UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Gabriela Missassi
“Desfechos reprodutivos da terapia antioxidante com
Crisina na varicocele experimental em ratos”
“Reproductive outcomes of antioxidant therapy with
Chrysin in experimental varicocele in rats”
Campinas
2017
“Desfechos reprodutivos da terapia antioxidante com Crisina na varicocele
experimental em ratos”
“Reproductive outcomes of antioxidant therapy with Chrysin in experimental
varicocele in rats”
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural na área de Biologia Celular.
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Masters in Cellular and Structural Biology in the area of Cellular Biology.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA GABRIELA MISSASSI E ORIENTADA PELA DRA. WILMA DE GRAVA KEMPINAS.
Orientadora: Dra. Wilma De Grava Kempinas
Campinas 2017
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972 Missassi, Gabriela,
M691d MisDesfechos reprodutivos da terapia antioxidante com crisina na varicocele experimental em ratos / Gabriela Missassi. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
MisOrientador: Wilma De Grava Kempinas.
MisDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Mis1. Varicocele. 2. Estresse oxidativo. 3. Antioxidantes - Uso terapêutico. 4. Crisina. I. Kempinas, Wilma De Grava. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Reproductive outcomes of antioxidant therapy with chrysin in
experimental varicocele in rats
Palavras-chave em inglês:
Varicocele Oxidative stress
Antioxidants - Therapeutic use Chrysin
Área de concentração: Biologia Celular
Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora:
Wilma De Grava Kempinas [Orientador] André Luis Filadelpho
Talita Sarah Mazzoni
Data de defesa: 17-02-2017
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas (Orientadora)
Prof. Dr. André Luis Filadelpho
Profa. Dra. Talita Sarah Mazzoni
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
Esse trabalho é dedicado ao meus pais, Silvia e Luiz, as pessoas mais importantes da minha vida. Dedico a eles, que desde pequena fazem de tudo para conseguir um sorriso ou um simples abraço; que sempre fizeram de tudo pela minha felicidade mesmo quando isso exigia muito deles; que são meu exemplo de vida e de amor; e que me deixaram partir mesmo quando os olhos, cheio de lágrimas, me pediam para ficar. Obrigada mãe e pai! Te Namo!
A Deus, por me dar saúde e disposição para enfrentar os desafios diários, e por colocar em meu caminho pessoas maravilhosas, que contribuíram de diferentes formas para a realização desse sonho.
Ao Júnior, meu irmão, amigo, eterno cúmplice, e exemplo de bom humor e perseverança. Obrigada por todas as vezes que escutou, tão atentamente, meus desabafos e histórias sem fim; pelos conselhos e por ser o melhor irmão do mundo.
A minha orientadora Wilma De Grava Kempinas, que sempre acreditou em mim, mesmo nos momentos em que duvidei da minha capacidade. Há 7 anos entrei no laboratório como apenas uma aluna da biologia e é graças a senhora, que hoje, saio como uma pesquisadora. Obrigada pela confiança e por contribuir para meu crescimento pessoal e profissional.
A Cibele, pelos utas apertados e demonstrações públicas de afeto que me deixavam encabulada; pela companhia até altas horas no laboratório; por segurar a barra quando eu mais precisei e, principalmente, por nunca ter desistido da nossa amizade mesmo nos momentos mais nebulosos.
A Raquel, pela amizade mais sincera e verdadeira. Obrigada por me guiar nessa louca jornada; por me incentivar a sempre ser melhor; pelas conversas madrugada a fora; e por ter negligenciado as mitocôndrias tantas vezes. Tinha tudo para dar errado, mas se o destino nos fez gêmeas, é porque era para dar certo.
A Josi, que com seu jeito desastrado e nada delicado me divertiu horrores nesses anos e conquistou minha afeição e admiração. Obrigada por contribuir para a realização desse sonho, mas principalmente por me presentear com sua amizade.
A Patrícia, pela companhia e por ter me ajudado muito nesses dois anos. Você foi muito importante e fez toda diferença.
sensacionais.
Ao Lucas, meu namorado e melhor amigo, que entrou na minha vida de repente e me mostrou o verdadeiro significado de companheirismo. Obrigado por me ajudar nos momentos mais difíceis; por fazer meus dias mais felizes; por ser meu exemplo de dedicação e carinho; e por ser o melhor parceiro que poderia desejar.
A Bianca, por me surpreender, diariamente, com os recadinhos cheios de mimos e cantadas de pedreiro. Obrigada por me fazer sentir especial e, por inúmeras vezes, transformar uma cara amarrada em um sorriso desajeitado e tímido.
A Ana Flávia, que com sua alegria contagiante e dancinhas esquisitas transformou momentos de tensão em situações leves e descontraídas. Mesmo longe e apesar de me atormentar até nos sonhos, agradeço o carinho, apoio e amizade.
A Bruna, que sempre me acolheu com tanto carinho durante minhas passagens por Ribeirão Preto. Obrigada pelos anos de amizade e por fazer de uma simples visita um grande momento.
A minha eterna companheira de quarto Tamiris, por ouvir meus desabafos e aguentar meus descontroles durante todos esses anos. Obrigada pela amizade, parceria, conselhos, conversas profundas e por estar ao meu lado em mais essa conquista.
Ao José Eduardo que, além de oferecer um suporte técnico excelente, com bom humor e uma pitada de sarcasmo fez com que os dias fossem cheios de risos e conversas filosóficas.
Ao Dr. Fernando Barbosa Júnior e a Dra. Daisy Maria Favero Salvadori, que abriram as portas de seus laboratórios, nos quais fui muito bem recebida.
Obrigada por terem aceitado meu convite.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida no início do meu mestrado.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) pela bolsa concedida no segundo ano de mestrado, processo no 2015/26309-3.
Epígrafe
“An arrow can only be shot by pulling it backward.
When life is dragging you back with difficulties, it
means it is going to launch you into something
great. So just focus, and keep aiming.”
Autor desconhecido
A varicocele é caracterizada pela dilatação venosa do plexo pampiniforme decorrente do mau funcionamento ou ausência das válvulas presentes nas veias espermáticas. Acredita-se que a infertilidade associada a essa condição seja decorrente, principalmente, do aumento no estresse oxidativo. Por esse motivo e considerando seus impactos e alta incidência, várias terapias antioxidantes vêm sendo propostas visando melhorar os parâmetros espermáticos de homens com varicocele. A crisina, flavonoide encontrado em altas concentrações no mel, própolis e extratos vegetais, é conhecida como um potente agente antioxidante. Vários estudos observaram que esse composto apresentou efeito protetor contra os danos causados pelo estresse oxidativo, e teve um impacto positivo nos parâmetros espermáticos. Diante desse contexto, o presente trabalho avaliou aspectos da histofisiologia reprodutiva, com ênfase sobre a qualidade espermática e fertilidade de ratos com varicocele induzida cirurgicamente e os efeitos do tratamento com crisina sobre esses parâmetros. O estudo envolveu três experimentos e os animais foram divididos em 3 grupos: sham (controle), V1 (varicocele + 50mg/kg/dia de crisina diluída em veículo) e V2 (varicocele + veículo); os animais foram submetidos à cirurgia, porém, somente os grupos V1 e V2 tiveram a veia renal parcialmente ligada. Uma semana após a cirurgia foi iniciado o tratamento dos grupos V1 e V2 e, decorridos 56 dias, os animais foram eutanasiados. Não foram observadas alterações nos pesos dos órgãos reprodutores e corpóreo, bem como na histolopatologia do epidídimo. Entretanto, a análise testicular mostrou que os animais do grupo V2 apresentaram, apenas no lado esquerdo, maior número de túbulos seminíferos contendo anormalidades quando comparado aos demais grupos. As análises morfométricas revelaram que a varicocele diminuiu significativamente o diâmetro dos túbulos seminíferos no testículo esquerdo em comparação ao grupo sham e V1, além de apresentar redução significativa na altura do epitélio em relação ao grupo sham. Em relação a morfologia, contagens espermáticas dos testículos e epidídimos, bem como os níveis de testosterona, foram semelhantes entre os grupos experimentais. No entanto, o grupo V2 apresentou menor número de espermatozoides móveis em comparação ao grupo sham, e o tratamento com crisina, apesar de melhorar esse parâmetro, não teve diferenças significativas em relação aos demais grupos. No ensaio cometa, os animais do grupo V2 apresentaram, em ambos os lados, aumento
não diferiram significativamente entre os grupos. Entretanto, a varicocele promoveu um aumento significativo nos níveis testiculares de malondialdeído em relação ao grupo sham e V1, indicando que o tratamento com crisina foi eficaz no combate aos danos promovidos pelo estresse oxidativo. Com isso, concluímos que a varicocele comprometeu os parâmetros testiculares e espermáticos sem que a fertilidade fosse afetada e, o tratamento com a crisina foi capaz de amenizar os efeitos deletérios associados a essa condição.
Varicocele is characterized by venous dilatation of the pampiniform plexus due to the malfunction or absence of the valves present in the spermatic veins. It is believed that the infertility associated with this condition is mainly due to the increase in oxidative stress. For this reason and considering its impacts and high incidence, several antioxidant therapies have been proposed in order to improve sperm parameters of men with varicocele. Chrysin, a flavonoid found in high concentrations in honey, propolis and plant extracts, is known as a potent antioxidant. Several studies reported that this compound, besides having an excellent protective activity against the damages caused by oxidative stress, had a positive impact on the spermatic parameters. In this context, the present work evaluated aspects of the reproductive histophysiology, with emphasis on the sperm quality of rats with surgically induced varicocele and the potential effects of treatment with chrysin. The study involved three experiments and the animals were divided into 3 groups: sham (control), V1 (varicocele + 50mg/kg /day of chrysin diluted in vehicle) and V2 (varicocele + vehicle); the animals were submitted to surgery, however, only groups V1 and V2 had a partial occlusion of renal vein. One week after surgery, treatment of groups V1 and V2 started and, after 56 days, the animals were euthanized. No changes were observed in reproductive organs and body weight, as well as in the histolopathology of the epididymis. However, the testis analysis showed that the animals in the V2 group showed, only in ipsilateral side, larger number of seminiferous tubules containing abnormalities when compared to sham and V1 groups. The morphometric analyzes revealed that varicocele significantly decreased the diameter of seminiferous tubules in ipsilateral side comparing with sham and V1 groups, in addition it showed a significant reduction in the epithelium height in relation to sham group. Regarding the morphology, sperm counts in the testes and epididymis, as well as testosterone levels, were similar among experimental groups. However, the V2 group had the lowest number of mobile spermatozoa in comparison with sham group, and the treatment with chrysin, despite improving this parameter, did not have significant differences in relation to the other groups. In the comet assay, the animals of the V2 group showed, on both sides, a significant increase in the sperm DNA fragmentation when compared to sham and V1 groups. The parameters evaluated in the sexual behavior and in the fertility test did not differ significantly between the groups.
combating the damages promoted by oxidative stress. With this, we concluded that varicocele compromised testicular and sperm parameters without affecting fertility, and treatment with chrysin was able to alleviate the deleterious effects associated with this condition.
Introdução... 15 1. Testículo... 15 2. Varicocele... 17 2.1. Estudos em humanos... 20 2.2. Modelos experimentais... 23 2.3. Estudos em ratos... 25
3. Estresse Oxidativo e Qualidade Espermática... 27
3.1. Terapias Antioxidantes... 28 4. Crisina... 29 Justificativa... 31 Objetivos... 32 Manuscrito... 33 INTRODUCTION... 36
MATERIAL AND METHODS... 38
RESULTS... 44 DISCUSSION... 45 REFERENCES... ACKNOWLEDGMENTS... 48 53 Referências Bibliográficas da Introdução ... 59
Apêndices ... 68
Introdução
1. Testículo e Espermatozoide
Os testículos, órgãos pares que se localizam no escroto dos mamíferos, são envoltos por uma cápsula fibrosa denominada túnica albugínea e apresentam dois compartimentos: tubular e intersticial (Johnson et al., 2015). O interstício é composto por vasos sanguíneos e linfáticos, além de macrófagos e células de Leydig, sendo essas responsáveis pela produção de andrógenos, como a testosterona (Russel et al., 1990). O compartimento tubular consiste de túbulos enovelados,cuja parede interna é formada pelo epitélio germinativo que contém as células de Sertoli (células somáticas) e células germinativas. A parede externa é envolta pela lâmina basal, tecido conjuntivo e células mioides ou peritubulares, sendo essas responsáveis pela contração rítmica dos túbulos (Weinbauer et al., 2010; Junqueira e Carneiro, 2013).
A espermatogênese é um processo cíclico, que ocorre nos testículos, no qual as células germinativas, através de sucessivas divisões, dão origem aos gametas masculinos, os espermatozoides (Clermont, 1972). Além de envolver as células germinativas propriamente ditas, o processo depende da ação das células de Sertoli e células de Leydig.
Além de formar a barreira de células de Sertoli, o que permite a compartimentalização do epitélio germinativo e consequentemente a criação de um ambiente altamente especializado e protegido do sistema imune e da entrada de agentes tóxicos, as células de Sertoli atuam na manutenção da integridade estrutural do epitélio germinativo; oferecem suporte nutricional para células germinativas; secretam proteínas importantes para a espermatogênese como a proteína ligadora de andrógenos-ABP (androgen-binding protein); fagocitam células germinativas em degeneração e corpos residuais provenientes de espermátides (Johnson et al., 2015; Russel et al., 1990).
Outro tipo celular que auxilia na manutenção desse processo é a célula de Leydig, cuja função é produzir andrógenos, principalmente testosterona. Vale ressaltar que o bom funcionamento tanto das células de Sertoli quando de Leydig depende da secreção do hormônio folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), respectivamente.
Em mamíferos, a espermatogênese dura em média 30 a 75 dias e pode ser dividida em 3 fases: proliferativa, meiótica e de diferenciação. Na primeira fase, as espermatogônias,
células imaturas e diploides, passam por sucessivas divisões mitóticas e dão origem a diversas gerações de células germinativas que podem continuar a se dividir (espermatogônias do tipo A), ou entrar em meiose (espermatogônias do tipo B) e originar os espermatócitos primários. Durante a segunda fase do ciclo, essa nova população sofre a primeira divisão meiótica formando células haploides, os espermatócitos secundários que, posteriormente, originarão as espermátides. Na última fase, através do processo denominado espermiogênese, cada espermátide sofre citodiferenciação e da origem a uma célula altamente especializada, o espermatozoide (Figura 1) (Russel et al., 1990; França et al., 2005; Junqueira e Carneiro, 2013).
Figura 1: Desenho esquemático que mostra os tipos celulares encontrados nos túbulos
seminíferos do testículo, ducto eferente, epidídimo e ducto deferente. Além disso, também é evidenciado, na região da cabeça do epidídimo, um espermatozoide contendo gota citoplasmática. Fonte: Adaptado de Krawetz (2005).
Após a espermiogênese, os espermatozoides imaturos são transportados para fora do testículo através de uma rede altamente anastomosada de canais, que direciona essas células aos ductos eferentes. Esses, por sua vez, desembocam no ducto epididimário, local onde os espermatozoides sofrerão maturação e serão estocados (Figura 1) (Johnson et al., 2015).
O processo de maturação ocorre à medida que essas células transitam pelo epidídimo e envolve uma série de modificações no espermatozoide, tais como perda da gota citoplasmática, aquisição de motilidade progressiva, capacidade fértil e habilidade de sofrer reação acrossomal (Yanagimachi et al., 1994). Para que todas essas modificações sejam realizadas de maneira adequada, o espermatozoide precisa permanecer no epidídimo por um
tempo determinado, que varia de espécie para espécie (França et al., 2005). Em homens, o trânsito espermático dura cerca de 6 dias, sendo 2 dias na cabeça/corpo e 4 dias na cauda, e em ratos 8 a 10 dias, sendo 3 na cabeça/corpo e 5 na cauda (França et al., 2005).
Em um estudo conduzido por Fernandez et al (2008), os autores observaram que tanto o sistema nervoso simpático, uma vez que este atua sobre a contratilidade da camada muscular que recobre o órgão, quanto a testosterona promoveram alterações no tempo de transito através do epidídimo e comprometeram a motilidade espermática e o potencial fértil de ratos adultos. O comprometimento da qualidade espermática deve-se ao fato dos espermatozoides permanecerem por menor tempo em contato com o microambiente luminal. Esse ambiente altamente especializado é mantido pelos diferentes tipos celulares presentes no epitélio desse órgão, uma vez que esses são responsáveis pela secreção e absorção de proteínas, estão envolvidos com o processo de endocitose e desempenham o papel de células imunes (Robaire et al., 2006).
Por fim, uma vez maturados, os espermatozoides são concentrados e armazenados na região da cauda do ducto epididimário até que a ejaculação ocorra. Durante a ejaculação os gametas são lançados no ducto deferente, seguindo até uma região dilatada dessa estrutura (ampola), na qual recebem os fluidos provenientes da glândula vesicular e da próstata. O fluido seminal formado é composto principalmente por proteínas e carboidratos, que são extremamente importantes para o metabolismo e motilidade espermática (Risbridger e Taylor, 2006; Junqueira e Carneiro, 2013).
2. Varicocele
Estima-se que a varicocele seja o principal fator responsável pela infertilidade masculina, atingindo em torno de 15% da população jovem e adulta. Dentre esses indivíduos, 35% apresentam infertilidade primária, ou seja, homens que não conseguiram conceber um filho, e 70-81% infertilidade secundária, que corresponde aos homens que já tiveram um ou mais filhos, porém têm dificuldade em conseguir obter uma nova gravidez (WHO, 1992; Smith et al., 2006). A incidência da varicocele aumenta aproximadamente 10% para cada década de vida, podendo atingir até 75% dos homens acima dos 80 anos (Levinger et al., 2007).
Essa condição é conhecida por apresentar caráter progressivo (Witt e Lipshultz, 1993), hereditário (Raman et al., 2005; Mokhtarl et al., 2008; Gokçe et al., 2010), sendo caracterizada
pela dilatação venosa do plexo pampiniforme devido à ausência ou mal funcionamento das válvulas presentes nas veias espermáticas (Naughton et al., 2001).
O plexo pampiniforme é formado por uma rede de pequenas veias anastomosadas que irriga os testículos, sendo responsável por resfriar o sangue que entra neste órgão. Esse sistema de resfriamento é extremamente importante, uma vez que a temperatura testicular é 1 - 2o C menor que a temperatura corporal, e que, quaisquer alterações nesse padrão podem
causar um impacto na espermatogênese (Harrison e Weiner, 1949; Einer-Jensen e Hunter, 2005).
O mecanismo de ação desse sistema envolve a transferência contra-corrente, ou seja, o sangue presente nas artérias testiculares perde calor para o sangue venoso resfriado que sai do testículo (Figura 2), entrando no órgão com uma temperatura semelhante a do mesmo. Portanto, em indivíduos com varicocele, devido à dilatação do plexo pampiniforme e a estase venosa desencadeada por essa condição, a transferência de calor é comprometida e consequentemente a temperatura testicular alterada (Einer-Jensen e Hunter, 2005).
Figura 2: Esquema que mostra o modelo de transferência de calor contra-corrente entre o
sangue presente nas veias que compõem o plexo pampiniforme e as artérias testiculares. Em um estudo conduzido por Chakraborty et al. (1985), ao compararem biópsias feitas nos testículos de homens com e sem varicocele, os autores documentaram que em indivíduos com essa condição a estase venosa foi tão severa, que não era possível observar o limite entre a membrana das células sanguíneas e das células endoteliais. Com isso, concluíram que além da temperatura testicular ser comprometida, o sangue desoxigenado, por permanecer mais tempo no tecido, poderia fazer com as células entrassem em estado de
Frio Frio Quente Direção do fluxo
Testículo
Corpo
Artéria s Veia Quentehipóxia. Como resultado dessas alterações, a maior parte dos pacientes apresentou danos testiculares moderados a severos, evidenciados pela falta de células em estágios mais avançados da espermatogênese e ausência de espermátides em processo de maturação ou pela ausência total de células germinativas. Adicionalmente, Pasqualotto et. al. (2005), observaram que a varicocele promoveu uma redução significativa no volume testicular, concentração e motilidade espermática de pacientes, concluindo que essa condição promove uma perda gradual da espermatogênese em detrimento da estase venosa e aumento na temperatura testicular, causando danos celulares progressivos que levam à infertilidade.
Apesar de ser encontrada em ambos os lados, a prevalência da varicocele é no testículo esquerdo (Damsgaard et al., 2016) e isso se deve ao fato da veia espermática interna esquerda estar verticalmente posicionada (considerando um homem ereto) e se inserir na veia renal esquerda formando um ângulo reto, enquanto a veia espermática direita encontra-se em posição mais inclinada e encontra-se inencontra-sere na veia cava inferior (Figura 3) (Sofikitis et al., 1993). Por muitos anos essa condição foi considerada unilateral, porém, atualmente, diversos estudos descrevem um caráter bilateral, afetando ambos os testículos (Gat et al., 2004, Ozturk et al., 2013). Uma das hipóteses que explica essa bilateralidade é devido a presença de uma comunicação venosa entre as veias espermáticas internas esquerda e direita (Cockett et al., 1998). Além disso, estudos utilizando o rato como modelo experimental mostram que o sistema nervoso simpático também pode estar envolvido nesta patologia (Ozturk et al., 2001).
Figura 3: Desenho esquemático mostrando a veia renal (VR) direita e esquerda, cava inferior
(VCI), espermática interna (VEI) direita e esquerda e a rede de pequenos vasos que compõem o plexo pampiniforme (PP) (A). Plexo pampiniforme em um indivíduo normal e com varicocele (B). Fonte: Adaptado de
http://radiologykey.com/duplex-ultrasound-evaluation-of-the-male-genitalia/ e
http://www.mayoclinic.org/diseasesconditions/varicocele/multimedia/varicocele/img-20007441.
2.1. Diagnóstico e Efeitos na Qualidade Espermática
A infertilidade é considerada um dos principais problemas de saúde pública que afeta cerca de 10 a 15% dos casais (Kliesch, 2014). Essa condição, segundo World Health Organization (2010), é definida como a incapacidade de um casal sexualmente ativo, que não faz uso de quaisquer métodos contraceptivos, gerar um filho no período de 1 ano. Os distúrbios envolvendo o sexo masculino são responsáveis por 40 a 50% dos casos de infertilidade e compreendem fatores idiopáticos, infecções, criptorquidismo, câncer, varicocele, dentre outros (Tuttelmann e Niechlag, 2010; Kliesch, 2014).
O diagnóstico da varicocele é feito através da avaliação do histórico médico e reprodutivo do paciente, análise de no mínimo duas amostras seminais e exame físico, no qual
PP VEI VR VCI Normal Varicocele Testículo
o indivíduo realiza a manobra de Valsalva, que consiste na tentativa de exalar o ar com a boca ou o nariz fechados. Além dessas, outras abordagens auxiliares como termografia, venografia e ultrassonografia escrotal de Doppler também podem ser utilizadas, porém são recomendadas somente para pacientes com diagnóstico inconclusivo ou com varicocele palpável (Cockett et al., 1998; The Male Infertility Best Practice Policy Committee of the American Urological Association, 2004; Khera e Lipshultz, 2008). De acordo com o exame clínico, a varicocele pode ser categorizada em três graus: grau 1 (pequenas) são palpáveis somente quando o paciente está em pé e realiza a manobra de Valsalva; grau 2 (médias) são palpáveis quando o paciente está em pé, sem a necessidade de realizar a manobra; grau 3 (grandes) são detectadas visualmente e palpáveis quando o paciente está em pé (Dubin e Amelar, 1977; Masson e Brannigan, 2014).
Atualmente, a intervenção cirúrgica (varicocelectomia) é o tratamento mais indicado e a maior parte dos trabalhos a considerem um método eficaz, pois melhora os parâmetros seminais, hormonais e férteis (Schatte et al., 1998; Mostafa et al., 2001; Hsiao et al., 2013; Abdel-Meguid et al., 2014). Contudo, seus efeitos no potencial fértil do homem ainda são controversos devido à grande variabilidade das populações estudadas, às diferenças nos critérios de inclusão e exclusão, aos delineamentos experimentais que nem sempre são adequados e à falta de dados pré e pós-operatórios (Masson e Brannigan, 2014).
Ainda que tenha alta prevalência e seja conhecida há anos, os mecanismos pelos quais essa condição compromete a fertilidade ainda não foram totalmente elucidados. Vários fatores têm sido atribuídos a sua ocorrência entre eles, estase venosa que leva a hipóxia e hipertermia testicular, refluxo de metabólitos adrenais e renais tóxicos, disfunção hormonal, aumento do estresse oxidativo e de danos no DNA do espermatozoide (Marmar, 2001; Naughton et al, 2001; Khera e Lipshultz, 2008; Blumer et al., 2011; Masson e Brannigan, 2014).
Um dos principais e mais recorrentes efeitos documentados em estudos comparativos entre homens com e sem varicocele referem-se as alterações nos parâmetros seminais (WHO, 1992; Zini et al., 2000; Smith et al., 2006; Blumer et al., 2008; Hosseinifar et al., 2013; Agarwal et al., 2016). Em uma pesquisa realizada por Damsgaard et al. (2016) dos 7035 homens investigados, 1102 (15,7%) apresentaram varicocele nos diferentes graus e diminuição na concentração, motilidade, morfologia e contagem espermática. Adicionalmente, apesar da testosterona permanecer inalterada, foi observado aumento nos níveis de LH e FSH e redução na inibina B à medida que o grau da varicocele aumentava,
indicando que essa condição, possivelmente, exerceu impacto negativo sobre as células de Leydig e consequentemente na espermatogênese. Ainda que este estudo tenha avaliado um grande número de homens, os efeitos da varicocele nos parâmetros seminais e níveis hormonais, ao mesmo tempo que corroboram com alguns trabalhos, conflitam com diversos outros (Smith et al., 2006;Goulis et al., 2011; Han et al., 2016).
Além da avaliação hormonal e da qualidade espermática, abordagens a nível molecular vem sendo utilizadas a fim de desvendar os mecanismos envolvidos na varicocele. Hosseinfair et al. (2013) e Chan et al. (2013) identificaram diferenças na expressão de 15 proteínas presentes nos espermatozoides de homens com varicocele grau 3 e 2 em relação a amostras de homens normais. Muitas dessas proteínas que estão associadas direta ou indiretamente ao desenvolvimento, estrutura e função do espermatozoide tiveram seus níveis alterados, fato que reflete diretamente na qualidade dessas células. Ademais, Aquila et al. (2015) observaram uma redução nos níveis da enzima conversora de testosterona, 5α-redutase, nos espermatozoides de pacientes com varicocele de grau 3, evidenciando outra via pela qual a varicocele pode comprometer a fertilidade.
Diversos relatos na literatura também têm documentado alterações nos níveis das espécies reativas de oxigênio (ERO) (Allamaneni et al., 2004; Agarwal et al., 2016; Barekat et al., 2016) e diminuição da capacidade antioxidante seminal de homens com varicocele (Hendin et al., 1999; Pasqualotto et al., 2000; Agarwal et al., 2009), sugerindo que o estresse oxidativo seja o principal responsável pela disfunção espermática causada por essa condição. Em um estudo comparativo entre homens normais e pacientes com varicocele férteis e inférteis, foi observado altos níveis de ERO nos homens com varicocele, independente do status reprodutivo (férteis ou inférteis), e esse parâmetro apresentou correlação negativa com a concentração e motilidade espermática (Smith et al., 2006). De maneira semelhante, Pasqualotto et al. (2000) observaram uma relação negativa entre a capacidade antioxidante total, morfologia e motilidade espermática de pacientes com varicocele.
Associados ao estresse oxidativo estão a fragmentação do DNA do espermatozoide (Barekat et al., 2016; Cho et al., 2016; Damsgaard et al., 2016) e comprometimento da integridade acrossomal (Blumer et al., 2011). As ERO, quando presentes em altas concentrações, além de induzirem a capacitação e reação acrossomal prematura (Blumer et al., 2011), tendem a atacar o DNA do espermatozoide causando danos irreparáveis
(Argawal et al., 2012). Consequentemente, a habilidade do espermatozoide de penetrar na zona pelúcida e a fertilização em si são comprometidos.
Finalmente, alterações na atividade mitocondrial também foram encontradas na presença da varicocele. Agarwal et al. (2016), ao avaliarem espermatozoides do ejaculado de pacientes inférteis e com varicocele, observaram reduções significativas na expressão de proteínas essenciais do complexo transportador de elétrons mitocondrial e de enzimas do ciclo de Krebs, fato que indica um estado de hipóxia. Complementarmente, Blumer et al. (2011) verificaram aumento na porcentagem de espermatozoides com mitocôndrias inativas e atrelaram esse evento à provável inibição de enzimas responsáveis pela fosforilação oxidativa.
Em suma, apesar da literatura conter ampla variedade de trabalhos que, através de diferentes abordagens, exploram os danos causados pela varicocele e os mecanismos subjacentes à essa condição, o conflito entre os resultados dificulta a compreensão de sua fisiopatologia. Por esse motivo, é necessário realizar estudos que avaliem um conjunto de parâmetros em populações bem definidas, correlacionando com dados pré-existentes.
2.2. Modelos experimentais
O motivo pelo qual muitas questões relacionadas à fisiopatologia da varicocele ainda não terem sido esclarecidas deve-se a dois principais fatores. O primeiro refere-se ao escasso acesso a amostras biológicas de pacientes. A obtenção desse material é extremamente limitada, uma vez que procedimentos experimentais invasivos não são permitidos, o que reduz o número amostral à valores não aceitáveis. Além disso, a falta de dados epidemiológicos coesos e bem delineados, que considerem os graus de varicocele, relação entre idade, fatores ambientais e saúde geral faz com que esses estudos expressem dados incompletos ou abertos a inúmeras interpretações (Turner, 2001).
Assim, o uso de modelos animais é extremamente importante, pois permite investigar o desenvolvimento dessa condição, bem como as questões fisiológicas envolvidas nesse processo. Uma vez que, a varicocele não se desenvolve naturalmente em animais quadrúpedes, a lesão deve ser induzida cirurgicamente através da oclusão parcial da veia renal esquerda (Figura 4) medialmente à inserção da veia espermática interna esquerda (Saypol et al., 1981; Turner, 2001).
Figura 4: Ilustração da veia renal esquerda e tributárias em condições normais (A) e após a
oclusão parcial realizada no modelo de indução da varicocele no lado esquerdo (B). VR: veia renal; VEI: veia espermática interna; Ur: ureter; VU: veia uretral. Fonte: Adaptado de Turner (2001).
Dentre os modelos animais encontrados na literatura temos o coelho, cão, macaco e rato. Estudos realizados em coelhos mostram que os animais submetidos a cirurgia de indução da varicocele apresentaram alterações nos parâmetros seminais e férteis e que a varicocelectomia foi capaz de reverter os danos causados por essa condição (Sofikitis et al., 1992). Kay et al. (1979) observaram diminuição significativa na contagem e motilidade espermática, aumento no número de espermatozoides com morfologia alterada e na temperatura testicular em ambos os testículos de macacos Rhesus com varicocele induzida. Outro estudo envolvendo macacos também verificou um aumento expressivo na temperatura testicular dos animais, bem como alterações no epitélio germinativo e na formação do acrossomo 18 meses após a cirurgia (Fussel et al., 1981). Em relação aos trabalhos envolvendo cães, foram constatadas alterações histológicas (Saypol et al., 1981) e diminuição na contagem e motilidade espermática (Al-Juburi et al., 1979).
É evidente que a maior parte dos estudos envolvendo os animais acima mencionados datam de décadas passadas, e isso deve-se ao fato do rato ser o modelo mais estudado atualmente.
2.2.1 Estudos em ratos
Os baixos custos, associados à experimentação animal e as similaridades anatômicas compartilhadas com os humanos, fazem do rato o modelo experimental mais utilizado atualmente. Em estudo realizado por Turner e Howards (1994), os autores compararam a anatomia venosa da varicocele induzida em ratos com a varicocele que ocorre naturalmente em homens e observaram que a vasculatura do modelo experimental reage de maneira muito semelhante à do humano quando há compressão da veia renal esquerda (Figura 5). Esse evento, em ambas espécies, culminou em uma redistribuição do fluxo sanguíneo para uma rota alternativa à veia espermática, terminando na veia ilíaca. Os resultados levaram os autores a concluir que as similaridades anatômicas e as respostas fisiológicas fazem do modelo de varicocele experimental em ratos uma abordagem apropriada para o estudo da fisiopatologia dessa condição.
Figura 5: Anatomia vascular em condições normais no homem (A) e no rato (C) e após o
desenvolvimento natural da varicocele no homem (B) e da varicocele experimental induzida no lado esquerdo do rato (D), mostrando as principais veias que servem como rotas do fluxo sanguíneo testicular. T: testículo; R: rim; AD: adrenal; PP: plexo pampiniforme; VR: veia renal; VCI: veia cava inferior; VEP: veia espermática interna; IL: veia ileolombar; VU: veia uretérica; VIC: veia ilíaca comum. Fonte: Adaptado de Turner e Howards (1994).
A B C D VCI VCI VR VR IL R R AD AD T T VU PP
Um dos primeiros estudos que mostram os efeitos da varicocele em ratos adultos foi desenvolvido por Saypol (1981), no intuito de avaliar as alterações na fisiologia testicular subsequentes à cirurgia. Neste trabalho, o autor observou aumento no fluxo sanguíneo e temperatura em ambos os testículos dos animais com varicocele quando comparados ao controle.
Adicionalmente aos eventos fisiológicos, vários autores relataram alterações no testículo decorrentes da varicocele experimental. Entre elas, diminuição do volume testicular (Mendes et al., 2016; Jang et al., 2012), desorganização do epitélio germinativo, aumento no número de células apoptóticas (Bayomy et al., 2012; Celik et al., 2013; Bolat, 2016), espessamento da membrana basal (Abdel-Dayem, 2009; Bayomy et al., 2012), diminuição no número de células de Leydig (Al-Rubiey, 2012; Ozturk et al., 2013;Gokhan-Kose et al., 2014), diâmetro dos túbulos seminíferos (Ko et al., 2010;Bayomy et al., 2012; Soares et al., 2013) e altura do epitélio germinativo (Razi et al., 2011; Jang et al., 2012).
Uma das possíveis causas que levam às alterações histológicas mencionadas acima é a diminuição nos níveis de testosterona intratesticular. Rajfer et al. (1987) relataram que a varicocele experimental promoveu diminuição significativa na atividade das enzimas 17α- Hidroxilase e 17,20- Desmolase, responsáveis pela via biossintética de testosterona no testículo. Da mesma maneira, Zheng et al. (2008) observaram um progressivo e expressivo declínio nos níveis de testosterona intratesticular à medida que a duração da varicocele aumentava. Outra provável explicação para disfunção espermatogênica está relacionada ao comprometimento da barreia de células de Sertoli devido ao aumento de citocinas pró-inflamatórias como TNFα, Il1α e Il6 (Oh et al., 2016).
Em relação a alta incidência de células apoptóticas, acredita-se que o mecanismo envolvido esteja relacionado ao aumento na expressão de proteínas pró-apoptóticas como caspase (Bayomy et al., 2012) e ligante indutor de apoptose relacionada a TNF-TRAIL- (Celik et al., 2013), atrelado a diminuição na expressão de proteínas anti-apoptóticas como a survivina e proteína inibitória de apoptose neural-NAIP (Minutoli et al., 2015).
Além das modificações sofridas no testículo, os parâmetros espermáticos, na maior parte dos estudos, também são afetados. Razi et al. (2011) observaram uma diminuição na contagem e motilidade espermática, aumento no número espermatozoides com morfologia alterada e redução no número de fetos após o acasalamento natural de ratos com varicocele. Do mesmo modo, Mendes et al. (2016) constataram que a varicocele afetou de
maneira negativa não só a motilidade e morfologia, mas também a integridade do acrossomo e a atividade mitocondrial dos espermatozoides, e que esses danos foram parcialmente revertidos frente ao tratamento com resveratrol.
Assim como sugerido em estudos realizados com homens, acredita-se que o estresse oxidativo seja o principal fator associado à queda na qualidade espermática de ratos com varicocele induzida. As alterações no microambiente e na hemodinâmica do testículo podem resultar no aumento na produção de ERO e/ou queda na capacidade antioxidante (Agarwal et al., 2009). Diversos estudos relatam que os ratos com varicocele induzida apresentam altos níveis de ERO (Ozturk et al., 2001; Jafari et al., 2010;Gholirad et al., 2016) e que a terapia adjuvante com antioxidantes permite reestabelecer esses níveis e melhorar a qualidade espermática (Moshtaghion et al., 2013; Sohrabipour et. al., 2013; Khosravanian et al., 2015; Mendes et. al., 2016).
3. Estresse oxidativo e qualidade espermática
Estresse oxidativo é uma condição biológica decorrente do desequilíbrio entre a produção de moléculas instáveis, altamente reativas e derivadas do oxigênio e a defesa antioxidante do corpo. Essas moléculas, também conhecidas como espécies reativas de oxigênio, em concentrações adequadas, são extremamente importantes para diversos fenômenos biológicos, incluindo a capacitação e hiperativação do espermatozoide e fusão desse com o oócito (Lamirande e O'Flaherty, 2008; Rivlin et al., 2004).
Sabe-se que o peróxido de hidrogênio (H2O2), em baixas concentrações, exerce
impacto positivo sobre a capacitação espermática, estimulando a fosforilação da tirosina em diversas proteínas, evento importante na cascata de sinalização desse processo (Rivlin et al., 2004). Adicionalmente, baixos níveis de H2O2 também são essenciais para que a reação
acrossomal ocorra, entretanto quando esses níveis se elevam, a reação ocorre prematuramente, reduzindo a capacidade do espermatozoide em penetrar na zona pelúcida do oócito (Hsu et al., 1999).
Quando presentes em altas concentrações, as ERO, por serem muito reativas, podem causar danos em membranas biológicas (Yoshikawa e Naito, 2002) e interferir em mecanismos celulares através da degradação e/ou modificação de proteínas e lipídios e alterações no citoesqueleto (Hinshaw et al., 1986; Comporti, 1989).
Por esse motivo, o DNA nuclear e mitocondrial das células germinativas são potenciais alvos das ERO. Estudos mostram que o DNA presente na mitocôndria dessas células é altamente susceptível aos danos promovidos pelo peróxido de hidrogênio, indicando que essa moléculaé um sensível biomarcador de estresse oxidativo (Sawyer et al., 2001). Por outro lado, apesar do DNA nuclear estar altamente compactado e o espermatozoide apresentar defesas antioxidantes, a exposição dessas células à ERO aumenta significativamente a fragmentação do material genético através de quebras em uma ou ambas as fitas do DNA (Duru et al., 2000).
Dentre os processos desencadeados pelo estresse oxidativo, a peroxidação lipídica tem recebido maior atenção nos últimos anos, sendo objeto de estudo de diversos pesquisadores. Segundo Sharma e Argawal (1996), peroxidação lipídica pode ser definida como degradação oxidativa de lipídios e tem como principal produto o malondialdeído (MDA). Considerando-se o fato dos espermatozoides apresentarem alto grau de ácidos graxos poli-insaturados, essas células especializadas tornam-se potenciais alvos desse processo (Aitken et al., 2014). Suleiman et al. (1996), ao avaliarem homens astenospérmicos, constataram que a medida que os níveis de MDA aumentavam, a motilidade espermática diminuía e a suplementação com vitamina E foi capaz reverter esses parâmetros e aumentar as chances de concepção. Além disso, esse produto também apresentou uma correlação positiva com o número de anormalidades encontradas nos espermatozoides, principalmente as relacionadas com a peça intermediária (Rao et al., 1989).
Por fim, além de impactar negativamente a qualidade espermática, o estresse oxidativo pode comprometer as defesas antioxidantes. Em um estudo conduzido por Davies (1987), o autor constatou que o radical hidroxila, além de alterar o peso e carga da catalase, superóxido dismutase e peroxidase, principais enzimas antioxidantes, também foi responsável pelo aumento da susceptibilidade à proteólise em detrimento de seu mau empacotamento.
3.1. Terapias Antioxidantes no Tratamento da Varicocele
Apesar da varicocelectomia ser o método de escolha no tratamento da varicocele, diversos trabalhos vêm explorando os efeitos das terapias adjuvantes com antioxidantes em pacientes e em modelos animais com varicocele (Garg e Kumar, 2016). A atividade protetora
contra os danos causados pelo estresse oxidativo juntamente com a melhora promovida nos parâmetros seminais, fazem dessas substâncias uma solução considerável nesses casos.
Um estudo preliminar mostrou que homens, após serem submetidos a cirurgia de correção da varicocele e tratados por 3 meses com 200 mg de N-acetil-L-cisteína, apesar de não apresentarem melhoras significativas nos parâmetros seminais, tiveram maior número de espermatozoides com DNA íntegro quando comparados ao grupo não tratado, indicando um possível papel protetor deste antioxidante (Bakerat et al., 2016). Da mesma maneira, homens tratados por 6 meses com sulfato de zinco após a varicocelectomia apresentaram melhora significativa nos parâmetros endócrinos e na capacidade antioxidante seminal (Nematollahi- Mahani et al., 2014). Outros antioxidantes como coenzima Q10 (Festa et al., 2014) e cinnoxicam (Cavallini et al., 2003) promoveram efeitos benéficos sobre os parâmetros espermáticos de homens inférteis e com varicocele após 3 meses de tratamento e de homens com varicocele de grau 3 após 2 meses, respectivamente.
Em ratos induzidos experimentalmente à varicocele, também foi evidenciado impacto positivo do tratamento com L-carnitina (Akdemir et al., 2014), semente de linho, vitamina E (Sohrabipour et al., 2013) e resveratrol (Mendes et al., 2016) sobre a qualidade espermática.
4. Crisina
Outro antioxidante que vem ganhando bastante atenção é a crisina, também conhecida como 5,7-dihidroxiflavona. Essa flavona natural pode ser encontrada em altas concentrações no mel, própolis e extratos de determinadas plantas (Kasala et al., 2015). Esse composto, além de ser conhecido por ser um potente agente antioxidante (Pushpavalli et al., 2010), possui atividade antineoplásica (Kasala et al., 2015), anti-inflamatória (Darwish et al., 2014; Rauf et al., 2015), anti-hipertensiva (Villar et al., 2002) e antienvelhecimento (Souza et al., 2015). Os efeitos benéficos vinculados a essa substância estão relacionados ao seu mecanismo de ação que, através da inibição da enzima CYP19 pertencente a superfamília do citocromo P450, impede a aromatização da testosterona e, consequentemente, a conversão desse hormônio em estrogênio (Kellis e Vickery, 1984; Sanderson et al., 2004).
Devido sua ótima capacidade antioxidante, diversos trabalhos mostram que a crisina tem efeito protetor contra danos de DNA decorrentes da exposição ao metilmercúrio
in vivo (Manzolli et al., 2015), atividade hepatoprotetora frente a intoxicação por d-galactosamina (Pushpavalli et al., 2010) e ao tratamento com quimioterápicos (Rehman et al., 2014; Ali et al, 2014). Além disso, também previne os efeitos nefrotóxicos desencadeados pela exposição à dioxina (Ciftci et al., 2012) e atenua os processos inflamatórios e oxidativos desencadeados após a isquemia (Yao et al., 2014).
Por outro lado, a atividade antiesteroidal associada à crisina torna interessante o estudo desse fármaco sobre o sistema reprodutor em condições normais ou que envolvam alterações nos níveis androgênicos. O primeiro trabalho que mostra os efeitos da crisina no sistema genital foi conduzido por Jana et al. (2008) que, ao incubarem células de Leydig de camundongos com esse composto, observaram aumento expressivo na produção de testosterona em relação ao controle. Através de uma outra abordagem, foi demonstrado que o tratamento de ratos machos adultos com 50mg/kg/dia de crisina por 60 dias, foi capaz de melhorar significativamente a concentração e motilidade espermática, níveis de testosterona e de enzimas antioxidantes (Ciftci et al., 2011). Além de melhorar os parâmetros espermáticos, segundo Dhawan et al. (2002), a crisina exerceu impacto positivo sobre a fertilidade de ratos idosos tratados por 30 dias. Mais recentemente, um trabalho publicado por Aksu et al. (2016) mostrou que essa flavona foi capaz de atenuar os danos reprodutivos promovidos pela exposição ao paracetamol.
Em razão dos efeitos benéficos da crisina sobre a qualidade e performance reprodutiva e da capacidade de reestabelecer o equilíbrio prooxidante da célula, esse fármaco torna-se um potencial agente terapêutico para o tratamento da varicocele, uma vez que, os danos causados por essa condição envolvem, principalmente, o aumento do estresse oxidativo.
Justificativa
Devido à grande incidência da varicocele, atualmente um dos principais fatores comprometedores da fertilidade humana e cujos efeitos sobre o potencial fértil ainda são controversos, a comunidade científica tem realizado diferentes estudos a fim de desvendar os mecanismos pelos quais essa condição compromete a fertilidade. No entanto, apesar de novas terapias para intervenção à doença terem sido testadas ainda não se conseguiu estabelecer estratégias terapêuticas totalmente seguras e eficazes, assim sendo, são extremamente importantes estudos com novas substâncias que incorporem conhecimento a essa importante condição. Nesse sentido, diante dos danos reprodutivos causados pela varicocele, pela necessidade de encontrar tratamentos complementares às intervenções já conhecidas e pelo fato da crisina ser um ótimo agente capaz de proteger um organismo de danos promovidos pelo estresse oxidativo, faz-se necessário uma investigação mais detalhada e abrangente, na qual se avalie os efeitos da terapia com crisina em ratos com varicocele induzida cirurgicamente.
Objetivos
O presente estudo teve como objetivo avaliar os danos promovidos pela varicocele experimental na qualidade espermática e fertilidade de ratos adultos e os possíveis efeitos protetores do tratamento com crisina após 56 dias, período que compreende, em média, a duração da espermatogênese desses animais.
Objetivos específicos:
- Investigar os efeitos da varicocele sobre qualidade espermática 56 dias após a cirurgia de indução.
- Investigar se o tratamento com crisina, um antioxidante, seria capaz de proteger dos danos promovidos pela varicocele.
A abordagem utilizada nesse estudo compreendeu a investigação do peso dos órgãos reprodutores, análises seminais (contagem, motilidade e morfologia espermáticas), histopatológicas (testículo e epidídimo) e morfométricas (testículo), dosagem de testosterona sérica e intratesticular, ensaio cometa no espermatozoide, avaliação do comportamento sexual seguido de teste de fertilidade e determinação dos níveis de peroxidação lipídica no testículo.
Manuscrito
Este trabalho deu origem ao manuscrito “Chrysin administration protects against oxidative damage in varicocele-induced adult rats” que será submetido ao periódico “Fertility and Sterility” (fator de impacto: 4,42).
Chrysin administration protects against oxidative damage in varicocele-induced adult rats
Running title: Chrysin ameliorates rat varicocele
Gabriela Missassi, B.Sc.,a* Cibele dos Santos Borges M.Sc.,a Josiane de Lima Rosa, M.Sc.,a
Patrícia Vilella e Silva, M.Sc.,a Airton da Cunha Martins Junior, M.Sc.,b Fernando Barbosa
Júnior, Ph.D., b Janete Aparecida Anselmo-Franci, Ph.D.,c and Wilma De Grava Kempinas,
Ph.D.a
a Department of Morphology, São Paulo State University (Unesp), Institute of Biosciences,
Botucatu, São Paulo; b Department of Clinical Analyses, Toxicology and Food Sciences, School
of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo; and c Department of Morphology, Stomatology and Physiology, School of Dentistry,
Universidade of São Paulo-USP, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.
*Graduate Program in Cell and Structural Biology, UNICAMP – University of Campinas, Campinas, SP, Brazil
Corresponding author: Gabriela Missassi
Department of Morphology, Institute of Biosciences, Univ Estadual Paulista-UNESP. Distrito de Rubião Jr, s/n, 18618-970, Botucatu, SP, Brazil.
Phone number: +55 14 3880-0476
E-mail adress: gabby_missassi@hotmail.com
Capsule: Chrysin treatment protected testicular tissue and epididymal spermatozoa from
Objective: To evaluate the reproductive outcomes and fertility of varicocelized rats and the
impact of chrysin within these parameters after 56 days of treatment.
Design: Experimental study in a research laboratory. Setting: Reproductive biology research laboratory. Animal(s): Male and female adult Wistar rats.
Intervention(s): Surgical procedure for varicocele induction, treatment with chrysin (50
mg/kg/day) or vehicle (DMSO+corn oil) for 56 days.
Main Outcome Measure(s): Body and reproductive organ weights, histopathological analysis
of testis and epididymis, morphometric evaluation of testis, testosterone levels, sperm parameters, sperm comet assay, lipid peroxidation in the testis, sexual behavior and reproductive performance through natural mating.
Result(s): Varicocele group presented high concentrations of malondihaldeyde in the testis,
low percentage of mobile sperm, high levels of sperm DNA fragmentation and alterations in seminiferous tubules. The varicocelized rats treated with chrysin restored these parameters to similar values of sham group. On the other hand, there were no differences in body and reproductive organ weights, histopathological analysis of epididymis, daily sperm production within testis and sperm number in the epidydimis, sperm morphology, testosterone levels, sexual behavior and fertility parameters among experimental groups.
Conclusion(s): Our results reinforce the idea that injuries provoked by experimental varicocele
on the rat testes and sperm quality are due, at least in part, to oxidative stress. Chrysin administration ameliorated these effects. Moreover, in this experimental model, varicocele showed bilateral effects without interfering with fertility.
INTRODUCTION
Infertility is one of the main public health problems and in more than 40% of these cases male disorders are involved. In this context, varicocele is considered the leading cause of infertility once it is present in approximately 15% of male population, 35% of men with primary infertility and 70-80% with secondary infertility (1, 2). In addition, varicocele is a biltateral (3), progressive (4) and hereditary condition (5) characterized by abnormal dilatation and tortuosity of pampiniform plexus.
Despite of being known and studied for many years the physiopathological mechanisms underlying varicocele have not yet been fully elucidated, however some theories that include venous stasis leading to hypoxia and testicular hyperthermia, reflux of toxic adrenal and renal metabolites, hormonal dysfunction, increased oxidative stress (OS), and sperm DNA damage have been proposed (6).
Since men with varicocele present high levels of ROS, nitric oxide (NO), and lipid peroxidation products like malonaldehyde (MDA), as well as decrease in antioxidant defenses, it is believed that OS is a key element in the varicocele-related infertility (7). Among the mechanisms by which OS leads to sperm dysfunction, lipid peroxidation contributes by targeting cell membranes, especially those rich with polyunsaturated fatty acids such as spermatozoa’s. This event results in reduced membrane fluidity and integrity, which compromise the sperm motility and acrosome reaction (8). In addition, ROS also target DNA molecule and causes irreparable damage in the genetic material impairing fertilization and normal development (9). Considering the deleterious effects associated with varicocele, and the important role of OS in this condition, adjuvant therapies with antioxidant have been proposed (10-12).
Chrysin, a flavonoid found in honey, propolis and plant extracts, is a potent antioxidant that has been widely studied due to its mechanism of action that prevents conversion of testosterone to estrogen through inhibition of enzyme CYP19 (13, 14). Several studies using animal models reported that chrysin improved sperm parameters (15, 16), increased testosterone levels (17) and prevented the oxidative damage caused by exposure to toxic chemicals (18, 19). Thus, because this flavonoid has a positive impact on sperm quality and a protective activity against the damage caused by OS, the aim of this study was to evaluate
reproductive and fertility outcomes of varicocele and the impact of chrysin in these parameters after 56 days of treatment.
MATERIAL AND METHODS
Animals
Wistar male (78-80 days old, weighing 300-400 g) and female rats (85 days old, weighing 200-315 g) were supplied by Central Biotherium of São Paulo State University (Unesp), Botucatu, and maintained under controlled environment with 23oC, 12/12-h light-dark cycle
with free access to food and tap water. The experimental procedures were approved by the local Ethics Committee for the Use of Experimental Animals of the University of São Paulo State (protocol number 772-CEUA) and are in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health).
Experimental Groups and Treatment
Male rats were allocated into three experimental groups: sham-operate (Sham; n=5-10) and varicocele groups received daily oral gavage dose of 50mg/kg/day of chrysin (V1; n=7-8) diluted in vehicle (corn oil and DMSO) or only vehicle solution (V2; n=7-10) for 56 days. The treatment period was chosen based on the duration of spermatogenesis in rats, which is approximately 56 days, since it requires 4.5 cycles within 13 days each, of the seminiferous epithelium in order for spermatogonia to become spermatozoa (20). Chrysin (5,7-Dihydroxyflavone) and dimethylsulphoxide (DMSO) were purchase from Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA and the dosage used was based in previous reports that 50mg/Kg/day of chrysin had a positive impact in sperm quality (15, 16) and a protective role against the oxidative stress damages (21-23).
Surgical Procedure
Experimental left varicocele was induced by parcial occlusion of left renal vein using the method described by Turner (24) with modifications. The animals were anesthetized with an intramuscular injection of ketamine 100 mg/kg and xylasine 5 mg/kg. The upper left abdominal quadrant was accessed through a midline laparotomy incision. The abdominal content was displaced to the right antimer and the insertion of left internal spermatic vein into the left renal vein was identify. The fat and connective tissue surrounding the renal vein was dissected, creating a tunnel underneath the vein and in a medial position to the insertion of the left spermatic vein. A 4-0 silk suture was placed around the renal vein and tied over a
0.80 mm needle. The needle was then removed, allowing the vein to expand to the limit of the ligation. Further, all abnormal collateral vessels were fully ligated once they would provide an effluent rout and release the pressure in the left internal spermatic vein. This procedure resulted in an increase in the intravenous pressure, which was transmitted to the left spermatic vein to promote the varicocele development. Then, the abdominal content was replaced and the midline incision was closed in 2 layers with 4-0 silk suture. The animals from sham group underwent the same procedure but the partial ligation of renal vein was not performed.
Experimental Design
In all experiments adult male rats underwent surgical procedure in post-natal day (PND) 78-80 and after one week of recovery the animals from varicocele groups were treated daily either with chrysin (50mg/kg/day) or vehicle for 56 days. The sham-operate group was not treated.
Experiment 1. Body and Organ Weights, Histological and Morphometric Analysis
Body and Reproductive Organ Weights
Nineteen animals (sham n=5; V1 n=7; V2 n=7) were weighted daily during the treatment period and at 57th day they were euthanized by decapitation. The testes and epididymides
from both sides were removed and had their weights recorded.
Histological Analysis
Testes and epididymides after weighted were fixed in Bouin’s solution (25% formaldehyde, 75% saturated solution of picric acid and 5% glacial acetic acid) for 24 h. The organs were immersed in paraffin wax and sectioned in 5µm. These sections (cross-section for testis and longitudinal sections for epididymis) were stained with hematoxylin and eosin (HE) and examined under light microscopy.
- Testis. A hundred seminiferous tubules, randomly chosen, were analyzed per animal and classified as normal (organized germ cell layers in the seminiferous epithelium) or abnormal (presence of acidophilic and multinucleated cells, retained spermatids,
degeneration of a specific cell type, vacuolization of the epithelium or exfoliation of cells in the lumen). The testicular interstitium was also evaluated but in a qualitative manner.
- Epididymis. The histological examination was qualitative. The entire longitudinal section was evaluated for the structure and aspect of epithelium, lumen and interstitium.
Morphometric Analysis of Seminiferous Tubules
The diameter of the seminiferous tubules and height of germinal epithelium (stage IX of spermatogenesis) were evaluated in 10 sections of seminiferous tubules per animal.
Experiment 2. Testosterone Levels, Sperm parameters and Comet Assay
In this experiment 24 adult male rats (n=8 per group) were used and after euthanasia their blood was collected for hormonal measurements, the testis were excised for sperm count and epididymal portions were used for evaluation of sperm motility, morphology, count and comet assay.
Testosterone Levels
Blood collection was performed between 8:00 and 12:00 AM. Serum was obtained by centrifugation of the samples (2500rpm, for 20 min at 4oC) and subsequently was stored at
-20oC. The concentration of testosterone (serum and intratesticular) was accessed using
ImmuChem™ Double Antibody Testosterone 125I RIA Kit and intra-assay variability for this hormone was 4.1%.
Sperm Motility
The epididymis was placed in a small petri dish containing 1mL of modified human tubal fluid (HTF) medium (Irvine Scientific) prewarmed to 34o C. The proximal cauda was perforated
and sperm suspension was transferred to a Makler chamber maintained at 34o C. Through a
phase-contrast microscope at 400x magnification one hundred sperm were classified as mobile and immobile.
For sperm morphology analysis, 100µl of sperm solution (the same used for motility assay) was aliquoted and added to 900µl of 10% formol saline. Then smears were prepared on histological slides, which were left to air dry for 40 minutes and observed under a phase contrast microscope at 400x magnification. A total of 200 spermatozoa per animal were evaluated and abnormalities were classified in two main categories: head abnormalities (without characteristic curvature, pin head and isolated head); tail abnormalities (rolled, broken and bended) (25, 26).
Sperm DNA Fragmentation (Comet Assay)
Sperm DNA fragmentation was evaluated by the comet assay as previously described (27) with the following modifications: frozen remaining sperm solution from the epididymides cauda were thawed and diluted in low melting point agarose (0.5% at 37°C; LGC Laboratories, Sao Paulo, Brazil), at a concentration of 106 cells/mL. An aliquot (75μL) of the solution was
placed on pre-coated slides with 1% normal melting point agarose (LGC Laboratories, Middlesex, UK). The slide was first immersed in lysis buffer (100mM Na2-EDTA, 10mM TrisHCl, 2,5M NaCl, pH 11.0) containing 40mM DTT and 2% Triton X-100 for 1h at 4°C and subsequently in lysis buffer containing proteinase K (0.1 mg/ml), for 2.5hrs at 37°C. The DNA was fractionated by alkaline electrophoresis (300mM NaOH, 1mM Na2 EDTA, pH 13.0) at 3 V/cm and 270 mAmps for 45 mins. Finally, the slides were washed with water, fixed in absolute ethanol, air dried and stored in the dark until analysis. For microscopy, the slides were stained with SYBR® Gold (1:10,000; Invitrogen, Waltham, MA) and analyzed using the Comet Assay IV software (Comet Assay IV, Perceptive Instruments, Wiltshire, UK). A total of 50 cells were analyzed per slide (2 slides/animal) and DNA damage was measured by analyzing the tail intensity (% of migrated DNA).
Sperm Count
After collecting the testis from both sides, these organs were decapsulated and then frozen at -20o C until the homogenization previously described by (28), with adaptations (29,
30). The remaining parenchyma was thawed over ice and homogenized in 5ml of NaCl 0.9% containing Triton X-100 0.5% followed by sonication for 30 seconds. After a 10-fold dilution an aliquot was transferred to Newbauer’s chamber (4 fields per animal) and mature spermatids (stage 19 of spermatogenic cycle) were counted. Daily sperm production (DSP)
was calculated dividing the number of mature spermatids by 6.1, which is the number of days that these spermatids are present in the seminiferous epithelium. Regarding the epididymis, caput/corpus and cauda were cut in small fragments with scissors, homogenized and the counting was performed as described for the testis.
Experiment 3. Sexual Behavior, Reproductive Performance and Lipid Peroxidation
Sexual Behavior and Reproductive Performance
Sexual Behavior was performed on 57th day of treatment for 4 hours in the dark phase
of the cycle under red illumination. For this, 26 male rats (sham n= 9; V1 n= 7; V2 n=10) were placed in boxes of polycarbonate crystal, for 5 minutes before the introduction of one sexually receptive adult female. The behavior assay started at the time that female was placed and the following measures were recorded for the next 40 minutes: intromission latency and frequency, the number of intromissions preceding the first ejaculation, ejaculation latency, intromission latency and frequency after postejaculation and total of ejaculations (31, 32). In case the male did not mount or intromit in the first 10 minutes after the introduction of the adult female, it was considered sexually inactive. Following the evaluation of sexual behavior, the rats (female and male) stayed in the same box for additional 4 hours, permitting a greater number of ejaculations. After this period, vaginal smears were collected for sperm detection and establishment of the day 0 of gestation (GD0). On GD 21, females were killed by decapitation to enable fertility evaluation. During the laparotomy the uterus and ovaries were collected and the numbers of corpora lutea, implantation sites, reabsorptions, live fetuses, and fetal weights were determined. From these results the following endpoints were determined: pregnancy rate = number of pregnant female/number of inseminated female x 100; rate of preimplantation loss= (number of corpora lutea - number of implantations/number of corpora lutea) x 100; rate of postimplantation loss= (number of implantations - number of live fetuses)/number of implantations x 100).
Lipid Peroxidation
The testes from both sides were homogenized separately in 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH-7.4). The protein content in the homogenate was determined by Bradford assay (33) using bovine serum albumin as a standard.
- Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) Assay
The level of lipid peroxidation was assessed using the TBARS assay by Drapur and Hodley (34). Briefly, 200µL the obtained homogenate were add to 500 µL thiobarbituric acid 0,8% , 500 µL Acetic acid buffer, 200 µL of SDS 8.1% and 100 µL of water. These samples were then incubated for 2 hours at 95°C and allowed to cool to room temperature. The absorbance was measured at 532nm. All of the assays were performed in duplicate and the amount of lipid peroxidation was expressed as nmol TBARS/g protein.
Statistical Analysis
Data were expressed as mean ± Standard Error of Mean (SEM) or median and interquartile range. Parametric variables were compared by ANOVA followed by Tukey’s test, nonparametric variables were compared by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s test and and x2-test was used for categorical dependent variables. Differences were considered significant
when 𝑝 < 0.05. The statistical analyses were performed by the software GraphPad Prism (version 5.0).
