FELIPE RAFAEL TORRES
Estudo do polimorfismo de hemoglobinas e
do gene HFE em populações brasileiras de
áreas endêmicas de Malária
Tese apresentada para
obtenção do Título de
Doutor em Genética.
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Regina Bonini-Domingos
São José do Rio Preto – SP
2005
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
CAMPUS DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
Livros Grátis
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Torres, Felipe Rafael.
Estudo do polimorfismo de hemoglobinas e do geneHFE em populações brasileiras de áreas endêmicas de Malária / Felipe Rafael Torres – São José do Rio Preto: [s.n.], 2005
96 f.
Orientadora: Profa. Dra. Cláudia Regina Bonini-Domingos Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista. Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Hemoglobinas. 2. Polimorfismo de hemoglobinas. 3. Malária. 4. Gene HFE. I. Bonini-Domingos, Cláudia Regina. II.
Universidade Estadual Paulista. Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
Felipe Rafael Torres
Estudo do polimorfismo de hemoglobinas e
do gene
HFE em populações brasileiras de
áreas endêmicas de Malária
COMISSÃO JULGADORA
TESE PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR
Presidente e Orientador:...
2
°
Examinador: ...
3
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Examinador: ...
4
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Examinador: ...
5
°
Examinador: ...
São José do Rio Preto, 02 de março de 2005
Este trabalho foi realizado no Laboratório
de Hemoglobinas e Genética das Doenças
Hematológicas
(LHGDH),
do
Instituto
de
Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE)
de São José do Rio Preto, Universidade Estadual
Paulista (UNESP).
À minha querida Juliana, que com carinho e imensurável amor
soube ser paciente e compreensiva, sempre presente ao meu lado,
minha maior conquista.
À Lara, meu tesouro e minha força propulsora,
minha maior realização.
Agradecimentos
Agradeço a todas as pessoas que apoiaram e vivenciaram a realização deste trabalho. Em especial agradeço:
ÀProf ª Dra. Cláudia Regina Bonini Domingos não só pela orientação mas pela amizade, dedicação, incentivo constante e por me receber de abraços abertos em seu laboratório dando todo apoio para realização deste trabalho. “O espírito se enriquece com aquilo que recebe, o coração com aquilo que dá” (Victor Hugo).
Aos professores Dr. Agnaldo Luiz Simões, Dr. Milton Artur Ruiz, Dr.
Haroldo Wilson Moreira e Dra. Agnes Cristina Fett Conte pela disponibilidade na
leitura e composição da banca examinadora.
Ao Prof. Dr.Ricardo Luiz Dantas Machado cuja motivação pela pesquisa malárica incentivou a realização deste trabalho.
A todos os professores, cujos ensinamentos e conduta muito contribuíram para a minha formação. Em especial agradeço aos professores Dra. Maria Tercília
Vilela de A. Oliveira, Dra. Cláudia Carareto e Dr. Carlos Ceron.
Às amigas incondicionais e companheiras de laboratório Paula Juliana
Zamaro, meu braço direito que na maioria das vezes antecipava meus pedidos de
ajuda, eWanessa de Souza, a fiel escudeira, pois sem a sua participação a realização deste trabalho seria muito difícil.
Aos colegas de laboratório, Ana Carolina, Viviane, Karina, Luciane Storti,
Ana Rosa, Luciana Ondei, Carlos Fabian e Ana Luiza pelo convívio fraternal e
proveitoso e que de uma forma ou de outra participaram da realização deste trabalho. ÀMarcela Ortiz pela contribuição dos seus conhecimentos lingüísticos.
Aos funcionários do Departamento de Biologia e Seção de Pós-Graduação pelo suporte técnico-acadêmico.
À Bio-Rad Laboratórios Brasil, em especial à minha gerente e amiga Dra.
Ana Requejo, pela compreensão e suporte instrumental para realização deste projeto.
Ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, UNESP, por ter sido parte integrante e fundamental em minha vida nestes últimos dez anos.
Aos meus grandes amigos Gustavo e Lilian que mesmo à distância se fizeram presentes com palavras de incentivo, sempre compreendendo as minhas ausências.
Aos meus pais, Romualdo e Lúcia, que com muito amor, dedicação e empenho possibilitaram a realização de mais esta etapa da minha vida.
À minha irmãIsabella pela amizade, paciência e revisão gramatical.
À minha esposa Juliana e à minha filha Lara, pelo amor incondicional sendo fontes de inspiração constantes em minha vida.
AoDeus Pai, todo poderoso, por ter me concedido o dom da vida, permitindo que trilhasse com dignidade mais uma etapa da minha vida.
“Penso que cumprir a vida seja simplesmente compreender a marcha, e ir tocando em frente... Cada um de nós compõe a sua própria história, e cada ser em si, carrega o dom de ser capaz... De ser feliz”. (Renato Teixeira e Almir Sater)
“A realização complexa de qualquer célula viva é parte e parcela do fato de que qualquer célula representa um evento mais histórico que físico. Essas coisas complexas não surgem todo dia por geração espontânea da matéria não viva; se o fizessem, elas realmente seriam fenômenos reprodutíveis e atemporais, comparáveis à cristalização de uma solução e seriam um assunto pertinente à física propriamente dita. Não, qualquer célula viva carrega consigo as experiências de um bilhão de anos de experimentação pelos seus ancestrais. Não se pode querer explicar uma entidade tão complexa em algumas simples palavras”.
RESUMO
TORRES, F.R. Estudo do polimorfismo de hemoglobinas em populações brasileiras de áreas endêmicas de Malária. São José do Rio Preto, 2005. 157p. Tese (Doutorado em Genética) – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
Neste trabalho, através dos estudos com populações da região norte do país, pretendeu-se relacionar a distribuição das hemoglobinopatias com a malária bem como avaliar a freqüência das mutações H63D e C282Y do gene HFE, em dois grupos de estudo: o grupo dos doadores de sangue, sem histórico de infecção malárica, provenientes dos hemocentros de quatro estados da região norte do Brasil, um grupo controle externo ao da Amazônia legal, e o grupo constituído por pacientes maláricos. Os polimorfismos de hemoglobinas foram avaliados por HPLC e por técnicas laboratoriais clássicas, e as duas mutações no gene HFE por PCR-RFLP. As populações do norte do país apresentaram alta incidência de alfa talassemia, mas não ocorreram diferenças significativas entre doadores e maláricos. Também não ocorreram diferenças significativas nas médias de HbA2, porém para as médias de HbF do Pará e Rondônia, as diferenças foram significativas entre os dois grupos, sugerindo a influência do efeito malárico nestas populações. A média de reticulócitos, significativamente reduzidos, nos doadores da região norte pode sugerir uma estratégia adaptativa destas populações ao ataque parasitário do Plasmodium. Quanto à análise do polimorfismo do gene HFE, a maioria dos indivíduos apresentaram o alelo H63D em heterozigose em ambos os grupos de estudo. No grupo de doadores a maior freqüência do alelo H63D ocorreu em indivíduos
caucasóides de todos os estados avaliados. No grupo malárico, Rondônia apresentou maior freqüência do alelo H63D entre os indivíduos não-caucasóides. Nos demais estados e no grupo malárico, o alelo H63D foi o mais freqüente entre os indivíduos caucasóides. Os resultados obtidos sugerem que a manutenção do polimorfismo das mutações no gene HFE pode ser explicada por outros fatores seletivos, que não a malária, ou por simples flutuação alélica ocorrida pelo constante fluxo entre os grupos populacionais do Brasil.
Palavras-chave: polimorfismo de hemoglobinas; malária; reticulócitos; Hb F; Hemocromatose hereditária (HH); polimorfismo do gene HFE; freqüência alélica;
ABSTRACT
TORRES, F.R. Study of Hemoglobin polymorphism in Brazilian populational group of endemic area. São José do Rio Preto, 2005. 157p. Tese (Doutorado em Genética) – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
Through the studies with populations of the north area of the country, we intended to relate the distribution of the eritrocytics diseases with malaria as well as to evaluate the incidence of the mutations in the HFE gene H63D and C282Y, in two study groups: the blood donor group, without report of malarica infection, from the blood banks of four states in the north area of Brazil, a external control group to the Amazonian legal area, and the group constituted by malaric patients. The hemoglobins polymorphisms were obtained by HPLC and techniques laboratorial and, the two mutations in the HFE gene by PCR - RFLP. The populations of the north region presented high frequency of alpha talassemia but they didn't happen significant differences between blood donors and malaric patients. They didn't also happen significant differences in the averages of HbA2, however, for the averages of HbF from Pará and Rondônia, the differences were significant among the two groups, suggesting the influence of the malaric effect in these populations. The reticulocytes average significantly reduced in the blood donors from north region can suggest a adaptative strategy of these populations to the parasitic attack of
Plasmodium. Most of the individuals presented the alelo H63D in heterozigose for
the HFE gene in both study groups. In the blood donors group the largest frequency of the alele H63D happened in caucasians of all the appraised states. In the malaric
group, Rondônia presented high frequency of the H63D alele among the non caucasians. For other states and in the group malárico, the H63D alele was the most frequent among the caucasians. The results obtained suggest that the polymorphism maintenance for the mutations in the gene HFE can be explained by other selective factors, that no the malaria, or for simple alelic oscillation happened by the constant flow among the population groups in Brazil.
Key words: hemoglobin polymorphism; malaria; reticulocytes; Hb F; hereditary hemochromatosis (HH); polymorphism HFE gene; allelic frequency.
SUMÁRIO
Capítulo 1 –Introdução...13
Capítulo 2 – Material e Métodos...25
Capítulo 3 - Avaliação de Hb A2 E Hb F em doadores de sangue de região malarígena da Amazônia Oriental Brasileira por HPLC ...46
Capítulo 4 - Hemoglobinas humanas – hipótese malária ou efeito materno?...52
Capítulo 5 - Estudo do polimorfismo de hemoglobinas em populações brasileiras de áreas endêmicas para Malária...79
Capítulo 6 - Estudo do polimorfismo do gene HFE em grupos populacionais da Amazônia brasileira...103
Capítulo 7 - Identificação de Hb B2 em dois caucasianos da região Amazônica Legal por procedimentos eletroforéticos e cromatográficos...122
Capítulo 8 - Hemoglobina I-Filadelfia [alfa 16 (A14) LYS→ GLU] em doador de sangue do estado do Acre, Brasil...131
Capítulo 9 – CONCLUSÕES...139
Referências...142
Anexo I...152
Anexo II...154
INTRODUÇÃO
Introdução
As doenças infecciosas e parasitárias são um grande problema de saúde pública, e sua prevalência, bem como os mecanismos de suscetibilidade aos diferentes agentes infecciosos que acometem a população nacional, são pouco conhecidos.
Vários estudos correlacionam a alta incidência das alterações hemoglobínicas em determinadas áreas do mundo, principalmente na África, com os locais endêmicos da malária, em um modelo evolutivo que indica a manutenção desses polimorfismos nas populações humanas. No Brasil, pouco se conhece sobre a real distribuição das alterações de hemoglobinas em áreas endêmicas da malária, considerando a influência da intensa migração interna na flutuação das freqüências de diferentes alterações de hemoglobinas em cada grupo populacional.
Portanto, através de estudos com populações da região norte do país, onde a malária é endêmica, pretendeu-se relacionar a distribuição dessa doença com a presença de polimorfismos de hemoglobinas e do gene HFE. Tais questões motivam a investigação, uma vez que o conhecimento desses processos permite a criação de estratégias efetivas de prevenção, controle e tratamento dessas doenças, contribuindo para a melhoria da qualidade de vida dos grupos populacionais envolvidos e conhecimento dos polimorfismos genéticos na população brasileira.
A hemoglobina é o pigmento que dá a coloração vermelha ao sangue, representando mais de 95% das proteínas solúveis contidas nos eritrócitos. Sua função primária é o transporte de oxigênio dos alvéolos capilares dos pulmões para os tecidos (Weatherall e Clegg, 1999). A molécula da hemoglobina é uma proteína globular composta por quatro globinas associadas a grupos heme, complexo formado
por um átomo de ferro em uma estrutura porfirínica. As subunidades da hemoglobina são codificadas por genes do tipo α e tipo β que são expressos seqüencialmente durante o desenvolvimento. Os genes do agrupamento α estão localizados no braço curto do cromossomo 16, enquanto os genes do agrupamento β localizam-se no braço curto do cromossomo 11 (Antonarakis,et al., 1985).
Nos estágios embrionários iniciais o tetrâmero de hemoglobina Gower 1, consiste de duas cadeia epsílon e duas zeta. Aproximadamente no início da oitava semana de gestação estas cadeias são gradualmente substituídas pelas cadeias alfa adulta e duas diferentes cadeias tipo beta, designadas Gã e Aã que diferem somente na presença da glicina ou alanina na posição 136, respectivamente. Durante o período de transição entre o estágio embrionário e fetais Hb Gower 2 (α2å2) e Hb Portland (æ2ã2) são detectadas. A Hb F (α2ã2) torna-se a hemoglobina predominante ao longo do período fetal restante. Após o nascimento, as cadeias gama globina são gradualmente substituídas pelas cadeias beta e delta globínicas. Por volta do sexto mês após o nascimento 97%-98% da hemoglobina é formada pelo tetrâmero α2β2 (Hb A), enquanto a Hb A2 (α2ä2) está presente em aproximadamente 2% a 3%. Pequenas quantidades de Hb F também são encontradas no sangue adulto (Maniatis
et al., 1980).
As anormalidades resultantes de mutações nos genes das globinas são tradicionalmente divididas em três principais categorias: variantes estruturais, talassemias e persistência hereditária da hemoglobina fetal (PHHF). A maioria das mutações pode ser facilmente classificada em um destes grupos, embora algumas estejam associadas com características fenotípicas aplicadas a mais de uma categoria.
Por exemplo, algumas das variantes estruturais e pelo menos uma forma de PHHF são expressas hematologicamente como talassemias (Hardisonet al., 2005).
Entre as mutações associadas com globinas estruturais, a maioria é devida ao resultado de substituição de um único par de base, sendo que grande parte destas mutações são expressas pela síntese anormal de cadeias globínicas pela substituição de um dos seus aminoácidos. As variantes estruturais são divididas em três classes, de acordo com o fenótipo clínico: variantes que causam anemia hemolítica, como por exemplo, as hemoglobinas S (Hb S) e C (Hb C); variantes com transporte de oxigênio alterado, como a metahemoglobina (Hb M), e as hemoglobinas variantes com fenótipos de talassemia, como por exemplo, hemoglobina E (Hb E).
Nas talassemias ocorre a redução na síntese de uma ou mais cadeias globínicas, desequilibrando as quantidades relativas entre os tipos alfa e beta, e levando a uma distorção na proporção de cadeias. A cadeia que é produzida em taxa normal, está em excesso relativo, devido à ausência de uma cadeia complementar com a qual possa formar um tetrâmero viável. As cadeias normais em excesso se precipitam na célula, lesando a membrana e provocando destruição prematura da hemácia. Os defeitos que originam talassemias podem ser decorrentes de mutações e grandes deleções. (Thompsonet al., 1991).
Várias deleções no gene β ou mutações pontuais nos promotores do gene ã causam estado clínico benigno, denominado persistência hereditária da hemoglobina fetal. Na PHHF a síntese das cadeias alfa e gama permanecem durante toda a fase adulta em taxas aproximadamente iguais, aumentando os níveis de Hb F no sangue periférico (Garneret al., 1998).
Até 1998, 750 variantes de hemoglobinas estruturais tinham sido identificadas. Mais de 75% delas devido a uma única substituição de aminoácido na cadeia da alfa ou beta globina, representando cerca de 20% das 2.600 mudanças teóricas que poderiam ocorrer nos genes das globinas (Hardison et al., 2005). Algumas variantes estruturais das hemoglobinas são prejudiciais, devido à substituição do aminoácido alterar a função ou estabilidade da molécula, resultando em quadro clínico bem definido. As variantes de hemoglobinas mais freqüentes observadas na população brasileira são as Hb S, Hb C e Hb D (Leoneliet al., 2000).
A hemoglobina S, a mais freqüente das variantes, é formada pela substituição de um aminoácido na cadeia beta, na posição seis, onde o glutamato (GAG) é substituído pela valina (GTG). Em homozigose ambos os genes codificam as cadeias beta S, e neste caso, Hb A não está presente devido à falta do alelo normal. O portador apresenta sintomas clínicos evidentes. Os heterozigotos para Hb S têm um único alelo alterado, o outro gene da cadeia beta codifica uma cadeia beta A normal, resultando no traço falciforme, que geralmente são assintomáticos (Weatherall e Clegg, 1999; Steinberg e Adams, 1978). A anemia falciforme é caracterizada por uma notável variabilidade entre os indivíduos afetados. Fatores que modificam a concentração intraeritrocitária da Hb S podem influenciar a expressão clínica da doença, como a quantidade e composição da Hb F e a associação da Hb S com outras variantes estruturais, talassemias do tipo alfa e beta, além de fatores ambientais (Weatherall, 2001).
Estudos antropológicos associados às análises bio-moleculares sugerem que o gene anormal para a síntese da globina S tenha primeiramente ocorrido entre os períodos Paleolítico e Mesolítico, aproximadamente 50 a 100 mil anos, na região
centro-oeste da África, Índia e leste da Ásia. Admite-se, portanto, que a origem da HbS foi multirregional, atingindo populações com diferentes haplótipos e, por essa razão, certamente é possível entender a diversidade clínica que se observa entre os pacientes com a doença falciforme (Naoum e Bonini-Domingos, 1997).
Por meio de seis diferentes enzimas de restrição (Hinc I, Hinc III, Xnm I, Hinf I, Hpa I e Bam HI) é possível identificar os cinco haplótipos para o gene βS, classificados conforme a origem geográfica em: Asiático (ou Indiano-Asiático), Senegal, Benin, Banto e Camarões. Tal prevalência geográfica dos genes βS associados com os haplótipos específicos tem sugerido a origem independente das mutações βS também no Brasil. A maioria dos cromossomos com o gene βStem um dos cinco haplótipos comuns, mas em alguns pacientes (5% - 10%) podem ser encontrados haplótipos menos comuns usualmente denominados como haplótipos atípicos. Estes haplótipos são provavelmente gerados por uma variedade de mecanismos genéticos como mutações em ponto nos sítios de restrições, simples ou duplas trocas entre dois haplótipos βS típicos ou, mais freqüentemente, associação entre um haplótipo βs típico e um haplótipo βA diferente, que está presente na população e ainda, por conversões gênicas (Zagoet at., 2000).
A expressão fenotípica das hemoglobinas é influenciada por fatores ambientais e/ou genéticos, co-herdados com os defeitos de hemoglobinas (Weatherall e Clegg, 1999). Dentre os fatores genéticos que podem influenciar a expressão fenotípica das variantes de hemoglobinas destacam-se a co-herança com os mutantes de hemocromatose hereditária, C282Y e H63D, e a deficiência de G6PD.
A hemocromatose é caracterizada por excessiva absorção do ferro na dieta e progressiva deposição deste metal no parênquima celular de órgãos como fígado, pâncreas e coração. A hemocromatose hereditária é uma doença genética, hereditária, freqüente na população caucasiana, atingindo uma pessoa em cada 10 na região do Mediterrâneo. Quando não tratada, a hemocromatose pode levar a complicações fisiológicas como diabetes mellitus, cardiopatia, cirrose hepática seguida de carcinoma hepatocelular e morte precoce (Le Gac et al., 2000; Gochee e Poweel, 2001). A identificação do gene HFE para a hemocromatose hereditária, em 1996, forneceu algumas hipóteses para essa patogênese e duas mutações foram caracterizadas: C282Y e H63D. A mutação C282Y é uma transição G→ A, que altera o aminoácido 282 de cisteína para tirosina e a mutação H63D é uma transversão C→ G, que altera o aminoácido 63 de histidina para ácido aspártico.
A freqüência destas mutações tem sido avaliada em diferentes grupos populacionais e relacionada ao aumento de suscetibilidade a algumas doenças infecto parasitárias (Beutler et al, 2001). A hemocromatose hereditária pode interferir também na sintomalogia dessas doenças, sendo que indivíduos portadores de hemocromatose apresentam predisposição a certas infecções causadas por patógenos comoListeria e o vírus da hepatite C. Para Moalem et al. (2001), os baixos níveis de ferro nos macrófagos, em pacientes com hemocromatose hereditária, conferiria certa resistência à infecção de determinadas doenças.
As freqüências das mutações H63D e C282Y em diferentes populações também são associadas a alterações de hemoglobinas, como as talassemias (Pippard e Wainscoat, 1987). Segundo Melis et al. (2002), indivíduos portadores de beta talassemia, que são homozigotos para H63D, tem níveis de ferro aumentado quando
comparados à indivíduos beta talassêmicos homozigotos normais (H/H), sugerindo que a mutação H63D pode ter um efeito modulador na absorção de ferro.
As hemoglobinopatias têm provido uma das poucas demonstrações convincentes da seleção, influenciando a freqüência de único gene na população humana. A alta freqüência de desordens, tal como a anemia falciforme e a beta talassemia, que ocorrem em áreas subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da malária, levou Haldane, a propor que a malária pode ser o agente seletivo responsável, balanceando a perda dos genes para anemia falciforme e talassemias por morte prematura dos homozigotos, com o aumento do valor adaptativo dos heterozigotos no ambiente com malária (Flint et al., 1986). O valor adaptativo dos indivíduos homozigotos para a anemia falciforme (Hb SS), diminuiria pela morte associada com a presença das células falcêmicas. Os indivíduos homozigotos normais (Hb AA) deveriam ser mais afetados que os indivíduos heterozigotos (Hb AS), pelos efeitos da malária. Parece que a vantagem dos indivíduos com Hb AS sobre os com Hb AA, na resistência à malária ocorre especialmente no início da infância, antes da criança desenvolver imunidade para seu próprio anticorpo (Edelstein, 1986).
Friedman e Trager (1981), fizeram uma revisão sobre o mecanismo que envolve a resistência das células falcêmicas à malária. Segundo os autores, as células Hb S infectadas pelo P. falciparum, desenvolvem modificações na membrana que as levam a aderirem no endotélio dos pequenos vasos sangüíneos. Com a baixa concentração de oxigênio nas células falcêmicas, ocorrem perfurações nas membranas dos parasitas e das células vermelhas, devido à perda de potássio.
A capacidade de proteção do hospedeiro frente à infecção malárica não é determinada somente por mecanismos físicos e imunológicos, mas também por características inatas, freqüentemente herdadas com padrão mendeliano. Entretanto, sua freqüência não decorre da exposição individual à infecção. Em termos evolutivos, a pressão seletiva dessa doença em populações humanas, afeta profundamente a distribuição e a freqüência das características que conferem resistência. A resistência inata para os estágios assexuais sangüíneos do parasita pode atuar em nível de membrana eritrocítica, dentro do eritrócito ou no plasma, limitando a capacidade de multiplicação do parasita (Milller e Carter, 1976).
A maioria dos genes selecionados pela malária é de defeitos hereditários das células vermelhas, como a anemia falciforme, Hb C e Hb E, talassemias e deficiência de G6PD (Nagel, 2002). Joishy et al. (1988) mostraram que a freqüência de malária causada pelo P. falciparum na Índia, é menor em indivíduos com traço falciforme do que em indivíduos normais. Chotivanich et al. (2002) encontraram parcial inibição ao crescimento do parasita em indivíduos portadores de Hb E, sugerindo que indivíduos homozigotos Hb EE e Hb E/ beta talassemia podem representar uma alternativa anti - P. falciparum. In vitro, iniciando a parasitemia a 1%, o P.
falciparum invade preferencialmente eritrócitos com hemoglobinas normais quando
comparado com eritrócitos com hemoglobina anormais do tipo Hb AH, Hb AE, Hb EE, Hb C/S e Hb E/beta talassemia (Chotivanichet al., 2002). Em termos evolutivos, a exposição humana para malária é bastante recente e, é provável, que pacientes com alterações hemoglobinícas em diferentes partes do mundo, tenham constituições genéticas diferentes com respeito à suscetibilidade para a malária e uma gama extensa de outros organismos (Weatherall, 2004).
Nas áreas de alta transmissão para malária na África e Ásia, observa-se a complexidade da imunidade, naturalmente adquirida pelo homem contra o plasmódio e a dinâmica relação parasito-hospedeiro que se desenvolve nos indivíduos constante e cronicamente expostos à doença. Nestas áreas, onde o P. falciparum é predominante, os recém-nascidos são protegidos da malária grave durante os seis primeiros meses de vida. A transferência de anticorpos maternos é considerada um os fatores responsáveis pela resistência do recém-nascido, que pode também estar envolvida com a presença de eritrócitos contendo grandes quantidades de Hb F, gerando um microambiente desfavorável ao crescimento parasitário (Druilhe e Perigon, 1994; Dubois e Pereira, 1995). Em ratos transgênicos a Hb F parece prover uma proteção ao P. falciparum pelo retardo no crescimento do parasita (Shear et al., 1993). Estudos in vitro (Pasvol et al., 1977) têm indicado que o crescimento do P.
falciparum em células contendo Hb F é retardado, mas a invasão é aumentada em
recém-nascidos. Hannah et al. (1998) também mostraram que a Hb F pode conferir proteção ao P. Falciparum pelo retardo ao crescimento do parasita devido a alta estabilidade do tetrâmeroα2γ2.
Das quatro espécies de parasita que podem infectar seres humanos, oP. vivax tem sido o mais freqüente nos últimos sete anos no Brasil (Machado e Póvoa, 2000). Embora a proteína que circunda o esporozoíto (CSP) seja o principal alvo no desenvolvimento de uma vacina, estes estudos necessitam de uma reavaliação, devido à descoberta de variações na seqüência repetitiva da porção central da CSP. Em 1989, foi descrita uma forma variante do P. vivax (VK247) na Tailândia, e posteriormente foi reportada a presença de um parasita, P. vivax-like,
morfologicamente semelhante ao P. vivax (VK210), mas com a seqüência repetitiva da porção central da CSP diferente das duas formas descritas anteriormente.
Vários estudos têm mostrado a distribuição global destas variantes (Qari et
al., 1993) e, no Brasil, por meio de testes sorológicos, foram detectadas as três
formas em amostras do estado de São Paulo (Curado et al., 1997) e em comunidades indígenas da Amazônia (Arruda et al., 1996). Machado e Póvoa (2000), por meio de técnicas moleculares, também detectaram as três variantes genéticas deste parasita na Amazônia brasileira, onde o VK210 foi encontrado em infecções simples e mistas com as outras duas variantes, enquanto que o VK247 e o P. vivax-like foram detectados apenas em infecções mistas. Observaram também, que o P. vivax-like está correlacionado com parasitemias menores, e o VK210 com níveis aumentados de parasitemia. A existência dessas variantes genéticas pode determinar diferentes características na intensidade dos sintomas, na resposta ao tratamento e preferência ao vetor, podendo gerar resistência a drogas e falhas nas medidas de controle tendo, portanto, importante implicação para o diagnóstico (Curadoet al., 1997).
Objetivos
O presente trabalho teve como objetivo geral relacionar a freqüência dos polimorfismos de hemoglobinas e do geneHFE em indivíduos com e sem malária da região norte do Brasil.
Objetivos específicos:
1. Avaliar o polimorfismo de hemoglobinas obtido por cromatografia Líquida de alta resolução (HPLC) e métodos laboratoriais clássicos; confirmar os defeitos estruturais de Hb S e Hb C por PCR-RFLP.
2. Avaliar a freqüência dos mutantes C282Y e H63D para o geneHFE; 3. Comparar os resultados obtidos para os polimorfismos nos dois grupos de
estudo e traçar o perfil genotípico dos portadores de malária da região Amazônica legal.
MATERIAL E MÉTODOS
Material e métodos
1. Amostras
A coleta das amostras foi efetivada após explicação detalhada dos objetivos do trabalho e assinatura em termo de consentimento (anexo 1) pelos participantes. Uma ficha de identificação foi preenchida para cada indivíduo (anexo 2) contendo os dados pessoais, história da infecção atual e registro de infecção pregressa. Foram coletados 5 ml de sangue venoso em tubo contendo EDTA e sob refrigeração até o envio ao LHGDH para análise, onde cada participante recebeu um código para preservar sua identidade. O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FAMERP e pela CONEP com registro número 5386/2002 (anexo 3).
Foram analisadas amostras de sangue de 397 doadores sem histórico de infecção malárica confirmados por teste de gota espessa, provenientes dos hemocentros de quatro cidades da região norte do Brasil, todas localizadas na Amazônia Legal brasileira, sendo 99 no Acre, 99 Amapá, 99 Pará e 100 Rondônia. Como grupo controle externo ao da Amazônia legal foram utilizadas amostras de 124 doadores de São José do Rio Preto (SP). Foram coletados 100 amostras de sangue em pacientes maláricos, das regiões de Belém (PA) e Macapá (AP), 75 de Porto Velho (RO) e 51 de Rio Branco (AC) totalizando 326 pacientes. No total foram avaliadas 847 amostras de sangue.
Os procedimentos laboratoriais utilizados para avaliar os polimorfismos de hemoglobinas foram realizados segundo protocolos estabelecidos no LHGDH, destacados abaixo e disponíveis em www.lhgdh.ibilce.unesp.br.
2.1 Resistência Globular Osmótica em Cloreto de Sódio a 0,36% (Silvestroni e Bianco, 1975)
Técnica utilizada para detectar talassemias do tipo beta principalmente na forma heterozigota, pois nesses casos os eritrócitos microcíticos são mais resistentes à hemólise nesta solução. A resistência globular não é específica para talassemia beta heterozigota, já que resultados positivos são encontrados também em anemias carenciais e outras hemoglobinopatias, como nos heterozigotos para hemoglobina C. No entanto cerca de 97% dos portadores de talassemia beta heterozigota apresentam positividade para esse teste.
Procedimento:
Em tubo de hemólise foram colocados 1,5 ml de solução de NaCl a 0,36% e 10µl de sangue total. Em seguida, o tubo foi agitado suavemente por inversão e mantido em repouso por 10 minutos. Para a análise o tubo foi colocado em frente a um papel branco com linha negras o que permitiu distinguir os testes positivos pela opacidade da reação.
Reagentes:
Solução estoque - NaCl a 10% - pH 7,4
NaCl 9,0 g
NaH2PO4.H2O 0,28g
Água destilada q.s.p 100mL
Solução trabalho
NaCl 10% 36 mL
Água destilada q.s.p 1000mL
2.2. Análise, a Fresco, da Morfologia Eritrocitária (Bonini-Domingos, 1993) Em esfregaço sanguíneo a fresco analisa-se o tamanho, a forma e a quantidade de Hb nos eritrócitos. Os indivíduos portadores de talassemia beta heterozigota apresentam moderada anisopoiquilocitose com prevalência de microcitose e hipocromia, facilmente visualizadas ao microscópio óptico. Os resultados podem ser divulgados da seguinte maneira, segundo padronização do LHGDH para cada um dos parâmetros avaliados: alterações discretas (+), alterações moderadas (++), alterações acentuadas (+++) e células normais (N).
2.3. Eletroforese em pH Alcalino (Marengo-Rowe, 1965, com modificações) É uma técnica utilizada para qualificação e quantificação de hemoglobinas normais e grande parte das anormais. As diferentes mobilidades eletroforéticas das hemoglobinas anormais são originadas por alteração de carga elétrica, causada por substituições de aminoácidos diferentes nas cadeias formadoras das moléculas. As hemoglobinas anormais que se originam de mutações onde não ocorre mudança de carga elétrica, migram na posição de Hb A. Nestes casos para a caracterização dessas hemoglobinas, usam-se outros processos eletroforéticos.
Procedimento:
Para a preparação da eletroforese em pH Alcalino foram colocadas iguais quantidades de solução tampão em cada compartimento da cuba de eletroforese e as fitas de acetato de celulose embebidas por 15 minutos em tampão TEB pH 8,5. Em seguida, as fitas foram secas com papel absorvente e colocadas na cuba. As amostras de hemoglobinas, previamente hemolisadas com saponina 1%, foram aplicadas a 1,0cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo e submetidas a uma corrente de 300V por 40 minutos.
Após a análise da corrida eletroforética, sem coloração, as tiras foram embebidas em Ponceau por 15 minutos e descoradas por 3 a 5 minutos e solução de ácido acético 10%. A análise foi feita comparando-se o perfil de migração das amostras com mapas de padrões específicos.
Reagentes:
Tampão TRIS-EDTA-BORATO (TEB) pH 8,6
Tris hidroximetil aminometano 10,2 g
Ácido etilenodiaminotetracético 0,6 g Ácido Bórico 3,2 g Água destilada q.s.p 1000 mL Conservar em geladeira Corantes: Ponceau Ponceau S 0,5 g Ácido tricloroacético 5,0 g
Água destilada q.s.p 100 mL
Solução descorante:
Ácido acético glacial. 100 mL
Metanol 50 mL Água destilada q.s.p 1000 mL Reativo hemolisante: Saponina P.A. 1 g Água destilada 100 mL 3. Testes Complementares
Os resultados obtidos nos testes de triagem determinaram os testes complementares para caracterização das hemoglobinas segundo a suspeita, em variantes ou talassemias.
3.1. Pesquisa de corpúsculos de Heinz e agregados de hemoglobina H (Papayannopoulos e Stamatayannopoulos, 1974)
Os corpúsculos de inclusão de hemoglobina H são formados por cadeias beta oriundas da desnaturação do tetrâmero. Após coloração esses corpúsculos apresentam-se dispostos homogeneamente no interior dos eritrócitos como pequenos pontos azulados.
Procedimento:
Foi colocado 50 µl de sangue total em tubo de ensaio, adicionado 50 µl de solução de azul Cresil brilhante. Em seguida, o tubo foi agitado suavemente. O
material foi incubado a 37ºC por 30 minutos e 60 minutos. Após este tempo, foram realizados finos esfregaços em lâminas de vidro para exame em microscópio óptico com objetiva de imersão.
Reagentes: Solução salina: Cloreto de sódio 0,9 g Água destilada q.s.p. 100 mL Solução citrato: Citrato de sódio 2,2 g Água destilada q.s.p. 100 mL
Solução de Azul Cresil Brilhante:
Azul Cresil brilhante 1,0 g
Solução salina 100 mL
Solução citrato 25 mL
3.2. Eletroforese em acetato de celulose pH neutro (Dacie e Lewis, 1985)
É uma técnica utilizada para identificação e quantificação das hemoglobinas H e Bart’s, que apresentam perfil de migração em pH alcalino similar a proteínas plasmáticas.
Procedimento:
As fitas de acetato de celulose foram embebidas por quinze minutos, em tampão fosfato pH neutro e, após este período secas entre folhas de papel absorvente.
Em seguida, foram conectadas com os compartimentos eletrolíticos da cuba com o mesmo tampão de embebimento, através de tiras de papel mata borrão ouperfex. As amostras de sangue hemolisadas foram aplicadas a 1,0cm da extremidade da fita que estava em contato com o pólo negativo. A corrente utilizada foi de 300V por 30 minutos.
Reagentes:
Tampão fosfato pH neutro
KH2PO4 3,11 g
Na2HPO4 1,66 g
Água destilada q.s.p. 1000 mL
Conservar em geladeira
3.3. Eletroforese de diferenciação em ágar-fosfato, pH 6,2 (Vella, 1968)
A eletroforese em gel de ágar-fosfato pH 6,2 é específica para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas mais lentas que a Hb A, como por exemplo: Hb S e Hb D; Hb C e Hb E que em eletroforese alcalina, migram em posições semelhantes, dificultando a correta identificação. Por este método, as Hb S e Hb C se separam da Hb A, enquanto as Hb D e Hb E migram na mesma posição da Hb A. Esse método permite também a caracterização semi-quantitativa de hemoglobina fetal.
Procedimento:
Em um erlenmeyer de 250 mL foram aquecidos os componentes do gel de ágar-fosfato até completa dissolução. Em seguida, foi pipetado 5,0 mL do gel em lâminas de microscopia e gelificado à temperatura ambiente.
As amostras foram aplicadas na porção média da lâmina, inserindo-se o aplicador com cuidado para não partir totalmente o gel. As conexões com os compartimentos eletrolíticos foi realizada com folhas duplas de papel de filtro. A corrente aplicada foi de 100V por 30 minutos. A primeira análise foi realizada sem coloração e, em seguida, a lâmina foi corada com Ponceau ou Negro de Amido.
Reagentes:
Tampão Fosfato pH 6,2 - Para uso nos compartimentos eletrolíticos e confecção do gel. Na2HPO4 2,02 g NaH2PO4.H2O 7,66 g Água destilada q.s.p 1000 mL Conservar em geladeira Gel de Ágar-Fosfato Ágar-agar 500 mg Tampão fosfato pH 6,2 25 mL
3.4. Contagem de Reticulócitos (Dacie e Lewis, 1985)
A fase jovem do eritrócito, indicativa de produção medular para reposição de perdas fisiológicas ou não. Os valores percentuais expressam a atividade de reposição. Foram utilizados os mesmos reagentes da pesquisa de corpos de Hb H e Heinz, porém, a análise foi efetuada com 10 minutos de incubação, evidenciando apenas os reticulócitos.
3.5. Eletroforese de Cadeias Polipeptídicas
A caracterização estrutural das hemoglobinas anormais é realizada em condições especiais, devido ao custo e às dificuldades inerentes aos métodos utilizados. Para dar seqüência ao estudo de uma hemoglobina anormal não identificável pelos métodos de qualificação e quantificação, utiliza-se a eletroforese de cadeias polipeptídicas. A separação eletroforética de cadeias globínicas constitui uma análise pré-molecular, muitas vezes conclusiva para o diagnóstico de hemoglobina anormal, sem que haja necessidade de se aplicar métodos de disposição bidimensional de peptídeos e análises de aminoácidos, ou biologia molecular.
3.5.1. Em pH Alcalino (Schneider, 1974, com modificações) Reagentes:
Tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6 Corante Negro de Amido
Uréia
2-mercaptoetanol
Procedimento:
- No dia anterior ao teste preparar o tampão trabalho, misturando 36 g de uréia e 70 mL de tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6 (tampão Tris-uréia), em um "becker". Deixar a solução homogeneizando em agitador magnético, até o momento do uso, em temperatura ambiente. O tempo de dissolução deve ser superior a 12 horas.
- Preparar as amostras misturando 50 mL do tampão Tris-uréia, 50 mL de 2-mercaptoetanol e 50 mL de hemolisado preparado com clorofórmio, em um pequeno tubo. Deixar em repouso por 1hora à temperatura ambiente. - Adicionar 6,4 mL de 2-mercaptoetanol ao tampão Tris-uréia restante,
misturar bem e colocar a solução tampão Tris-uréia-mercaptoetanol nos compartimentos eletrolíticos, reservar quantidade suficiente dessa solução para embebimento do acetato de celulose por 1 hora.
- Retirar o excesso da solução tampão do acetato entre duas folhas de papel de filtro e colocá-lo bem esticado na cuba de eletroforese, fazendo conexões com os compartimentos eletrolíticos com papel filtro duplo. - Aplicar as amostras na porção superior do acetato, próximo ao pólo
positivo da cuba.
- Passar 110 volts por 40 minutos; após este tempo alterar a Voltagem para 220 volts e deixar por mais 20 minutos.
- Corar as fitas com Negro de amido ou outro corante de proteínas. Colocar em solução descorante.
3.5.2. Em pH Ácido (Alter et. al., 1980)
Segue o mesmo princípio da eletroforese de cadeias globínicas em pH alcalino, permitindo a separação das frações de globinas por suas afinidades diferenciadas em pH ácido. Permite boa visualização das globinas gama. Metodologia bastante precisa para a separação de globinas, podendo também ser utilizada para quantificação das frações.
Reagentes:
Solução estoque gel poliacrilamida (60:0,4)
Acrilamida 15 g Bis- acrilamida 0,1 g H2O q.s.p. 25 mL Uréia (8M) Uréia 12 g H2O q.s.p. 25 mL 2 – Mercaptoetanol (1M) 2 - Mercaptoetanol 35 mL H2O q.s.p. 500 mL
Tampão para Corrida – Ácido acético (5%)
Ácido acético glacial 50 mL
H2O q.s.p. 1000 mL Gel de poliacrilamida (12%) Solução estoque 2,5 mL Ácido acético 625 mL Uréia 8M 9,375 mL Triton X-100 250 mL Persulfato de amônio (25%) 30 mg
TEMED 100 mL
Tampão de amostra
Uréia 8M 1,25 mL
Ácido acético glacial 125 mL
2- mercaptoetanol 125 mL
Pironina Y 1,0 mg
Preparação do gel de poliacrilamida:
- Misturar a solução estoque de acrilamida-bisacrilamida (60:0,4%), uréia 8M, ácido acético glacial, persulfato de amônio, TEMED. Colocar a solução do gel nas placas, previamente limpas e montadas utilizando espassadores. Após este procedimento introduzir o molde para a formação das canaletas. Aguardar 30 minutos para a polimerização em temperatura aproximada de 30ºC.
- Após polimerização do gel, submeter à 200Volts por 1 hora, com tampão ácido acético 5% nos compartimentos eletrolíticos e o pólo positivo no topo. Este procedimento é realizado para homogeneização do pH entre o gel e o tampão.
- Trocar o tampão de corrida dos compartimentos eletrolíticos, retirando o excesso de tampão das canaletas, em seguida aplicar 10 mL de 2 – mercaptoetanol 1M em cada canaleta e submeter o gel à 150 Volts por 1 hora.
Preparação da amostra:
- Centrifugar 100 mL de sangue com solução salina a 0,85%, a 1.500 rpm, durante 5 minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir no mínimo por 4 vezes. Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar 10x o volume de água destilada para romper os eritrócitos e liberar a hemoglobina.
- Preparar as amostras para aplicação misturando 1,5 mL do hemolisado, descrito acima, com 10 mL do tampão de amostra.
Procedimento:
- Após a realização das pré-corridas trocar novamente o tampão de corrida, aplicar as amostras e submeter a corrente constante de 50mA (200V) por 3 horas.
4. Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) (Huisman, 1986)
A análise de hemoglobinas por HPLC utilizou o sistema automatizado VARIANT da Bio-RAD e kit de diagnóstico para beta talassemia, que permitiu a quantificação das Hb A2 e Hb F com precisão. O kit de diagnóstico para beta talassemia heterozigota (BIO-RAD) utiliza os princípios de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) associado à cromatografia de troca catiônica. As amostras hemolisadas são mantidas a 12°±2ºC em câmara automática, sendo seqüencialmente injetadas no sistema de fluxo da análise em intervalos de 6,5 minutos.
As duas bombas de êmbolo duplo e uma mistura de tampões de eluição com controles de gradientes pré-programados passam através da coluna analítica. Quando
a força iônica da mistura aumenta, mais fortemente as hemoglobinas retidas na coluna são eluídas .
Um fotômetro, de filtro de comprimento de onda duplo (415 e 690 nm), monitora a eluição das hemoglobinas da coluna, detectando as alterações de absorbância a 415 nm. O filtro secundário de 690 nm corrige a linha de base para efeitos provocados pela mistura dos tampões com forças iônicas diferentes. As mudanças na absorbância são monitoradas e exibidas no formato de um cromatograma da absorbância versus tempo. Os dados de análise provenientes do detector são processados por um integrador embutido e impressos no relatório de amostras.
Para auxiliar na interpretação de resultados, janelas de eluição têm sido estabelecidas para as hemoglobinas mais freqüentemente encontradas, baseadas nas suas características de tempos de retenção. O tempo de retenção é o tempo transcorrido da injeção da amostra até o ápice do pico de hemoglobina. Cada hemoglobina tem um tempo de retenção característico. No final de cada análise da amostra, uma cópia do cromatograma e os dados do relatório são automaticamente impressos. O relatório inclui a porcentagem da área corrigida para as hemoglobinas A2 e F de todas as amostras subseqüentes na rotina de trabalho. A interpretação dos
cromatogramas se faz por comparação com padrões fornecidos pelo fabricante.
5. Análises Moleculares
5.1. Protocolo para extração de DNA de glóbulos brancos utilizando método fenol-clorofórmio (Pena et al., 1991, com modificações)
O DNA genômico dos indivíduos foi obtido a partir de leucócitos de sangue periférico, segundo técnica descrita por Pena et al., (1991), com modificações. A extração foi realizada através de um composto fenol-clorofórmio e precipitação por etanol, com segue abaixo:
1.Colocar 300 µL de sangue periférico, colhido com EDTA, em tubo tipo
eppendorf de 1,5 mL e completar o volume para 1000 µL com solução de lise 1;
2. Deixar descansar por 15 minutos e centrifugar 6 minutos em velocidade baixa;
3. Desprezar o sobrenadante;
4. Acrescentar aopellet 450µL de solução de lise 2, agitar novórtex por 30 segundos, adicionar 25 µL de SDS à 10% e 5 µL de proteinase K 20 mg/mL e homogeneizar;
5. Manter em banho-maria a 37ºCovernight ou 42ºC por 3 horas; 6. Adicionar 500µL de fenol equilibrado e homogeneizar;
7. Centrifugar 6 minutos a velocidade baixa;
8. Transferir a fase superior para outro tubo e adicionar 500 µL de clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de 24:1;
9. Homogeneizar e centrifugar por 6 minutos a 7.000 rpm;
10.Transferir a fase superior para outro tubo e adicionar novamente 500µL da solução clorofórmio/álcool isoamílico e homogeneizar.
12. Colocar 50 µL de KCl 2M (gelado) em um tubo e transferir o sobrenadante do outro tubo para este e adicionar 500 µL etanol 100% (bem gelado). Inverter o tubo várias vezes até precipitar o DNA.
13. Centrifugar 6 minutos a 7.000 rpm;
14. Desprezar o sobrenadante e lavar o DNA, que ficou aderido ao tubo, com 200µL etanol 70% (gelado). Deixar secar por 15 minutos;
15. Colocar 25µL de TBE ou água Mili-Q e manter em banho-maria a 37ºC por 24 horas, para total solubilização do DNA;
16. Conservar em freezer -20ºC.
Reagentes:
Solução de lise 1 para extração de DNA (lise de células vermelhas)
Sacarose 0,32M 10,95 g
Tris HCl 10 mM 1 mL
MgCl25 mM 0,5 mL
Triton 1% (x100) 1 mL
Água mili-Q autoclavada q.s.p. 100 mL
Dissolver bem e armazenar em geladeira.
Solução de lise 2 para extração de DNA (lise de células brancas)
NaCl (0,075 M) 2,19 g
EDTA (0,02 M) (solução estoque pH 8,0) 20 mL
Água mili-Q q.s.p. 500 mL
Proteinase K (20 mg/mL)
Proteinase K 20 mg
Água mili-Q q.s.p. 1 mL
Conservar em freezer.
Clorofórmio/álcool isoamílico 24:1 (Preparar na hora do uso)
Clorofórmio 24 mL
Álcool isoamílico 1 mL
SDS 20%
SDS 20 g
Água mili-Q q.s.p. 100 mL
5.2. Detecção de variantes hemoglobínicas por reação em cadeia da polimerase (PCR)
5.2.1. PCR-RFLP para Hb S e C
Para confirmação das amostras com prováveis hemoglobinas S e C foram realizadas amplificações do DNA genômico utilizando os primers sense P277 (5’ GGC AGA GCC ATC TAT TGC TTA 3’) e anti-sense P278 (5’ ACC TTA GGG TTG CCC ATA AC 3’). A solução de amplificação continha 10µM deprimers, 1,25 mM de cada desoxinucleotídeo, 10 ng de DNA genômico, 2,0 mM MgCl2, 2,5 µl de tampão (10x) e 1U de Taq Polimerase em um volume final de 25µl. Os reagentes
foram submetidos a 94°C por 5 minutos para desnaturação inicial, seguidos de 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 10 minutos. O produto de amplificação (5µl), foi submetido à digestão por enzima DdeI para Hb S e BseRI para Hb C a temperatura de 37°C por 7 horas. A análise do produto da digestão foi realizada em géis de agarose-EDTA a 1,5% corados com brometo de etídio e visualizados em luz ultra-violeta (UV) e fotografados em sistema digitalizado (DigiDoc / Bio-Rad).
5.2.1 Identificação dos mutantes C282Y e H63D para o gene HFE por PCR-RFLP
Foram realizadas amplificações para o gene da hemocromatose hereditária utilizando os primers sense R63 (5’ ATC CCC AGC CTT GTT AAC TG 3’) e o
anti-sense L63 (5’ ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC 3’) para a mutação H63D e
os primers sense R282 (5’ CTC AGG CAC TCC TCT CAA CC 3’) e o anti-sense L282 (5’ GGG TAT TTC CTT CCT CCA ACC 3’) para a mutação C282Y. A solução de amplificação continha 18 µM de primers, 1,25 mM de cada desoxinucleotídeo, 10 ng de DNA genômico, 2,0 mM MgCl2, 2,5µl de tampão (1x) e 1U de Taq Polimerase em um volume final de 25µl. O mix de amplificação foi submetido a 94°C por 5 minutos para desnaturação inicial, seguidos de 30 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 10 minutos. A análise dos produtos amplificados foram realizados em géis de agarose a 1,5% em tampão TAE e corrida eletroforética a 80V por 12
minutos. A visualização foi feita com brometo de etídio em luz ultra-violeta (UV) em sistema DigiDoc/Bio-Rad.
Após a amplificação, os produtos foram submetidos à digestão enzimática com as enzimas BclI para a mutação H63D e RsaI para a mutação C282Y. As condições de digestão foram as seguintes para ambas enzimas: 12µl de H2O mili Q autoclavada, 2,1µl de tampão, 0,7µl (15-10 U/µl) de enzima e 5µl de DNA por 07 horas ouovernight. A temperatura de digestão para BclI foi de 50°C e para RsaI foi de 37°C. O produto de digestão (10µl) foi aplicado em gel de agarose a 3%. A corrente aplicada foi de 80V por 30’, com 1,0µl de brometo de etídio, 2µl de tampão TAE e 3,5µl de padrão eletroforético. A identificação dos alelos mutantes se deu segundo identificação dos fragmentos como ilustrados na figura 1.
6. Análises Estatísticas
Para avaliar as diferenças nas médias dentro e entre os grupos de estudo foi utilizado o Teste t de Student e, para comparação das frequências, foi realizado o teste de proporção (teste binomial). As análises estatísticas foram realizadas no programa BioEstat 2.0 com nível de significância de 5%.
PCR-RFLP para a mutação C282Y
Amplificado
Digestão com Rsa I a 37oC
Alelo Normal Alelo Mutante PCR-RFLP para a mutação H63D Amplificado Digestão com BCl I a 50oC Alelo Normal Alelo Mutante
Figura 1. Padrão de digestão enzimática para as mutações H63D e C282Y do gene para hemocromatose hereditária. 296 pb 29 pb 116 pb Não digere 441 pb 296 pb 145 pb 496 pb 358 pb 138 pb 496 pb
AVALIAÇÃO DE Hb A2 E Hb F EM
DOADORES DE SANGUE DE REGIÃO
MALARÍGENA DA AMAZÔNIA
ORIENTAL BRASILEIRA POR HPLC
HEMOGLOBINAS HUMANAS –
HIPÓTESE MALÁRIA OU EFEITO
MATERNO?
HEMOGLOBINAS HUMANAS – HIPÓTESE MALÁRIA OU EFEITO MATERNO?
HUMAN HEMOGLOBINS - MALARIA HYPOTHESIS OR MATERNAL EFFECT?
MSc. Felipe Rafael Torres – Biólogo, Mestre em Genética1
Prof. Dra. Claudia R. Bonini-Domingos – Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas1
1Laboratório de Hemoglobinas e Genética das Doenças Hematológicas – Departamento de Biologia – UNESP, São José do Rio Preto – SP.
Resumo
As hemoglobinopatias têm provido uma das poucas demonstrações convincentes da seleção, influenciando a freqüência de único gene na população humana. A alta taxa de desordens, tais como a anemia falciforme e a beta-talassemia, ocorridas em áreas subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da malária, levou Haldane a propor que a malária pode ser o agente seletivo responsável que balanceia a perda dos genes para a talassemia e a anemia falciforme, por morte prematura dos homozigotos a partir do aumento do valor adaptativo de heterozigotos no ambiente com malária. Mas uma nova proposta surgiu para explicar a manutenção deste polimorfismo, baseada na fertilidade diferencial ou efeito parental. Alguns autores observaram uma distorção favorecendo a transmissão de alelos mutantes em áreas não endêmicas de malária. Com base nestas observações, esses autores propuseram um efeito materno para
explicar tais distorções. Este estudo tem como objetivo apresentar uma revisão destes mecanismos envolvidos na manutenção do polimorfismo de hemoglobinopatias, desde seu modelo clássico até hipóteses alternativas que surgiram recentemente na literatura.
Palavras-chave: hemoglobinopatias; malária; polimorfismo genético; efeito materno.
Abstract
The hemoglobinopathies have been providing one of the few convincing demonstrations of the selection, influencing the frequency of only gene in the human population. The high rate of disorders, such as the sickle cell anemia and the beta-thalassemia, happened in areas subtropical or tropical inside of the belt of the malaria, it took Haldane to propose that the malaria can be the responsible selective agent that balances the loss of the genes for the thalassemia and the sickle cell anemia, for premature death of the homozygosity starting from the increase of the value the fitness heterozygosity in the areas with malaria. But a new proposal appeared to explain the maintenance of this polymorphisms, based on the differential fertility or parental effect. Some authors observed a distortion favoring the transmission of alelles mutants in areas no endemic of malaria. With base in these observations, those authors proposed a maternal effect to explain such distortions. This study has as objective presents a revision of these mechanisms involved in the maintenance of the polymorphisms of hemoglobinopathies, from classic model to alternative hypotheses that appeared recently in the literature.
Palavras-chave: hemoglobinopathies; malaria; genetic polymorphism; maternal effect.
Introdução
Cerca de 10% da população mundial é portadora assintomática de dois tipos importantes de anemia hereditária: doença falciforme e talassemias. Ambas apresentam distribuição geográfica bastante diversificada na África, Ásia, Europa e América, apesar de originalmente estarem confinadas nas regiões tropicais e subtropicais. Desde a década de 50 tem sido discutido que as altas prevalências dessas duas anemias hereditárias, assim como a causada pela deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, se deve à proteção seletiva de seus heterozigotos contra os efeitos letais das infecções causadas peloPlasmodium falciparum.1
As clássicas teorias de Haldane,1949 e Allison,1954 sobre a vantagem seletiva do heterozigoto são tradicionalmente aceitas, especialmente a do gene de anemia falciforme onde as áreas maláricas são endêmicas.
Uma similaridade entre a distribuição geográfica da β-talassemia e a incidência de malária em algumas áreas também tem sido demonstrada, entretanto, os mecanismos de proteção dos heterozigotos talassêmicos não são completamente compreendidos. 2
Apesar de décadas de estudos epidemiológicos e especulações, o modo de seleção que favorece o gene da hemoglobina S continua pouco conhecido. Lisa et al. (1994) 3 propôs que a fertilidade diferencial seria uma explicação para a manutenção do polimorfismo de hemoglobinopatias em algumas populações.
Malária: casuística e infecção
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a malária é a doença tropical e parasitária que mais causa problemas sociais e econômicos no mundo, sendo somente suplantada pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Também conhecida como paludismo, a malária é considerada problema de saúde pública em mais de 90 países, nos quais cerca de 2,4 bilhões de pessoas (40% da população mundial) convivem com os risco de contágio. Anualmente, sobretudo no Continente Africano, cerca de 500 a 300 milhões da população é infectada, e desta, cerca de um milhão morre em conseqüência da doença. No Brasil, principalmente na região amazônica, apesar do registro de 500 mil casos por ano, a letalidade da moléstia é baixa e não chega a 0,1% do número total de enfermos.4
A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e cada uma de suas espécies determina aspectos clínicos diferentes para a enfermidade, sendo três espécies os de maiores ocorrências: P. falciparum, P. vivax e P. malarie. O protozoário é transmitido ao homem pelo sangue, geralmente por mosquitos do gênero Anopheles ou, mais raramente, por outro meio que coloque o sangue de uma pessoa infectada em contato com o de uma sadia como por exemplo, o compartilhamento de seringas (consumidores de drogas), transfusão de sangue ou até mesmo de mãe para feto, na gravidez. Apesar do Plasmodium poder infectar animais como aves e répteis, o tipo humano não infecta outras espécies. Mesmo sem comprovação, há a suspeita de que certos tipos de malária possam ser transmitidos de macacos para humanos via mosquito. 5
Comumente, todas as espécies de Plasmodium atacam células do fígado e glóbulos vermelhos, que são destruídos ao serem utilizados para reprodução do protozoário. A destruição das hemácias pelo parasita da malária parece ser vital e maciça durante o desenvolvimento intraeritrocitário. Um eficiente caminho metabólico permite a degradação da hemoglobina em aminoácidos que serão utilizados como fonte de nutrientes pelo parasita. 6 O rompimento das células vermelhas pelos parasitas converte as hemoglobinas em metahemoglobinas (MetaHb). Ukoet al. (2003) 7 demonstraram que o nível de MetaHb encontrados em pacientes maláricos está relacionado com o grau de parasitemia, facilitando assim, o diagnóstico dos pacientes.
Ao inocular o homem, o Anopheles introduz em sua corrente sangüínea, por meio de sua saliva, uma forma ativa do Plasmodium denominada esporozoíta, que faz parte de uma de suas fases de vida. Uma vez no sangue, os esporozoítas rumam para o fígado, onde penetram as células hepáticas se multiplicando e dando origem à outra fase de vida chamada merozoíta. Uma parte dos merozoítas permanece no fígado e continua a se reproduzir em suas células, a outra cai novamente na corrente sangüínea e adentra as hemácias para seguir o processo reprodutivo. As hemácias parasitadas também são destruídas e originam ora outros merozoítas, ora gametócitos, células precursoras dos gametas do parasita, sendo tanto femininas quanto masculinas. 5
O mosquito Anopheles torna-se vetor da malária no momento em que ingere gametócitos de um indivíduo infectado. Dentro do mosquito, estes gametócitos tornam-se gametas e fecundam-se, originando o zigoto, que atravessa a parede do estômago do inseto e transforma-se em oocisto, tipo de célula-ovo. Após algum
tempo, o oocisto se rompe e libera novos esporozoítos que migram para as glândulas salivares do mosquito estando desta forma, prontos para infectar um novo indivíduo.
O mais agressivo dos parasitas é o P. falciparum, que se multiplica mais rapidamente e, conseqüentemente, invade e destrói mais hemácias que as outras espécies, causando um quadro de anemia mais imediato. Além disso, os glóbulos vermelhos parasitados pelo P. falciparum sofrem alterações em sua estrutura, o que os tornam mais adesivos entre si e às paredes dos vasos sangüíneos, causando pequenos coágulos que podem gerar problemas cardíacos como tromboses e embolias. Geralmente após a picada do mosquito transmissor, o P. falciparum permanece incubado no corpo do indivíduo infectado por 12 dias. A seguir, surge um quadro clínico variável, que inclui calafrios, febre alta (no início contínua e depois com freqüência de três em três dias), dores de cabeça e musculares, taquicardia, aumento do baço e, por vezes, delírios. No caso de infecção por P. falciparum, também existe uma chance em dez de se desenvolver o que se chama de malária cerebral, responsável por cerca de 80% dos casos letais da doença. Além dos sintomas correntes, aparece também ligeira rigidez na nuca, perturbações sensoriais, desorientação, sonolência, excitação, convulsões, vômitos e dores de cabeça, podendo o paciente chegar ao coma. Por vezes o quadro da malária cerebral lembra o da meningite ou do tétano, da epilepsia, do alcoolismo dentre outras enfermidades neurológicas. 8
Suscetibilidade e imunidade
A princípio, todo ser humano é suscetível à malária, mesmo aqueles que já a contraíram por diversas vezes, pois a imunidade induzida pela presença do parasita
nunca chega a conferir proteção total. Em situações em que o indivíduo já apresentou dezenas de episódios da doença, o que é bastante comum acontecer na África, poderá ser observado um abrandamento dos sintomas. Também há casos em que características individuais podem levar a uma resistência natural à doença, como por exemplo a ausência de antígeno Duffy nos glóbulos vermelhos, que os tornaria refratários à invasão pelo P. vivax; hemoglobinopatia (HbS) em que a invasão pelo P.
falciparum é bastante reduzida 9,10,11 e as enzimopatias, como a deficiência de
glicose-6-fosfato desidrogenasse,12 em que os parasitas não apresentariam um bom desenvolvimento no interior das hemácias. Nota-se que todas representam formas de proteção parcial, mas suficientes para evitar quadros mais graves da doença.
Hemoglobinopatias
A molécula da hemoglobina é uma proteína globular composta por quatro globinas associadas a grupos heme, complexo formado por um átomo de ferro em uma estrutura porfirinica. As subunidades da hemoglobina são codificadas por um pequeno grupo de genes (α e β) que são expressos seqüencialmente durante o desenvolvimento. Os genes do cluster α estão agrupados no braço curto do cromossomo 16, enquanto os genes do cluster βestão agrupados no braço curto do cromossomo 11.13
Nos estágios embrionários iniciais o tetrâmero de hemoglobina Gower 1 consiste de duas cadeias å (cluster β) e duas æ (cluster α). Aproximadamente no início da oitava semana de gestação as cadeias produzidas são gradualmente substituídas pela cadeiaα adulta e duas diferentes cadeias fetais, designadas Gã e Aã. As cadeias ã diferem somente na presença da glicina ou alanina na posição 136,
respectivamente. Durante o período de transição entre o estágio embrionário e fetal as hemoglobinas Hb Gower 2 (α2å2) e Hb Portland (æ2ã2) são detectadas. A Hb F
(α2ã2) torna-se a hemoglobina predominante ao longo do período fetal restante. Após
o nascimento, as cadeia ã gradualmente são substituídas pelas cadeiasβe ä. Por volta do sexto mês após o nascimento 97% - 98% da hemoblobina é formada pelo tetrâmero α2β2 (Hb A), enquanto Hb A2 (α2ä2) está presente em aproximadamente
2% a 3%. Pequenas quantidades de Hb F são também encontradas no sangue adulto.14
Entre as mutações associadas às globinas estruturais anormais, a maioria se dá pelo resultado de substituições de um único par de bases, sendo que grande parte destas mutações é expressas pela síntese anormal de cadeias globínicas dada pela substituição de um dos seus aminoácidos. As variantes estruturais são divididas em três classes, de acordo com o fenótipo clínico: variantes que causam anemia hemolítica, por exemplo a hemoglobina falcêmica (Hb S) e hemoglobina C (Hb C), variantes com transporte de oxigênio alterado, tal como a metemoglobina (Hb M), e as hemoglobinas variantes com fenótipos de talassemia, como por exemplo a hemoglobina E (Hb E).
Nas talassemias ocorre a redução da síntese de uma ou mais cadeias de globina, desequilibrando as quantidades relativas destas. A mutação reduz o nível de síntese da cadeiaαeβ, e esta redução produz uma distorção da proporção de cadeia. A cadeia, que é produzida na taxa normal, está em excesso dada a ausência de uma cadeia complementar com a qual possa formar um tetrâmero. As cadeias normais em excesso precipitam-se na célula, lesando a membrana e provocando destruição prematura da hemácia.15
Até 1998, 750 variantes de hemoglobinas estruturais tinham sido identificadas, sendo mais de 75% delas dadas por uma única substituição de aminoácido na cadeia da α ou β globina, representando cerca de 20% das 2.600 mudanças teóricas que poderiam ocorrer nos genes das globinas. Algumas variantes estruturais das hemoglobinas são prejudiciais, uma vez que a substituição do aminoácido altera a função ou a estabilidade da molécula de hemoglobina, resultando em um quadro clínico bem definido. As variantes de hemoglobinas mais freqüentemente observadas nas populações brasileiras são Hb S, Hb C e Hb D.16
A hemoglobina S é formada pela substituição de um aminoácido na cadeia beta, na posição seis, onde o glutamato (GAG) é substituído pela valina (GTG). Em homozigose ambos os genes codificam as cadeias betas S, e neste caso, Hb A não está presente em decorrência da falta do alelo normal para cadeias beta. O portador apresenta sintomas clínicos evidentes. Os heterozigotos para Hb S têm um único alelo alterado, o outro gene da cadeia beta codifica uma cadeia beta A normal, resultando no traço falciforme, geralmente assintomático.17,18
A anemia falciforme é caracterizada por uma notável variabilidade entre os indivíduos afetados. Fatores que modificam a concentração intraeritrocitária da hemogoblina S podem influenciar a expressão clínica da doença assim como a quantidade e composição da hemoglobina F e sua associação com outras variantes estruturais ou talassemias do tipoαeβ, além de fatores ambientais.19,20
Estudos antropológicos associados às análises bio-moleculares sugerem que o alelo anormal, para a síntese da globina S, tenha surgido entre os períodos Paleolítico
e Mesolítico, aproximadamente há 50 ou 100 mil anos na região centro-oeste da África, Índia e leste da Ásia.1
Por meio de seis diferentes enzimas de restrição (Hinc I, Hinc III, Xnm I, Hinf I, Hpa I e Bam HI) foi possível identificar cinco haplótipos para o gene ·s denominado conforme a origem geográfica: Asiático (ou Indiano-Asiático), Senegal, Benin, Banto e Camarões. Tal prevalência geográfica dos genesβsassociados com os haplótipos específicos tem sugerido origens independentes das mutações βs nestas regiões.21 A maioria dos cromossomos com o gene βs tem um dos cinco haplótipos comuns, mas em alguns pacientes (5% - 10%) podem ser encontrados haplótipos menos comuns usualmente denominados como haplótipos atípicos. Estes haplótipos são provavelmente gerados por uma variedade de mecanismos genéticos como mutações em ponto nos sítios de restrições, simples ou duplas trocas entre dois típicos haplótipos βs ou mais freqüentemente entre um típico haplótipo βs e um diferente haplótipo βA associado que está presente na população e conversões gênicas.21
Atualmente, a presença dos genes βs em diferentes partes do Continente Americano e Europeu são originários da África, e a proporção de haplótipos associados está relacionada com as várias migrações de populações africanas para estes continentes. O polimorfismo associado ao gene βs tem comportamentos notavelmente diferentes na expressão clínica da anemia falciforme, bem como nas variações de respostas às drogas.20
