Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal
Avaliação e Caraterização por
Métodos Computacionais de
Diferentes Radioisótopos no
Contexto da Terapia Paliativa de
Metástases Ósseas
Avaliação e Caracterização por Métodos
Computacionais de Diferentes Radioisótopos no
Contexto da Terapia Paliativa de Metástases
Monografia do Curso de Mestrado em Engenharia Biomédica da
Universidade do Porto
Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal
Licenciado em Engenharia Biomédica pela Universidade
de Trás-os-Montes e Alto Douro (2013)
Orientador:
João Manuel R. S. Tavares
Professor Associado do Departamento de Engenharia
Mecânica da Faculdade de Engenharia da
Universidade do Porto
Coorientador:
Adriana Alexandre S. Tavares
Investigadora da Molecular Neurolmaging (MNI), LLC New
Haven, Connecticut, USA
Agradecimentos
Ao Professor João Manuel R. S. Tavares pela orientação e disponibilidade fornecidos ao longo deste documento, fundamentais para a correta elaboração do mesmo.
A Dr.ª. Adriana Alexandre S. Tavares pelo apoio prestado, bem como, pelo auxílio e ajuda fornecida para a realização do mesmo.
E a todos aqueles de que forma direta e indireta contribuíram de forma positiva para o desenvolvimento deste trabalho.
Sumário
A finalidade deste trabalho é avaliar os efeitos radiobiológicos de alguns radiofármacos utilizados na radioterapia paliativa de metástases ósseas, bem como inferir sobre a sua eficiência terapêutica, através do recurso a métodos computacionais.
As metástases ósseas podem ocorrer em 30 a 70% dos doentes portadores de neoplasias. Os tumores malignos que mais frequentemente metastizam para o tecido ósseo incluem o carcinoma da mama, próstata e pulmão. Nos doentes com metástases ósseas, a radioterapia externa ou interna pode ser utilizada como um método de tratamento paliativo, cuja finalidade é o alívio dos sintomas, promovendo a melhoria da qualidade de vida do doente.
A radioterapia interna com utilização de radioisótopos tem sido amplamente utilizada para terapia paliativa das metástases ósseas, encontrando-se múltiplos radioisótopos em utilização como, por exemplo, o Samário-153, o Estrôncio-89, o Rénio-186 e 188, o Fósforo-32, o Tecnénio-99m, o Hólmio-166, o Estanho-117m, o Lutécio-177, o Samário-153 e o Rádio-223.
Para a realização da Dissertação final de Mestrado é necessário proceder a uma recolha e pesquisa bibliográfica de estudos científicos previamente realizados na área de interesse, com posterior síntese num único documento, que servirá de apoio ao estudo a realizar. A presente Monografia serve como o ponto de partida para a realização da Dissertação final e tem por objetivo descrever o estado da ciência da terapia de metástase ósseas com recuso a radiofármacos, bem como descrever adequadamente conceitos essenciais nesta temática.
IÍndice
CAPÍTULO 1 ... 12 1.1. INTRODUÇÃO ... 14 1.2. PRINCIPAIS OBJETIVOS ... 15 1.3. ESTRUTURA ORGANIZATIVA ... 16 1.4. CONTRIBUIÇÕES PRINCIPAIS ... 17 CAPÍTULO 2 ... 19 2.1. INTRODUÇÃO ... 212.2. PRINCÍPIOS DO CICLO CELULAR ... 22
2.3. CARCINOGÉNESE ... 25
2.4. RADIOBIOLOGIA CELULAR ... 32
2.4.1. Efeitos Celulares da Radiação ... 34
2.4.2. Efeitos Direto e Indiretos da Radiação ... 35
2.4.3. Tipos de Danos Celulares Radioinduzidos ... 36
2.4.4. Destino das Células Radioinduzidos ... 37
2.4.5. Mecanismos de Reparação do ADN ... 38
2.4.6. Curvas de Sobrevida ... 41
2.5. APOPTOSE E NECROSE... ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED. 2.6. SUMÁRIO ... 43
CAPÍTULO 3 ... 45
3.1 INTRODUÇÃO ... 46
3.2 CARACTERÍSTICAS DAS CÉLULAS ÓSSEAS NORMAIS E TUMORAIS ... 46
3.2.1 Morfologia e Cinética das células do Tecido Ósseo e Tumorais ... 52
3.3 METÁSTASES ÓSSEAS ... 55
3.3.1 Sinas e Sintomas das Metástases Ósseas ... 56
3.3.2 Métodos de Deteção das Metástases Ósseas ... 57
3.3.3 Tratamento ... 59 3.3.3.1 Tratamento Sistémico ... 60 3.3.3.2 Tratamento Local ... 62 3.4 SUMÁRIO ... 63 CAPÍTULO 4 ... 65 4.1 INTRODUÇÃO ... 67
4.2 TIPOS DE DECAIMENTO RADIOATIVO ... 68
4.2.2 Transformações Isobáricas ... 69
4.2.3 Transformações Isoméricas ... 71
4.3 RADIOISÓTOPOS UTILIZADOS EM TERAPIA PALIATIVA DAS METÁSTASES ÓSSEAS ... 73
4.3.1 Fósforo-32 ... 74 4.3.2 Estrôncio-89 ... 75 4.3.3 Ítrio-90 ... 75 4.3.4 Estanho-117m ... 76 4.3.5 Samário-153 ... 76 4.3.6 Hólmio-166 ... 77 4.3.7 Túlio-170 ... 77 4.3.8 Lutécio-177 ... 78 4.3.9 Rénio-186 ... 78 4.3.10 Rénio-188 ... 79 4.3.11 Rádio-223 ... 79
4.4 RADIOFÁRMACOS PARA TERAPIA PALIATIVA DE METÁSTASES ÓSSEAS ... 80
4.4.1 Mecanismos de Captação do Radiofármaco ... 81
4.4.2 Sumário das Evidencias Clinicas Após Tratamento Paliativo de Metástases Ósseas com Radiofármacos ... 89 4.5 SUMÁRIO ... 91 CAPÍTULO 5 ... 93 5.1 INTRODUÇÃO ... 94 5.2 RESPOSTA A IRRADIAÇÃO ... 94 5.3 MODELOS DE TRACKING ... 95 5.4 SUMÁRIO ... 99 CAPÍTULO 6 ... 101 6.1 CONCLUSÕES FINAIS ... 102 6.2 PERSPETIVAS FUTURAS ... 103 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 104
Capı́tulo 1
Introdução ao Trabalho e Estrutura
da Monografia
1.1. Introdução
As metástases ósseas são uma das mais importantes complicações associada ao desenvolvimento e proliferação de células malignas. Estas são também um dos maiores problemas que um doente com cancro pode experienciar, sendo que cerca de 80-100% dos doentes que morrem de cancro da próstata, mama e pulmão possuem metástases ósseas. De entre esses doentes, mais de 75% experienciam significativas dores ósseas e 50 % dos mesmos reportam analgia inadequada (Maini, Sciuto, Romano, & Bergomi, 2003; Viña, 2005).
O alívio dos sintomas induzidos pelas metástases ósseas pode ser conseguido por via de um tratamento de corpo inteiro ou meio corpo com feixes de radiação externo de 8 Gy, com uma taxa de sucesso a rondar os 80%. Contudo com o uso desta modalidade de irradiação corporal externa, todos os tecidos do corpo estão expostos a elevados níveis de radiação de forma semelhante, o que pode causar efeitos secundários consideráveis, em particular para os tecidos saudáveis que se encontram à volta do tecido tumoral maligno (Salazar, n.d.; Sivaprasad & Rajagopal, 2012).
A terapia com radiofármacos é menos invasiva, tipicamente melhor tolerada e produz resultados no alívio da dor óssea, com a vantagem de limitar a exposição da radiação aos tecidos alvos (Volkert & Hoffman, 1999). Contudo, estudos são necessários para investigar, nomeadamente, quais as melhores vias de administração, dose, frequência de administração e radioisótopos que resultarão numa melhor captação do radiofármaco por parte do tecido alvo (Maini et al., 2003; Sivaprasad & Rajagopal, 2012).
Atualmente vários estudos têm vindo a apresentar dados favoráveis ao tratamento paliativo de metástases ósseas quando este é aplicado em estados menos avançados da doença oncológica e muitos radiofármacos novos têm sido apontados como tendo elevado potencial terapêutico (Maini et al., 2003). Outros estudos têm demonstrado que os radioisótopos que decaem por emissão de partículas β- e por captura eletrónica
são os que apresentam maior potencial terapêutico, bem como, alguns radioisótopos com decaimento α, como o caso do rádio-223, onde a sua elevada energia é
depositada num volume muito reduzido (Neves, Kling, & Oliveira, 2005; Tomblyn, 2012).
Irradiação de células tumorais com recurso a partículas radioativas como as acima mencionadas, por via de uso de radiofármacos, pode induzir lesões na estrutura do ADN da célula alvo, as quais podem subsequentemente levar à morte da mesma por um processo de morte celular programada designado de apoptose (Maini et al., 2003). Tal resultaria numa destruição seletiva de células tumorais por um processo de morte celular controlado. Uma variedade de fatores contribui para a eficiência dos radiofármacos, dado que os efeitos da radiação nas células é um processo complexo e vários esforços têm vindo a ser realizados para melhor compreender todo este processo através de estudos in vitro e in vivo, bem como avanços científicos na área da radiobiologia. Para além disso, nos últimos anos foram desenvolvidos, com sucesso, vários simuladores computacionais que têm vindo a acelerar a obtenção de resultados in silico e melhorar o conhecimento científico atual na área de radiobiologia celular, nomeadamente na área de efeitos da radiação ionizante em células.
1.2. Principais Objetivos
Estudos recentes documentam interesse da aplicação de diversos radiofármacos em múltiplas patologias oncológicas com fins terapêuticos, constituindo um tema cada vez mais atual. Neste sentido, acredita-se que estudos radiobiológicos como os que se pretendem realizar no âmbito desta Dissertação são absolutamente pertinentes. Tornando-se de extrema utilidade para caracterizar, de uma forma que se espera mais circunstanciada e completa possível, a natureza dos efeitos e eficácia dos diferentes radiofármacos em diferentes cenários patológicos. Assim, espera-se, uma vez concluída esta Dissertação com o tema “Avaliação e Caraterização por Métodos Computacionais de Diferentes Radioisótopos no Contexto da Terapia Paliativa de Metástases Ósseas”, contribuir para um maior conhecimento cientifico sobre:
• A avaliação dos efeitos radiobiológicos das principais emissões de cada radioisótopo em vários cenários de simulação.
• A eficiência terapêutica de cada radiofármaco estudado, nomeadamente através da comparação dos efeitos radiobiológicos produzidos pelas principais emissões de cada radioisótopo;
Por seu lado, após a conclusão desta Monografia, espera-se conseguir abordar de forma correta e global o estado da arte, no que toca à utilidade de diferentes radiofármacos utilizados na radioterapia paliativa das metástases ósseas, pela recolha de informação científica que funciona como introdução de alguns dos conceitos utilizados na área em estudo e guia de investigação a desenvolver para a Dissertação.
1.3. Estrutura Organizativa
Pretende-se organizar a presente Monografia de uma forma autónoma e independente para facilitar o acesso às diversas áreas estruturas em 7 capítulos. Assim, descreve-se sumariamente de seguida o que será abordado em cada capítulo:
• Capítulo 2. Princípios do Ciclo Celular, Radiobiologia Celular e Apoptose Neste capítulo realiza-se uma descrição global, dos principais conceitos do ciclo celular, com acessória relação deste com a morte celular programada, isto é, apoptose. Este capítulo reveste-se de capital importância pois para o desenvolvimento desta Dissertação é fundamental o conhecimento da cinética celular, em particular, as suas relações com o processo apoptótico, bem como dos efeitos da radiação no mesmo.
• Capítulo 3. Metástases Ósseas
Neste terceiro capítulo são explicados os conceitos básicos associados ao desenvenvolvimento de metástases ósseas, bem como às alterações que estas provocam na morfologia e cinética celular. Neste capítulo também serão apresentados os diferentes métodos de deteção e tratamento das metástases ósseas.
Neste quarto capítulo são introduzidos os princípios da radioatividade e decaimento radioativo. Para além disso, são também descritas as principais características físicas de cada radioisótopo com potencial na área da terapia paliativa de metástases ósseas, nomeadamente o seu esquema de decaimento e principais partículas emitidas .
• Capítulo 5. Modelos de Radiobiologia Celular
Neste quinto capítulo são enumerados e descritos os modelos radiobiológicos mais relevantes para a execução da Dissertação final, bem como todos os parâmetros necessários para a sua compreensão.
• Capitulo 6. Conclusões Finais e Perspetivas Futuras
Neste último capítulo são apresentas algumas conclusões finais sobre o trabalho desenvolvido, indicando igualmente quais as perspetivas futuras da continuação do desenvolvimento deste trabalho para posterior apresentação como Dissertação.
1.4. Contribuições Principais
Como principais contribuições desta Monografia, enquanto introdutório à respetiva Dissertação, salientam-se o estudo aprofundado de várias investigações conduzidas no âmbito da terapêutica com radiofármacos de metástases ósseas e a revisão e organização da informação mais pertinente num único documento.
No que diz respeito à Dissertação espera-se que esta contribua para melhorar o conhecimento científico neste tema em particular, pois é um campo de intensa pesquisa e interesse crescente.
Capı́tulo 2
Princípios do Ciclo Celular,
2.1. Introdução
De um modo geral, as células crescem, aumentam o seu conteúdo e por fim dividem-se. Cada célula origina duas células-filhas que, se tudo ocorrer dentro da normalidade, serão geneticamente idênticas á célula-mãe. Por sua vez, estas células-filhas podem tornar-se células-mães da geração seguinte. Assim, a vida de uma célula começa quando esta surge a partir da célula-mãe e acaba, quando ela própria se divide para originar duas células-filhas.
O conjunto de transformações e processos que decorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria se divide constitui um processo dinâmico e continuo, denominado ciclo celular.
Durante a divisão celular, os organelos, enzimas e outros constituintes da célula são distribuídos pelas células-filhas. O ácido desoxirribonucleico (ADN) é exatamente autoduplicado e as cópias rigorosamente divididas. É esta fidelidade na duplicação e na distribuição do material genético pelas células-filhas que assegura a continuidade genética.
Todo o procedimento do ciclo celular é controlado por diversas proteínas e enzimas que além de garantirem a ausência de erros, asseguram a coordenação da cinética do ciclo, isto é, a duração de cada fase específica do processo e o tempo total necessário para que todo o processo ocorra. Uma mutação numa proteína ou enzima de controlo pode ter consequências dramáticas na cinética celular. Por exemplo, as células carcinogénicas, em geral, têm uma duração do ciclo celular muito inferior às células normais, devido a alterações em genes elementares no controlo do ciclo celular, designados por oncogenes.
Um dos destinos finais que as células podem experienciar é a morte celular programada ou apoptose. Este destino final é importante do ponto de vista terapêutico, dado que este tipo de morte celular tem um efeito mínimo ou mesmo ausente sobre as células vizinhas. A apoptose é um mecanismo de segurança presente nas células que é desencadeado sempre que as células são danificadas de forma irreversível, garantindo assim a integridade da continuidade genética. O processo
apoptótico é controlado por um vasto número de enzimas e proteínas específicas que iniciam todo o processo assim que algum recetor é ativado.
A radiação ionizante quando interage com material biológico, nomeadamente as células, provoca algumas alterações nos seus constituintes, em particular no ADN, por ser o componente mais sensível a radiação. Os efeitos provocados pela radiação nas células podem ser diretos, isto é, energia radioactiva interage directamente com o ADN, provocando alterações no mesmo; ou por métodos indiretos, onde a energia depositada pela radiação no meio reage comas moléculas de água originando a formação de radicais livres, que por sua vez interagem com os constituintes celulares.
2.2. Princípios do Ciclo Celular
As células crescem e dividem-se de acordo com o seu ciclo celular. Este ciclo é o processo através do qual uma célula somática duplica o seu material genético e o reparte igualmente às suas células-filhas, e é dividido em interfase e fase mitótica. A interfase corresponde ao período entre o fim de uma divisão celular e o início da divisão seguinte, enquanto, a fase mitótica enquadra o período durante o qual ocorre a divisão celular propriamente dita.
Para que o ciclo celular seja iniciado, uma sequência ordenada de eventos necessita de ocorrer, que inclui:
• Ligação de um fator de crescimento a um recetor específico na membrana plasmática;
• Ativação deste recetor, que subsequentemente ativa proteínas transdutoras de sinais presentes no citoplasma;
• Transmissão do sinal até ao núcleo;
• Ativação de proteínas reguladoras nucleares; • Iniciação e progressão do ciclo celular.
São conhecidas aproximadamente 50 proteínas que atuam como fatores de crescimento. As células que possuem o recetor específico para um determinado fator
de crescimento serão iniciadas no ciclo, enquanto as que não expressarem esse recetor permanecerão inativas. Existem processos e componentes que controlam o ciclo celular podem ser divididos em duas amplas categorias (Park & Lee, 2003; Sherr, 1996):
• Controladores Positivos: estimulam a progressão da célula no ciclo celular, a fim de que ocorra a divisão normal em duas células-filhas. Estes controladores positivos incluem:
o Quinases dependentes da ciclina (CDKs): estão presentes durante todo o ciclo celular e são ativadas em determinadas fases do mesmo após ligação às ciclinas. Este complexo CK-ciclina fosforila proteínas específicas.
o Ciclinas: são sintetizadas somente em fases específicas, de acordo com os requisitos do processo de divisão celular, e destruídas após a sua utilização. Ligam-se às CDKs para que estas possam exercer as suas funções.
• Controladores Negativos: inativam as funções dos controladores positivos, o que conduz à interrupção do ciclo celular ou à indução da apoptose;
o Inibidores de quinases dependentes da ciclina (CKIs): são proteínas que interagem com as CDKs ou complexos ciclina-CDK, bloqueando a sua ação.
o Complexo ubiquitina: degrada ciclinas e outras proteínas, impedindo a progressão do ciclo celular.
o Fostatases: atuam na desfosforilação de CDKs e complexos cilcina-CDKs, tornando-os inativos.
A interfase, que antecede a fase mitótica, divide-se em três subfases: G1, S e G2. O intervalo G1, ou pós-mitótico, inicia-se quando a célula é estimulada a multiplicar. Este intervalo corresponde ao período entre o fim da mitose e o início da síntese de ADN (fase S), e caracteriza-se por um amento do volume celular e intensa síntese de proteínas e enzimas. Na fase S, ocorre a autorreplicação de cada uma das moléculas de
ADN, a fim de que cada cromossoma seja formado por dois cromatídeos ligados por um centrómero. O intervalo G2, ou pré-mitótico, ocorre após a síntese de ADN (fase S) e antes do início da mitose. Neste período ocorre sobretudo a síntese de biomoléculas e ácido ribonucleico (ARN) necessários à divisão celular, consultar Figura 1.
Figura 1: Progressão do ciclo celular depende de uma sequência de ativação e desativação de diversos complexos CDKs e CDKIs (Stewart & Kleihues, 2003)
Durante o ciclo celular existem etapas de avaliação interna que determinam a progressão ou a interrupção do ciclo celular, designados por checkpoints. O checkpoint 1 ocorre no final do intervalo G1 e o checkpoint 2 ocorre no final do intervalo G2. Se o resultado da avaliação for negativo, as células param o seu processo de divisão e permanecem no estádio denominado G0 por tempo indeterminado ou até à sua morte. Se pelo contrário, a avaliação efetuada for positiva, estas prosseguem para a fase seguinte do ciclo celular, isto é, a fase mitótica.
Relativamente à fase mitótica esta é comummente dividida em duas etapas principais: a mitose, que corresponde à divisão do núcleo, e a citocinese, que corresponde à divisão do citoplasma. A mitose, embora seja um processo contínuo, é dividido didaticamente em prófase, metáfase, anáfase e telófase. A prófase é, de um modo geral, a etapa mais longa da mitose. Nesta fase, sucede a condensação dos cromossomas, tornando-se mais espessos e curtos, e os dois centríolos começam a afastar-se em sentidos opostos, formando-se o fuso acromático. Na metáfase os cromossomas atingem o máximo de encurtamento, o fuso acromático fica completo e os centríolos atingem os pólos da célula. Para além disso, os cromossomas orientam-se
com os centrómeros no plano equatorial, voltados com as terminações para o exterior. Durante a anáfase surge a clivagem dos centrómeros, separando-se os dois cromatídeos que passam a constituir dois cromossomas independentes. Durante nesta fase ocorre a ascensão dos cromossomas filhos aos polos da célula. Por ultimo, na telófase, a membrana nuclear reorganiza-se em torno dos cromossomas de cada célula-filha, o fuso mitótico é degradado e os cromossomas descondensam, terminado assim a mitose. A citocinese carateriza-se pela divisão do citoplasma e consequente individualização de cada célula-filha. Este processo começa a ser preparado durante a mitose com a formação do anel contrátil de filamentos proteicos. Durante a citocinese estes filamentos contraem-se e puxam a membrana celular para o interior da célula, causando um sulco de clivagem, que vai lentamente estrangulando o citoplasma até separar as células-filhas.
A duração das subfases do ciclo celular varia com o tipo de espécie animal ou vegetal, tipo de tecido e com o estado de desenvolvimento do organismo. Tipicamente o tempo de duplicação celular animal (humana?) varia entre 10 a 40 horas com a fase G1 a durar 30%, fase S 50%, fase G2 15% e a mitose 5% do tempo do ciclo celular.
2.3. Carcinogénese
O crescimento e multiplicação das células carcinogénicas são diferentes do crescimento e multiplicação das células normais. As células carcinogénicas estão continuamente a proliferar, ao contrário das células normas que tem um número limitado de divisões celulares. Ao contrário das células normais, as células carcinogénicas conseguem invadir e proliferar noutros tecidos que não os seus de origem. O crescimento sem controlo e a proliferação noutros tecidos são característicos que demarcam as células carcinogénicas das células normais. Assim, estas células crescem geralmente em massas altamente desorganizadas e todo o seu processo de crescimento e divisão aparenta ser independente dos fatores de crescimento. Existem seis alterações na estrutura e biologia celular que caraterizam o crescimento celular maligno. Estas alterações estão presentes em todos os tipos de
cancro e incluem: 1) sinalização autossuficiente de desenvolvimento; 2) insensibilidade aos inibidores de crescimento; 3) evasão à apoptose; 4) potencial replicativo ilimitado; 5) vascularização muito sustentada; e 6) invasão tecidular e metástases. A instabilidade genómica, liderada pelo crescimento mutagénico, é considerada o principal fator para a manifestação destas alterações celulares (Sefried & Shelton, 2007).
As células tornam-se cancerosas devido a lesões no seu ADN, que está presente em todas as células e media todas as suas ações. Nas células normais, quando ocorre uma lesão no ADN esta tende a ser reparada com sucesso ou, caso tal não aconteça, a célula pode entrar em morte celular. Nas células carcinogénicas, tipicamente a lesão no ADN não é reparada, porém a célula também não morre como deveria acontecer. Em vez disso, esta continua em divisão, produzindo células mutadas e com grande instabilidade genómica. A instabilidade genética pode ser hereditária ou advir de erros na reprodução das células ou ainda ser induzida por fatores presentes no meio ambiente envolvente, consultar Figura 2.
Figura 2: A carcinogénese é um processo com múltiplas etapas, envolvendo diversos eventos genéticos e epigenéticos nos proto-oncogenes, genes supressores tumorais e genes antimetastáticos (Stewart & Kleihues,
2003)
O processo de conversão de uma célula normal para uma célula carcinogénica é dividido em duas fases principais: iniciação e promoção. Durante a fase de iniciação da
carcinogénese, uma alteração permanente no genoma da célula garante-lhe uma vantagem no crescimento em relação as células vizinhas. A maioria das mutações iniciais ocorrem em genes supressores tumorais ou em oncogenes. Os proto-oncogenes codificam uma vasta gama de fatores de crescimento, recetores de fatores de crescimento, enzimas ou fatores de transcrição que promovem o crescimento ou divisão celular, consultar Tabela 1. Versões mutadas de proto-oncogenes que promovem a proliferação de células anormais são designados por oncogenes. Os oncogenes ativam as cascatas de sinalização continuamente, resultando num aumento da produção de fatores de crescimento que estimula os crescimento celular. Por exemplo, o myc é um proto-oncogene que atua como fator de transcrição. Uma versão mutada do myc converte-o num oncogene associado a 70% dos cancros. Outro oncogene é o ras que normalmente funciona como um interrutor das cascatas de sinalização. Uma mutação no ras causa a abertura permanente da via de sinalização, levando a um crescimento celular descontrolado. Cerca de 30% dos tumores apresentam uma mutação no ras, incluindo os carcinomas do pâncreas, tiroide, colon e pulmões. Por sua vez os genes supressores tumorais evitam a carcinogénese e inibem o crescimento celular, pelo que, a perda destes genes facilita o desenvolvimento tumoral. As proteínas codificadas pelos genes supressores tumorais atuam, geralmente, ao nível da membrana celular, do citoplasma ou do núcleo. O RB e o p53 são exemplo de genes supressores tumorais. O p53 é o gene supressor tumoral mais comumente relacionado com os cancros e o mais amplamente investigado, consultar Figura 3. Alterações nestes genes são encontradas em aproximadamente 70% dos cancros do colon e em 50% dos cancros da mama e pulmão (Park & Lee, 2003).
Nome Função/Descrição Tipo de gene
APC Regulação da transcrição de genes Supressor tumoral
BCL2 Estimulação da angiogenese Oncogene
BRCA1 Controlo o ciclo celular Supressor tumoral
HER2 Receção de fatores de crescimento Oncogene
myc Regulação da interação entre proteínas e
fatores celulares Oncogene
p16 e p21 Inibição da quinase Supressor tumoral
p53 Regulação da apoptose e fator de
transcrição Supressor tumoral
ras Sinalização da cascata do ciclo celular Oncogene
RB Regulação do ciclo celular Supressor tumoral
SIS Fator de crescimento Oncogene
Tabela 1: Exemplos de genes importantes no processo de carcinogénese celular (genes supressores tumorais e oncogenes).
Figura 3: Via de sinalização com múltiplas respostas desencadeadas com a acumulação de p53 no núcleo celular (Stewart & Kleihues, 2003)
As alterações de função dos proto-oncogenes e genes supressores tumorais podem ser causadas por:
• Carcinogénicos químicos: a maioria dos agentes químicos que causam cancro são mutagénicos, isto é, alteram a estrutura do ADN. Alguns carcinogénicos químicos contêm um grupo electrofílico altamente reativo que ataca o ADN.
• Radiação: alguns tipos de radiação (ultravioleta, raios-X e raios-γ) tem potencial carcinogénico, podendo provocar lesões no ADN, que incluem, quebras simples ou duplas das cadeias de ADN, perda de bases ou formação de dímeros de pirimidina. A radiação também pode provocar a formação de radicais livres, sendo estes os responsáveis pela maioria dos efeitos carcinogénicos indiretos da radiação.
• Vírus: podem contribuir para a mutação celular de diversos modos. Alguns introduzem oncogenes nos cromossomas da célula hospedeira, outros podem afetar a expressão dos proto-oncogenes celulares, pela introdução de mutações que podem inativar ou alterar os locais de codificação de sequências dos mesmos.
O tumor depois de iniciado passa à fase de promoção, isto é, o seu desenvolvimento é incentivado por agentes químicos ou hormonais, designados por promotores tumorais. Estes agentes não são por si só mutagénicos mas aceleram ou promovem a transformação provocada pelo agente carcinogénico. Os promotores mutagénicos atuam através da ativação de componentes das vias de sinalização intracelulares, garantindo assim vantagens no seu desenvolvimento em relação às células vizinhas. Após a iniciação e promoção tumoral, a célula pre-cancerígena entra num processo referido como progressão. Durante a fase de progressão, células pré-cancerosas geneticamente vulneráveis, com vantagem no desenvolvimento em relação às células normais, são continuamente lesadas, através da repetida exposição a fatores ou promotores carcinogénicos.
FALAR da METASTIZAÇÃO
2.4 Apoptose e Necrose
Apoptose, ou morte celular programada, carateriza-se por ocorrer de forma individual, não infligindo, por isso, morte às células vizinhas. A morte celular por apoptose participa em múltiplas situações fisiológicas. A combinação da apoptose com a
proliferação celular é responsável pelo delineamento de tecidos e órgãos nos embriões. Por exemplo, a apoptose regula a separação dos dedos nos fetos. Problemas na regulação da apoptose podem conduzir ao aparecimento de inúmeras patológicas, nomeadamente cancro, (Tavares 2009).O processo apoptótico tem o seu início após a captação de um sinal ou estimulo pelas células para entrarem em apoptose, realizando um vasto conjunto de alterações. Uma família de proteínas denominada caspase é tipicamente ativada nas fases iniciais do processo, sendo responsáveis pela degradação de componentes celulares fundamentais para o funcionamento celular normal, incluindo enzimas responsáveis pela reparação do ADN. Por outro lado, as caspases podem ativar enzimas destruidoras, tais como, ADNases, que iniciam a quebra do ADN.
A célula em apoptose apresenta uma morfologia distinta e caraterística, que tem início com o encurtamento celular devido a destruição dos filamentos de actina e lâminas do citoesqueleto. Posteriormente o núcleo celular apresenta uma aparência em ferradura devido a quebra da cromatina e condensação nuclear e um contínuo encurtamento celular é observado de forma a permitir a posterior remoção dos restos celulares pelos macrófagos. Na fase final da apoptose surgem pequenas bolsas membranares, que formam vesículas, denominados corpos apoptóticos. Estas alterações morfológicas são comuns a todas as células em apoptose explícita, independentemente do agente indutor do processo. Quer isto dizer que a ação das caspases representa uma via comum, que opera em todas as células programadas para morrer, (Anazetti & Melo 2007).
A sensibilidade da célula face a um estímulo apoptótico depende de um número de fatores como a expressão de proteínas indutoras e anti-apoptóticas, a intensidade do estímulo e o estádio do ciclo celular. Existe um extenso número de mecanismos que induzem apoptose. A apoptose pode ser desencadeada por estímulos extrínsecos, tais como, a ligação de indutores de apoptose a recetores da membrana celular, denominados recetores de morte celular. Para além dos processos referidos, a apoptose pode ser induzida por sinais intrínsecos que produzem stresse celular, devido à exposição à radiação, a químicos ou vírus. Pode igualmente resultar de uma privação de fatores de crescimento ou stresse oxidativo induzido pela formação de radicais livres.
Existe uma grande correlação entre o ciclo celular e a apoptose, reconhecida pelos genes que codificam as proteínas c-Myc, p53, Rb, ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-kB, CDK, ciclinas e CKI. Após estimulação, estas proteínas podem induzir proliferação celular, interrupção do ciclo celular ou morte celular programada. A resposta celular é fortemente influenciada pela informação genética existente, o microambiente, a extensão de dano no ADN e a concentração de diferentes proteínas.
A morte celular por necrose ocorre, geralmente, em resposta a danos severos nas células e é caraterizada, morfologicamente, por um aumento do volume citoplasmático e mitocondrial, seguido da rutura da membrana plasmática e extravasamento do conteúdo celular, induzindo deste modo uma resposta inflamatória, que pode causar dano e, por vezes até morte às células vizinhas. Deste modo, quando a morte celular ocorre por via da necrose, um grande número de células é afetado e lesado durante o processo inflamatório. Contrariamente ao processo de retração celular observada aquando do processo apoptótico, na necrose observa-se um edema celular devido às lesões no citoesqueleto e inibição das bombas de Na+/K+, o que origina a perda da permeabilidade seletiva da membrana.
Em síntese, na apoptose, ou morte celular programada, as células morrem como resultado de uma grande variedade de estímulos, contudo, o processo é controlado e regulado. Contrariamente a necrose, corresponde à morte celular descontrolada, que conduz ao aparecimento de lise celular e consequente resposta inflamatória, consultar Figura 9.
Figura 4: Apoptose e a necrose são distinguidas por alterações morfológicas características (Stewart & Kleihues, 2003)
2.5. Radiobiologia Celular
A radiobiologia é a ciência que estuda a ação da radiação ionizante nas células, nos tecidos biológicos e nos organismos completos, combinando para tal, a física da radiação e a biologia.
Em radiobiologia a qualidade de um feixe de radiação ionizante é caraterizada pela transferência linear de energia (LET), que expressa a energia transferida ao meio por unidade de comprimento do percurso, expressa geralmente em 𝐾𝑒𝑉 𝜇𝑚⁄ .
Segundo a International Comission on Radiation Units (ICRU), a LET pode ser definida pelo “quociente 𝑑𝐸 𝑑𝑙⁄ , no qual 𝑑𝐸 é a energia média localmente depositada no meio por uma partícula ou radiação de energia especificada ao longo de uma distancia 𝑑𝑙”. À medida que a intensidade da ionização aumenta, aumenta também a probabilidade de deposição da energia diretamente no material biológico, ou seja, de ocorrer interação biológica.
Comparada com a radiação eletromagnética, as radiações particuladas tem maior poder ionizante, logo maior probabilidade de interagir com os tecidos. Para além disso, as partículas radioativas perdem a sua energia rapidamente produzindo numerosas
ionizações numa curta distância, como se comprova pelos valores apresentados na Tabela 2.
Tipo de Radiação LET (𝑲𝒆𝑽 𝝁𝒎⁄ )
Cobalto-60 0.25 Eletrões de 1 MeV 0.3 Raio-X diagnóstico 3.0 Fotões de 10 MeV 4.0 Neutrões de 2,5 MeV 20.0 Partículas α de 5 MeV 100.0 Núcleos pesados 1000.0
Tabela 2: Diferentes tipos de radiação e correspondente valor LET.
Historicamente, a eficiência biológica relativa (RBE) descreve quantitativamente o efeito relativo da LET, através de uma comparação da dose de radiação em estudo com uma dose de raios-X de 250 KeV. Mais recentemente tem sido proposta uma alteração da quantificação da RBE, no qual a dose de radiação padrão são os raios- γ do 60C e não
os raios-X de 250 keV. Em termos gerais, quando a LET aumenta a RBE também aumenta. Em termos matemáticos, a RBE é definida pela razão:
𝑅𝐵𝐸 =𝐷𝑜𝑠𝑒 𝑑𝑎 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑎çã𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑟 𝑢𝑚 𝑑𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑓𝑒𝑖𝑡𝑜 𝑏𝑖𝑜𝑙ó𝑔𝑖𝑐𝑜𝐷𝑜𝑠𝑒 𝑑𝑎 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑎çã𝑜 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑟 𝑜 𝑚𝑒𝑠𝑚𝑜 𝑒𝑓𝑒𝑖𝑡𝑜 𝑏𝑖𝑜𝑙ó𝑔𝑖𝑐𝑜 A RBE varia não só com o tipo de radiação utilizada, mas também com diferentes tipos de células e tecidos, condições fisiológicas, efeito biológico em estudo, dose, taxa de dose e fracionamento. Um aumento da RBE apenas apresenta interesse terapêutico quando a RBE para o tecido normal é inferior à do tumor, aumentando assim, o nível de morte celular no tumor e a razão alvo:não alvo, melhorando assim a eficácia terapêutica, (Suntharalingam, 2002).
Outro parâmetro importante a avaliar no efeito da radiação é a relação do enriquecimento em oxigénio (OER), que descreve numericamente o efeito do oxigénio, uma vez que a resposta dos tecidos biológicos à radiação é maior quando são irradiados em situação aeróbica do que em condições de anoxia ou hipoxia. O oxigénio é necessário para a formação de radicais livres durante a ionização da água, os quais induzem a formação de H2O2. O OER é descrito matematicamente pela equação:
𝑂𝐸𝑅 = 𝐷𝑜𝑠𝑒 𝑞𝑢𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧 𝑜 𝑚𝑒𝑠𝑚𝑜 𝑒𝑓𝑒𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑚 𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖çõ𝑒𝑠 𝑎𝑒𝑟ó𝑏𝑖𝑐𝑎𝑠𝐷𝑜𝑠𝑒 𝑞𝑢𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧 𝑢𝑚 𝑑𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑓𝑒𝑖𝑡𝑜 𝑠𝑜𝑏 𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖çõ𝑒𝑠 𝑎𝑛𝑜𝑥𝑖𝑐𝑎𝑠
O valor de OER é fortemente dependente da LET, uma vez que o OER é maior para radiações de baixo LET e é menos eficaz com radiações de alto LET.
2.5.1 Efeitos Estocásticos e Determinísticos da Radiação
Pelas leis de Bergonie e Tribondeau (1906), conclui-se que quanto mais diferenciada é a célula, maior é a sua radiorresistência e quanto maior é a taxa de proliferação, de crescimento e atividade metabólica da célula, maior é a radiossensibilidade. Assim, tecidos ou órgãos em desenvolvimento e proliferação ativa são mais radiossensível que tecidos ou órgãos totalmente desenvolvidos e diferenciados, Figura 4.
Em 1925, Ancel e Vitemberger modificam a lei de Bergonie e Tribondeau, introduzindo a noção de tempo de latência, afirmando que a suscetibilidade das células à lesão por radiação é o mesmo, mas o tempo de aparecimento das lesões produzidas pela radiação vária de acordo com o tipo de célula, influenciadas pela quantidade de stresse biológico que a célula está sujeita, pela necessidade de divisão, e pelas condições de pré e pós-radiação da célula exposta.
Figura 5: Relação entre a radiossensibilidade das células e as suas características de divisão e diferenciação celulares.
• Vida curta • Indiferenciadas
• Dividem-se regularmente
Muito Alta
• Dividem-se um número limitado de vezes
• Algum grau de diferenciação
Alta
• Dividem-se ocasionalmente • Esperança de vida muito variavel
Média
• Vida longa
• Não se dividem muitas vezes • Grau variavel de diferenciação
Baixo
• Não se dividem
• Altamente diferenciadas
Os efeitos celulares da radiação podem ser classificados com base na sua probabilidade de ocorrência, sendo divididos em dois tipos distintos:
• Efeitos estocásticos: Podem aparecer a partir da lesão de uma ou várias células,
não existe limiar, pelo que os efeitos são de natureza aleatória, isto é, assume-se que existe sempre a probabilidade de ocorrerem, mesmo para pequenas doses de radiação. Um aumento da dose implica um aumento da frequência do efeito e não da sua gravidade.
• Efeitos determinísticos: estão associados a um limiar a partir do qual surgem, são
os efeitos cuja severidade aumenta com o aumento da dose.
2.1.1. Efeitos Direto e Indiretos da Radiação
Quando as células são expostas a radiação ionizante, ocorrem primeiramente efeitos físicos entre os átomos e moléculas da célula e a radiação, e só mais tarde se verificam os danos biológicos. Os efeitos biológicos da radiação resultam sobretudo de lesões provocadas ao ADN, o qual é o componente mais sensível da célula no que toca a radiação ionizante. Contudo, existem outros componentes da célula, que uma vez danificados, podem produzir efeitos biológicos na célula como por exemplo enzimas, lípidos estruturais, entre outros.
Quando a radiação incidente interage com o material biológico, transfere energia para a célula, provocando danos que podem ser resultado de efeitos diretos ou indiretos da radiação. No efeito direto, a radiação interage diretamente com a molécula alvo, ou seja o ADN. Os átomos do ADN são ionizados ou excitados, conduzindo a uma cascata de eventos físicos e químicos, que eventualmente produzem o dano biológico. O efeito direto é o processo dominante em interações de radiação de alta LET.
No efeito indireto, a radiação interage com outas moléculas ou átomos, principalmente moléculas de água, no interior da célula, produzindo radicais livres, os quais posteriormente provocam a ionização da molécula alvo. As interações da radiação com as moléculas de água no interior da célula produzem radicais livres de curta vida, nomeadamente, o H2O+ e o OH·. Os radicais livres em causa podem induzir
biológico provocado por radiação de baixa LET é devido ao efeito indireto da radiação, consultar Figura 5 (Tavares, 2009).
Figura 6: Efeitos diretos versos efeitos indiretos (Hall & Giaccia, 2006)
2.1.2. Tipos de Danos Celulares Radioinduzidos
As células expressam os danos radioinduzidos aquando da sua divisão e multiplicação. Lesões que provocam aberrações cromossómicas e mutações genéticas nas células podem levar à morte celular, inibição da divisão celular ou a transformações malignas. Estas alterações celulares podem ter como consequências finais a alteração da função tecidular, morte tecidular ou indução de cancro.
A interação de radiação ionizante com material biológico provoca uma cascata de eventos nefastos para a estrutura e função do material em causa. Quando existe interação entre radiação e o ADN, um dos seguintes efeitos biológicos na estrutura do ADN podem ocorrer: 1) alteração das ligações entre as bases, devido a substituição de bases, adição de novas bases ou remoção de bases existentes, substituição cruzada de bases; 2) Single Strand Break (SSB), quebras simples da cadeia; ou 3) Double Strand Break (DSB), quebras duplas da cadeia. Estes danos do ADN podem conduzir a alterações na função do ADN levando a uma das seguintes consequências: inibição temporária ou permanente da síntese de ADN, síntese de ADN incorreto, inibição ou prevenção da mitose ou mesmo síntese de proteínas incorretas. Por outro lado
quando a interação da radiação ocorre com enzimas, alterações da estrutura terciária ou disrupção das ligações químicas das enzimas podem ocorrer, levando à inibição da atividade enzimática ou a alterações do metabolismo celular. Se as interações ocorrem nas membranas celulares, pode ocorrer um aumento da permeabilidade aos iões, resultando em potenciais alterações da composição intracelular e extracelular da célula.
Suntharalingam e colegas em 2002 classificaram os danos provocados em células de mamíferos em três grandes grupos (REF):
• Danos letais: os quais são irreversíveis, conduzindo à morte da célula;
• Danos subletais: podem ser reparados em algumas horas exceto se outros danos subletais forem adicionados durante a reparação celular, o que conduzirá ao aparecimento de um dano letal;
• Danos potencialmente letais: podem ser processados pelos mecanismos de reparação quando as células são retidas no estádio G0.
2.1.3. Destino das Células Irradiadas
A irradiação da célula pode resultar em nove possíveis destinos finais, (Suntharalingam, 2002):
• Ausência de efeito;
• Atraso na divisão: célula fica retida no estádio G0;
• Apoptose: a célula morre por fragmentação;
• Falha reprodutiva: a célula morre na tentativa de executar mitose;
• Instabilidade genómica: carateriza-se por um atraso da falha reprodutiva como resultado da introdução de instabilidade genómica;
• Mutação: a célula sobrevive, mas está mutada;
• Transformações: a célula sobrevive, mas a mutação leva a alterações de fenótipo e possibilidade de carcinogénese;
• Efeito bystander: a célula irradiada envia sinais as células vizinhas não irradiadas, induzindo danos genéticos nas mesmas;
• Resposta adaptativa: a célula irradiada é estimulada para reagir e tornar-se mais resistentes à radiação.
2.1.4. Mecanismos de Reparação do ADN
Quando a radiação ionizante interage com o material biológico, principalmente o ADN, provoca alterações na sua estrutura num curto espaço de tempo, entre 10-3 e 10-5
segundos, estimulando a quebras de ligações químicas do ADN. Contudo, os efeitos biológicos de tal lesão surgem tardiamente, após um período de latência quem pode demorar desde algumas horas até vários anos. Como consequência dos danos no ADN a célula pode sofrer uma mutação, entrar em apoptose ou tornar-se numa célula carcinogénica. Caso a morte celular seja o destino final da célula irradiada, esta pode ocorrer dentro de algumas horas, isto é, efeitos precoces da radiação. Contudo, se o dano for oncogénico, a sua expressão pode ser adiada durante anos, isto é, efeito tardio da radiação. Dependendo da energia depositada pela radiação ionizante na célula irradiada podem ocorrer quebras de apenas uma cadeia de ADN ou quebras nas duas cadeias de ADN (mencionadas anteriormente). Em termos biológicos as SSBs são tipicamente de fácil reparação, não apresentando assim grandes consequências celulares, a não ser em caso de reparação incorreta a qual pode conduzir ao aparecimento de uma mutação. Também as DSBs separadas por vários pares de bases são frequentemente facilmente reparados pelos mecanismos celulares. Porém as DSBs complexas, separadas por poucos pares de bases são uma das lesões mais toxicas e mutagénicas nas células humanas. Uma única DSB tem potencial para remover mais de 100 milhões de pares de base de informação genética.
O número de lesões no ADN geradas pela radiação é elevado, mas o número de células que morrem devido as lesões é substancialmente mais reduzido. O número de lesões induzidas no ADN por uma radiação de 1-2 Gy é aproximadamente de 1000 SSBs e 40 DSBs. Dados experimentais demonstram que as DSBs induzidas por radiações de baixo LET são tipicamente mais facilmente reparadas que as DSBs provocadas por radiações de alto LET. Conhecimento relativo à interação e trajeto da radiação (track structure)
com a matéria tem vindo a ser utilizado para explicar as variações e diferentes distribuições das lesões no ADN.
Existem múltiplos mecanismos enzimáticos de reparação do ADN nas células que atuam em diferentes tipos de lesões. Para as lesões DSBs, os principais mecanismos de reparação são a recombinação homóloga (Homologous Recombination) e a recombinação não homóloga (Non-Homologous End Joining, NHEJ) (Helleday, Lo, Van Gent, & Engelward, 2007). A recombinação homóloga requer que parte do ADN não esteja danificado para servir como molde para síntese de novo ADN, é um mecanismo raro, sem erros, e que acontece essencialmente após a replicação, na fase final do estádio S e G2 do ciclo celular. Este tipo de reparação inicia-se com a ligação de um complexo proteico aos locais das lesões. De seguida ocorre a síntese dos nucleótidos em falta, de forma a criar um complexo cruzado entre as cadeias de ADN lesadas e normais, designado de junção de Holliday. Por último occore a quebra da junção Holliday, que é o passo final no processo de reparação por recombinação homóloga. A recombinação não homóloga provoca lesões pré-mutagénicas, as quais podem ser letais no caso de aberrações em anel, dicêntricas ou pontes de anáfase; ou não-letais se forem pequenas deleções ou translocações simétricas. Este mecanismo opera na ponta do fragmento de ADN, após a identificação por parte da proteína Ku70/Ku80 do local da lesão. De seguida a proteína de reparação liga-se ao DNA-PK, o qual promove uma re-coneção dos fragmentos de ADN. Este mecanismo ocorre essencialmente na fase final do estádio G1 e fase S do ciclo celular.
A radiossensibilidade celular depende da fase do ciclo celular no qual a célula se encontra quando é irradiada. Em geral, a fase final do estádio S é a mais radiorresistente, a fase G2 e M são as mais radiossensíveis e a fase G1 tem uma radiosenssibilidade intermédia (Figura 6). A reparação de danos celulares durante a fase final do estádio S é preferencialmente executada por via do método de reparação HR em vez do método NHEJ, o que poderá ser atribuído à elevada radioressistência desta fase do ciclo celular. .
Figura 7: Fração de células que sobrevivem a uma dose de 6.6 Gy de raio-X em função do tempo. Note-se que a sobrevivência celular cresce até um máximo na fase final do estádio S (Wang, 2000).
Existem mecanismos de reparação mais simples que são utilizados principalmente nas quebras simples como o caso da reparação por excisão de bases (Base Excision Repair, BER) que permite corrigir problemas em bases individuais através da produção de um local AP (local apurínico ou apirimidínico), reparação por excisão de nuclídeos (Nucleotide Excision Repair, NER) que corrige dímeros de timina através da remoção de oligonuclídeos e reparação de erros de emparelhamento (Mismatch Repair, MMR). O mecanismo BER é um processo celular que repara lesões no ADN fora do ciclo celular (G0). É responsável primeiramente pela remoção de lesões pequenas e simples nas
bases do genoma, que de outra forma poderiam causar mutações por reparações incorretas ou quebras na duplicação do ADN. O processo BER é iniciado pela glicosilase (DNA glycosylases), que reconhece e remove as bases lesadas ou alteradas da cadeia de ADN, formando locais AP. Estes locais são então clivados pela endonuclease AP (AP endonuclease). A quebra simples resultante pode então ser processada pelo denominado Short-patch BER (SP-BER, onde um único nucleótido é substituído) ou pelo Long-patch BER (LP-BER, onde são sintetizados 2-10 novos nucleótidos). Estudos sugerem que fatores como o tipo de lesão, a fase do ciclo celular e o grau de diferenciação da célula influencia a decisão celular na escolha entre reparação por SP-BER ou LP-SP-BER.
Por outro lado, o processo NER é um mecanismo de excisão importante que remove mutações resultantes da radiação como dímeros de timina. O reconhecimento da lesão leva à remoção de um pequeno segmento da cadeia de ADN que a contém. A
cadeia de ADN sem lesão é utilizada pela ADN-polimerase como molde para a síntese da sequência complementar em falta. Por fim a ligação que completa o processo e origina a dupla cadeia de ADN reparada está a cargo ADN-ligase. A Figura 7 apresentada abaixo sintetiza de forma simples os processos BER e NER que ocorrem em células dos mamíferos.
Figura 8: Esquema dos mecanismos de reparação BER (A) e NER (B) (Blakely, 2011)
2.1.5. Curvas de Sobrevida
O procedimento padrão utilizado para medir a radiossensibilidade de uma população celular é a retenção da sua integridade reprodutiva. Este é referido como a sobrevida celular e percentagem de sobrevida após irradiação, assumindo que existe uma relação clara entre a apoptose, o crescimento celular e a sobrevivência celular para um vasto intervalo de doses.
O tipo de radiação influencia a forma da curva de sobrevida celular, sendo que radiações densamente ionizantes apresentam curvas de sobrevida quase exponenciais
face à dose absorvida, enquanto radiações pouco ionizantes apresentam uma pequena diminuição inicial, seguida de uma região denominada em ombro e de um decréscimo constante para altas doses, consultar Figura 8.
Figura 9: Curvas de sobrevida celular típica para radiação de alta LET e baixa LET: (a) Primeiro modelo e (b) modelo atual (Tavares, 2009)
As curvas de sobrevida são melhor expressas em gráficos semi-logarítmicos de sobrevivência celular versus dose de radiação, geralmente com doses de 1 a 10 Gy por célula. O modelo mais utilizado na atualidade é o modelo linear-quadrático, o qual utiliza um polinómio de segunda ordem, em que as constantes α representa a inclinação inicial da curva e β a componente quadrática de morte celular para descrever o declive da sobrevida (S) com o aumento da dose (D):
𝑆 = 𝑒−(𝛼𝐷+𝛽𝐷2)
A razão α/β fornece a dose para a qual os componentes quadráticos e lineares da morte celular são iguais.
A taxa de sobrevivência celular é maior quando uma dose é administrada de forma fracionada num período superior a 2 horas, comparado com uma única dose. Esta variação é atribuída às reparações das lesões subletais entre frações. Em geral o período de reparação de metade das lesões subletais varia entre 0.5 a 1 hora para células em cultura podendo ser maior em tecidos. E a reparação completa pode demorar entre 6 a 8 horas, podendo também ser mais moroso em tecidos. O sucesso da reparação do dano depende da dose absorvida e do tempo de exposição, existindo uma velocidade máxima de reparação observada quando a lesão atinge níveis de
saturação, análogo à cinética enzimática. A reparação é menos bem-sucedida para irradiações de altas taxas de doses, apresentado maior sucesso para baixas taxas de doses. O sucesso crescente da sobrevivência celular a baixas doses ou com doses muito espaçadas no tempo é consistente com a importância dada ao tempo de reparação das lesões subletais. Outro efeito importante na sobrevida celular é o chamado efeito bystander, em que as células próximas das células irradiadas, mas que não foram atingidas diretamente pela radiação, exibem lesões similares àquelas observadas em células diretamente atingidas pela radiação.
2.2. Sumário
Deste capítulo conclui-se que a célula começa a sua vida quando se origina a partir da divisão da célula-mãe e termina quando ela própria se divide em duas células-filhas. O ciclo celular, bem como toda a cinética a este associado, desempenha um papel fundamental na resposta celular à irradiação pois aquando de um dano pode iniciar o processo de reparação celular, pode ativar o processo de morte celular ou pode retirar essas células danificadas do ciclo celular, colocando estas num estádio quiescente designado G0. A apoptose é o processo de morte celular que menos danos causa às
células vizinhas, sendo o processo controlado de morte celular, desejável em cenários de terapias com recurso à radiação. Também neste capítulo se observa que a radiação provoca efeitos nefastos nas células e que estes dependem em muito da qualidade da radiação e dos mecanismos de reparação que atuam nas lesões. O esquema apresentado na Figura 10 sumaria os principais dados apresentados neste capítulo, sintetizando todo os processos celulares tipicamente observados após indução de danos às células.
Figura 10: Sumário dos principais processos de resposta celular a diferentes tipos de danos celulares induzidos.
Capı́tulo 3
3.1 Introdução
Um dos grandes problemas associados ao processo carcinogénico é a possibilidade deste se disseminar por diversas áreas do corpo humano, complicando assim o combate as células carcinogénicas. As metástases são aglomerados de células malignas que se espalham a partir do primeiro local de desenvolvimento tumoral, para outros locais do corpo, sendo um processo fisiológico muito pouco eficiente, pois a habilidade das células cancerosas promoverem a proliferação de metástases com sucesso depende das suas características individuais e do meio, incluindo as células do sistema imunológico, as propriedades que as células vão encontrar no sistema linfático e corrente sanguínea e no seu local de destino.
As metástases ósseas podem ocorrer em 30 a 70% dos doentes portadores de neoplasias. Os tumores malignos que mais frequentemente metastizam para o tecido ósseo incluem o carcinoma da mama, próstata e pulmão. Clinicamente a dor é o sintoma mais frequentemente associado a metástases ósseas. As metástases ósseas podem ainda conduzir a fraturas ósseas e a hipercalcemia.
A deteção dos locais metastáticos pode ser realizada com recurso a diversas técnicas de imagiológica médica, das quais se destacam a cintigrafia óssea, radiografias e técnicas tomográficas de emissão ou transmissão. Vários tratamentos têm sido utilizados para erradicar as metástase ósseas ou para melhorar a qualidade de vida do doente, sendo que estes dependem do estado da doença e da saúde geral do doente, podendo ser divididos em tratamentos sistémicos ou locais.
3.2 Princípios Gerais do Processo Metastático
O tumor formado por células cancerosas metastáticas é designado de tumor metastático ou metástase (Kaplan et al., 2006). Um tumor metastático tem frequentemente o mesmo tipo de células do tumor original, partilhando assim com o
tumor original algumas características moleculares em comum, tais como a expressão de certas proteínas ou a presença de algumas alterações cromossómicas especificas. A metástase é o resultado final de várias etapas interdependestes, um processo multifacetado que inclui uma complexa interação entre o tumor e o local hospedeiro, uma sequência de acontecimentos que ainda hoje não está completamente esclarecida. Os principais passos associados ao processo metastático incluem (Figura 14):
• Invasão local: as células cancerosas invadem tecido vizinho normal;
• Invasão dos vasos: as células cancerosas invadem e movem-se através das paredes dos vasos linfáticos e sanguíneos adjacentes;
• Circulação: as células cancerosas movem-se pelo sistema linfático e corrente sanguínea para outros locais do corpo;
• Extravasão: as células cancerosas param de se mover em pequenos capilares, onde invadem a parede dos capilares e migram pelo tecido envolvente;
• Proliferação: as células cancerosas multiplicam-se no novo local e formam pequenos tumores, micrometástases;
• Angiogenese: os pequenos tumores estimulam o desenvolvimento de vasos sanguíneos, fundamentais para a obtenção de oxigénio e nutrientes, permitindo assim o desenvolvimento contínuo do tumor metastático.
A habilidade das células cancerosas promoverem a proliferação de metástases com sucesso depende das suas características individuais, das características das células não cancerosas (incluindo as células do sistema imunológico presentes no local original) e das características do meio que as células vão encontrar no sistema linfático, na corrente sanguínea e no seu local de destino final. A Figura 15 demonstra alguns dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento e proliferação das metástases ósseas.
Figura 12: Mecanismos que induzem o desenvolvimento e proliferação das metástases ósseas. IL-interleucina, TNF- fator de necrose tumoral, TGF- fator de cresimento tumoral, EGF- fator de crescimento epidermal, PTHrP- proteína relacionada com a hormona tiroideia, PGE- prostaglandina E, MCSF- fator estimulador de colónias de
macrófagos (Bączyk, 2011)
Fisiologicamente, a metástase é um processo ineficiente. Sabe-se, por exemplo, que após injeção intravenosa experimental de células tumorais altamente metastáticas, apenas 0.01% destas irão conseguir formar um foco tumoral (Meohas et al., 2005). Alguns pacientes com tumores metastáticos não apresentam sintomas, porém quando ocorrem sintomas, estes variam consoante a localização e tamanho da metástase. A maioria dos cancros tem capacidade de se espalharem por vários locais diferentes do corpo simultaneamente. As metástases ósseas surgem com maior frequência dos carcinomas da mama, pulmão, rim, próstata e tiroide. Localizando-se mais comumente nas vertebras, arcos costais, na pelve e no fémur, embora qualquer osso possa ser disseminado (Kaplan et al., 2006).
3.3 Características das Células Ósseas Normais e
Metastáticas
O tecido ósseo é constituído essencialmente por dois tipos distintos de células, que asseguram a qualidade do tecido através da síntese e degradação contínua do mesmo: os osteoblastos e os osteoclastos.
Os osteoblastos, células osteogénicas, tem aproximadamente 3 meses de vida e provêm das células pluripotentes da matriz mesenquimal. A sua principal função é a produção de colagénio tipo I e proteoglicanas que formam a estrutura orgânica intracelular do osso que vai ser calcificada. Para além disso, os osteoblastos são também responsáveis pela síntese de vários tipos de proteinases, (osteonectina, osteopontina e osteocalcina).
Os osteoclastos, com um tempo de vida de aproximadamente de 2 semanas, derivam da linhagem monócito-macrofagal das células hematopoiéticas. Após diferenciação em contacto com a matriz óssea, conectam-se e produzem uma forma polinuclear ativa. A adesão do osteoclasto com a matriz óssea cria um microambiente em que a libertação de ácidos (H+) ou hidrolases inicia o processo de osteólise. Os osteoclastos têm a
habilidade de fagocitar a matriz óssea e digerir no seu citoplasma. Um fator importante no funcionamento dos osteoclastos é o feedback negativo através do qual os indutores de apoptose são estimulados, induzindo a degradação da matriz óssea. A Figura 11 demonstra a organização e estrutura do tecido ósseo (imagem à direita) e expõem uma imagem histológica do tecido ósseo e as suas células (imagem à esquerda).
Figura 13: Representação da estrutura e organização do tecido ósseo e imagem histológica do tecido ósseo com as principais células ósseas: osteoblastos, osteoclastos e osteócitos.
Os produtos de degradação da matriz óssea bem como fatores de crescimento ósseo, a proteína morfogénica do osso (bone morphogenetic protein - BMP),o fator transformador de crescimento (transforming growth factor - TGF-β) e o fator de crescimento dos fibroblastos (fibroblast growth factor - FGF) estimulam de formas diferentes a maturação das diversas células do tecido ósseo, sendo que algumas destas, após a estimulação produzem osteoprotegenina (osteoprotegerin - OPG), o principal inibidor da maturação dos osteoblastos (Kaplan, Psaila, & Lyden, 2006).
Em 1889 Stephen Paget reconhece a predisposição das células carcinogénicas dos tumores da mama para disseminarem para o esqueleto, apresentando a teoria das sementes (células carcinogénicas) e da sua dependência do solo (tecido alvo) no processo metastático. Paget comparou o processo de metastização óssea com o processo de plantação de sementes: “When a plant goes to seed, its seed are carried in all directions: but they only live and grow if they fall on congenial soil” (Sterling, Edwards, Martin, & Mundy, 2011). As células tumorais, uma vez estabelecidas no osso, segregam vários fatores de crescimento e fatores que mediam a absorção óssea, os quais iniciam ou aceleram a destruição óssea pelos osteoclastos, produzindo assim um ciclo vicioso (Figura 12). Por exemplo, as células cancerosas da próstata expressam o fator de crescimento TGF-β, o qual ao aderir à matriz óssea pode afetar a maturação dos osteoblastos. As células carcinogénicas reagem à presença de TGF-β através da libertação de proteínas relacionadas com a hormona paratiroideia (parathyroid hormone related protein - PTHrP), que está fortemente associada ao aumento da absorção óssea tanto em humanos como em animais. O fator de crescimento EGF, por seu lado, pode aumentar a facilidade a migração das células carcinogénicas da corrente sanguínea para o osso.
Figura 14: Ciclo vicioso da interação tecido metastático-tecido ósseo que favorece a estabilização e crescimento do tumor. Quando as células tumorais (azuis) atingem o osso, estas segregam fatores que estimulam os osteoclastos (roxos) para a degradação óssea. Esta degradação estimula a libertação de fatores de crescimento a
partir do osso que favorecem o desenvolvimento das células tumorais. (Sterling et al., 2011)
O conhecimento científico sobre a interação das células carcinogénicas com o microambiente ósseo tem vindo a aumentar e sabe-se que os diferentes tipos de células, bem como interações complexas entre o osso, as células tumorais e o estroma, têm um papel distinto na regulação da destruição óssea durante o processo de metastização óssea. Por exemplo, dados experimentais têm demostrando que a rigidez óssea tem um papel preponderante na primeira fase de desenvolvimento das metástases ósseas, sendo que a rigidez do osso aumenta a expressão de PTHrP, facilitando a invaginação das células carcinogénicas na matriz óssea. Os osteoblastos também apresentam um papel importante neste ciclo vicioso, pois são as células precursoras dos osteoblastos que produzem o RANKL, que estimula a diferenciação dos osteoclastos. Também a diferenciação dos osteoblastos é inibida na presença de TGF-β, resultando assim na inibição de formação de novo osso, consultar Figura 12. Vários grupos de investigação têm demostrado também que os fibroblastos podem alterar o fenótipo invasivo de algumas células tumorais tramsformando células tumorais benignas em células tumorais com fenótipo maligno (Sterling et al., 2011). Estudos realizados anteriormente com o objetivo de investigar os tempos de duplicação das células metastáticas ósseas demonstraram que, caso todas as células do tumor se encontrassem em divisão e não houvesse perda de células, o tempo de duplicação do volume do tumor iria refletir o tempo do ciclo celular das células
tumorais (TC). A fração reduzida de crescimento significa que o tempo potencial de
duplicação de volume (Tpot) do tumor é superior ao ciclo celular das células
carcinogénicas, devido à sua heterogeneidade e a perda de células significa que o tempo médido de duplicação (TD) é ainda superior. Os tumores humanos tem um TD
médio de 2 a 3 meses, dependendo do tipo de tumor, contudo as células tumorais apresentam TC de 2 a 3 dias e um Tpot de 4 a 20 dias.
3.3.1 Morfologia e Cinética das Células do Tecido Ósseo e
Tumorais
O ciclo celular de cada tipo de célula é controlado por diversos marcadores, enzimas e proteínas que lhes proporciona uma cinética particular, pode ser alterada se ocorrer alguma alteração genética, como no caso das células carcinogénicas da próstata e mama.
As células carcinogénicas metastáticas da próstata, tal como as células normais que as originam, são sensíveis a estimulação por hormonas de crescimento. Na presença de certas hormonas, a percentagem de proliferação (Kp) destas células é estimulada,
enquanto na ausência de hormonas a taxa de morte celular (Kd) aumenta. Na
presença das hormonas estimuladoras do crescimento, ocorre o contínuo crescimento das células metastásticas da próstata, uma vez que, a taxa de proliferação supera a taxa de morte celular (Berges et al., 1995).
O Kp é calculado através da divisão do valor GF para um dado tipo de célula pelo
período intermitótico Tc desse mesmo tipo de célula (expresso em dias), com posterior
multiplicação do resultado por 100. O GF é determinado por análises imunocitoquimicas para detetar células em ciclo celular, através da deteção do antigene Ki67 presente em células em proliferação (G1, S, G2) e ausente em células fora
de ciclo (G0). Ou seja, o GF é a porção de células da amostra marcadas positivamente
com o antigene Ki67. Por outro lado, o Tc é determinado pela observação de culturas
de células através de um vídeo com subsequente determinação e quantificação do tempo entre mitoses. O valor Kd, que expressa em percentagem a taxa de morte
celular diária, é calculado dividindo a fração de células cuja extremidade do ADN está marcada com TTF exógena (terminal transferase) pela semi-vida das células marcadas
