIps) – são aqueles integrados ao genoma do hospedeiro por recombinação homóloga, em uma ou múltiplas cópias, dependendo do sítio alvo de integração (local de homologia); Vetores autônomos – são aqueles que se baseiam em plasmídeos que contêm sequências de replicação autônoma (ARS) e que funcionam como origens de replicação.
D) Células hospedeiras
São aquelas nas quais são introduzidos os vetores recombinantes de modo a obter maiores quantidades do DNA recombinante. As características de uma célula hospedeira ideal para clonagem são:
a) Crescimento rápido;
b) Capacidade de crescimento em meio de cultivo simples e de baixo custo;
10 c) Não ser nocivo;
d) Fácil manipulação e propagação; e) Aceita muitos vetores;
f) Disponibilidade de diferentes estirpes geneticamente definidas. Os principais tipos de células hospedeiras usadas na tecnologia do DNA recombinante são:
a) Procarióticas: A bactéria Escherichia coli é amplamente utilizada em muitos protocolos de clonagem. Porém, esses hospedeiros não são empregados para a produção de proteínas de grande complexidade e tamanho, como os anticorpos, devido a impossibilidade de realizar algumas modificações pós-traducionais (como glicosilação, fosforilação, carboxilação etc). Além da E. coli, outras bactérias também podem ser usadas em experiências de clonagem gênica, como por exemplo, espécies dos gêneros Bacillus, Pseudomonas e Streptomyces.
b) Eucarióticas: As leveduras (Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae) são os organismos unicelulares eucarióticos favoritos para a clonagem gênica. Isso deve-se ao fato de possuírem uma organização celular similar à dos eucariotos superiores. Além das leveduras, outros eucariotos também são utilizados como células hospedeiras, como: Fungos filamentosos (dos gêneros Aspergillus e Trichoderma); Células de mamíferos (CHO, BHK); Células de insetos (Sf9 de Spodoptera frugiperda) e Células de plantas (protoplastos).
3. Transferência de gene em bactérias
Em 1946, Joshua Lederberg e Edward Tatum demonstraram que as bactérias podem transferir e recombinar informação genética, abrindo o caminho para o uso de bactérias em estudos de genética e biologia molecular.
As bactérias podem trocar material genético por três mecanismos diferentes, todos envolvendo algum tipo de transferência de DNA e a recombinação entre o DNA transferido e o cromossomo bacteriano. Esses mecanismos são:
11 a) Conjugação – A conjugação bacteriana, descoberta por Lederberg e Tatum (1946) em E. coli K12. Esse mecanismo que ocorre quando o material genético é transferido diretamente de uma bactéria doadora para outra bactéria receptora através de uma ponte citoplasmática temporária (também denominada ponte de conjugação). Neste processo, duas bactérias se aproximam e a ponte de fimbrias se forma de uma bactéria doadora para a receptora. Um plasmídeo ou parte do cromossomo bacteriano é replicado e transferido como fita simples, pelo tubo de conjugação, para a bactéria receptora. Já na célula receptora, o DNA é novamente replicado, ocorrendo a recombinação entre sequencias homólogas do DNA transferido e o cromossomo da célula receptora. Porções do DNA que não sofreram recombinação são degradadas. Na conjugação, o DNA é transferido apenas do doador para o receptor, sem troca recíproca de material genético.
b) Transformação - O fenômeno da transformação envolve um processo no qual o DNA (de uma bactéria doadora) livre no meio é tomado por uma bactéria receptora, resultando em alterações genotípicas nessa célula. Para a bactéria conseguir captar o DNA é necessário que a mesma encontre-se em estado de competência (com a presença de receptores na superfície celular). O DNA adere-se à face externa da membrana celular bacteriana, quando então, DNA binding proteins e endonucleases clivam esse DNA em fragmentos de 6.000 – 8.000 bp. Algumas enzimas clivam as pontes de hidrogênio estabelecidas entre os pares de base e separam as duas metades da dupla fita, para que somente uma fita entre na célula. Uma vez no citoplasma, o DNA exógeno ligado às DNA binding proteins (que evitam a digestão pelas DNAses) encontra o cromossomo da célula receptora ou um plasmídeo e ocorre a recombinação em sítios de homologia. Esse fenômeno pode ser observado em bactérias gram-positivas e em gram-negativas.
c) Transdução – processo que ocorre quando vírus bacterianos (denominados bacteriófagos, ou simplemente, fagos) transferem o DNA de uma bactéria para outra. A transdução ocorre da seguinte maneira:
12 2. O DNA fágico induz a célula hospedeira a converter todo seu metabolismo para a síntese de novos fagos.
3. Finalmente, ao término do ciclo lítico do fago, vários componentes das partículas virais, no citoplasma, são montados e a célula é lisada, liberando novos fagos infectivos. Durante o processo de montagem, alguns erros ocasionais ocorrem e grandes segmentos de DNA bacteriano acabam por se incorporar no genoma do novo fago, em detrimento de porções do DNA do próprio vírus. Esses novos fagos são denominados fagos defectivos.
4. Cultivo de bactérias
A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias) exige a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e fatores de crescimento (por exemplo, vitaminas e aminoácidos). Um meio que contém apenas os nutrientes necessitados por bactérias prototróficas é chamado de meio mínimo. As bactérias prototróficas, são aquelas do tipo selvagem que podem usar 0s componentes mais simples do meio (como C e P) para sintetizar boa parte dos compostos de que precisam para o crescimento e reprodução. Já as linhagens mutantes (chamadas de auxotróficas) não têm uma ou mais enzimas necessárias para metabolizar nutrientes ou produzir moléculas essenciais, e só crescerão em meios suplementados com um ou mais nutrientes. Por exemplo, as linhagens auxotróficas que são incapazes de sintetizar o aminoácido leucina não crescerão em meio mínimo, no entanto crescerão se a leucina for adicionada ao meio. Já o meio completo, contém todos os compostos necessários para o crescimentos e reprodução bacteriana.
Além dos compostos presentes no meio de cultura para que haja um crescimento bacteriano satisfatório, normalmente, ainda é necessário, incubar
13 os meios em condições adequadas de pH, pressão osmótica, disponibilidade de oxigênio e temperatura.
Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É, portanto, essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-separá-las em cultura pura, para assim efetuar testes de identificação de natureza bioquímica.
Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. Essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, umidade, etc., durante certo período de tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície. Uma colônia é um conjunto formado por um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido e que é visível a olho nu. Cada colônia provém de uma única célula e, assim, representa um clone de uma cultura pura.
3.1. Classificação dos meios de cultura
Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.
a) Quanto à Consistência
Existem meios de cultura em três estados físicos: Liquido; Sólido e Semi-sólido.
Os meios líquidos, como os caldos nutritivos de crescimento (constituídos basicamente de extratos de carne ou levedura; peptona, também chamada de triptona) podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Apresentam, no entanto, dois inconvenientes: 1) as culturas bacterianas desenvolvidas geralmente não revelam quaisquer características especiais e, portanto, a identificação de bactérias em mios líquidos é bastante limitada; 2) é
14 impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em meios líquidos.
Os meios sólidos, ao contrário dos meios líquidos, permitem observar diferenças nas colônias bacterianas que se desenvolvem na superfície (e por vezes no interior) do meio, pois geralmente, elas se diferem em relação a morfologia e cor, auxiliando na identificação e posterior isolamento das bactérias. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. São ainda utilizados para a conservação de culturas, e permitem observar determinadas reações bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). O agente gelificante mais utilizado nos meios sólidos para o cultivo de bactérias é o agar (1,5 a 2%). Também conhecido como agar-agar ou agarose, é um hidrocolóide extraído de diversos gêneros e espécies de algas marinhas vermelhas, da classe Rodophyta. Tais algas são denominadas agarófitas. As principais espécies de valor comercial são as agarófitas dos gêneros Gracilaria (Gracilariaceae), Gelidium (Gelidiaceae), Pterocladia (Gelidiaceae) e Ahnfeltia (Phyllophoraceae); existem outras, tais como a Acanthopheltis japonica, Ceramium hypnaeordes e C. boydenii, por exemplo. As Gelidium, particularmente Gelidium amansii, propiciam uma melhor qualidade de agar, porém são de cultivo mais difícil e menos abundantes como recursos naturais do que as Gracilárias, as quais são cultivadas em escala comercial em vários países e regiões.
Em seu estado natural, o agar ocorre como carboidrato estrutural da parede celular das algas agarófitas. É uma mistura heterogênea de dois tipos de polissacarídeos: a agarose, um polímero neutro, e a agaropectina, um polímero com carga sulfatado. A agarose, fração geleificante, é uma molécula linear neutra, essencialmente livre de sulfatos, que consiste de cadeias repetidas de unidades alternadas β-1,3 D-galactose e -1, 4, 3,6-anidro-L-galactose (Figura 5). A agaropectina, fração não-gelificante, é um polissacarídeo sulfatado (3% a 10% de sulfato) composto de agarose e porcentagens variadas de éster sulfato, ácido D-glucurônico e pequenas quantidades de ácido pirúvico. A proporção destes dois polímeros varia de acordo com a espécie da alga, sendo que a agarose é o componente principal, representando cerca de 70% do total. De forma simplificada, pode-se dizer que
15 a agarose e a agaropectina se diferenciam pela presença de restos de sulfato e piruvato, relativamente abundantes na agaropectina e escassos (idealmente, ausentes) na agarose.
Figura 5 – Estrutura do Agar.
O agar possui várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal, como:
a) O agar é insolúvel em água fria, porém expande-se consideravelmente e absorve uma quantidade de água de cerca de até vinte vezes o seu próprio peso.
b) Rápida dissolução em água quente (temperatura de fusão 85-100 oC). A fusão do gel de agar não ocorre à temperaturas inferiores a 85ºC.
c) Gel de agar fica transparente quando atinge sua temperatura de fusão
d) A geleificação do agar ocorre à temperaturas muito abaixo da temperatura de fusão. Uma solução de 1,5% de agar forma um gel ao ser resfriado para uma temperatura de 32 ºC a 45 ºC.
e) O agar é capaz de formar um gel firme a concentrações tão baixas quanto 0,5%.
f) Não é nutriente para a maior parte dos microrganismos g) Não é metabolizado durante o crescimento microbiano
Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente a concentração de 5 g/l de meio) podem ser utilizados em estudos de fermentação, estudos de mobilidade bacteriana e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias.
16 Com relação a composição, os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios: os sintéticos e os complexos. Os meios sintéticos, ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas, de modo constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. meio de citrato de Simmons), e os meios complexos, compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas, de origem animal, vegetal ou microbiana como, por exemplo, extrato de carne, as peptonas e o extrato de levedura, que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. Como exemplos destes meios têm-se os meios de McConkey, Drigalsky ou Endo.
c) Quanto ao tipo de utilização • Meios de isolamento
Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos:
a) Meios basais - Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Não existe um meio de cultura universal (ex. caldo nutritivo, água peptonada, triptona sal, gelose nutritiva).
b) Meios seletivos - Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. Torna-se útil, no caso de uma população plurimicrobiana, porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias.
c) Meios diferenciais - São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. Esses meios quando contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos, tais como o meio agar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, o meio agar sangue para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos.
d) Meios seletivos e diferenciais - Alguns meios de cultura são simultaneamente seletivos e diferenciais. São, sobretudo, utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública, como por exemplo, na
17 determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares. Temos como exemplos destes tipos de meios:
Meio de McConkey - É um meio seletivo, uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas, permitindo o crescimento, apenas das bactérias Gram negativas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam.
Meio de Drigalsky - É um meio muito semelhante ao anterior e contém, igualmente, lactose, indicador de pH (azul de bromotimol), cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac - (não fermentadoras de lactose).
Meios de pré-enriquecimento
São aqueles que permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, ou seja, para culturas que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada, caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em pó).
Meios de enriquecimento
São meios básicos suplementados com produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro, ovo ou sangue. Exemplos: Agar sangue, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos - meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações alimentares).
Meios de identificação
São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e, por conseguinte, resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. meio Clark-Lubs - permite distinguir
18 entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose).
Estocagem ou manutenção
São meios utilizados para a conservação a manutenção das bactérias num estado de vida latente por um longo período. Esses meios garantem a viabilidade de microrganismos (Ágar Sabouraud, Meios com leite, Ágar suco de tomate, Ágar sangue, Ágar Simples, meio semi-sólido, etc.).
3.2. Etapas gerais para o preparo dos meios de cultura a) Pesagem dos componentes do meio.
c) Dissolução completa dos componentes do meio de cultura em água destilada ou ultrapura
d) Ajuste de pH (quando necessário) d) Esterilização em autoclave.
f) Distribuição em tubos ou placas de Petri após arrefecimento a 40 - 45º C (No caso dos meios sólidos ou semi-sólidos)
g) Adição de suplementos termolábeis como, por exemplo, antibióticos (o calor da esterilização destrói determinados suplementos, não permitindo a sua adição anterior).
3.3. Principais técnicas de inoculação de bactérias em meios de cultura sólidos
a) Espalhamento
É utilizada para contagem de colônias e o inóculo (suspensão) é, neste caso, aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma alça de Drigalsky.
b) Estrias ou esgotamento
A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colônias isoladas, e realiza-se à superfície de meio sólido, com uma alça de platina, a partir de uma suspensão ou de uma colônia isolada.
c) Incorporação (pour plate)
A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colônias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo
19 (suspensão) no meio, enquanto quente (não mais do que 40 ºC para não destruir o inóculo) e, portanto, ainda liquefeito.
e) Picada central
Este tipo de inoculação é utilizado, por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com palito de dente, agulha ou pipeta de Pasteur estéreis, num meio geleificado em tubo ou placa de Petri.
4. A Escherichia coli como sistema de clonagem e expressão
A E. coli é um dos diversos microrganismos anaeróbios facultativos que fazem parte da microbiota intestinal dos animais homeotérmicos, sendo considerado um patógeno oportunista de interesse nas indústrias de alimentos. Pertence a família Enterobacteriaceae cujos membros se caracterizam por serem bacilos Gram negativos, não esporulados, capazes de fermentar a glicose com produção de ácido e gás. Possuem motilidade quando apresentam flagelos peritríquios ou podem ser imóveis. O peptideoglicano é o constituinte básico da sua parede celular e responsável pela rigidez da parede, fornecendo resistência ao processo de lise osmótica. Esse peptideoglicano é um polímero composto pelos açúcares N-acetilglicosamina e N-acetilmurámico (unidos por ligação 1→4) e por um tretrapetídeo (contendo L-alanina, ácido D-glutâmico, ácido meso-diaminodimélico e D-alanina). São facultativamente anaeróbicos, possuindo o metabolismo oxidativo e fermentativo. A E. coli possui um cromossomo circular com 4,64 milhões de pares de base.
Devido ao amplo estudo sobre suas características fisiológicas, bioquímicas e genéticas, a E. coli tornou-se um dos mais importantes organismos-modelos para pesquisas na biologia molecular, principalmente aquelas relacionadas a clonagem e expressão de proteínas. Isso porque a E. coli apresenta as seguintes vantagens: a) Fácil manipulação, cultivo e armazenamento; b) rápido crescimento; c) pouco exigente nutricionalmente (normalmente utiliza meios mínimos); d) disponibilidade de várias cepas comerciais); e) baixo custo; f) ampla disponibilidade de vetores; g) níveis satisfatórios de proteínas expressas; h) disponibilidade de cepas comerciais contendo códon plus (exemplo: E. coli BL21-CodonPlus); i) Escalonável; j)
20 Possibilidade de alterações nos parâmetros para melhorar a expressão. Por outro lado, o sistema E. coli também apresenta as seguintes desvantagens: a) A maioria das cepas comercial são incapazes de realizar modificações pós-traducionais específicas (como glicosilição); b) Pode haver a formação ineficiente de pontes dissulfeto nas proteínas recombinantes; c) Mau enovelamento de proteínas recombinantes no citoplasma; d) possibilidade de formação de corpos de inclusão (proteínas insolúveis não funcionais); e) Secreção ineficiente de proteínas recombinantes; f) Presença de endotoxinas (LPS) e g) Indução de proteólise.
A grande maioria das cepas de E. coli usadas em técnicas de DNA recombinante derivam de uma única cepa, denominada K-12, e essas cepas, atualmente utilizadas, são geralmente denominadas por uma ou mais letras, que indicam o laboratório onde a cepa foi obtida, e por numeração referente a ordem temporal de isolamento.
4.1. Meios de cultura para o cultivo de E. coli
Essa bactéria cresce rapidamente, e pode ser mantida, em meio mínimo, líquido ou solidificado com ágar, contendo uma fonte de carbono (glucose consiste na melhor fonte de C) e sais (N, P). Entretanto, E. coli cresce mais rapidamente e melhor em meio rico contendo aminoácidos, precursores de nucleotídeos, vitaminas e outros metabólitos, que as células teriam de sintetizar. A maneira mais fácil de suprir todos esses elementos é utilizar meio enriquecido, mas de composição indefinida, usando materiais biológicos ricos hidrolisados, tais como leite, carne e leveduras.
O caldo LB (Luria-Betani broth) é o meio de cultura mais usado em práticas de biologia molecular para cultivo de células de Escherichia coli. Na sua formulação pode haver uma alta concentração de sal (o meio LB Miller Broth contendo NaCl 1%) ou uma baixa concentração de sal (o meio LB Lennox Broth contendo NaCl 0,5%). Diferentes linhagens bacterianas podem exigir diferentes concentrações de sal. A fórmula de baixo teor de sal é mais frequentemente usada em seleções de antibióticos sensíveis ao sal. Vantagens como, facilidade de preparo; permite a taxa de crescimento acelerado da maioria das cepas de E. coli, disponibilidade comercial e composições simples
21 contribuem para a popularidade de uso do caldo LB. Esse meio contém: o produto de digestão enzimática de caseína é conhecido como peptona (o termo triptona referem-se à peptona de caseína obtida por digestão triptica ou pancreática); extrato de levedura; e cloreto de sódio. A peptona é rica em aminoácidos e peptídeos. Além de aminoácidos e peptídeos, o extrato de levedura, também contém os ácidos nucleicos, lipídios e outros nutrientes que são necessários para o crescimento bacteriano. O meio LB pode permitir o crescimento da E.coli até uma DO600 nm de 2 a 3, sob condições normais de incubação agitação (37 oC a 250 rpm).
Outros meios também são utilizados para o cultivo de E. coli e as diferenças em suas formulações variam conforme o objetivo do cultivo e aplicações (QUADRO 1).
QUADRO 1 – Meios de cultura comumente utilizados para o cultivo de E. coli
Nome meio Composição Aplicação
LB Miller Broth
1% peptona, 0.5% extrato de levedura e 1% NaCl
Crescimento e propagação de E.coli; produção de DNA
plamidial e proteínas
LB Lennox Broth
1% peptona, 0.5% extrato de levedura e 0,5% NaCl
Crescimento e propagação de E.coli; produção de DNA
plamidial e proteínas SOB Medium 2% peptona, 0.5% extrato de levedura, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2 , 10mM MgSO4 Preparo de células competentes de elevada eficiência; produção de DNA
plamidial e proteínas
SOC Medium
SOB + 20mM glucose Transformação cellular e crescimento de células competentes Terrific Broth (TB) 1.2% peptona, 2.4% extrato de levedura, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4 e 0.4% glicerol
Produção de DNA plamidial e proteínas com alto
rendimento
Super Broth (SB)
3.2% peptone, 2% extrato de levedua e 0.5% NaCl
Produção de DNA plamidial e proteínas com alto
22 4.1.1. Preparo do meio LB Miller Broth (caldo simples líquido) para o cultivo de E. coli Formulação: Extrato de levedura → 0,3 g Peptona → 1,0 g Cloreto de sódio → 1,0 g Água destilada → 100,0 mL Preparação:
1. Pesar separadamente os componentes do meio numa balança de precisão; 2. Após a pesagem, transferir os componentes para um béquer de vidro e adicionar H2O destilada (3/4 do volume final do meio). Promover a total solubilização dos componentes utilizando um bastão de vidro ou agitador elétrico (usando barra magnética), evitando a formação de espuma.
3. Verificar e ajustar o pH para 7,0 com NaOH 1M; 4. Completar o meio para o volume final de 100 mL; 5. Distribuir meio em tubos ou recipientes de cultivo;
6. Esterilizar o meio em autoclave a 121 °C (1 atmosfera de pressão) por 20 minutos. Recomenda-se incubar o meio a 37 °C por 24 a 48 horas, para constatar a eficiência da esterilização.
Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma, porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis ou que reajam com as substâncias dos meios, as mesmas são esterilizadas por filtração membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0,22 m de diâmetro (Millipore, Sartorius), e depois incorporadas, assepticamente, ao meio previamente esterilizado.
4.1.2. Preparo do meio LB Miller Broth (ágar simples) para o cultivo de E. coli
1. O ágar simples é obtido adicionando-se 1,0 a 1,5 % de agar ao meio de caldo simples (o meio pode ficar um pouco amolecido, a depender da qualidade do ágar). Aumentando-se a concentração de ágar para 2,0%, o meio ficará bem sólido)
23 2. Dissolver o agar no meio agitando para não aderir ao recipiente, até a completa dissolução, evidenciada pela ausência de grânulos de ágar nas paredes do recipiente;
5. Esterilizar em autoclave a 121 °C por 20 minutos.
6. Retirar da autoclave, esfriar a 50-70 °C e distribuir (de 15 a 25 mL por cada placa) em placas de Petri (15 x 100 mm) estéreis.
4.1.3. Função dos componentes do meio LB
Extrato de carne/ levedura - Fonte de carbono orgânico, nitrogênio, vitaminas e sais minerais e, nesse caso de energia.
Peptona – fonte de nitrogênio e aminoácidos oriundos da caseína
Cloreto de sódio - aumenta a pressão osmótica e mantém a isotonia do meio
Agar - Tem como função solidificar os meios e não é metabolizado por bactérias.
Observações:
1. A adição de extrato de levedura (0,5%) e glicose (0,5 a 1,0 %) ao caldo simples enriquece o meio fornecendo vitamina B, fonte adicional de nitrogênio e carbono, e pode até permitir o crescimento de alguns microrganismos exigentes.
2. Os meios de cultura após esterilização devem ser incubados em condições ambientais (temperatura e atmosfera) adequadas para verificação da esterilidade (Prova da esterilidade).
3. A estocagem dos meios de cultura esterilizados e esfriados deve ser feita acondicionando-os invertidos, em sacos plásticos fechados, para reduzir a desidratação dos mesmos, colocando-os em refrigeração por, no máximo 15 dias.
4.1.4. Crescimento das culturas de E. coli
Em condições ideais para crescimento, as bactérias E. coli reproduzem-se por fissão binária a uma taxa média a cada 20 minutos em meio rico, mas em meio mínimo contendo glucose como fonte de carbono, o tempo de duplicação atinge 50-60 minutos. Essa taxa pode ser mantida apenas por um
24 curto período. Uma cultura de bactéria, quando inoculada em meio de cultura a partir cultura de armazenamento (placa, estoque, “stab”, “slant”) passa pelas seguintes fases de crescimento (Figura 6) :
1. Fase inicial (lag) – a multiplicação de bactérias é baixa ou ausente, pois as células devem se adaptar as novas condições e sintetizar componentes necessários para síntese de DNA, RNA, proteínas antes de iniciar o crescimento. A 37 oC, essa fase “lag” dura entre 10 a 60 minutos, dependendo da composição do meio, genótipo da bactéria, grau de aeração e período que as células estiveram na fase estacionária.
2. Fase de crescimento logarítmica (log) ou exponencial – crescimento na taxa máxima, em progressão geométrica ou exponencial, que perdura até a composição do meio ser alterada ou o oxigênio se tornar limitante.
3. Fase estacionária – taxa de crescimento equivalente a taxa de morte
4. Fase de declínio e morte – taxa de morte maior que a taxa de crescimento com o decréscimo de células viáveis.
Figura 6 – Fases da curva de crescimento bacteriano
A maioria das técnicas de DNA recombinante requerem culturas de bactérias nas fase log ou estacionária de crescimento. Células na fase exponencial de crescimento podem ser diluídas em meio fresco, com a mesma composição, sem alterar a taxa de crescimento, e pode assim ser mantida indefinidamente nesta fase. Numa densidade de 107 células mL-1 em meio
25 líquido, o oxigênio não consegue difundir eficientemente da atmosfera para as células, suficiente para o crescimento aeróbico, a menos que a cultura seja agitada ou aerada diretamente. O crescimento pode ser reduzido drasticamente na ausência de oxigênio, e mesmo com aeração, o oxigênio torna-se limitante na concentração de células acima de 2-3 x 109 mL-1.
Considerando que a maioria das células nas culturas de armazenamento estão mortas, a maioria dos experimentos iniciam com a inoculação de um pequeno volume da cultura (denominado pré-inoculo), e as células são crescidas por 8 a 16 horas para ocorre a ativação da cultura.
A concentração de células viáveis numa cultura pode ser determinada através do plaqueamento de diluições seriais da cultura em meio sólido e o crescimento das colônias. Cada célula viável pode se multiplicar até formar uma única colônia que pode ser contada após 8 a 16 horas de crescimento. Bactérias em cultura na fase de crescimento exponencial ou na fase estacionária podem formar colônias. Cada colônia obtida equivale ao número de células viáveis por um volume conhecido, usado para ser aplicado e plaqueado no meio. Para obter-se um número confiável, colônias únicas e independentes devem ser obtidas, e o número de colônias não deve exceder a algumas centenas por placa e estarem bem espalhadas por toda a superfície do meio. Quando a concentração de células nessa fase de crescimento é maior do que 107 mL-1, as culturas devem ser diluídas antes de serem plaqueadas. Normalmente, se utilizam diluições abaixo de 10-4 mL-1. O procedimento utilizado consiste em fazer diluições seriais de 10 ou 100 vezes, e 0,1 mL dessas diluições são usadas no plaqueamento.
Devido o inconveniente de aguardar várias horas para obter esses resultados, outros métodos são utilizados. A determinação imediata da concentração de células relaciona a turbidez com a densidade de células. A turbidez de uma cultura é uma função da massa de células (e não número de células!) por unidade de volume, e é devida a dispersão da luz pela massa de células, medida convenientemente num espectrofotômetro.
O espectrofotômetro mede a quantidade de luz, num determinado comprimento de onda, que passa através de uma solução, causando a dispersão da luz de seu percurso original, e consequentemente não percebida
26 pelo detector. A quantidade de luz recebida pelo detector é normalmente expressa como uma função logarítmica da fração da luz incidente não recebida, chamada Absorbância. A turbidez é estimada pela Absorbância ou Densidade Óptica em espectrofotômetro nos comprimentos de onda entre 400 a 600 nm. Normalmente, utiliza-se o comprimento de onda de 600 nm para determinar a densidade de células, pois, apesar da sensibilidade aumentar com valores mais baixos, no comprimento de onda de 400 nm, alguns meios ricos absorbem luz significativamente nesse espectro, afetando as leituras. Variações no tamanho das células entre as cepas e as condições fisiológicas de crescimento, afetam a turbidez de uma cultura, e a Densidade Óptica (DO) deve ser usada como estimativa de concentração de células apenas após calibração de uma contagem de células viáveis através do plaqueamento de diluições seriais. Essa calibração é apenas confiável para a cepa avaliada e quando a cultura estiver na fase exponencial para condições específicas de cultivo e para cada espectrofotômetro específico. Se a densidade de células estiver muito elevada, existe a possibilidade de dispersão da luz ser anulada pelo excesso de células, causando uma absorbância menor do que a esperada. Isso ocorre principalmente para Abs600nm maior do que 0,8. Para culturas densas, com valores > 0,8, deve-se diluir a cultura antes para a leitura, e corrigir pelo fator de diluição.
4.1.5. Purificação das culturas de E. coli
De forma a purificar culturas bacterianas de contaminantes e/ou mutantes, deve-se iniciar uma cultura a partir de colônias únicas, testar para as características desejadas, e manter essa cultura pura em estoque para uso futuro. Para obtenção de colônia única, uma cultura de bactérias deve ser aplicada sobre meio sólido em placa, de forma a permitir a separação e crescimento de colônias únicas. Cada colônia única é formada por 106 a 109 células. A melhor forma de separar as células é através da técnica de riscar placas:
1. Aquecer o “loop” da alça de inoculação de bactérias na parte superior da chama (a mais quente!) até a alça ficar em brasa, por um período curto. Remover a alça da chama, e deixá-la esfriar por cerca de 5 segundos. Abrir
27 a tampa de uma placa de Petri contendo um meio rico solidificado (LB-agar) e tocar o agar com cuidado. Esse ato não deve gerar nenhum ruído, pois a alça quente ao encostar no meio pode criar um aerosol espalhando bactérias na placa.
2. Riscar a placa com a alça, com cuidado para frente e para trás, movendo até cerca de metade da área da placa. A alça não deve encostar os lados das placas. Flambar (esterelizar na chama) a alça rapidamente, virar a placa cerca de 90o e riscar a placa transversalmente a área riscada incialmente, cobrindo cerca de ¼ da placa. Flambar a alça novamente, e girar a placa mais 90 o e riscar a última parte da placa, movendo a alça através da segunda área riscada. Cada risca, seguida de flambagem, resulta numa diluição serial de qualquer bactéria na placa.
3. Cobrir a placa de Petri. Inverter a placa e incubar em estufa a 37 oC para E. coli. É recomendável fechar as placas com parafilme ou filme plástico, de modo a evitar a infestação por formigas.
5. As leveduras como sistema de clonagem e expressão
As leveduras são fungos que têm sido utilizados pelo homem há milhares de anos e cuja manipulação causou um grande impacto na produção de alimentos e, por conseguinte, influenciando o próprio processo de desenvolvimento socioeconômico da humanidade. O pão, a cerveja e o vinho representam os produtos mais expressivos do processo de manipulação desses microrganismos ao longo do tempo. Em todos esses processos, a levedura S. cerevisiae teve um papel de destaque. Além de ser considerada um dos microrganismos mais úteis ao homem, essa levedura é um dos sistemas eucarióticos mais bem conhecidos. Sua genética é bem dominada e seu genoma foi totalmente sequenciado, fato este que representou uma das maiores conquistas da Biologia no século XX. Após o advento da tecnologia do DNA recombinante, a levedura S. cerevisiae pôde ser empregada em estudos de genética molecular a partir do final dos anos 70, quando ela foi geneticamente transformada pela primeira vez. Desde então, vários tipos de vetores moleculares foram desenvolvidos, inclusive cromossomos artificiais de levedura (YAC - Yeast Artificial Chromosomes). Com a obtenção de cepas de
28 leveduras mutantes foi possível o isolamento de genes de outros organismos eucarióticos por complementação. Nos últimos anos, foi desenvolvida em S. cerevisiae uma das mais sofisticadas abordagens para a identificação de genes interativos. Trata-se de uma técnica conhecida como sistema duplo-híbrido ou “two hybrid”, que propiciou a identificação de vários genes envolvidos em vias de transdução de sinal e no ciclo celular.
No campo da pesquisa aplicada, a levedura S. cerevisiae logo se destacou como um interessante candidato para a expressão de genes heterólogos de interesse biotecnológico. Embora a bactéria E. coli represente uns dos mais poderosos sistemas de expressão heteróloga, várias proteínas eucarióticas de interesse comercial não puderam ser expressas eficientemente nesse microrganismo. Entre as razões para esses insucessos poderíamos citar: conformação incorreta, ausência de modificações pós-traducionais e baixos níveis de expressão. Alguns desses problemas puderam ser resolvidos quando as mesmas proteínas foram expressas em S. cerevisiae. O ambiente intracelular da levedura é adequado para a ocorrência de várias reações que normalmente ocorrem em células de mamíferos. Além do mais, S. cerevisiae goza do status de microrganismo GRAS (Generally Recognized As Safe) o que é de suma importância no que se refere à produção de biofármacos por engenharia genética. No entanto, várias proteínas humanas sofrem hiperglicosilação quando secretadas por S. cerevisiae o que será discutido mais adiante.
Ao longo das últimas duas décadas, outras leveduras têm sido apresentadas como sistemas alternativos de expressão por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae. Entre esses novos sistemas, destaca-se a Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica, ou seja, que é capaz de crescer em meio de cultura contendo metanol como única fonte de carbono. O fato de crescer até alta densidade celular em um meio barato levou a empresa Phillips Petroleum Company a propor o uso dessa levedura como fonte de alimento (single cell protein - SCP). Após constatar que o processo de produção de SCP era inviável economicamente, a empresa decidiu transformar P. pastoris em um sistema de produção de proteínas recombinantes.
29 A levedura P. pastoris apresenta duas vantagens sobre a S. cerevisiae que a tornam uma atraente célula hospedeira para a produção de proteínas heterólogas. A primeira, é o forte promotor usado para transcrever genes heterólogos, o qual é derivado do gene que codifica a enzima álcool oxidase (AOX1) de P. pastoris. Esse promotor é regulado transcricionalmente por metanol, um indutor relativamente barato. Uma vez que o promotor AOX1 é controlado pela manipulação da fonte de carbono adicionado ao meio de cultura, o crescimento e a indução de cepas de P. pastoris, que expressam proteínas heterólogas, são facilmente obtidos em todas as escalas, desde frascos até grandes fermentadores. Por serem facilmente cultivadas em soluções concentradas de metanol, as culturas de P. pastoris são capazes de inativar a maioria dos organismos contaminantes.
A segunda vantagem da P. pastoris é que esta levedura não é considerada uma forte fermentadora, como a S. cerevisiae. A fermentação realizada por leveduras gera etanol, o qual, em culturas de alta densidade, pode rapidamente atingir níveis tóxicos (efeito Crabtree). O efeito Crabtree, descrito para leveduras (como a S. cerevisiae), consiste no desvio do piruvato, proveniente da glicólise, para uma rota fermentativa, mesmo em condições plenamente aeróbicas, resultam na produção de etanol. No caso da E. coli, observa-se primordialmente a fermentação acética, enquanto que a S. cerevisiae prioriza a alcóolica.
Para uma produção economicamente viável de proteínas recombinantes a concentração de proteínas no meio deve ser proporcional à quantidade de células. É necessário, pois, atingir níveis de alta densidade celular os quais não são facilmente obtidos com S. cerevisiae. Em contraste, as cepas produtoras de P. pastoris são facilmente cultivadas a densidades celulares de aproximadamente 100 g/L de peso seco, ou até maiores.
O uso de P. pastoris como sistema para a expressão de proteínas recombinantes tornou-se popular por várias razões: facilidade de manipulação genética e cultivo, meios de cultura simples e barato, fácil escalonamento, possibilidade de crescer em alta densidade celular e, sendo um eucarioto, a habilidade de produzir e secretar proteínas recombinantes solúveis e enoveladas corretamente devido a capacidade de promover processamentos
30 pós-traducionais importantes (exemplo, glicosilação e adição de pontes dissulfeto). É importante destacar que os fatores mais importantes que afetam a densidade celular e o rendimento de proteínas recombinantes produzidas em leveduras são: taxa de aeração, controle de pH e a disponibilidade de nutrientes.
5.1. Composição dos meios de cultura para leveduras Quadro 2 – Composição do Meio Agar-YPD
Quadro 3 – Composição do meio complexo líquido YPD
Ajustar o pH para 6,5+ 0,2 6. Manutenção de culturas bacterianas e leveduras
A natureza impõe em seu curso normal que materiais biológicos sigam o ciclo de degeneração e morte, desta forma, algumas características podem se alterar e se perder, com o passar do tempo. A intenção de interromper ou pelo menos retardar o relógio biológico de organismos tem sido alvo desde os tempos mais remotos, tendo alcançado hoje, um potencial significativo de estocagem de amostras biológicas a curto, médio e longo-prazo.
Nesse sentido, o incremento de protocolos mais eficientes de conservação de microrganismos poderá assegurar, de certa forma, a continuidade e expansão de pesquisas na área microbiológica e da biologia molecular. Tal ação permite o desenvolvimento de estudos capazes de superar barreiras cronológicas e geográficas e, por conseguinte, elucidar as particularidades dos diferentes organismos.
A importância da manutenção e principalmente preservação de microrganismos caracteriza-se como reflexo da necessidade de utilização de organismos ou espécimes a qualquer momento, quer para fins experimentais,
31 didáticos, industriais ou estudos comparativos. Desta forma, conhecer a melhor maneira de preservar culturas bacterianas e dispor de técnicas simples e eficientes, reveste-se de grande valia aos laboratórios de microbiologia. Para tanto, a sobrevivência do agente não se constitui o único objetivo. Torna-se necessário considerar a viabilidade e principalmente a escolha de métodos que não promovam em maior ou menor grau a ocorrência de mutações ou variabilidades.
No que se refere à estocagem, conservação e manutenção de amostras independentes da origem, o que inclui células humanas, animais e vegetais, bactérias, vírus, fungos e material genético (DNA/RNA), há o propósito de diagnóstico e pesquisa, ampliando a aplicação laboratorial. Por consequência, não se aplica para a conservação de amostras biológicas uma fórmula singular, ideal ou universal que determine a eficiência de sua estocagem e preservação por longos períodos (COSTA et al., 2009). A escolha do método de manutenção mais adequado deve ser baseada pelas características do agente em estudo, assim como pelas vantagens e desvantagens de cada técnica disponível.
O objetivo principal dos métodos de manutenção microbiológica é preservar a viabilidade e principalmente proporcionar estabilidade genética do microrganismo ao isolamento, pelo maior tempo possível, evitando assim a formação excessiva de mutações que alterem suas características. Além disso, procura-se adequar a escolha de uma técnica de conservação baseando-se nas particularidades do microrganismo, nas características do próprio método a ser aplicado, nos custos de manutenção da técnica, da importância do acervo e principalmente na capacidade laboratorial e disponibilidade de equipamentos (ABREU e TUTUNJI, 2004; GIRÃO et al., 2004).
Diante da necessidade de preservação de microrganismos, muitas vezes, busca-se conservar um agente que foi selecionado e melhorado com intuito de manter sua nova identidade. Ainda assim, o objetivo da manutenção de um microrganismo não é somente conservar seu estado inicial evitando mutações indesejáveis, mas também garantir ao máximo a vitalidade das células e a quantidade de células viáveis (PAOLI, 2005; OKAFOR, 2007). Segundo Costa e Ferreis (1991), os métodos de manutenção de
32 microrganismos podem ser classificados de acordo com tempo máximo de preservação:
Métodos de curto prazo: repique contínuo;
Métodos de médio prazo: preservação em óleo mineral, preservação em água esterilizada, congelamento a -20 ºC;
Métodos de longo prazo: liofilização, criopreservação.
Diversos protocolos de estocagem têm sido desenvolvidos e aplicados, porém, a maioria não tem se mostrado plenamente eficaz, visto as peculiaridades de cada agente a ser conservado e até mesmo pelas características das técnicas, por isso, vem se justificando a conjunção de dois ou mais protocolos a fim de se garantir a melhor recuperação dos microrganismos (GREEN, 2008; COSTA et al., 2009).
6.1. Método de manutenção a curto prazo 6.1.1. Repicagem contínua ou periódica
A técnica de repique contínuo, também chamado de subcultivo ou repicagem periódica, é um método simples e tradicional de manutenção de culturas de microrganismos em laboratórios de biologia molecular. Por ser uma das mais antigas técnicas de conservação, tem sido bastante utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, principalmente de bactérias (ROMEIRO, 2006). O método consiste na inoculação do microrganismo em meio adequado, incubação em ambiente favorável à multiplicação e estocagem em baixas temperaturas, após sua multiplicação. Nesta situação, é aconselhável o armazenamento de culturas sob refrigeração (5 a 8 °C), em busca da redução do metabolismo dos microrganismos e o aumento entre os intervalos de repiques das culturas, proporcionando a conservação de leveduras em média de um a três meses e de bactérias em torno de cinco a doze meses (COSTA e FERREIRA, 1991; GREEN, 2008). A repetição do processo para novos meios deve ser realizada em intervalos de tempo condizentes com as necessidades e particularidades de cada microrganismo, avaliando-se as condições ótimas e período máximo de sobrevivência entre as diferentes cepas. Entretanto, é aconselhável que a transferência de culturas seja realizada antes que o substrato do meio seja totalmente utilizado pelos microrganismos, ou então se
33 desidrate. Para minimizar o efeito da desidratação, os microrganismos devem ser conservados em tubos de ensaio com tampa rosqueável ou selados com parafina, em ambientes protegidos da luz e de variações de temperatura, mantendo preferencialmente uma faixa entre 5 e 8 °C.
O método de repicagem contínua apresenta como vantagens a facilidade e o baixo custo, por não provocar estresse ou injúria celular e não necessitar de reativação dos microrganismos. Entretanto, apresenta maior risco de contaminação em decorrência da constante manipulação das culturas devido aos repiques contínuos e periódicos; perdas de características genéticas decorrentes de mutações; necessidade de maior espaço físico para armazenamento das culturas; logística inconveniente quanto à postagem; variabilidade entre as cepas e consequentemente entre os intervalos de repiques para cada microrganismo armazenado (ROMEIRO, 2006).
A idade das culturas e, principalmente, as frequências de repicagens devem ser avaliadas para o emprego deste método de manutenção, pois, as culturas mais velhas acabam por gerar culturas-filhas modificadas, levando-se em consideração a ocorrência de alterações tanto de caráter morfológico quanto fisiológico.
A composição do meio de cultura pode interferir na resistência das células, no entanto, existem dois conceitos que se opõem sobre qual a composição ideal de meio de cultivo na manutenção de microrganismos: meios com boa composição de nutrientes ou meios menos elaborados, do ponto de vista nutricional (COSTA et al., 2009)
6.2. Métodos de manutenção a médio prazo 6.2.1. Manutenção em óleo mineral
Este método de conservação é uma alternativa simples que consiste na aplicação de uma camada de óleo mineral esterilizado sobre uma cultura, a fim de limitar a quantidade de oxigênio disponível, causando assim uma redução no metabolismo e consequentemente, na taxa de multiplicação do agente (RHODES, 1957; COSTA & FERREIRA, 1991). Esta técnica proporciona uma maior longevidade às estirpes, quando comparada à repicagem periódica, bem como redução da velocidade de desidratação do meio de cultura, em
34 consequência da diminuição de oxigênio. Diversas bactérias podem ser conservadas por esta técnica, sendo armazenados com sucesso por dois a três anos, visto a redução na atividade metabólica e nas transferências para outros meios de cultura. Entretanto, comparando com outros métodos, apresenta desvantagens equivalentes à técnica de subcultivo, como a possibilidade de contaminações, instabilidade genética e dificuldades com a utilização do óleo (esterilização e manuseio).
A manutenção de microrganismos submersos em óleo mineral promove a redução do consumo de oxigênio em torno de 10% em poucas horas. Camadas de óleo superiores a 1 cm não devem ser utilizadas, mediante a redução da viabilidade dos microrganismos em condições de total exaustão de oxigênio (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006). Caso a conservação de culturas seja feita em tubo inclinado, o óleo deve ser adicionado até que todo o meio esteja recoberto, pois o contato dos microrganismos com o ar promove desidratação total da cultura pela evaporação da água.
Considerando o sucesso na manutenção de microrganismos, verifica-se que os óleos utilizados nesta técnica devem ser de boa qualidade e pureza, apresentar alta viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9 à temperatura de 20 °C e, além disso, não devem conter produtos tóxicos, sendo a parafina e a vaselina, os mais recomendados para a manutenção de microrganismos em curto prazo (BARKER, 2002; ROMEIRO, 2006). Outra preocupação quanto à qualidade dos óleos utilizados neste método se recorre ao processo de esterilização. Existem dois procedimentos possíveis para a esterilização do óleo mineral: autoclavagem a 1 atm por 30 minutos seguida de secagem a 150 ºC, ou aquecimento à 170 ºC por uma hora. Alternativamente também é recomendado a autoclavagem a 121 °C por 15 minutos, seguida de permanência em estufa a 100 °C por uma noite para remoção de água. (LELLIOT & STEAD,1987). A temperatura de conservação do meio após adição do óleo pode variar entre -4 e -20 ºC, sofrendo ajustes mediante as necessidades individuais de cada agente. A recuperação dos microrganismos mantidos sob conservação em óleo mineral baseia-se apenas na transferência das culturas para outro meio sólido ou líquido (ROMEIRO, 2006). Entretanto, estudos preconizam que na transferência de culturas preservadas por este
35 método, seja utilizado o mesmo meio de cultivo utilizado durante a manutenção e sugerem que a retirada dos microrganismos deve ser precedida pela drenagem total da camada de óleo (PEREIRA et al., 2008; PASSADOR et al., 2010).
6.2.2. Manutenção em água esterilizada
A preservação em água destilada esterilizada ou também conhecida pelo método de Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em água esterilizada ou solução salina, sendo indicada na preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões osmóticas de soluções hipotônicas (PIMENTEL & FIGUEIREDO, 1989; COSTA & FERREIRA, 1991; NEUFELD & OLIVEIRA, 2008). Esta técnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com cerca de 10 a 15 dias, e busca redução do metabolismo, com consequente latência das células diante da restrição de fontes nutritivas (COSTA & FERREIRA, 1991; ABREU & TUTUNJI, 2004). O método se baseia na transferência de culturas para frascos contendo uma solução de água esterilizada, com posterior armazenamento a temperatura ambiente.
Apesar do baixo custo e reprodutibilidade, nota-se os riscos de contaminação das culturas e um possível comprometimento na estabilidade genética de alguns microrganismos. De uma forma geral, a utilização de água destilada esterilizada como meio de manutenção tem sido proposto com sucesso para bactérias fitopatógenas, esporos do gênero Bacillus e fungos (APARECIDO et al., 2001; NEUFELD & OLIVEIRA, 2008; PASSADOR et al. 2010). No entanto, esse método não é indicado para o cultivo de E. coli destinada a ensaios de biologia molecular.
6.2.3. Congelamento comum
O congelamento comum se baseia na conservação de microrganismos em temperaturas relativamente baixas entre -4 e -20 °C. Apresenta-se como um dos métodos de manutenção mais simples e baratos, além de oferecer boa segurança para o armazenamento de diversos microrganismos por períodos de três meses a dois anos, devido a uma redução significativa no metabolismo
