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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. MIRNA MEANA DIAS. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO BRUTO E METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DOS FRUTOS DA Arctium lappa L. (Asteraceae).. JUIZ DE FORA, MG 2013. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(2) MIRNA MEANA DIAS. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO EXTRATO BRUTO E METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DOS FRUTOS DA Arctium lappa L. (Asteraceae).. Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas – Área de concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais.. Orientador: Prof. Dr. Ademar Alves da Silva Filho. JUIZ DE FORA 2013. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

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(4) “Desistir... Eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério. É que tem mais chão nos meus olhos, do que cansaço nas minhas pernas; Mais esperança nos meus passos, do que tristeza nos meus ombros; Mais estrada no meu coração, do que medo na minha cabeça.” Cora Coralina. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(5) DEDICATÓRIAS. Dedico este trabalho ao meu pai, meu herói, Francisco que pelo modo como me educou: na bondade, dignidade e honestidade, me fez chegar até aqui. Ao senhor, Pai, que sempre lutou, desejou e esperou que todos os meus sonhos se concretizassem sinta-se realizado junto comigo. Minha eterna saudade.... A minha querida mãe, Aparecida, pelo seu amor, por viver a minha vida, nas minhas constantes ausências. Nunca seria capaz de agradecer somente com palavras.. Ao meu marido Rodrigo, que com seu amor nunca desistiu do meu sonho e não mediu esforços para concretizá-lo, sem seu companheirismo em todos os momentos nada seria possível.. À minha filha, tão amada, Sofia, razão da minha vida que sempre aceitou com paciência e compreensão meu tempo tão reduzido para um amor tão grande.. Ao meu irmão Fabricio, pelo incentivo e amizade de sempre.. A QUEM COM MUITO AMOR DEDICO...... Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(6) AGRADECIMENTOS. À Deus, por fazer o impossível acontecer todos os dias em minha vida. A toda minha família, tios (as), primos (as) que sempre me incentivaram. Em especial, a tia Hilda, que foi sempre presente comigo, pelo apoio desde o começo e principalmente no final desta caminhada. E a Madrinha Marlene que, mesmo na fragilidade da sua condição de vida, ainda conseguiu saber e se alegrar com a notícia da minha aprovação para este curso. Aos meus avós, particularmente ao vovô Carlos Meana que sempre apostou em mim. Ao Sérgio Sefair e Katarina Nascimento pela confiança depositada em nossa família que viabilizou a conclusão deste sonho. Ao Prof. Ademar Alves da Silva Filho pelos ensinamentos, oportunidades e confiança que deposita em seus alunos. Aos companheiros e amigos do NIPPAN: nas pessoas de Lara Soares e Túlio Pessoa, pela ajuda e convivência durante esse período e a aluna de iniciação científica, Polyana Zaquine pela colaboração na etapa inicial deste trabalho. A Faculdade de Farmácia da UFJF, pelo Programa de Pós-graduação em Ciências, na pessoa de seus coordenadores: Prof. Dr. Orlando de Vieira de Sousa e Profa. Dra. Maria Silvana Alves. Aos professores do Mestrado em Ciências Farmacêuticas pelos grandes ensinamentos passados. Ao laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia, pelo suporte constante oferecido na realização deste trabalho. A funcionária técnicoadministrativa Celinha, pela paciência de sempre e a Profa. Fabíola Dutra Dias pela confiança desde o início dos trabalhos. Meu carinho e admiração a Profa. Dra. Magda Narciso Leite que sempre me incentivou, agradeço a oportunidade de aprender e conviver mais uma vez com você. Aos colaboradores na realização dos ensaios esquistossomicidas: Dr. Josué de Moraes (Instituto Adolfo Lutz) e Profa. Dra. Priscila de Faria Pinto (Instituto de Ciências Biológicas/UFJF).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(7) Ao Departamento de Química da UFJF, pelas análises de RMN realizadas. Aos companheiros da segunda turma do Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UFJF pelo compartilhamento de sabedorias e experiências. Especialmente aos amigos: Clarissa Campos, Antônio V. Doriguetto, Kamilla Coelho, Paulo Henrique Dias e Renan Salgado por tornarem mais suave esta caminhada. Agradeço também a ajuda do amigo Leonardo Sousa, doutorando em Fitotecnia/UFV, na identificação do material vegetal. Aos amigos de uma vida inteira que me sustentaram com seus sorrisos, muito obrigada. À FAPEMIG pelos recursos financeiros fornecidos para a execução deste projeto. Ao Programa de Monitoria da UFJF pela bolsa concedida. À todos que de alguma forma, contribuíram para que esta etapa pudesse ser completada.. “Agradeço a meu Deus toda vez que me lembro de vocês.” (2 Coríntios 8:16). Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(8) RESUMO DIAS, M. M. Avaliação da Atividade Esquistossomicida in vitro do Extrato Bruto e Metabólitos Secundários dos Frutos de Arctium lappa L. (Asteraceae). 2013. 108 p. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG, 2013. A esquistossomíase, causada por parasitos do gênero Schistosoma, é uma doença que afeta cerca de 240 milhões de pessoas no mundo. O Praziquantel é o fármaco de escolha para o tratamento desta parasitose e, devido principalmente aos casos de resistência do parasito a esta medicamento, se faz necessária a busca de novas moléculas e/ou protótipos com potencial atividade esquistossomicida. Neste contexto, a pesquisa com produtos naturais desponta como uma alternativa para o descobrimento de novos fármacos para o tratamento da esquistossomíase. Entre as espécies vegetais de interesse para a produção de substâncias esquistossomicidas, destaca-se a Arctium lappa L. (Asteraceae), a qual é reconhecida por biossintetizar lignóides, classe de metabólitos que tem demonstrado grande potencial esquistossomicida. O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico do extrato hidroalcoólico dos frutos de A. lappa, bem como a avaliação da atividade esquistossomicida in vitro, frente aos vermes adultos de S. mansoni, do extrato e de seus metabólitos majoritários. O estudo fitoquímico de A. lappa L. resultou no isolamento de duas lignanas dibenzilbutirolactônicas, a arctiina e arctigenina. A análise dos resultados de avaliação esquistossomicida obtidos demonstrou que o extrato hidroalcoólico bruto na concentração de 200 mg/mL apresentou expressiva atividade esquistossomicida in vitro, sendo capaz de provocar a morte de 100% dos parasitos em até 24 horas de incubação. A arctiina, metabólito majoritário purificado do extrato, foi capaz de matar e provocar lesões tegumentares em 100% dos vermes adultos. Os resultados obtidos sugerem que a atividade esquistossomicida in vitro demonstrada pelo extrato hidroalcoólico pode estar relacionada à presença da arctiina, corroborando com o potencial esquistossomicida in vitro das lignanas dibenzilbutirolactônicas, frente aos vermes adultos de S. mansoni. Palavras-chave: Schistosoma mansoni; Arctium lappa L.; lignanas; arctiina; arctigenina.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(9) ABSTRACT. DIAS, M. M. Schistosomicidal Activity Evaluation in vitro of the crude extract and Secondary Metabolites of the Arctium lappa L. (Asteraceae) fruit 2013. 108 p. Master Thesis (Master in Pharmaceutical Sciences) – Pharmacy College, Juiz de Fora Federal University, Juiz de Fora, MG, 2013. Schistosomiasis caused by the Schistosoma parasite is a disease that affects about 240 million people around the world. Praziquantel is the chosen drug for the treatment of this parasitosis. It is imperative to search for new molecules and / or prototypes with potential schistosomicidal activity. This requirement is due to the tough performance of the parasite against this medicine. In this context, the research with natural products has been recognized as an alternative to discover new pharmacos for Schistosoma treatment. Arctium lappa L. (Asteraceae) stands out among vegetal plants of interest for the production of schistosomicidal substances. This is recognized for being able to biosynthesize lignoid, a kind of metabolite that has performed great schistosomicidal potential. This master thesis describes the phytochemical study of the hydroalcoholic extract from A. lappa L. fruit, as well the evaluation of the schistosomicidal activity evaluation in vitro, facing the adult worms of S. mansoni from the extract and from its majority metabolite. The phytochemical study of A. lappa L. resulted in the isolation of two dibenzyl butyrolactone. lignan,. a. arctiin. e. arctigenin.. The. results. obtained. schistosomicidal evaluation showed that hydroalcoholic extract crude in concentration of 200 mg/mL showed significant antischistosomal activity in vitro and is capable of causing the death of the 100% of the parasites within 24 hours of incubation. The arctiin a major purified metabolite from the extract, was capable of killing by causing tegumentary lesions en 100% of the adult worms. The obtained results suggest that the schistosomicidal activity in vitro showed by the hydroalcoholic extract can be related to arctiin presence, supporting the potencial schistosomicidal in vitro of dibenzyl butyrolactone lignan, against the adult worms of S. mansoni.. Key words: Schistosoma mansoni; Arctium lappa L.; lignans; arctiin; arctigenin.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(10) LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. AFA. Ácido acético glacial: formaldeído: etanol: água destilada (2: 9:30: 59). AL. Extrato Hidroalcoólico Bruto dos Frutos de A. lappa L.. AL-A. Fração em acetato de etila. AL-D. Fração diclorometânica. AL-DII. Subfração Diclorometânica II. AL-DIII. Subfração Diclorometânica III. AL-H. Fração hexânica. CLAE. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. CC. Cromatografia em Coluna Clássica. CCD. Cromatografia Camada Delgada. CDCl3-D. Clorofórmio Deuterado. CF. Cromatografia em Coluna Flash. DMSO. Dimetilssulfóxido. DNA. Ácido desoxirribonucéico. d. Dupleto. dd. Duplodupleto. FM. Fase Móvel. HIV. Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana). HPLC. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. iNOS. Óxido nítrico sintase. J. Constante de acoplamento. m/v. Massa por volume. m. Multipleto. NIPPAN. Núcleo de Identificação e Pesquisa de Princípios Ativos Naturais. OMS. Organização Mundial de Saúde. OXA. Oxamniquina. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(11) PZQ. Praziquantel 13. Ressognância Magnética Nuclear de Carbono. 1. RMN H. Ressognância Magnética Nuclear de Hidrogênio. ROS. Espécie Reativa de Oxigênio. RPMI 1640. Meio Roswell Park Memorial Institute 1640. s. Simpleto. t. Tripleto. UI/mL. Unidades Internacionais por mililitro. UV. Ultravioleta. v/v. Volume por volume. RMN. C. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(12) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Distribuição global da esquistossomíase. .............................. 22. Figura 2. Ciclo de transmissão do Schistosoma mansoni. ................... 23. Figura 3. Estrutura química do Praziquantel (PZQ – 1) e Oxamniquina (OXA – 2). ......................................................................................... Figura 4. Estrutura química da artemisinina (3) e seu derivado artemeter (4). ......................................................................................... Figura 5. Metabólitos. secundários. antiparasitários:. quinina. 26 (5). licochalcona A (6). ................................................................ Figura 6. e 26. Substâncias com atividade antiparasitária: anfotericina B (7) e ivermectina (8). ...................................................................... Figura 7. 25. 27. Padrão de ligação e numeração das lignanas, segundo a IUPAC. ............................................................................................... 29. Figura 8. Principais subclasses estruturais das lignanas. ................... 29. Figura 9. Estrutura. tipo. química. da. virolina. (9),. neolignana. do. 8.O.4’..................................................................................... 30. Figura 10. Estrutura química da podofilotoxina (10) .............................. 31. Figura 11. Estrutura química da neolignana veraguensina (11) e lignana justicidina B (12) com atividade antiparasitária. .................... 31. Figura 12. Estrutura química da neolignana: licarina A (13). ................... 32. Figura 13. Alteração tegumentar e morte do S. mansoni induzido por adição in vitro da neolignana diidrobenzofurânica licarina A.(100 µM) ................................................................................................ Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com). 32.

(13) Figura 14. Verme adulto de S. mansoni incubado em controle negativo (meio RPMI 1640) e com adição in vitro da lignana dibenzilbutirolactólica metilcubebina.(10 µM) .............................................................. Figura 15. Lignanas. dibenzilbutirolactólica:. cubebina. (14). 33 e. dibenzilbutirolactônicas: metilpluviatolídeo (15), hinoquinina (16), 6-6’-dinitrohinoquinina (17), com atividade esquistossomicida. ................................................................................................ 34. Figura 16. Folhas e frutos da A. lappa L. (Asteraceae).. ......................... 36. Figura 17. Estruturas químicas de alguns ácidos fenólicos presentes na A. lappa L.: ácido cafeico (18), ácido clorogênico (19) e ácido dicafeoilquínico (20). ............................................................... Figura 18. 38. Estruturas químicas de alguns flavonóides encontrados em A. lappa L.: luteolina (21), quercetina (22), quercitrina (23) e rutina (24). ........................................................................................ Figura 19. 38. Estruturas químicas de algumas lignanas dibenzilbutirolactônicas presentes. nos. frutos. e. sementes. da Arctium lappa L.:. trachelogenina (25), Lappaol F (26), diarctigenina (27), arctiina (28) e arctigenina (29) .......................................................... Figura 20. 40. Esquema geral do procedimento de partição líquido-líquido do extrato hidroalcoólico bruto dos frutos da A. lappa L. ............. 52. Figura 21. Cromatografia em Coluna da Fração AL-D ............................ 53. Figura 22. Fluxograma do isolamento e purificação dos principais metabólitos dos frutos da A. lappa L. ......................................................... 54. Figura 23. Hidrólise sob refluxo da substância AL-DIII 5*......................... 56. Figura 24. Região dorsal de um macho de Schistosoma mansoni, onde é avaliado o efeito de compostos no tegumento. ...................... Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com). 64.

(14) Figura 25. Estrutura química da substância isolada AL-DIII-5* e identificada como a lignana dibenzilbutirolactônica: arctiina (arctigenina 4’-Oglicosídeo). ........................................................................... Figura 26. Espectro de RMN de 1H da substância AL- DIII 5* (300 MHz, CDCl3). ................................................................................... Figura 27. Espectro de RMN de. C da substância AL- DIII-5* (75 MHz,. Espectro de RMN de. 74. 13. C da substância AL- DII 6-2 (75 MHz,. CDCl3) .................................................................................... Figura 31. 72. Espectro de RMN de 1H da substância AL- DII 6-2 (300 MHz, CDCl3). ..................................................................................... Figura 30. 70. Estrutura química da substância isolada AL-DII 6-2 e identificada como a lignana dibenzilbutirolactônica: arctigenina. ............... Figura 29. 67. 13. CDCl3) ................................................................................... Figura 28. 65. 76. Estrutura química da substância isolada AL- H B e identificada como a lignana dibenzilbutirolactônica: arctigenina. ............. 77. Figura 32. AL- H B: Sólido branco .......................................................... 78. Figura 33. Espectro de RMN de 1H da substância AL- H B (300 MHz, CDCl3,.  em ppm) .............................................................................. Figura 34. Espectro de RMN de. 79. 13. C da substância AL- H B (75 MHz, CDCl 3.  em ppm). ............................................................................. 80. Figura 35. Controle negativo (meio RPMI 1640) e DMSO 0,5% ............ 83. Figura 36. Efeito do AL no tegumento dos machos de S. mansoni. A: controle negativo (sem adição do extrato). B: controle positivo (Praziquantel 10 µM). C: 50 µg/mL. D: 100 µg/mL. A-D: Imagens tridimensionais. Barras = 50 µm ............................................ Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com). 87.

(15) Figura 37. Vermes adultos de S. mansoni incubado com adição in vitro da substância AL- DIII-5* (arctiina) a 100 µM, Em (A) e (B), machos tratados com 100 µM de arctiina. Em (C) e (D), as fotos mostram fêmea incubadas com 100 µM de AL- DIII-5*. ........................ Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com). 91.

(16) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Principais classes de metabólitos especiais e substâncias químicas presentes na A. lappa L. e suas atividades biológicas reportadas pela literatura ....................................................... 42. Tabela 2. Frações obtidas por CC da fração AL-D................................. 53. Tabela 3. Frações obtidas por CC de AL-DIII........................................... 55. Tabela 4. Frações obtidas por CF do hidrolisado de AL-DIII 5*................ 57. Tabela 5. Frações obtidas por CC de AL-DII ......................................... 58. Tabela 6. Frações obtidas por CF de AL-DII 6....................................... 59. Tabela 7. Dados do espectro de RMN de 1H, da substância AL- DIIII-5*, a 300 MHz em CDCl3 ( em ppm, multiplicidade), J. em Hz... .............................................................................................. Tabela 8. Dados do espectro de RMN de. 13. C, da substância AL- DIIII-5*, a. 75 MHz em CDCl3 ( em ppm). ........................................... Tabela 9. Dados do espectro de RMN de. 13. 77. Efeito in vitro do extrato hidroalcoólico bruto dos frutos de A. lappa L. frente aos vermes adultos de S. mansoni ......................... Tabela 12. 75. C, das substâncias AL- DII 6-2 a. 75 MHz em CDCl3 ( em ppm). ............................................ Tabela 11. 71. Dados do espectro de RMN de 1H, das substâncias AL- DII 6-2, a 300 MHz em CDCl3 ( em ppm, multiplicidade), J em Hz .... Tabela 10. 68. 82. Atividade in vitro das lignanas arctiina e arctigenina isoladas a partir do AL frente aos vermes adultos de S. mansoni.................90. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(17) SUMÁRIO 1.. INTRODUÇÃO ................................................................................. 19. 1.1. Considerações Gerais ..................................................................... 19. 1.2.. Esquistossomíase ............................................................................ 21. 1.3.. Produtos naturais com atividade esquistossomicida ....................... 25. 1.4.. Lignóides.......................................................................................... 27. 1.4.1.. Lignanas e Neolignanas: Definição, Nomenclatura e Diversidades Estruturais ....................................................................................... 28. 1.4.2.. Atividades biológicas das lignanas e neolignanas .......................... 30. 1.5.. A família Asteraceae, o gênero Arctium e a espécie Arctium lappa L. ..................................................................................................... 34. 2.. OBJETIVOS ..................................................................................... 47. 2.1. Objetivos gerais................................................................................ 47. 3.. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................... 48. 3.1.. Instrumentação e materiais cromatográficos ................................... 48. 3.1.1. Materiais e reagentes ...................................................................... 49. 3.2.. Coleta e identificação do material vegetal ....................................... 3.3.. Obtenção do extrato hidroalcoólico bruto dos frutos de Arctium lappa L. ........................................................................................... 50. 3.4.. Fracionamento do extrato hidroalcoólico bruto utilizando processo. 50. de partição líquido-líquido ................................................................ 50. 3.5.. Estudo da fração diclorometânica - AL- D ....................................... 53. 3.5.1.. Estudo da fração diclorometânica - AL- DIII ..................................... 55. 3.5.1.1.. Hidrólise da substância isolada AL- DIII 5*........................................ 55. 3.5.1.2.. Purificação da aglicona obtida a partir da hidrólise ......................... 56. 3.5.2.. Estudo da fração diclorometânica - AL- DII ................................ 57. 3.5.2.1.. Estudo da fração diclorometânica - AL- DII 6 .............................. 58. 3.6.. Avaliação in vitro da atividade esquistossomicida do extrato hidroalcoólico bruto e das substâncias isoladas dos frutos da A.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(18) lappa L ............................................................................................. 59. 3.6.1.. Animais utilizados e manutenção do ciclo evolutivo do Schistosoma mansoni ..................................................................... 59. 3.6.1.1.. Linhagem de Origem do Parasito .................................................... 3.6.1.2.. Animais hospedeiros ....................................................................... 59. 3.6.1.3.. Manutenção do Ciclo Evolutivo de Schistosoma mansoni .............. 60. 3.6.1.4.. Recuperação dos Vermes Adultos de S. mansoni .......................... 61. 3.6.2.. Preparo das amostras e materiais utilizados no ensaio esquistossomicida ........................................................................... 61. 3.6.3.. Ensaios in vitro com vermes adultos de Schistosoma mansoni ...... 3.6.4.. Avaliação do ensaio esquistossomicida .......................................... 63. 4.. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 65. 4.1.. Isolamento e purificação dos metabólitos de interesse ................... 65. 4.2.. Determinação e identificação estrutural das substâncias isoladas. 65. 4.2.1.. Substância isolada AL- DIII-5* .......................................................... 65. 4.2.2.. Substância isolada AL- DII 6-2 ......................................................... 72. 4.2.3.. Substância isolada AL- B .............................................................. 77. 4.3.. Atividade esquistossomicida in vitro do extrato hidroalcoólico bruto dos frutos de A. Lappa L. (AL) frente a vermes adultos de S. mansoni ...................................................................................... 81. 4.4.. Atividade esquistossomicida in vitro das substâncias isoladas dos frutos de A. Lappa L. (AL) frente a vermes adultos de S. mansoni 89. 5.. CONCLUSÕES ................................................................................ 6.. REFERÊNCIAS ............................................................................... 95. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com). 59. 62. 94.

(19) Ficha catalográfica elaborada através do Programa de geração automática da Biblioteca Universitária da UFJF, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Meana Dias, Mirna. Avaliação da Atividade Esquistossomicida in vitro do Extrato Bruto e Metabólitos Secundários dos Frutos da Arctium lappa L. (Asteraceae) / Mirna Meana Dias. -- 2013. 113 p. Orientador: Ademar Alves da Silva Filho Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade Federal de Juiz de Fora, Faculdade de Farmácia e Bioquímica. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2013. 1. Schistosoma mansoni. 2. Arctium lappa L.. 3. lignanas. 4. arctiina. 5. arctigenina. I. Alves da Silva Filho, Ademar, orient. II. Título..

(20) 19. Introdução. 1.. INTRODUÇÃO:. 1.1.. Considerações gerais: A utilização de plantas medicinais para tratamento, cura e prevenção de. doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (PASA, 2011). As plantas medicinais e seus extratos têm sido utilizados por muitos séculos para o tratamento de diversas patologias, de dores de cabeça a infecções parasitárias. No Brasil, o uso de plantas medicinais pela população com a finalidade de se tratar enfermidades sempre foi expressivo, principalmente devido à extensa e diversificada flora (ANTHONY et al., 2005, HOTEZ et al., 2007). Ainda hoje, é inegável que a maioria da população de baixa renda recorra às plantas medicinais como único lenitivo para seus males, visto que o comércio de medicamentos no Brasil atende apenas à faixa economicamente ativa (cerca de 30% da população), supondo-se que o restante encontra nos produtos de origens naturais, especialmente nas plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos. Dentro deste contexto social e econômico, as plantas medicinais e os fitoterápicos adquirem enorme importância no tratamento e cura das doenças e por isso, devem ser prioritariamente analisados segundo métodos modernos disponíveis (ALI, 2011; FREZZA, 2012; LAPA et al., citado em SIMÕES, 2003). Grande número de medicamentos sintéticos foi obtido a partir de precursores naturais (ELISABETSKY et al., 1995), sendo que estes representam uma valiosa alternativa para o desenvolvimento de novos fármacos. Exemplos de fármacos obtidos de plantas são a digoxina (Digitalis sp.- Plantaginaceae), utilizada em insuficiência cardíaca; o taxol (Taxus brevifolia- Taxaceae), usado como antitumoral e a morfina (Papaver somniferum - Papaveraceae), um potente analgésico (MISHRA e TIWARI, 2011). A descoberta de produtos naturais ativos é constituída não apenas pela necessidade de caracterização das propriedades químicas das moléculas, mas também pela descoberta de novas substâncias que podem servir de modelos (protótipos) para o desenvolvimento de novos fármacos (BARBOSA DE CASTRO et al.; 2013). Assim, as plantas continuam mantendo a sua histórica significância como importante fonte de novos fármacos, produzindo compostos ativos ou substâncias. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(21) 20. Introdução. que também podem ser modificadas estruturalmente. Atualmente, 25% dos compostos ativos prescritos nos Estados Unidos e Reino Unido foram isolados de plantas medicinais (ANTHONY et al., 2005; NEWMAN e CRAGG, 2012). Nos últimos 30 anos várias pesquisas têm sido realizadas para se determinar quais os efeitos e os mecanismos de ação de diversos metabólitos secundários vegetais. No entanto, menos de 10% das espécies de plantas floridas do mundo (aproximadamente 250.000 espécies) têm sido investigadas cientificamente quanto às suas propriedades químicas e farmacológicas. Contudo, a diversidade do reino vegetal representa uma extraordinária reserva de novas moléculas, uma vez que apenas uma pequena porcentagem das espécies vegetais existentes no mundo tem sido investigadas quimicamente, sendo a triagem biológica e farmacológica de seus constituintes é ainda menor (CORDELL, 2000; HOSTETTMAN e WOLFENDER, 1997). Considerando a enorme riqueza da flora do Brasil, que possui a maior biodiversidade genética vegetal do mundo e em torno de 22% das espécies de plantas existentes no planeta, ainda há uma enorme e inexplorada fonte natural de metabólitos secundários vegetais com inúmeras propriedades químicas e medicinais ainda não reveladas (CALIXTO e SIQUEIRA-JR., 2008; KATZ e COELHO 2008; ROKNI et al., 2012; SIMÕES e SCHENKEL, 2002). Inicialmente,. muitos. pesquisadores. da. área. de. produtos. naturais. preocupavam-se principalmente em elucidar as estruturas e propriedades químicas dos metabólitos vegetais purificados. Recentemente, grande número de estudos têm-se concentrado na investigação das propriedades biológicas desempenhadas por tais substâncias. Como consequência, diversas classes de metabólitos secundários vegetais, incluindo os lignóides estão sendo “redescobertas”, já que suas potencialidades biológicas estão sendo investigadas empregando-se grande variedade de novos ensaios e metodologias biológicas (DA SILVA FILHO et al., 2004, 2008; VUORELLA et al., 2004). Dentre as várias patologias pelas quais as substâncias químicas especiais, produzidas pelas plantas, possuem potencial para o desenvolvimento de novos. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(22) 21. Introdução. medicamentos, destacam-se, as doenças tropicais negligenciadas, especialmente a esquistossomíase. Esta parasitose devido à sua complexa epidemiologia, grande prevalência mundial e a existência de poucos medicamentos atualmente eficazes para o seu tratamento vêm adquirindo destaque, na pesquisa de novos fármacos de origem natural para o controle e tratamento dos indivíduos infectados (BARBOSA DE CASTRO et al., 2013). A epidemiologia da esquistossomíase no Brasil encontra-se bem descrita no estudo realizado por Coura Amaral (2004), no período compreendido entre os anos de 1977 e 2002. Onde os autores concluíram que nenhum método isolado é capaz de controlar a esquistossomíase e que todos os programas de controle devem considerar a necessidade de uma aplicação multidisciplinar dos métodos existentes. No longo prazo, devem ser desenvolvidas medidas de saneamento básico, abastecimento de água potável, bem como a educação sanitária e a participação efetiva da comunidade para controlar a infecção. Em curto prazo, o tratamento dos indivíduos doentes associado com o controle dos focos de infestação dos hospedeiros intermediários são relevantes para o controle da morbidade da doença, embora não seja o suficiente para interromper a transmissão da doença. 1.2.. Esquistossomíase: A esquistossomíase é uma doença típica de países em desenvolvimento, que. contam com recursos reduzidos para investimento em saúde pública. Causada por vários. trematóides. pertencentes. ao. gênero. Schistosoma,. atualmente. a. esquistossomíase ou esquistossomose afeta mais de 240 milhões de pessoas, sendo que aproximadamente 20 milhões têm consequências severas da doença (DE MELO et al., 2011). Esta parasitose está distribuída em 76 países (Fig. 1) dos continentes africano, asiático e americano e cerca de 780 milhões de pessoas estão expostas ao risco de contrair uma das esquistossomoses (BARBOSA DE CASTRO et al. 2013; MAGALHÃES et al., 2009, 2010; OMS, 2006, 2011a, 2011b; STEINMAMM et al., 2006). No Brasil, a área abrange 19 estados sendo endêmica em 9 destes (especialmente o Estado de Minas Gerais), com aproximadamente 42 milhões de. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(23) 22. Introdução. habitantes expostos ao risco e cerca de 7 milhões de indivíduos infectados, os quais em muitos casos apresentam severas deficiências orgânicas, comprometendo o desenvolvimento de jovens e a produtividade de adultos e fazendo desta doença um dos mais sérios problemas de saúde (KING, 2009; MELO e COELHO, 2005; OMS 2011a, 2011b).. Figura 1. Distribuição global da esquistossomíase. Fonte: GRYSEELS et al., 2006.. De acordo com Organização Mundial de Saúde (OMS) a esquistossomíase humana é uma das doenças tropicais negligenciadas que continua avançando em novas áreas, sendo impulsionada por fatores sociais, econômicos e a má organização nos projetos de irrigação e ocupação de terras nos países em desenvolvimento (CHITSULO et al., 2000; OMS, 2006, 2011a). Entre as espécies de Schistosoma que podem infectar o ser humano somente a espécie S. mansoni se adaptou no Brasil, provavelmente devido à presença de moluscos do gênero Biomphalaria, os quais atuam como hospedeiros intermediários (MELO e COELHO, 2005). O S. mansoni é um trematódeo cuja principal característica é o seu acentuado dimorfismo sexual quando adulto. A infecção por este parasito determina uma patologia denominada esquistossomíase intestinal,. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(24) 23. Introdução. popularmente conhecida como "Xistose", "Bilharziose" ou "Barriga d'água" (GRYSEELS et al., 2006; RIBEIRO-DOS-SANTOS et al., 2006). Como podemos observadar na figura 2, após a liberação dos ovos de Schistosoma pela urina (esquistossomíase urinária por S. haematobium) ou fezes (esquistossomíase intestinal por S. mansoni, S. japonicum, S. intercalatum e S. mekongi) da pessoa infectada, estes entram em contato com a água e liberam as larvas (miracídio), as quais penetram nos caramujos de água doce (hospedeiros intermediários). Depois de várias semanas, estes moluscos eliminam as cercárias que são as formas infectantes. Após a entrada no hospedeiro definitivo (geralmente o homem), as cercárias perdem a cauda diferenciando-se em esquistossômulos, os quais alcançam a corrente sanguínea e passam pelo pulmão, fígado e veias mesentéricas inferiores, onde ocorre nova maturação e tornam-se vermes adultos. Os vermes adultos são dióicos e pareados por toda a vida. As fêmeas liberam os ovos nas pequenas vênulas intestinais alcançando a luz intestinal, onde são liberados, juntamente com as fezes, para o meio, reiniciando o ciclo (OMS, 2006, 2011a).. Figura 2. Ciclo de transmissão do Schistosoma mansoni. Fonte: GRYSEELS et al., 2006.. A:. vermes adultos emparelhados (masculino resistente alojando o feminino delgado). B: ovos (da esquerda para direita, S. haematobium, S. mansoni, S. japonicum). C: miracídio ciliado. D: caramujos hospedeiros intermediários (da esquerda para a direita, Oncomelania, Biomphalaria, Bulinus). E: cercárias.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(25) 24. Introdução. Com relação ao tratamento da esquistossomíase, estão incluídos na lista da OMS, o Praziquantel (PZQ, estrutura 1, Fig. 3) e a Oxamniquina (OXA, estrutura 2, Fig. 3). O PZQ, um derivado de pirazino-isoquinolínico, é um composto comercializado na forma racêmica, contendo partes iguais de seus isômeros ópticos, muito embora o isômero ativo seja o levógiro (OMS, 2011a, 2011c; XIAO et al., 1989). Este fármaco é ativo contra todas as espécies de Schistosoma humano, demonstrando atividade também sobre as cercárias e vermes adultos (GÖNNERT et al., 1977; UTZINGER et al., 2003). Embora seja considerado um fármaco de baixa toxicidade e apresentar elevada eficácia terapêutica contra todas as espécies de Schistosoma, o praziquantel possui baixa efetividade sobre os esquistossômulos e, portanto, não é utilizado como fármaco profilático (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003; UTIZINGER et al., 2003). Além disso, o PZQ não previne a re-infecção, necessita de tratamentos repetidos em áreas endêmicas e já há inúmeros relatos demonstrando o crescente surgimento de linhagens resistentes a este medicamento (ARAÚJO, 2011; COUTO et al., 2011; FALLON et al., 1998; ISMAIL et al., 1999; OMS, 2006, 2011c). Desta forma, a pesquisa de novos fármacos para a terapêutica experimental da esquistossomose deve ser uma prioridade e poderá também ser direcionada para a obtenção de compostos profiláticos, os quais irão prevenir a infecção por agirem nas formas jovens do Schistosoma sp. (COUTO et al., 2011). A Oxamniquina (OXA, estrutura 2, Fig. 3), um derivado de tetraidroquinolínico, é ativa somente contra o S. mansoni e tem efeito esquistossomicida principalmente contra machos adultos. O medicamento é de baixo custo, mas causa efeitos colaterais severos. Em pacientes não curados ocorre redução de ovos nas fezes da ordem de 80 a 90% (COUTO et al., 2011; DELGADO et al., 1992; GRYSEELS et al., 2006).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(26) 25. Introdução. Praziquantel (1). Oxamniquina (2). Figura 3. Estrutura química do Praziquantel (PZQ – 1) e Oxamniquina (OXA – 2).. Portanto,. considerando. a. situação. atual. da. farmacoterapia. da. esquistossomose, o investimento em pesquisa para a obtenção de novos fármacos esquistossomicidas se faz necessário (ANTHONY et al., 2005, OMS, 2011c). Dentro deste contexto, os produtos naturais e, especialmente as plantas medicinais, possuem grande importância para o desenvolvimento de novos fármacos empregados na medicina humana. 1.3.. Produtos naturais com atividade esquistossomicida: Produtos naturais são definidos como substâncias produzidas por sistemas. vivos (FISCHBACH et al., 2007; KAYSER et al., 2003; VERPOORTE, 1998), incluindo também os extratos (por exemplo, extrato bruto de plantas) e os compostos isolados (como os metabólitos secundários) obtidos a partir de plantas, amimais ou microorganismos (SARKER et al., 2005). De acordo com a literatura, atualmente mais de 70% dos novos fármacos guardam alguma relação com produtos naturais. Estudos realizados no período de 1981 a 2010 mostram que foram desenvolvidos, por exemplo, 14 novos fármacos antiparasitários, sendo que somente 4 destes possuem origem puramente sintética, e todos os demais possuem sua origem ou são derivados diretos de produtos naturais (NEWMAN e CRAGG, 2012). Muitas plantas têm sido pesquisadas tanto química quanto biologicamente na tentativa de se detectar preparações brutas ou constituintes ativos que possam ser utilizados. como. modelos. para. o. desenvolvimento. de. novos. fármacos. esquistossomicidas (FERREIRA et al., 2011; KAYSER et al., 2003; KONÉ et al., 2011; KRON et al., 2007; MIRANDA et al., 2012; YOUSIF et al., 2007). Uma vez. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(27) 26. Introdução. conhecida a atividade biológica do extrato bruto, é possível encontrar os componentes mais ativos por fracionamento e, assim, isolar as substâncias ativas principais (CHITWOOD, 2002). Com relação a metabólitos secundários antiparasitários, temos o exemplo da artemisinina (estrutura 3, Fig. 4), uma lactona sesquiterpênica obtida das folhas de Artemisia annua (Asteraceae) e utilizada no tratamento da malária que se mostrou eficaz contra o S. japonicum, S. haematobium e S. mansoni (LESCANO et al., 2004; NDJONKA et.al., 2013; UTZINGER et al., 2001; XIAO et al., 2000a e 2000b).. Artemisinina (3). Artemeter (4). Figura 4. Estrutura química da artemisinina (3) e seu derivado artemeter (4).. Além disso, Araújo e Colaboradores (1991, 1999) verificaram uma discreta redução do número de vermes em hamsters infectados com S. mansoni, após o tratamento com artemeter (estrutura 4, Fig. 4), um derivado da artemisinina (ABDIN et al., 2003). Da mesma forma, a quinina (estrutura 5, Fig. 5) e a licochalcona A (estrutura 6, Fig. 5) são exemplos de metabólitos secundários vegetais antiparasitários.. Quinina (5). Licochalcona A (6). Figura 5. Metabólitos secundários antiparasitários: quinina (5) e licochalcona A (6).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(28) 27. Introdução. Já a anfotericina B (estrutura 7, Fig. 6) e a ivermectina (estrutura 8, Fig. 6) são importantes antiparasitários isolados de microrganismos, como os do gênero Streptomyces (FERREIRA et al., 2011; KAYSER et al., 2003; PONTIN et al., 2008).. Anfotericina B (7). Ivermectina (8) Figura 6. Substâncias com atividade antiparasitária: anfotericina B (7) e ivermectina (8). Recentemente, várias pesquisas têm sido realizadas com produtos naturais com o objetivo de se encontrar compostos que possam ser utilizados como protótipos para o desenvolvimento de fármacos esquistossomicidas (BRAGUINE et al., 2010; FREZZA, 2012; MAGALHÃES et al., 2009, 2010; PARREIRA et al., 2010; SAYED et al., 2008). Dentre as classes de substâncias químicas especiais, produzidas pelas plantas, com potencial esquistossomicida estão os lignóides. 1.4.. Lignóides: O termo lignóide é uma designação genérica que caracteriza um grupo de. metabólitos secundários cujo esqueleto é formado exclusivamente pelo grupo fenilpropânico (C6-C3)n, sendo n restrito a poucas unidades (WARD, 1999). Devido à. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(29) 28. Introdução. grande diversidade de ocorrência, ao amplo espectro de atividades biológicas e ao importante papel que exercem no desenvolvimento do vegetal, os lignóides têm sido objeto de estudo em várias pesquisas, especialmente aquelas focadas na busca de novos fármacos antiparasitários (DA SILVA FILHO et al., 2008; MACRAE e TOWERS, 1984; SOUZA e LORENZI, 2005). Dentre os lignóides, destacam-se as lignanas e as neolignanas. 1.4.1. Lignanas e Neolignanas: Definição, Nomenclatura e Diversidades Estruturais. As lignanas são dímeros derivados da condensação por acoplamento oxidativo de álcoois cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos, cujo carbono  (C3) da cadeia lateral encontra-se oxidado (WARD, 1999). Assim, as lignanas são biossintetizadas por meio da dimerização, por acoplamento oxidativo, de unidades fenilpropanoídicas (C6C3), formando uma variedade de subclasses estruturalmente bem distintas. O termo lignana foi introduzido primeiramente por Haworth em 1936, em sua revisão sobre resinas naturais para designar e agrupar uma então rápida e crescente. classe. de. produtos. naturais.. Definição. esta. que. vigorou. por. aproximadamente três décadas, até que um grande número de novas substâncias foi sendo descoberto, juntamente com os avanços nas técnicas espectroscópicas de elucidação estrutural que criaram uma nova e mais complexa diversidade estrutural de lignanas (TRAZZI, 2008). Com o objetivo de padronizar a terminologia empregada para nomeá-las, em 2000, a IUPAC propôs uma definição que visou formalizar as principais tendências da literatura, recomendando uma definição similar à inicialmente proposta por Haworth, na qual se denomina como lignana toda substância originária do acoplamento. entre. duas. unidades. C6C3. (propilbenzeno),. particularmente. caracterizada por uma ligação carbono-carbono nas posições 8 e 8’ (Fig. 7) (TRAZZI, 2008).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(30) 29. Introdução. Figura 7. Padrão de ligação e numeração das lignanas, segundo a IUPAC.. Considerando que a grande maioria das lignanas de origem natural, até hoje conhecidas, apresenta oxidadas as posições 9 e 9’, estas podem ser divididas em 5 principais grandes subclasses estruturais (WHITING, 1985), como demonstrado na figura 8 abaixo:. Dibenzilbutanodióis. Furofurânicas. Dibenzilbutirolactônicas. Aritetralínicas. 9 9'. O. O. Dibenzociclooctadiênicas Figura 8. Principais subclasses estruturais das lignanas.. Já as neolignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento oxidativo de alil e/ou propenil fenóis e, ao contrário das lignanas, são isentas de oxidação no carbono . A nomenclatura sistemática é um pouco mais complexa. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(31) 30. Introdução. (Fig. 9), que apesar da diversidade de esqueletos e funções, formam um grupo de compostos naturais, singularmente homogêneo (LOPES et al., 2004).. Virolina (9) Figura 9. Estrutura química da virolina (9), neolignana do tipo 8.O.4’.. 1.4.2. Atividades biológicas das lignanas e neolignanas Desde que o homem introduziu os vegetais em sua dieta, ele tem consumido, sem conhecimento, diversas plantas ricas em lignanas e neolignanas. Muitas destas plantas têm sido largamente utilizadas, há milênios pela tradicional medicinal oriental, como a planta japonesa Fraxinus japônica (Oleaceae), utilizada como: diurético, analgésico e antireumático, que possui majoritariamente a lignana: pinoresinol (TRAZZI, 2008). A atividade antiviral destas classes de metabólitos tem sido muito pesquisada. Desde 1942, quando do extrato alcoólico da Podophyllum peltatum (Berberidaceae) foi identificada a podofilotoxina (estrutura 10, Fig. 10), a qual foi relatada como agente antiviral no tratamento do vírus HPV – Condiloma acuminata, causador de verrugas venéreas, estendendo-se depois a outros tipos de verrugas viróticas. Há mais de uma década, de acordo com estimativas modestas, já existiam mais de 200 novas substâncias naturais e semi-sintéticas conhecidas, estruturalmente derivadas da podofilotoxina (10). Com efeito, podemos destacar o etoposídeo e o teniposídeo (Sandoz®), ambos em pleno uso clínico no tratamento de vários tipos de tumores (BARBOSA DE CASTRO et al., 2013; DAVID et al., 2001).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(32) 31. Introdução. Podofilotoxina (10) Figura 10. Estrutura química da podofilotoxina (10). Entre as diferentes atividades biológicas atribuídas a estas classes de substância, tem-se ressaltado a ação antiparasitária das lignanas e neolignanas frente ao Trypanosoma cruzi e a Leishmania sp (DA SILVA et al., 2005; DA SILVA FILHO et al., 2004, 2008; SOUZA et al., 2004, 2005). Em relatos de Schmidt e Colaboradores (2012), cita-se a ação tripanocida e leishmanicida da neolignana tetraidrofurânica: veraguensina (estrutura 11, Fig.11). E a potente ação tripanocida da lignana ariltetralínica: justicidina B (estrutura 12, Fig.11).. Veraguensina (11). Justicidina B (12). Figura 11. Estrutura química da neolignana veraguensina (11) e lignana justicidina B (12) com atividade antiparasitária.. O. destaque. especial. tem. sido. dado. principalmente. à. atividade. esquistossomicida das lignanas e neolignanas. Estudos recentes demonstraram que algumas lignanas dibenzilbutirolactônicas e dibenzilbutirolactólica, bem como as neolignanas tetraidrofurânicas e diidrobenzofurânicas, produzidas sinteticamente ou oriundas do metabolismo secundário de plantas, possuem expressiva atividade esquistossomicida in vitro e in vivo contra o Schistosoma mansoni, sendo capazes de promover tanto a separação quanto a morte dos parasitos adultos (BARBOSA DE. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(33) 32. Introdução. CASTRO et al., 2013; DA SILVA et al., 2005; DA SILVA FILHO et al., 2004, 2008; SOUZA et al., 2004, 2005; Patente PI 0503951-7). Dados. da. literatura. reportam. a. ação. in. vitro. da. neolignana. diidrobenzofurânica: licarina A (estrutura 13, Fig.12) contra os vermes adultos de S. mansoni.. Licarina A (13) Figura 12. Estrutura química da neolignana: licarina A (13).. Como se pode observar na figura 13, esta molécula possui elevada atividade esquistossomicida, sendo capaz de matar os parasitos provocando lesões tegumentares nos mesmos (BARBOSA DE CASTRO et al., 2013; Patente PI 0503951-7).. Figura 13. Alteração tegumentar e morte do S. mansoni induzido por adição in vitro da neolignana diidrobenzofurânica licarina A. A – Vermes adultos mantidos em meio RPMI, B – Vermes adultos em meio RPMI com DMSO 10%, C-D Vermes adultos em meio RPMI tratado com 100 µM da neolignana durante 120 h. A-C aumento.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(34) 33. Introdução. Em estudos realizados com a cubebina (estrutura 14, Fig. 15), lignana dibenzilbutirolactólica, presente nas sementes de Piper cubeba (Piperaceae), além de provocar a morte de 100% dos parasitos adultos após 24 h de incubação, foi capaz de provocar alterações significativas no tegumento de S. mansoni (Fig. 14) (Patente PI 0503951-7, DA SILVA et al., 2005; DE SOUZA et al., 2005), conforme apresentado na figura 14.. B. A. Figura 14. Verme adulto de S. mansoni incubado em controle negativo (meio RPMI 1640) e com adição in vitro da lignana dibenzilbutirolactólica metilcubebina. (A) Verme adulto de S. mansoni incubado em meio RPMI 1640, sob atmosfera em 5% de CO2 a 37 ºC por 24 horas, na ausência da substância. (B), Verme adulto de S. mansoni incubado em meio RPMI 1640, sob atmosfera em 5% de CO2 a 37 ºC por 24 h, na presença de metilcubebina (10 M) (Patente PI 0503951-7).. DA SILVA FILHO e Colaboradores (2004; 2005) reportam a potente ação esquistossomicida in vitro e in vivo contra os vermes adultos de S. mansoni das lignanas. dizenzilbutirolactônicas:. hinoquinina. (estrutura. 16,. Fig.. metilpluviatolideo 15). e. seu. (estrutura. derivado. 15,. Fig.. 15),. semi-sintético,. 6-6’-. Dinitrohinoquinina (estrutura 17, Fig. 15) (BARBOSA DE CASTRO et al., 2013; Patente PI 0503951-7).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(35) 34. Introdução. Cubebina (14). Metilpluviatolideo (15) O. N+. O– O. O. O. O. O N+. O–. O O. Hinoquinina (16). 6-6´-Dinitrohinoquinina (17). Figura 15. Lignanas dibenzilbutirolactólica: cubebina (14) e dibenzilbutirolactônicas: metilpluviatolídeo (15), hinoquinina (16), 6-6’-dinitrohinoquinina (17), com atividade esquistossomicida.. Conforme os dados apresentados vêm se tornando crescente o interesse pela pesquisa das lignanas como protótipos de novas substâncias com potencial esquistossomicida. Dentre as espécies vegetais de interesse medicinal que biossintetizam lignanas, destaca-se a Arctium lappa L. (Asteraceae). 1.5.. A família Asteraceae, o gênero Arctium e a espécie Arctium lappa L.: A família Asteraceae é a maior família do reino vegetal (BERETTA et al.,. 2008), possuindo cerca de 1.600 gêneros e aproximadamente 23.000 espécies, agrupadas em três subfamílias e 17 tribos (BREMER, 1994; FERREIRA et al., 2009). De ampla distribuição, esta família é encontrada em diferentes localidades, destacando as regiões tropicais, subtropicais e temperadas (BARROSO et al., 1991). As plantas desta família possuem grande importância econômica, pois são cultivadas como plantas ornamentais (como a margarida), medicinais (como a. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(36) 35. Introdução. arnica, bardana, carqueja e guaco), apícolas (como o alecrim-do-campo), oleaginosas. (girassol),. aromáticas. (camomila),. inseticidas. (crisântemo). e. comestíveis (alface, almeirão, chicória e estévia). Além disso, muitas espécies são invasoras de lavouras e tóxicas ou potencialmente tóxicas para animais e para o homem (BERETTA et al., 2008) No Brasil, a família é representada por 300 gêneros e 2.000 espécies (SOUZA e LORENZI, 2005). Muitas plantas dessa família são conhecidas pelas suas propriedades medicinais e diversas espécies possuem atividade analgésica, antiinflamatória e antimicrobiana (LORENZI e MATOS, 2002). Quimicamente esta família se destaca pela enorme diversidade de metabólitos secundários, sendo caracterizada pela presença de terpenoides, flavonoides e poliacetilenos (ZDERO e BOHLMANN, 1990). O gênero botânico Arctium pertence à família Asteraceae. E como representantes deste gênero, podemos citar as espécies: Arctium lappa L., Arctium minus (Hill) Bernhardi, Arctium minus nemorosum (Lej.) Syme, Arctium pubens B, Arctium leosperum, Arctium tomentosum. Das quais se destaca à Arctium lappa L. também conhecida como bardana devido ao seu uso na culinária e suas propriedades medicinais como antitumoral e antiviral (CORRÊA, 1894; SANTOS, 2007). A Arctium lappa L. (Asteraceae), originária da Europa e Sibéria e encontrada em países como Portugal, França, Espanha, Alemanha, Itália, chegou ao Brasil por meio de imigrantes japoneses devido ao seu valor terapêutico e alimentar (MORGAN, 2003; MUNARIN et al., 2010). É conhecida por várias denominações de acordo com o país onde é encontrada: no Japão é conhecida como “Gobo” (KARDOŠOVA et al., 2003); “Lampazo” é a sua denominação nos países de língua espanhola; “Bardane” na França e “Burdock” nos países de língua inglesa (CORRÊA, 1984; MORGAN, 1997). No Brasil é chamada de “Bardana”, “Orelha-degigante”, “Bardana-maior”, “Pegamasso” e “Erva-dos-tinhosos” (CUNHA, 2003).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(37) 36. Introdução. A. lappa L. é uma planta herbácea bienal, de fácil cultivo, capaz de se desenvolver em ambientes úmidos e sombreados. Pode alcançar até 1,5 m de altura (FONT QUER, 1988) e possui folhas grandes, que atingem cercade 40 cm de comprimento (CASTRO, 1981; FONT QUER, 1988; MOTA DA SILVA, 2010). As flores são rosadas ou púrpuras e a floração ocorre no verão (CORRÊA, 1984), sendo que suas flores (e os frutos também) são formadas após o segundo ano de cultivo (Fig. 16) (MORGAN, 1997; MOTA DA SILVA, 2010). Os frutos possuem papilos de pêlos muito caducos. As raízes, que podem chegar a 1,2 m de profundidade, são carnosas, brancas internamente e pardas externamente (FONT QUER, 1988). Preferencialmente, devem ser coletadas antes da floração (CORRÊA, 1984), pois as raízes maduras apresentam suas propriedades terapêuticas reduzidas com o passar do tempo (MORGAN, 1997).. Figura 16. Folhas e frutos da A. lappa L. (Asteraceae). Fonte: Horto da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora. Foto: Autora (2012).. As indicações populares dos usos terapêuticos da Bardana são diversas, como antihipertensivo, no tratamento da gota, arteriosclerose, hepatite e como antiinflamatória (FERRACANE et al., 2010). Também utilizada pelas suas propriedades. hipoglicemiantes. (KARDOŠOVÁ. et. al.,. 2003),. desintoxicante. sanguínea e nos tratamentos de afecções cutâneas, como os eczemas (CHAN et al., 2011). Sua toxicidade ainda não é totalmente conhecida, mas potencialmente pode causar reações de sensibilização cutânea por contato. Seu consumo também não é recomendado para gestantes, devido ao estímulo da atividade uterina (CUNHA, 2003; RODRIGUEZ et al., 1995).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(38) 37. Introdução. Vários estudos já foram realizados sobre as atividades biológicas da Bardana dentre os quais citamos: os efeitos antitussígenos e imunomoduladores produzidos pelos polissacarídeos presentes no extrato das raízes desta planta (KARDOŠOVÁ et al., 2003). Estudos demonstraram que a fração hexânica das folhas da Bardana apresenta atividade antimicrobiana frente a microrganismos orais, tais como: Bacillus sutilis, Candida albicans, Lactobacillus acidophilus e Pseudomonas aeruginosa (PEREIRA et at., 2005; SOUZA, 2004). Por outro lado, os constituintes fenólicos presentes na Bardana tais como o ácido cafeico (estrutura 18, Fig. 17) e o ácido clorogênico (estrutura 19, Fig. 17) possuem forte efeito inibitório sobre herpesvírus (HSV-1, HSV-2) e adenovírus (ADV-3, ADV-11) (CHAN et al., 2011). A arctigenina (estrutura 29, Fig. 19), um das lignanas presentes na bardana, demonstrou atividades in vivo e in vivo contra o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) (EICH et al., 1996; SCHRODER et al., 1990). O efeito antialérgico da Bardana foi atribuído, em estudos realizados por Knipping e Colaboradores (2008), aos seus efeitos de inibição da liberação de mediadores químicos, bem como sobre a inibição da biossíntese de leucotrienos pelos basófilos. Os mesmos pesquisadores, em outro estudo realizado em 2008, mostraram que a ação anti-inflamatória do extrato da bardana ocorre principalmente pela sua capacidade de inibir a produção de enzima óxido nítrico sintase (iNOS). A Bardana também apresenta muitos relatos sobre a sua atividade antioxidante. Estudos in vitro demonstraram que a ação antioxidante da Bardana é resultado da redução das espécies reativas ao oxigênio (ROS) e dos danos ao DNA celular (LEONARD et al., 2006). Esta ação antioxidante foi considerada como o mecanismo responsável pela hepatoproteção observada após a hepatotoxicidade induzida pelo acetaminofeno e pelo tetracloreto de carbono (CCl4) (LIN et al., 2000), e após a hepatotoxicidade induzida pelo etanol e potencializada pelo CCl4 (LIN et al., 2002). Esta ação, que vem sendo atribuída devido à presença dos ácidos fenólicos como: ácido cafeico (estrutura 18, Fig. 17), ácido clorogênico (estrutura 19, Fig. 17) e ácido dicafeoilquínico (estrutura 20, Fig. 17).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(39) 38. Introdução. Ácido cafeico (18). Ácido clorogênico (19). Ácido dicafeoilquínico (20) Figura 17. Estruturas químicas de alguns ácidos fenólicos presentes na A. lappa L.: ácido cafeico (18), ácido clorogênico (19) e ácido dicafeoilquínico (20).. E também dos flavonóides: luteolina (estrutura 21, Fig. 18), quercetina (estrutura 22, Fig. 18), quercitrina (estrutura 23, Fig. 18) e rutina (estrutura 24, Fig. 18) presentes nesta espécie.. Luteolina (21). Quercetina (22). Quercitrina (23). Rutina (24). Figura 18. Estruturas químicas de alguns flavonóides encontrados em A. lappa L.: luteolina (21), quercetina (22), quercitrina (23) e rutina (24).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(40) 39. Introdução. Estudos fitoquímicos demonstram que as lignanas e neolignanas são os principais metabólitos presentes nos frutos e sementes da A. lappa L. (Asteraceae). Dentre estas, se destacam a presença das lignanas dibenzilbutirolactônicas: trachelogenina (estrutura 25, Fig. 19), Lappaol F (estrutura 26, Fig. 19), diarctigenina (estrutura 27, Fig.19), arctiina (estrutura 28, Fig.19) e arctigenina (estrutura 29, Fig.19) (CHAN et al., 2011; WU, et al., 2009).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(41) 40. Introdução. Trachelogenina (25). Lappaol F (26). Diarctigenina (27). Arctiina (28). Arctigenina (29) Figura 19. Estruturas químicas de algumas lignanas dibenzilbutirolactônicas presentes nos frutos e sementes da Arctium lappa L.: trachelogenina (25), Lappaol F (26), diarctigenina (27), arctiina (28) e arctigenina (29). A arctigenina (29) é uma das principais lignanas encontrada nas sementes, frutos e folhas da Bardana. Estudos mostram que esta substância apresenta grande potencial para o tratamento de algumas doenças antiinflamatórias, já que é capaz de inibir a produção de óxido nítrico pela enzima óxido nítrico sintase (iNOS) em macrófagos (CHAN et al., 2011; WANG et al., 2007). Além disso, trabalhos têm. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(42) 41. Introdução. demonstrado que a arctigenina (29) tem a propriedade de privar as células cancerosas de nutrientes essenciais, como a glicose, levando-as à morte (AWALE et al., 2006; CHAN et al., 2011). Ainda, são descritas outras propriedades biológicas para esta lignana, como atividade in vivo e in vitro em inibir a replicação do vírus HIV-1 (CHAN et al., 2011; CHO et al., 2004; EICH et al., 1996; VLIETINCK et al., 1998). Já para a arctiina (28), o heterosídeo da arctigenina (29), foi descrita a ação anticancerígena, confirmada pelo teste de indução de tumores cutâneos induzidos pelo 7,2 di-metil-benzatraceno em ratos (WANG et al., 2005).. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(43) 42. Introdução. Tabela 1. Principais classes de metabólitos especiais e substâncias químicas presentes na A. lappa L. e suas atividades biológicas reportadas pela literatura. Classe de. Substância. Partes da Planta. Atividade Biológica. Metabólito Especial Arctigenina. Folhas, frutos, sementes e raízes.. Supressor do choque. térmico, antitumoral e antivírus. influenza.. Arctiina. Folhas, frutos e raízes.. Atividade antitumoral, atividade quimiopreventiva, atividade antiproliferativa frente a células de hibridoma B e células MH 60.. Lignanas. Trachelogenina. Frutos. 2+. Atividade antagonista dos canais de Ca , propriedades antiHIV.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(44) Introdução. Continuação da Tabela 1. Principais classes de metabólitos especiais e substâncias químicas presentes na A. lappa L. e suas ativi pela literatura. Lappaol F. Frutos e sementes. Inibição da produção de. Frutos, raízes e sementes.. Inibição da produção de. Frutos. Antibacteriano e anti-ang. Lignanas Diarctigenina. Beta-eudesmol. Terpenóides. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(45) Introdução. Continuação da Tabela 1. Principais classes de metabólitos especiais e substâncias químicas presentes na A. lappa L. e suas ativi pela literatura. Ácido cafeico. Ácido clorogênico. Estemas, folhas e pele das raízes.. Atividade antioxidativa e. Folhas e pele das raízes. Atividade neuroprotetor anti-HIV.. Polifenóis. Taninos. Raízes. Atividade antitumoral, hialuronidase.. Inulina. Raízes. Eficácia. prebiótica,. antidiabéticas.. Frutoses. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(46) Introdução. Continuação da Tabela 1. Principais classes de metabólitos especiais e substâncias químicas presentes na A. lappa L. e suas ativi pela literatura. Sitosterol-beta-D-glucopiranosídeo. Raízes. Esteróides. Fonte: CHAN et al., 2011.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com). Efeito na alfa-DNA polim.

(47) 46. Introdução. Tendo em vista a importância da descoberta de protótipos naturais ativos frente a S. mansoni, ensaios iniciais de triagem e bioprospecção para descoberta de extratos brutos vegetais ativos, recentemente realizados, demonstraram atividade esquistossomicida para o extrato hidroalcoólico dos frutos de Arctium lappa L. (Asteraceae). Esta amostra foi capaz de promover, em baixas concentrações (300 µg/mL), a separação e/ou a morte de casais adultos (machos e fêmeas) de S. mansoni. Desta forma, considerando a atividade inicial apresentada pelo extrato hidroalcoólico dos frutos da Bardana, bem como o potencial esquistossomicida demonstrado pelas lignanas dibenzilbutirolactônicas, o prosseguimento dos trabalhos tornou-se imprescindível com a realização do isolamento e identificação do(s) metabólito(s) secundário(s) ativo(s) presente(s) no extrato hidroalcoólico dos frutos da A. lappa L. e a avaliação esquistossomicida in vitro deste extrato e dos seus constituintes principais.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(48) 47. Objetivos. 2.. OBJETIVOS:. 2.1.. Objetivo geral: O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar as atividades. esquistossomicidas in vitro do extrato hidroalcoólico bruto e de substâncias majoritárias isoladas dos frutos de A. lappa L., visando encontrar moléculas e/ou protótipos naturais com potencial esquistossomicida. Para esses propósitos, os objetivos específicos do trabalho foram: . Obter o extrato hidroalcoólico bruto dos frutos de Arctium lappa L.;. . Realizar o estudo fitoquímico dos frutos da Arctium lappa L. visando o isolamento, a purificação e a identificação das principais substâncias presentes no extrato hidroalcoólico, principalmente os lignóides;. . Avaliar a atividade esquistossomicida in vitro do extrato hidroalcoólico bruto dos frutos de Arctium lappa L. em diferentes concentrações, uma vez que sua atividade esquistossomicida já foi identificada em triagem preliminar realizada por este grupo de pesquisa.. . E realizar também o ensaio esquistossomicida in vitro de seus principais metabólitos secundários isolados e identificados.. Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).

(49) 48. Materiais e Métodos. 3.. MATERIAIS E MÉTODOS:. 3.1.. Instrumentação e materiais cromatográficos: O Núcleo de Identificação e Pesquisa em Princípios Ativos Naturais. (NIPPAN), da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora, dispôs dos seguintes equipamentos para a realização deste trabalho: - Rotaevaporador (Fisaton®, modelo 558); bomba à vácuo (Prismatec ®, modelo 121) e Banho Ultratermostático (Cientec ®, modelo CT-281-28) - Aparelho de Soxhlet com manta aquecedora Marconi®. - Bomba Bunchi V-700. - Câmara de Ultravioleta 254e 366 nm (U.V. SL-204, Solab Científica®). - Balança semi-analítica (BL 320, Marte®). - Balança analítica (AY 220, Marte®). O Departamento de Química, do Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal de Juiz de Fora, disponibilizou a utilização do espectrômetro BRUKER AVANCE DRX/300 que opera em campo magnético de 300 MHz (RMN 1H) e 75 MHz (RMN 13C). Para a realização do ensaio esquistossomicida, foram utilizados: - Agitador de tubo, tipo Vortex (modelo AP 56, Phenix®, Ltda.) - Estufa de CO2 (Revco®, Thermo Electron Corporation) - Estereomicroscópio (SMZ 1000, Nikon®). - Microscópio Confocal de Varredura a laser (Laser Scanning Microscopy, LSM 510 META, Carl Zeiss Inc.). Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com).