ISAAC FILIPE MOREIRA KONIG
ASSESSMENT OF SUBLETHAL EFFECTS OF
ACETYLCARVACROL IN THE OOCYTE MORPHOLOGY
OF Rhipicephalus microplus (CANESTRINI, 1888) AND
Rhipicephalus sanguineus sensu lato (LATREILLE, 1806) TICKS
(ACARI: IXODIDAE)
LAVRAS-MG
2019
ISAAC FILIPE MOREIRA KONIG
ASSESSMENT OF SUBLETHAL EFFECTS OF ACETYLCARVACROL IN THE OOCYTE MORPHOLOGY OF Rhipicephalus microplus (CANESTRINI, 1888) AND
Rhipicephalus sanguineus sensu lato (LATREILLE, 1806) TICKS (ACARI: IXODIDAE)
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para a obtenção do título de Mestre.
Prof. Dr. Rafael Neodini Remedio Orientador
Profa. Dra. Ana Paula Peconick Coorientadora
LAVRAS-MG 2019
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a).
Konig, Isaac Filipe Moreira.
Assessment of sublethal effects ofacetylcarvacrol in the oocyte morphology of Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1888) and
Rhipicephalus sanguineus sensu lato (latreille, 1806) ticks (Acari:
ixodidae) / Isaac Filipe Moreira Konig. - 2019. 98 p.
Orientador(a): Rafael Neodini Remedio. Coorientador(a): Ana Paula Peconick.
Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade Federal de Lavras, 2019.
Bibliografia.
1. Carrapato-do-boi. 2. Carrapato-marrom-do-cão. 3. Ovário. I. Remedio, Rafael Neodini. II. Peconick, Ana Paula. III. Título.
ISAAC FILIPE MOREIRA KONIG
ASSESSMENT OF SUBLETHAL EFFECTS OF ACETYLCARVACROL IN THE OOCYTE MORPHOLOGY OF Rhipicephalus microplus (CANESTRINI, 1888) AND
Rhipicephalus sanguineus sensu lato (LATREILLE, 1806) TICKS (ACARI: IXODIDAE)
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SUBLETAIS DO ACETILCARVACROL NA MORFOLOGIA DOS OVÓCITOS DE CARRAPATOS Rhipicephalus microplus (CANESTRINI, 1888) E Rhipicephalus sanguineus sensu lato (LATREILLE, 1806)
(ACARI: IXODIDAE)
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para a obtenção do título de Mestre.
APROVADA em 12 de Julho de 2019. Dr. Rafael Neodini Remedio - UFLA Dr. Sidney de Almeira Ferreira - UFLA
Dra. Maria Izabel Camargo Mathias – UNESP – Rio Claro
Dr. Rafael Neodini Remedio Orientador
Dra. Ana Paula Peconick Coorientadora
LAVRAS-MG 2019
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer ao povo brasileiro que luta arduamente, todos os dias, para pagar seus impostos e, com isso, financia as pesquisas em universidades públicas desse país. Não há outro caminho para o desenvolvimento do Brasil senão o investimento em pesquisas e a defesa das universidades públicas.
Agradeço a toda a minha família, em especial a minha mãe, Maria de Lourdes Moreira, por sempre acreditar em mim e me dar todo o suporte necessário.
Agradeço a todos os professores, desde os que me ensinaram a ler aos que contribuíram para a realização desse trabalho. Sem vocês, certamente, eu não teria chegado onde cheguei.
Agradecimento mais que especial ao meu orientador, Rafael Remedio, pela paciência, competência, grande auxílio na realização desse trabalho e por ser um exemplo de profissional a ser seguido.
Agradeço ao meu chefe, José Rafael, por sempre se mostrar compreensivo e me incentivar durante a realização desse projeto. O incentivo à qualificação do corpo técnico é um mecanismo fundamental para a melhoria da qualidade dos projetos desenvolvidos em Universidades. Agradeço ao José Rafael, além do professor Vitor Mati, pelas relevantes contribuições para esse trabalho durante a qualificação.
Agradeço à UFLA, ao Departamento de Medicina Veterinária e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde por fornecerem o espaço e todas as condições para a realização desse trabalho.
Agradeço, ainda, aos meus amigos de Lavras/trabalho/república/vida. Vocês me acompanharam e incentivaram durante todo esse tempo e me ouviram falar sobre carrapatos por longos períodos. Certamente vocês também serão um pouquinho "mestre em carrapatos"! Não há palavras suficientes que expressem minha gratidão a vocês.
RESUMO
Os carrapatos do gênero Rhipicephalus possuem dois representantes com ampla distribuição no Brasil, sendo eles R. sanguineus sensu lato (s. l.) e R. microplus. Esses carrapatos apresentam grande importância médico-veterinária por transmitirem patógenos ao homem e ao cão, no caso de R. sanguineus (s. l.); e ao gado, no caso de R. microplus. Além disso, R. microplus é responsável por prejuízos econômicos da ordem de um bilhão de dólares por ano, apenas no Brasil. Por isso, esses parasitos são alvos de diferentes métodos de controle, como o uso de substâncias acaricidas. O carvacrol, um monoterpeno fenólico extraído de plantas, apresenta elevada ação carrapaticida. Seu derivado semi-sintético, acetilcarvacrol, tem sido estudado como nematicida, especialmente por apresentar maior eficiência, maior estabilidade e mais baixa toxicidade aos hospedeiros quando comparado ao carvacrol. Com base nestas informações, esse trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de concentrações subletais do acetilcarvacrol, diluído em solução de dimetilsulfóxido (DMSO) a 3%, na morfologia do ovário de carrapatos R. sanguineus (s. l.) e R. microplus. Para isso, os carrapatos foram submersos, durante cinco minutos, em diferentes concentrações de acetilcarvacrol, baseadas em experimentos prévios, conforme procedimento já estabelecido na literatura. Após um período de sete dias, os carrapatos foram dissecados para coleta dos ovários. O material foi processado e incluído em historesina, seccionado, corado e avaliado por meio de morfometria e um protocolo de análise semiquantitativa. As alterações morfológicas comuns nos ovários de R. sanguineus s. l. e R. microplus foram vacuolização citoplasmática e nucleolar, diminuição de tamanho e formato irregular das células germinativas e descolamento do córion. Para R. sanguineus (s. l.) houve ainda drástica alteração das células epiteliais do oviduto, inclusive com desaparecimento de células germinativas jovens. Para ambas as espécies, concentrações maiores de acetilcarvacrol causaram danos estatisticamente significativos de acordo com a análise semiquantitativa proposta. Os resultados demonstram o potencial de acetilcarvacrol como método de controle da reprodução desses parasitos a longo prazo.
Palavras- chave: Carrapato-do-boi. Carrapato-marrom-do-cão. Ovário. Toxicidade.
ABSTRACT
The ticks of the genus Rhipicephalus have two species with wide distribution in Brazil, namely R. sanguineus sensu lato (s. 1) and R. microplus. These ticks are of great medical and veterinary importance for transmitting pathogens to humans and dogs in the case of R. sanguineus (s. 1); and cattle, in the case of R. microplus. In addition, R. microplus is responsible for economic losses in the order of one billion dollars per year, only in Brazil. Therefore, these parasites are targets of different control methods, such as the use of acaricidal substances. Carvacrol, a phenolic monoterpene extracted from plants, shows high acaricidal action. Its semi-synthetic derivative, acetylcarvacrol, has been studied as nematicide, especially since it presents greater efficiency, greater stability and lower toxicity to the hosts, when compared to carvacrol. Based on this information, this study aimed to evaluate the effects of sublethal concentrations of acetylcarvacrol diluted in 3% dimethyl sulfoxide solution (DMSO) in the morphology of the ovaries of R. sanguineus (s. 1) and R. microplus ticks. In order to do this, the ticks were submerged, during five minutes, in different concentrations of acetylcarvacrol, based on previous experiments, according to procedure already established in the literature. After a period of seven days, the ticks were dissected for collection of the ovaries. The material was processed and included in historesin, sectioned, stained and evaluated by means of morphometry and a semiquantitative analysis protocol proposed in this study. The common morphological alterations in the ovaries of R. sanguineus s. l. and R. microplus were cytoplasmic vacuolization, ring-shaped nucleolus, irregular size and shape of germ cells and chorion detachment. For R. sanguineus (s. 1.), there was still a drastic alteration of oviduct epithelial cells, including the disappearance of young germ cells. For both species, higher concentrations of acetylcarvacrol caused statistically significant damages according to the proposed semiquantitative analysis. The results demonstrate the potential of acetilcarvacrol as a method for long-term control of these parasites’ reproduction.
SUMÁRIO
PARTE I 1. INTRODUÇÃO ... 11 2. REFERENCIAL TEÓRICO ... 12 2.1. Carrapatos ... 12 2.1.1. Rhipicephalus microplus ... 13 2.1.2. Rhipicephalus sanguineus ... 14 2.2. Controle de carrapatos ... 17 2.2.1. Controle alternativo ... 17 2.2.2. Carvacrol e acetilcarvacrol ... 182.3. Controle baseado na reprodução ... 21
3.3.1. Morfologia do ovário de carrapatos ... 22
3. OBJETIVOS ... 25 3.1. Objetivo Geral ... 25 3.2. Objetivos Específicos ... 25 REFERÊNCIAS ... 26 PARTE II - Artigo I ABSTRACT ... 37 1. INTRODUCTION ... 38
2. MATERIAL AND METHODS ... 39
2.1. R. microplus ticks ... 39
2.2. Synthesis of carvacrol acetate ... 40
2.3. Adult immersion test ... 40
2.4. Histology ... 40
2.5. Semi-quantitative and morphometric analysis ... 41
3. RESULTS ... 46
3.1. Histopathological analysis ... 46
3.2. Morphometric analysis ... 50
3.3. Semi-quantitative analysis ... 50
REFERENCES ... 58
PARTE III - Artigo II ABSTRACT ... 65
1. INTRODUCTION ... 66
2. MATERIAL AND METHODS ... 67
2.1. R. sanguineus sensu lato ticks ... 67
2.2. Acetylcarvacrol ... 68
2.3. Adult immersion test ... 68
2.4. Histology ... 68
2.5. Histochemistry ... 69
2.6. Morphometric and semi-quantitative analysis ... 70
3. RESULTS ... 71 3.1. Lethal concentration (LC) ... 71 3.2. Morphological analysis ... 71 3.3. Morphometric analysis ... 79 3.4. Semi-quantitative analysis ... 80 4. DISCUSSION ... 83 REFERENCES ...88 PARTE IV 1. DISCUSSÃO GERAL ... 95 2. CONCLUSÃO GERAL ... 97 REFERÊNCIAS...98
11
1. INTRODUÇÃO
Os carrapatos R. microplus, também conhecido como carrapato-do-boi, e R. sanguineus sensu lato, o carrapato-marrom-do-cão, apresentam ampla distribuição global (ANDREOTTI et al., 2014) e reconhecida importância na saúde humana e veterinária (JONGEJAN; UILENBERG, 2004). A infestação por esses parasitos causa dor, prurido e desconforto aos hospedeiros, além de estar relacionada com a transmissão de uma grande variedade de patógenos (DANTAS-TORRES et al., 2006). Além disso, uma única fêmea ingurgitada desses carrapatos é capaz de fazer a postura de milhares de ovos (TROUGHTON; LEVIN; 2007), tornando necessária a utilização de diferentes métodos de controle (DE LA FUENTE, 2018).
A utilização de acaricidas sintéticos é o principal método de controle de carrapatos. Todavia, o uso prolongado ou inapropriado dessas substancias pode acelerar a seleção de parasitos resistentes, além de gerar resíduos no meio ambiente (KLAFKE et al. 2017; TSABOULA et al., 2016). Dessa forma, extratos vegetais surgem como acaricidas alternativos promissores devido ao relativo baixo custo e toxicidade, além de grande abundância (TAK; ISMAN, 2017). Acetilcarvacrol é derivado de um composto natural com atividade acaricida comprovada, o carvacrol (CETIN et al., 2010 NOVATO et al., 2015). Estudos demonstraram que a acetilação desse composto aumenta sua atividade biológica (RAMÍREZ et al., 2016), enquanto diminui a toxicidade para mamíferos (ANDRE et al., 2016). Além disso, outras atividades biológicas já foram atribuídas ao acetilcarvacrol, como efeito ansiolítico em ratos (PIRES et al., 2013), atividade bactericida (CACCIATORE et al., 2015), ação anti-inflamatória (DAMASCENO et al., 2014), atividade anti-helmíntica in vitro contra Schistosoma mansoni (MORAES et al., 2013), dentre outras.
Além da atividade acaricida, a utilização de compostos capazes de afetar a morfologia de órgãos fundamentais para a sobrevivência ou perpetuação da espécie são de particular interesse no controle de carrapatos (CAMARGO-MATHIAS, 2018). Desse modo, o presente estudo avaliou os efeitos de acetilcarvacrol na morfologia dos ovários de R. microplus e R. sanguineus s. l.. Inicialmente, avaliou-se as alterações nos ovários do carrapato do boi e propôs-se um novo método para avaliação dessas alterações morfológicas. Por fim, demonstrou-se o potencial acaricida de acetilcarvacrol e os efeitos desse composto nos ovários de R. sanguineus sensu lato através de técnicas histológicas e histoquímicas.
12
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Carrapatos
Carrapatos são parasitos hematófagos obrigatórios em pelo menos um estágio da vida (NAVA et al., 2010). Esses parasitos apresentam ampla distribuição mundial e infestam mamíferos, aves, répteis e anfíbios (SAUER, 1995). Carrapatos pertencem à subclasse Acari e são divididos em três famílias: Argasidae, Ixodidae e Nuttalliellidae. Os carrapatos ixodídeos são também conhecidos como ‘carrapatos duros’ devido à presença de um escudo que cobre integralmente, no caso dos machos, e parcialmente, no caso das fêmeas, a parte dorsal de seus corpos (SONENSHINE; ROE, 2014). No Brasil existem aproximadamente 61 espécies de carrapatos, dentre ixodídeos e argasídeos. Os carrapatos ixodídeos pertencem aos gêneros Amblyomma (30 spp.), Ixodes (8 spp.), Haemaphysalis (3 spp.), Rhipicephalus (2 spp.) e Dermacentor (1 spp.) (DANTAS-TORRES et al., 2009). Para o gênero Amblyomma, três novas espécies foram posteriormente descritas: A. tonelliae n. sp., A. interandinum n. sp., e A. patinoi n. sp. (NAVA et al., 2014).
Os carrapatos ixodídeos apresentam ciclo de vida dividido em três estágios (larva, ninfa e adultos), todos com um único instar (SAUER, 1995). Esses parasitos se destacam como importantes transmissores de patógenos, como vírus, bactérias, fungos e protozoários (DANTAS-TORRES et al., 2012). Algumas características do ciclo de vida dos carrapatos ixodídeos os colocam em posição de destaque na transmissão de patógenos, a citar: o lento metabolismo, com exceção da fêmea ingurgitada; a possibilidade de permanecer longos períodos sem se alimentar; a ingestão de grande quantidade de sangue; e a produção de grande quantidade de ovos (SONENSHINE; ROE, 2014).
O gênero Rhipicephalus possui dois representantes com alta incidência no Brasil: R. sanguineus e R. microplus. Essas espécies se destacam por ampla distribuição no Brasil e no mundo, além de sua grande importância veterinária na transmissão de patógenos (ANDREOTTI et al., 2014).
2.1.1. Rhipicephalus microplus
Rhipicephalus microplus é popularmente conhecido como "carrapato-do-boi" devido a sua grande preferência em parasitar bovinos, especialmente os das raças taurinas
13 (ANDREOTTI et al., 2014). Todavia, podem também parasitar equinos, cães, gatos e os animais silvestres, embora com menor frequência (BARRÉ; UILENBERG, 2010). A infestação de R. microplus causa desconforto aos animais, além de afetar o desenvolvimento do rebanho, e a produção de carne e de leite (JONSSON, 2006). A produção de couro é também fortemente afetada pela infestação por R. microplus. Embora o aparelho bucal dessa espécie de carrapato seja relativamente pequena, as áreas preferidas para infestação normalmente são as de maior potencial de produção de couro (JONGEJAN; UILENBERG, 2004). Ademais, R. microplus é o vetor de Babesia bovis, Babesia bigemina, Anaplasma marginale (CLERCQ et al., 2012) e Borrelia theileri (SOARES et al., 2000) aos bovinos.
Devido aos fatores mencionados acima, estima-se que, no Brasil, a infestação de carrapato-do-boi representa uma perda econômica de US$ 968 milhões de dólares por ano (RODRIGUES; LEITE, 2013). Já Grisi et al. (2014), em reavaliação mais abrangente do potencial impacto econômico de diversas parasitoses em bovinos no Brasil, estimam que apenas a infestação por R. microplus é responsável por uma perda anual de 3,24 bilhões de dólares. Esses danos provocados pela infestação de R. microplus ocorrem não apenas no Brasil, mas em grande parte do mundo (MADDER et al., 2011). Essa espécie de carrapato é originária do sudeste da Ásia e se espalhou por todos os trópicos, incluindo a Austrália, a África oriental e ocidental, além da América do Sul e Central (JONGEJAN; UILENBERG, 2004). De fato, esse parasito é bem adaptado em toda a América Latina e na Austrália, sendo também reportada alarmante ‘invasão’ no oeste da África (CLERCQ et al., 2012). Madder et al. (2011) relatam que a introdução de R. microplus no oeste de África foi capaz de reduzir significativamente a população da espécie nativa de carrapatos, R. decoloratus. Os autores argumentam que R. microplus é uma espécie extremamente invasiva e que tem causado sérias perdas econômicas na região (MADDER et al., 2011).
Rhipicephalus microplus é um parasito monoxênico, alcançando o hospedeiro no estágio larval e permanecendo até o completo ingurgitamento (HITCHCOCK, 1954). Em condições laboratoriais, a fêmea ingurgitada apresenta um período pré-oviposição médio de quatro dias. Já o período de oviposição tem duração média de nove dias, com produção máxima no terceiro dia, totalizando aproximadamente 589.1±119.2 ovos por fêmea. Em média, uma única fêmea faz a postura de três mil ovos, permanecendo viva por dois a seis dias após a oviposição. A eclosão das larvas acontece em até 25 dias após a postura. Após alcançar o hospedeiro, as larvas se alimentam por até oito dias, realizam a ecdise para o
14 estágio de ninfa e posteriormente para o estágio adulto. Considerando condições ambientais ótimas e a disponibilidade de hospedeiro, cada ciclo de R. microplus apresenta duração de 65±8.0 dias (SENBILL et al.,2018). Hitchcock (1954), ao infestar cinco bovinos com larvas de R. microplus, observou a presença de fêmeas ingurgitadas 18,9 dias após a infestação. Essas fêmeas apresentaram um ritmo diurno para deixarem o hospedeiro para iniciarem a postura. Não havendo disponibilidade de hospedeiro, larvas de R. microplus podem permanecer vivas no ambiente por até cinco meses sem se alimentarem (UTECH et al., 1983).
Fêmeas ingurgitadas de R. microplus são capazes de fazer a postura de milhares de ovos, apresentam ciclo de desenvolvimento rápido, alta capacidade invasiva e de transmissão de patógenos (MADDER et al., 2011). Ademais, essa espécie de carrapato apresenta diversos mecanismos de resistência aos acaricidas comercialmente disponíveis (GUERRERO et al., 2012). Dentre os mecanismos mencionados por Guerrero et al. (2012) destacam-se os que causam modificações no local de ação dos acaricidas, aumento do metabolismo ou sequestro do acaricida, ou ainda redução na capacidade do acaricida em penetrar através das camadas protetoras do corpo do carrapato. Diante disso, a busca constante por substâncias com atividades acaricidas faz-se necessária. (CONTRERAS et al., 2017). Dentre os diversos métodos disponíveis, os métodos de controle baseados na reprodução dos parasitos se destacam por atuarem em etapa fundamental para a perpetuação da espécie (KARUNARATNE, 2017; DE LA FUENTE et al., 2007).
2.1.2. Rhipicephalus sanguineus
Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.), popularmente conhecido como “carrapato-marrom-do-cão”, representa um grupo de aproximadamente 17 espécies de carrapatos amplamente distribuídos no mundo (DANTAS-TORRES, 2010). Anteriormente, o complexo de espécies R. sanguineus era referido como R. sanguineus sensu stricto (PEGRAM et al., 1987). Todavia, Dantas-Torres et al. (2013) demonstraram, através de estudos morfológicos e genéticos, que o complexo R. sanguineus possivelmente compreende espécies diferentes alocadas em um mesmo grupo, sugerindo, por este motivo, que se evite o uso do termo R. sanguineus sensu stricto.
Rhipicephalus sanguineus é um parasito trioxeno que alcança o hospedeiro no estágio larval, se alimenta e deixa o hospedeiro para sofrer ecdise no ambiente. O mesmo ocorre no estágio de ninfa e, posteriormente, o adulto alcança o hospedeiro pela terceira vez para
15 finalizar o ciclo (DANTAS-TORRES, 2010). R. sanguineus possui grande especificidade pelo cão, mas ocasionalmente parasita outras espécies, inclusive humanos (DANTAS-TORRES, 2008). A preferência por hospedeiro foi determinada em experimento realizado com 30 voluntários humanos, além de cães e porcos da índia, no qual R. sanguineus nos três estágios de desenvolvimento (larva, ninfa e adultos) foram liberados em compartimentos fixados nos braços dos voluntários e no dorso de cachorros e porcos da índia. Após 24 horas, foi observado que 3,5% das larvas, 2% das ninfas e 5% dos adultos se fixaram em humanos. Já em cães, 21,3% das larvas, 61,1% das ninfas e 31,8% dos adultos se fixaram nesse hospedeiro após 24 horas (NELSON, 1969). Trabalhos mais recentes demonstraram a infestação de R. sanguineus em humanos na Itália (OTRANTO et al., 2014), Uruguai (VENZAL et al., 2003), Panamá (BERMÚDEZ et al., 2012), dentre outros. No Brasil, a infestação por R. sanguineus em humanos já foi reportada nos estados do Rio Grande do Sul (MENTZ et al., 2016), Pernambuco (DANTAS-TORRES et al., 2006) e Goiás (LOULY et al., 2006).
Além de dor, incômodo e prurido, a picada de R. sanguineus está relacionada com a transmissão de mais de uma dezena de agentes infecciosos aos cães e ao homem. R. sanguineus é um parasito de grande importância em saúde pública por estar relacionado com a transmissão de Rickettsia rickettsii, agente causador da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas, nos Estados Unidos da América e no México, e R. conorii, agente causador da Febre Maculosa do Mediterrâneo na Europa (DANTAS-TORRES; OTRANTO, 2015). No Brasil, R. sanguineus é considerado um potencial vetor da bactéria R. rickettsii, agente causador da Febre Maculosa Brasileira (SILVA et al., 2017). Isso se deve à identificação molecular de R. rickettsii em R. sanguineus coletados em cachorros naturalmente infestados no município de Resende, Rio de Janeiro, no ano de 2006, onde ocorreram cinco casos humanos de Febre Maculosa Brasileira (CUNHA et al., 2009). Também foi observada a presença de R. rickettsii em R. sanguineus no município de Juiz de Fora, Minas Gerais (PACHECO et al., 2011), no estado do Rio de Janeiro (GEHRKE et al., 2009), no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul (ALMEIDA et al., 2013), na região de Maciço de Baturité, Ceará (SILVA et al., 2017), dentre outros. Além disso, Costa et al. (2011) demonstraram a transmissão transovariana e transestadial, especialmente do estágio de ninfa para adultos, de R. rickettsii em carrapatos R. sanguineus. Dessa forma, fica evidente que existe uma chance considerável de R. sanguineus participar ativamente da transmissão de R. ricketsii no território brasileiro. Todavia, mais estudos são necessários para confirmar essa hipótese (CUNHA et al., 2009).
16 Rhipicephalus sanguineus é um parasito altamente adaptado para sobreviver em habitações humanas, sendo ativo durante todo o ano em regiões tropicais e subtropicais, bem como em algumas áreas temperadas (DANTAS-TORRES, 2010). Além disso, estudos demonstraram que o aumento da temperatura aumenta a preferência de R. sanguineus por humanos e coelhos (PAROLA et al., 2008; SOCOLOVSCHI et al., 2009). Diante disso, especula-se que o aumento de dois a três graus Celsius provocados pelo aquecimento global pode ser fator determinante para o aumento de casos de parasitoses transmitidas por esse carrapato a humanos (DANTAS-TORRES, 2010).
O ciclo de R. sanguineus se inicia com a oviposição da fêmea, capaz de fazer a postura de até quatro mil ovos. O período de oviposição pode perdurar por várias semanas, sendo a produção de ovos dependente do peso da fêmea e tempo de postura dos ovos (KOCH, 1982). Em condições experimentais controladas, as larvas eclodem em até 32 dias após a postura e se alimentam por quatro dias, em média. A ecdise da larva ocorre, em média, 32 dias após a alimentação. Posteriormente, a ninfa se alimenta por quatro a sete dias e sofre ecdise após uma média de 32,8 dias. Quando no estágio adulto, a fêmea se alimenta por cerca de nove dias e, sem seguida, inicia o período pré-oviposição, que varia de três dias a algumas semanas (DANTAS-TORRES et al., 2010; TROUGHTON; LEVIN, 2007). Vale ressaltar que, embora a fêmea possa iniciar a alimentação na ausência do macho, é necessário a cópula para seu completo ingurgitamento (DANTAS-TORRES, 2010). O ciclo de R. sanguineus se completa em média em 23 a 25 semanas sob condições laboratoriais. Na ausência de hospedeiro, adultos podem permanecer em jejum por períodos maiores que 12 meses quando armazenados de quatro a oito graus Celsius (TROUGHTON; LEVIN, 2007). Diante do exposto, fica evidente a necessidade de métodos eficientes de controle para esse parasito (DANTAS-TORRES, 2008, 2006; SILVA et al., 2017).
2.2. Controle de carrapatos
O controle de carrapatos pode ser realizado através de vacinação (CONTRERAS et al., 2017; DE LA FUENTE et al., 2007), controle biológico (WASSERMANN et al., 2016), controle químico através de acaricidas sintéticos (MILLER et al., 2011) ou extratos vegetais (TAK; ISMAN, 2017), dentre outros. Embora De La Fuente (2018) argumente que o controle de carrapatos deva ocorrer de maneira integrada, o uso de acaricidas sintéticos ainda é o método mais amplamente utilizado. Todavia, o uso frequente desses compostos pode resultar
17 na seleção de carrapatos resistentes, necessitando de dosagens maiores e aplicações em intervalos menores (KLAFKE et al., 2017). Além disso, o uso indiscriminado de acaricidas sintéticos pode gerar efeitos tóxicos em animais, plantas e humanos, bem como contaminar o solo e água (TSABOULA et al., 2016). Extratos vegetais e óleos essenciais se apresentam como alternativas promissoras no controle desses parasitos devido à grande variedade de espécies de plantas, baixo custo e grande abundância (BENELLI et al., 2016).
2.2.1. Controle alternativo
Óleos essenciais são compostos voláteis originários do metabolismo secundário de plantas, utilizados para atrair polinizadores, bem como proteger contra estresse térmico, microrganismos ou outros patógenos (PAVELA, 2015). Os terpenos são uma classe de compostos presentes em óleos essenciais sintetizados por plantas, a partir de unidades de isopreno, que se destacam por sua ampla atividade biológica (TAK; ISMAN, 2017). A modificação enzimática desses compostos para adição de átomos de oxigênio gera uma subclasse de terpenos, os terpenoides (BURT, 2004). De fato, uma variedade de terpenoides se destacam por suas atividades biológicas, especialmente como acaricidas, a citar: carvacrol (CRUZ et al., 2013; NOVATO et al., 2018, 2015; RAMÍREZ et al., 2016; SENRA et al., 2013), timol (DAEMON et al., 2009; JACK et al., 2006; NOVATO et al., 2015), eugenol (ARAÚJO et al., 2016; MONTEIRO et al., 2012; NOVATO et al., 2018), dentre outros. A atividade acaricida desses três terpenoides foi avaliada por Araújo et al. (2016) em larvas em jejum de R. microplus e R. sanguineus. O timol apresentou os melhores resultados em ambas as espécies com CL50 de 1,53 mg/mL para R. microplus e 2.98 mg/mL para R. sanguineus s.l.,
seguido de carvacrol com CL50 de 1,76 mg/mL e 3.29 mg/mL, respectivamente. R. microplus
mostrou-se mais suscetível frente a todos os compostos quando comparado ao R. sanguineus s. l. (MATOS et al., 2018; ARAÚJO et al., 2016).
Extratos vegetais ou metabólitos secundários isolados de plantas atuam de maneira variada para mitigar a infestação por carrapatos, inibindo o desenvolvimento dos ovos, neutralizando os hormônios que coordenam a ecdise, ocasionando efeitos neurotóxicos, além de atuarem como repelentes (CAMARGO-MATHIAS, 2018; DE LA FUENTE, 2018; MATOS et al., 2018; ROSADO-AGUILAR et al., 2017). Dentre uma variedade de metabólitos secundários com atividade acaricida, carvacrol se destaca como uma alternativa promissora para o controle desses parasitos (SOUZA et al., 2019).
18 2.2.2. Carvacrol e acetilcarvacrol
Carvacrol (2-metil-5-(1-metiletil)fenol) é um monoterpeno fenólico encontrado em óleos essenciais de plantas da família Lamiaceae. É um dos constituintes majoritários dos óleos essenciais de plantas Origanum sp. e Thymus sp, assim como seu isômero, o timol (SANTORO et al., 2007). Kulisic et al. (2004), por exemplo, ao empregar aparelho de Clevenger com quantidade conhecida de n-pentano para coleta das frações do extrato aquoso de Origanum sp., obtiveram o óleo essencial com 2,9% de rendimento, contendo 41,1% de carvacrol e 58,9% de timol (KULISIC et al., 2004).
Ademais, o carvacrol é também uutilizado como aditivo alimentar devido às suas propriedades antimicrobianas e antioxidantes, tendo sido considerado seguro (Generally Recognized as Safe – GRAS) pelo órgão fiscalizador dos Estados Unidos da América (US Food and Drug Administration – FDA) (GUARDA et al., 2011). Além disso, foi inserido na lista de substâncias químicas aromatizantes pelo Departamento de Saúde e Segurança Alimentar do Conselho da Europa. A adição desse composto é permitida na Europa na concentração de até 25 ppm (=mg/L), no caso de aromatizantes para doces (VINCENZI et al., 2004). Experimento realizado com leitões 28 dias após o nascimento, fornecendo carvacrol nas concentrações de 500 e 2000 mg/kg da dieta, resultou no aumento da relação altura de cripta/vilosidades no intestino, aumentando a capacidade de digestão e absorção do intestino, sem alterar a composição da microbiota intestinal (MICHIELS et al., 2010). Dessa forma, Michiels et al. (2010) consideraram a adição de carvacrol na dieta dos leitões uma alternativa segura para aumento da produção.
Carvacrol apresenta comprovada ação acaricida para uma gama de espécies de carrapatos, entre elas larvas em jejum de R. sanguineus (ARAÚJO et al., 2016), ninfas e adultos em jejum de Ixodes scapularis e Amblyomma americanum (DOLAN et al., 2009), larvas em jejum de A. sculptum e Dermacentor nitens (NOVATO et al., 2015), dentre outras. Outros estudos avaliaram a atividade acaricida de óleos essenciais no qual carvacrol era um dos constituintes majoritários, além de avaliarem a atividade do composto isoladamente a título de comparação. Com isso, demonstraram que carvacrol é o principal responsável pela atividade acaricida contra adultos em jejum de Hyalomma marginatum (CETIN et al., 2010), larvas em jejum de R. microplus (CRUZ et al., 2013), adultos em jejum de R. turanicus (KOC et al., 2013), dentre outros.
19 Para larvas em jejum de R. sanguineus e R. microplus, carvacrol mostrou promissora ação acaricida, com concentrações letais para a metade da população (CL50) de 3,29 e 1,76
mg/mL, respectivamente (ARAÚJO et al., 2016). O mecanismo pelo qual carvacrol atua, embora possivelmente não seja o principal, é através da inibição da acetilcolinesterase (ANDERSON; COATS, 2012). A inibição dessa enzima, responsável pela hidrólise do grupamento éster da acetilcolina e diminuição dos impulsos elétricos, ocasiona superestimulação dos neurônios, levando ao aumento da contração muscular, convulsões e, eventualmente, morte dos artropodes (MUKHERJEE et al., 2007). Ademais, carvacrol demonstrou ação repelente em ninfas em jejum de Ixodes scapularis (DIETRICH et al., 2006). Finalmente, o desenvolvimento de células germinativas de fêmeas semi-ingurgitadas de R. sanguineus mostrou-se drasticamente afetado quando submetido a concentrações subletais de carvacrol (SOUZA et al., 2019).
Embora muitos compostos isolados de óleos essenciais de plantas apresentem alta atividade acaricida, algumas limitações dificultam o uso desses compostos em aplicações a campo. Pavela e Benelli (2016) argumentam que fatores como a baixa estabilidade frente à oxidação dificultam o uso prático dessas substâncias. Carvacrol, por exemplo, apresenta um grupamento hidroxila em sua estrutura que pode ser facilmente oxidado (SOLOMONS et al., 2016). Diante disso, estudos passaram a utilizar compostos químicos naturais para a síntese de análogos semissintéticos, com o objetivo de aumentar sua estabilidade e atividade biológica, além de reduzir a toxicidade para organismos não-alvo (CACCIATORE et al., 2015). Dentre essas modificações destaca-se a acetilação do carvacrol (NOVATO et al., 2018).
O acetilcarvacrol apresenta um grupamento éster em sua estrutura, em substituição ao grupo hidroxila do carvacrol, o que confere maior estabilidade ao composto (SOLOMONS et al., 2016). Além disso, a acetilação demonstrou aumentar a atividade acaricida em larvas em jejum de R. microplus. Em comparação ao carvacrol, a taxa de mortalidade média das larvas aumentou de 35,85 para 67.83%, quando se empregou o composto acetilado (RAMÍREZ et al., 2013). Em estudo posterior também realizado por Ramírez et al. (2016), acetilcarvacrol mostrou atividade acaricida superior ao carvacrol, com CL50 de 5,01 e 59,72 µmol/mL,
respectivamente, para larvas em jejum de R. microplus. Para esse teste, as larvas foram incubadas por 24h a 28 °C em envelopes previamente expostos a concentrações variando de 0,0625 a 1% (m/v) dos compostos, diluídos em uma mistura de tricloroetileno e azeite de oliva (2:1) (RAMÍREZ et al. 2016). Todavia, Novato et. al. (2018) demonstraram que
20 carvacrol foi mais eficiente que seu derivado acetilado, acetilcarvacrol, em teste realizado empregando etanol absoluto como solvente. Nesse trabalho, carvacrol apresentou uma CL50
de 0,83 mg/mL e acetilcarvacrol 2,49 mg/mL em larvas de R. microplus. Diante disso, Novato et al. (2018) argumentam que os resultados da atividade acaricida de carvacrol apresentados por Ramírez et al. (2013) são curiosamente mais baixos dos que os já relatados na literatura, salientando também que a atividade acaricida de compostos pode variar entre espécies e entre os estágios de desenvolvimento de uma mesma espécie. Vale ressaltar ainda que, não surpreendentemente, a utilização de solventes diferentes pode ocasionar resultados diversos dos trivialmente esperados (KARAASLAN et al., 2018). Finalmente, cumpre destacar que embora os derivados acetilados de timol, eugenol e carvacrol apresentaram atividade acaricida inferior aos compostos originários, acetilcarvacrol mostrou-se o mais eficiente dentre os demais compostos acetilados (NOVATO et al., 2018).
Por fim, André et al. (2016) demonstraram que acetilcarvacrol apresenta atividade in vitro e in vivo contra nematóides gastrointestinais de pequenos ruminantes e toxicidade reduzida para ratos, quando comparado ao carvacrol. Nesse trabalho, a dose letal por via oral para a metade dos ratos (DL50) foi de 1.544,5 mg/kg para acetilcarvacrol e 919 mg/kg para
carvacrol. Compostos que apresentam DL50 superior a 1.000 mg/kg quando administrados por
via oral, são considerados seguros ou de baixa toxicidade (LEI et al., 2018). Além disso, outras atividades biológicas já foram atribuídas ao acetilcarvacrol, como efeito ansiolítico em ratos (PIRES et al., 2013), atividade bactericida (CACCIATORE et al., 2015), ação anti-inflamatória (DAMASCENO et al., 2014), atividade anti-helmíntica in vitro contra Schistosoma mansoni (MORAES et al., 2013), dentre outras.
2.3. Controle baseado na reprodução
Fêmeas de carrapatos ixodídeos utilizam grande quantidade da energia obtida durante a alimentação para a produção de ovos. Com isso, uma única fêmea é capaz de fazer a postura de milhares de ovos (DANTAS-TORRES, 2010; TROUGHTON; LEVIN, 2007). Diante disso, diversos estudos têm sido realizados com o objetivo de verificar o efeito de concentrações subletais de compostos, sobretudo os extraídos de plantas, na eficiência reprodutiva desses parasitos. Alguns parâmetros avaliados são o período pré-oviposição, a massa dos ovos, o tempo de oviposição, a eclodibilidade das larvas, dentre outros (AGNOLIN et al., 2014; PAZINATO et al., 2016). Além disso, técnicas histológicas podem ser
21 empregadas como ferramentas adicionais importantes para a avaliação do efeito de drogas em órgãos particularmente importantes para a sobrevivência/perpetuação dos carrapatos (CAMARGO-MATHIAS, 2018; CAMARGO-MATHIAS; FURQUIM, 2013; FONTANETTI et al., 2010).
Em geral, aberrações cromossomais e nucleares são consideradas alterações toxicológicas típicas, que podem ser encontradas em células de animais expostos a determinada droga (FONTANETTI et al., 2010). De fato, diversos estudos empregaram a histologia para analisar o efeito de compostos químicos na morfologia do ovário de carrapatos objetivando o controle da reprodução (ARNOSTI et al., 2011; BARBOSA et al., 2016; CAMARGO-MATHIAS et al., 2017; DENARDI et al, 2012, 2010; SOUZA et al., 2019; OLIVEIRA et al., 2008). Dentre as principais alterações encontradas destacam-se: a vacuolização citoplasmática e nucleolar, formato e tamanho irregular das células germinativas, diminuição do conteúdo de lipídeos e proteínas, dentre outros (OLIVEIRA et al, 2016; SOUZA et al., 2019). Ocorre que uma célula germinativa com tamanho reduzido, por exemplo, pode dar origem a um descendente com suprimento limitado de nutrientes (ARNOSTI et al., 2011). Se considerarmos que um composto também seja capaz de afetar a morfologia da glândula salivar do parasito, sua alimentação, fixação ao hospedeiro e balanço hídrico também ficarão prejudicados (CAMARGO-MATHIAS, 2018). Alterações como vacuolização citoplasmática, perda de contato celular, formato irregular dos ácinos, ruptura de grânulos secretórios, dentre outros, já foram evidenciadas por uma série de pesquisadores nas glândulas salivares de carrapatos expostos a compostos acaricidas (MATOS et al., 2018; PEREIRA et al., 2009; REMEDIO et al., 2016; VENDRAMINI et al., 2012). Finalmente, os parasitos afetados poderiam, por exemplo, chegar ao estágio adulto ingurgitado e produzir um número reduzido de ovos, visto que essa produção é dependente da massa/tamanho do carrapato (KOCH, 1982). Considerando que sua alimentação tenha sido hipoteticamente afetada pela substância química, vê-se um exemplo de controle à longo prazo no qual o descendente da terceira geração poderá ser prejudicado pela exposição de gerações anteriores a determinada droga.
2.3.1. Morfologia do ovário de carrapatos
A morfologia dos ovários de R. microplus e R. sanguineus foi descrita através de técnicas histológicas e ultraestruturais por Saito et al. (2005) e Oliveira et al. (2005),
22 respectivamente. Os ovários desses parasitos consistem em um tubo único em formato de 'ferradura', no qual uma grande quantidade de ovócitos em diferentes estágios de desenvolvimento está aderida a uma camada de células epiteliais denominada pedicelo (Figura 1). Cinco estágios de desenvolvimento estão presentes no ovário de uma fêmea ingurgitada, sendo que o desenvolvimento ocorre assincronicamente ao longo do órgão. Os ovócitos I são as menores células da linhagem germinativa, com citoplasma homogêneo e basófilo, e núcleo (vesícula germinativa) em posição central, com nucléolo evidente. A medida que o desenvolvimento avança, finas granulações são observadas nos ovócitos II. A partir do estágio III os grânulos de vitelo tornam-se maiores, e a vesícula germinativa desloca-se para o polo basal da célula (OLIVEIRA et al., 2005; SAITO et al., 2005). Nesdesloca-se estágio inicia-se a deposição do córion, camada que envolve o ovócito, confere proteção e permite trocas gasosas quando o ovo alcança o exterior (SAMPIERI et al., 2012). No estágio IV o núcleo é raramente observado, os grânulos tornam-se maiores e mais acidófilos. Finalmente, no estágio V, os ovócitos são maiores, com córion completamente depositado e grânulos de vitelo também maiores. Nesse estágio, os ovócitos alcançam o oviduto e são depositados pelas fêmeas durante a postura (OLIVEIRA et al., 2005; SAITO et al., 2005). Saito et al. (2005) relataram a presença de ovócitos do tipo VI em R. microplus. Segundo os autores, tais ovócitos são normalmente encontrados em R. microplus e apresentam características morfológicas anormais, tais como: desorganização citoplasmática, formato irregular e dobramentos no córion. Todavia, a presença desse estágio de desenvolvimento em R. microplus não foi confirmada em trabalhos posteriores (BARBOSA et al., 2016; SREELEKHA et al., 2017).
23 Figura 1: Estrutura do ovário de Rhipicephalus microplus. I – ovócito I; II – ovócito II; III – ovócito III; IV – ovócito IV; V – ovócito V; ec – epitélio; lu – lúmen; ovd – oviduto; gv – vesícula germinal. Adaptado de Saito et al. (2005).
Souza et al. (2019) demonstraram drástico prejuízo nos ovócitos de fêmeas semi-ingurgitadas de R. sanguineus s.l tratadas com 100 µL/mL de carvacrol, diluído em solução de etanol a 50%. Nesse tratamento, apenas ovócitos nos estágios I e II foram observados. Além disso, essas células apresentaram grandes alterações, como formato irregular, diminuição de tamanho, marginalização da cromatina e vacuolização citoplasmática. Alterações similares, porém menos intensas, foram encontradas nos tratamentos empregando concentrações mais baixas de carvacrol (50 e 25 µL/mL). Diante disso, constatou-se que
24 concentrações subletais de um composto extraído de plantas pode afetar a reprodução desse parasito, agindo como um método de controle a longo prazo (SOUZA et al., 2019).
Extrato hexânico de Acmella oleraceae, popularmente conhecido como Jambú, também apresentou resultados promissores para o controle reprodutivo a longo prazo de de fêmeas semi ingurgitadas de R. microplus (OLIVEIRA et al., 2016). Nesse trabalho, os carrapatos foram expostos às concentrações de 12,5 mg/mL, 25mg/mL e 50 mg/mL do extrato de A. oleraceae diluído em solução de etanol a 50% acrescido de DMSO a 1%. Os resultados demonstraram que, mesmo em concentrações reduzidas (12,5 mg/mL), extensas vacuolizações citoplasmáticas e nucleolares foram observadas em ovócitos I e II, além da presença de vacúolos ao redor dos grânulos de vitelo dos ovócitos IV. Já em concentrações mais elevadas (50 mg/mL), não foi possível observar a presença de ovócitos I e II devido ao dano morfológico significativo provocado pelo extrato. Os pesquisadores argumentam que a vacuolização nucleolar é um processo irreversível que irá culminar na morte celular. Já a vacuolização citoplasmática é explicada como um processo celular possivelmente reversível que visa a expulsão do composto tóxico ou a destruição de organelas afetadas pela substância (OLIVEIRA et al., 2016). Além disso, o extrato aquoso de folhas de Azadirachta indica, popularmente conhecido como neem, foi incapaz de causar mortalidade em fêmeas semi ingurgitadas de R. sanguineus na concentração de 10 e 20%. Todavia, diversas alterações morfológicas foram observadas nos ovários desses parasitos expostos ao extrato. Dentre essas alterações, destacam-se diminuição do tamanho e do conteúdo protéico dos grânulos, formato irregular e vacuolização citoplasmática dos ovócitos. Além disso, esse estudo demonstrou que os carrapatos expostos a 10% de extrato aquoso de neem apresentaram alterações morfológicas mais significativas nos ovários quando comparado àqueles expostos a 20% do extrato (DENARDI et al., 2011). Dessa forma, fica evidente o potencial de concentrações subletais de produtos de origem vegetal em causar danos nos ovócitos e auxiliar na diminuição das taxas reprodutivas de carrapatos no longo prazo.
25
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar o efeito de concentrações subletais de acetilcarvacrol na morfologia do ovário de fêmeas ingurgitadas de carrapatos Rhipicephalus microplus e Rhipicephalus sanguineus sensu lato.
3.2. Objetivos Específicos
1. Analisar, após a exposição a diferentes concentrações subletais de acetilcarvacrol, a morfologia do ovário de fêmeas ingurgitadas de carrapatos R. microplus e R. sanguineus s. l. por meio de técnica histológica de rotina.
2. Determinar, por meio de análise morfométrica, possíveis diferenças no tamanho de ovócitos de fêmeas ingurgitadas de carrapatos R. microplus e R. sanguineus s. l. expostos a concentrações subletais de acetilcarvacrol.
3. Classificar os possíveis efeitos tóxicos observadas no ovário dos carrapatos expostos a concentrações subletais de acetilcarvacrol a partir de um protocolo de análise semiquantitativa, baseado no grau de reversibilidade e na extensão das alterações.
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