Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
(CIPHARMA)
Análise da expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV nas
lesões intraepiteliais cervicais
Bruna Caroline Vieira Pitol
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
(CIPHARMA)
Análise da expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV nas
lesões intraepiteliais cervicais
Bruna Caroline Vieira Pitol
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, para obtenção do Grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Angélica Alves Lima Co-orientadora: Profa. Dra. Cláudia M.Carneiro
Dedico este trabalho...
À Deus e ao meu anjo da guarda, por não me deixarem desistir do meu caminho.
Aos meus pais, Fioravante e Alzeni, pela luta e esforços diários em busca da minha formação. Aos meus irmãos Sandra e Dudu, pelas palavras de incentivo. À Deni, pelo carinho durante tantos anos.
Ao meu irmão Marcus, por ser tão especial! Obrigada por sempre estar ao meu lado. Você é e sempre será meu maior exemplo.
À Profa. Dra. Angélica Alves Lima, minha orientadora, por todo o aprendizado e oportunidades proporcionadas durante todos estes anos. Por tornar possível a conclusão deste projeto e contribuir para minha formação profissional. Por ser um exemplo de professora que possui ética e respeito pelos seus alunos. E também pela amizade e delicadeza sempre presentes. Minha eterna gratidão!
À Profa. Dra. Cláudia Martins Carneiro, minha co-orientadora, por ser imprescindível para a realização deste projeto. Por todo o aprendizado repassado ao longo destes anos e pela disponibilidade e paciência em me ajudar em tantos momentos. Muito obrigada!
Ao Laboratório Tafuri, em especial ao Dr. Alexandre Tafuri, pela colaboração e disponibilidade na realização deste projeto.
À Profa. Dra. Ilka Afonso Reis, pela colaboração e por ser fundamental na conclusão das análises estatísticas.
Aos professores, funcionários e alunos do LIMP (Laboratório de Imunopatologia) e LPC (Laboratório de Pesquisa Clínica), por toda a ajuda na execução deste projeto. Obrigada por me receberem e colaborarem em diversos momentos. Em especial à Carol e Paula, pelo auxílio nos momentos em que precisei.
À equipe da Profa. Dra. Angélica A. Lima, alunas: Bárbara, Lenita, Priscila, Paula e em especial à Pri e Nayara (companheiras de tantos momentos), por toda a ajuda prestada para a realização deste trabalho. Muito obrigada pela amizade sempre presente!
Ao Prof. Roney Luiz de Carvalho Nicolato, exemplo de profissional farmacêutico. Obrigada pelo carinho, ensinamentos e por manter as portas do LAPAC sempre abertas.
Aos Profs. Dr.Luiz Fernando de Medeiros Teixeira e Dr.Laser Antônio Machado Oliveira, pelas sugestões na banca de qualificação.
Às amigas Dani e Ana, pelos bons momentos e apoio diários. Sem vocês o caminho teria sido mais árduo. Obrigada por dividirem comigo tantas experiências nesta casa.
À Rep. Caixotinho, meu refúgio. Obrigada por sempre fazer parte das minhas melhores lembranças. Atuais moradoras pelos bons momentos e pela ajuda nestes dois anos. Em especial à KT, por ter cuidado tanto de mim em tempos difíceis!
Às amigas Débora, Luana, Priscilla, Caru, Jamily, Mari e KT! Irmãs para a vida toda. Obrigada pelas inúmeras palavras de apoio, pela presença constante e por torcerem tanto pelo meu sucesso. Amo muito vocês!
Aos amigos Rodrigo, Giani e Dani, por serem os sobreviventes da Farmácia 04/2 em OP! Rodrigo, obrigada por tudo ao longo destes anos. Jamais te deixarei!
Aos amigos da turma de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela convivência e momentos compartilhados.
Aos verdadeiros amigos de Ouro Preto, GV e Divino das Laranjeiras, pelo companheirismo.
Aos professores e funcionários do programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas-Cipharma, pela oportunidade.
À FAPEMIG, CAPES e CNPq pelo financiamento e apoio na realização deste trabalho.
Às pacientes, que concordaram em participar deste projeto, permitindo que o material biológico fosse utilizado nesta tese.
“Ser feliz é encontrar força no perdão, esperanças nas batalhas,
segurança no palco do medo, amor nos desencontros. É agradecer a Deus
a cada minuto pelo milagre da vida.”
i
1) Introdução... 1
2) Objetivos ... 4
2.1) Objetivo Geral ... 5
2.2) Objetivos Específicos ... 5
3) Revisão da literatura ... 6
3.1) Papilomavírus Humano (HPV) ... 7
3.1.1) Estrutura e organização do genoma viral ... 7
3.1.2) Classificação dos Papilomavírus... 8
3.2) Desenvolvimento do câncer cervical ... 10
3.2.1) Transmissão viral ... 11
3.2.2) Infecção pelo HPV ... 12
3.2.3) Remissão ou persistência da infecção por HPV e/ou das lesões precursoras 15 3.2.3.1) Remissão ... 15
3.2.3.2) Persistência ... 15
3.2.4) Progressão de um clone de células infectadas para pré-câncer e invasão ... 16
3.2.4.1) Ciclo celular ... 16
3.2.4.2) Mecanismo carcinogênico ... 18
3.3) Diagnóstico das lesões intraepiteliais cervicais e do HPV ... 20
3.3.1) Citologia ... 21
3.3.2) Colposcopia... 23
3.3.3) Histologia ... 23
3.3.4) Técnicas moleculares para detecção do DNA do HPV ... 24
3.4) Biomarcadores e o diagnóstico do câncer cervical ... 25
ii
3.4.2) Proteína p16 ... 27
3.4.3) Teste para análise dos biomarcadores ... 28
3.5) Tratamento ... 29
4) Metodologia ... 31
4.1) Amostragem ... 32
4.2) Imuno-histoquímica ... 32
4.2.1) Preparação das lâminas ... 33
4.2.2) Desparafinização ... 33
4.2.3) Recuperação antigênica ... 33
4.2.4) Bloqueio da atividade da peroxidase endógena ... 33
4.2.5) Anticorpo primário... 34
4.2.6) Anticorpo secundário ... 34
4.2.7) Revelação ... 35
4.2.8) Contra-coloração e montagem das lâminas ... 35
4.3) Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE) ... 36
4.4) Fotodocumentação e análise da marcação imuno-histoquímica ... 36
4.5) Análise estatística ... 37
5) Resultados ... 40
5.1) Caracterização da amostra selecionada, revisão e reclassificação dos laudos anatomopatológicos ... 41
5.2) Padronização ... 42
5.3) Análise da expressão das proteínas de ciclo celular ... 46
5.3.1) Proteína p16 ... 46
5.3.2) Proteína p53 ... 51
5.4) Análise do Papilomavírus Humano (HPV) ... 53
iii
5.6) Análise da eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas
p16, p53 e L1/HPV ... 60
5.7) Comparação dos métodos de análise imuno-histoquímica: quantitativo x qualitativo (parâmetro distribuição) ... 65
6) Discussão ... 67
6.1) Proteínas do ciclo celular: p16 e p53 ... 68
6.2) Análise do HPV ... 70
6.3) Proteínas do ciclo celular e HPV ... 72
6.4) Eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas p16, p53 e L1/HPV ... 73
6.5) Análise imuno-histoquímica ... 74
7) Conclusão ... 79
8) Referências ... 81
9) Anexos ... 102
iv
Figura 1: Organização estrutural do genoma do HPV, destacando a localização e
algumas funções da região reguladora LCR e das ORFs E e L. ... 9
Figura 2: Etapas da carcinogênese cervical.... 11
Figura 3: Epitélio cervical. ... 13
Figura 4:Complexos ciclinas-CDKs nas fases do ciclo celular. ... 17
Figura 5:Mecanismos de controle do ciclo celular ... 20
Figura 6: Parâmetros considerados na análise qualitativa .. Erro! Indicador não definido. Figura 7: Diluições testadas para o anticorpo anti-p16 ... Erro! Indicador não definido. Figura 8: Diluições testadas para o anticorpo anti-p53 ... Erro! Indicador não definido. Figura 9: Diluições testadas para o anticorpo anti-L1/HPV ... 45
v
Tabela 1: Sistemas de classificação das lesões cervicais. ... 21
Tabela 2: Anticorpos primários e condições utilizadas na imuno-histoquímica. ... 35
Tabela 3: Diagnóstico das amostras extraído dos laudos do Laboratório Tafuri. ... 41
Tabela 4:Expressão da proteína p16 de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 46
Tabela 5: Análise do padrão de imunorreatividade da p16 em relação ao parâmetro distribuição de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 47
Tabela 6: Análise do padrão de imunorreatividade da p16 em relação ao parâmetro intensidade de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 48
Tabela 7: Análise do padrão de imunorreatividade da p16 em relação ao parâmetro topografia de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 49
Tabela 8:Expressão da proteína p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 51
Tabela 9:Expressão da proteína L1/HPV de acordo com o diagnóstico histopatológico.
... 54
Tabela 10: Análise do padrão de imunorreatividade da L1/HPV em relação ao
parâmetro distribuição de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 54
Tabela 11: Análise do padrão de imunorreatividade da L1/HPV em relação ao
parâmetro intensidade de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 55
Tabela 12: Análise do padrão de imunorreatividade da L1/HPV em relação ao
parâmetro topografia de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 56
Tabela 13: Análise da expressão da L1/HPV e p16, pelo método quantitativo, de acordo com diagnóstico histopatológico. ... 59
Tabela 14: Análise da expressão da L1/HPV e p16, pelo método qualitativo (parâmetro distribuição), de acordo com diagnóstico histopatológico. ... 59
Tabela 15:Análise da eficiência diagnóstica das proteínas p16 e L1/HPV, isoladas ou
em associação, considerando os resultados do método quantitativo. ... 63
Tabela 16:Análise da eficiência diagnóstica das proteínas p16 e L1/HPV, isoladas ou
em associação, considerando os resultados do parâmetro distribuição do método qualitativo. ... 63
Tabela 17: Análise da concordância entre os métodos quantitativo e qualitativo na avaliação da expressão da p16. ... 66
Tabela 18: Análise da concordância entre os métodos quantitativo e qualitativo na avaliação da expressão da p53. ... 66
vi
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ACOG: American College of Obstetricians and Gynecologists (Sociedade Americana
de Obstretas e Ginecologistas)
ACS: American Cancer Society (Sociedade Americana do Câncer)
ASCUS: Células Escamosas Atípicas de Significado Indeterminado
CDK:Cyclin Dependent Kinase (Quinase Dependente de Ciclina)
CDKI:Inhibitor of Cyclin Dependent Kinase (Inibidor de Quinase Dependente de Ciclina)
E:Early (Precoce)
E2F: Fator de transcrição
FDA:Food and Drug Administration (Agência Reguladora dos EUA de Alimentos e Medicamentos)
HPV: Human Papillomavirus (Papilomavírus Humano)
HSIL:High Grade Squamous Intraepithelial Lesion (Lesão Intraepitelial Escamosa de Alto Grau)
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IHQ: Imuno-histoquímica
JEC: Junção Escamo-Colunar
L:Late (Tardia)
LCR:Long Control Region (Região Reguladora)
LSIL:Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion (Lesão Intraepitelial Escamosa de Baixo Grau)
NIC: Neoplasia Intraepitelial Cervical
NIC I: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau I
NIC II: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau II
NIC III: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau III
ORF:Open Reading Frame (Região de Leitura Aberta)
pb: pares de bases
PCR:Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
PV: Papilomavírus
vii
SUS: Sistema Único de Saúde
VLP: Vírus Like Particle (Partículas Semelhantes ao Vírus)
viii
O câncer cervical é o terceiro tipo de tumor mais frequente na população feminina mundial. A associação entre o Papilomavírus Humano (HPV) e as lesões pré-neoplásicas e pré-neoplásicas do colo uterino está bem estabelecida. As oncoproteínas virais E6 e E7 interferem nos mecanismos de controle do ciclo celular da célula hospedeira e a investigação de proteínas regulatórias deste ciclo pode apontar algum biomarcador, que auxiliaria na definição da gravidade da neoplasia intraepitelial cervical. Objetivo:
Analisar a expressão das proteínas do ciclo celular p16 e p53 e da L1 do vírus HPV (L1/HPV) em cervicites, neoplasias intraepiteliais cervicais e carcinomas e discutir a possível utilização como biomarcadores da gravidade destas lesões. Metodologia: Um total de 150 amostras de biópsias obtidas dos arquivos do Laboratório Tafuri, Belo Horizonte, MG, no período de 2006 a 2011, distribuídas de acordo com o diagnóstico histopatológico em LB, NIC I, NIC II, NIC III e CEI, foram submetidas ao procedimento de imuno-histoquímica para avaliar as proteínas p16, p53 e L1/HPV. Foram considerados dois métodos de análise da imuno-histoquímica: quantitativo e qualitativo (distribuição, intensidade e topografia). Resultados: A expressão da proteína p16 aumentou significativamente com a gravidade da lesão, independente do critério de análise, quantitativo (p=0,000) ou qualitativo (p=0,000), sendo que a quantificação permitiu diferenciar alguns graus de lesão. Associação estatisticamente significativa foi verificada também em relação aos parâmetros intensidade (p=0,000) e topografia (p=0,001). A expressão da proteína p53 não variou com a gravidade das lesões, seja pelo método quantitativo ou qualitativo. A proteína L1/HPV foi menos expressa nas lesões mais graves e associação significativa foi verificada entre o padrão de expressão da L1/HPV e o diagnóstico histopatológico tanto na análise quantitativa (p=0,000) quanto na qualitativa (p=0,006). A eficiência diagnóstica do teste da p16 e L1/p16 foi maior em relação à L1 isolada. Não foi observada melhoria no diagnóstico quando o teste da p16 foi associado à análise da L1/ HPV por imuno-histoquímica. A concordância entre os métodos de análise quantitativa e qualitativa não foi muito elevada, sendo maior na avaliação da p16 (k=0,617) e menor em L1/HPV(k=0,172).
Conclusão: A proteína p16 parece promissora como biomarcador no prognóstico da
ix
2
O câncer cervical ou do colo do útero é o terceiro tipo de tumor mais frequente entre as mulheres, com aproximadamente 529 mil novos casos e uma média de 275 mil óbitos por ano em todo o mundo. Sua incidência é cerca de duas vezes maior em países em desenvolvimento quando comparada aos mais desenvolvidos (INCA, 2011).
A infecção por HPV é reconhecida mundialmente como a causa principal do câncer cervical (zur Hausen, 1974; zur Hausen, 1976; zur Hausen, 1977; zur Hausen, 2009). O mecanismo carcinogênico exercido pelo vírus está relacionado com a atuação das oncoproteínas virais E6 e E7 sobre os mecanismos de controle do ciclo celular, desregulando os processos celulares de proliferação (Boulet et al., 2007; Moody & Laimins, 2010).
Atualmente, a realização do exame de Papanicolaou ou preventivo é a estratégia primária utilizada na prevenção do câncer cervical (WHO, 2010). A eficácia da detecção precoce de anormalidades citológicas através deste exame é responsável pela redução na incidência do câncer, bem como na taxa de mortalidade (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010). No entanto, o diagnóstico preciso do tipo de lesão existente só ocorre a partir do exame anatomopatológico
(Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
Um problema vigente, no que se refere ao diagnóstico histopatológicos, é a baixa reprodutibilidade intra e inter-observadores. Isto ocorre porque os critérios de classificação adotados são muito subjetivos. O diagnóstico diferencial entre as lesões de baixo grau (Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I – NIC I) e as de alto grau (Neoplasia Intraepitelial Cervical graus II e III – NIC II e III) é muito variável entre os patologistas, principalmente na transição de NIC I para NIC II. A conduta clínica das pacientes depende da graduação das lesões, uma vez que as de baixo e alto graus são tratadas de formas diferentes (Martin & O'leary, 2011).
3
Neste contexto, a identificação de biomarcadores que possam fornecer informações sobre a progressão ou regressão das lesões e, portanto, melhorar o prognóstico e diagnóstico, pode representar significativo avanço nos programas de rastreamento e prevenção do câncer cervical (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010). A busca por novos marcadores e pelo entendimento da correlação entre os já existentes vêm sendo objeto de muitas pesquisas atualmente.
Um marcador eficiente deve ser (a) sensível, para não subdiagnosticar os casos que necessitam de tratamento e (b) preciso, para identificar apenas os casos realmente positivos. O ideal é que o biomarcador esteja especificamente associado à evolução da doença, apresentando capacidade de discriminar lesões de baixo e alto graus com risco de progredir daquelas com maior chance de regredir espontaneamente (Wentzensen & von Knebel Doeberitz, 2007).
No caso do câncer cervical, considerando que o HPV interfere nos mecanismos de controle do ciclo celular da célula hospedeira, a investigação de proteínas regulatórias deste ciclo pode apontar algum biomarcador na identificação de lesões cervicais com risco real de evolução para carcinoma (Tsuda et al., 2003; Wang et al., 2004).
Atualmente, as proteínas regulatórias do ciclo celular, como a p53, ciclina D1, ciclina E, CDK4 e inibidores de ciclinas (p21, p27, p16) vem sendo amplamente estudadas (Ghobashy et al., 2004; Bahnassy et al., 2006, Pinto et al., 2012). A expressão das proteínas de supressão tumoral, como a p16 e p14, em células epiteliais do colo do útero, tem sido relacionada com lesões de alto grau (Wang et al., 2005; Bulten et al., 2006). Já a relação da expressão da p53 com as lesões pré-neoplásicas e neoplásicas da cérvice não está bem estabelecida (Herbsleb, 2001; Turkcuoglu et al., 2007). Além disso, há um grande interesse na inclusão de testes para análise do DNA do HPV nos programas de triagem diagnóstica do câncer cervical (Agoff et al., 2003; Godoy et al., 2008; Gatta et al., 2011; Martin & O'leary, 2011). Uma opção mais recente de avaliação viral é a análise da expressão das proteínas L1 e E6/E7 do HPV (Yoshida et al., 2008; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010; Frega et al., 2011).
5 2.1) Objetivo Geral
Analisar a expressão das proteínas do ciclo celular p16 e p53 e da L1 do vírus HPV (L1/HPV) em cervicites, neoplasias intraepiteliais cervicais e carcinomas e discutir a possível utilização como biomarcadores da gravidade destas lesões.
2.2) Objetivos Específicos
- Correlacionar o padrão de expressão da p16 e p53 com o da L1/HPV e avaliar estas proteínas, isoladamente ou associadas, como possíveis biomarcadores da gravidade da neoplasia intraepitelial cervical;
- Comparar dois métodos de análise da imuno-histoquímica das proteínas p16, p53 e L1/HPV: quantitativo e qualitativo (parâmetro distribuição);
7
O entendimento da etiologia do câncer cervical foi um grande desafio para os pesquisadores (zur Hausen, 2009). Inicialmente, atribuíram a ocorrência da neoplasia ao vírus Herpes Simples tipo 2 (Rawls et al., 1968; Naib et al., 1969; Nahmias et al., 1970). Entre 1974 e 1976, zur Hausen e colaboradores mostraram a importância do Papilomavírus Humano (HPV) na gênese e evolução do tumor cervical (zur Hausen et al., 1974; zur Hausen et al., 1976; zur Hausen et al., 1977). Posteriormente, Meisels e Fortin observaram que os tipos celulares, denominados coilócitos, encontrados em esfregaços cervicais de pacientes com displasias leves, seriam indicativos de alteração celular provocada pelo HPV (Meisels & Fortin, 1976; Meisels et al., 1977). Em 1982, surgiram os primeiros trabalhos relatando o isolamento de tipos de HPV em amostras cervicais (Gissmann et al., 1982 a,b; Zachow et al., 1982; Green et al., 1982). O primeiro estudo epidemiológico sobre HPV e câncer cervical foi publicado em 1987 (de Villiers, 1987).
A partir de então, muitos projetos vêm sendo conduzidos em todo o mundo para avaliar, principalmente: (a) a interação do vírus com a gênese do câncer, (b) os mecanismos envolvidos na infecção viral e no desenvolvimento de lesões, bem como remissão ou progressão destes eventos, (c) a prevalência da infecção por HPV, (d) os fatores associados ao vírus e importantes na carcinogênese, (e) diferentes métodos de detecção do HPV, (f) testes para melhoria da sensibilidade e especificidades no prognóstico e diagnóstico do câncer cervical e (g) vacinas profiláticas e terapêuticas ou outros tipos de tratamento. Além disso, atualmente muito se discute a respeito do papel do HPV em neoplasias anogenitais, da orofaringe e da pele (Campo, 2003; Forslund, 2007; Giuliano et al., 2008; zur Hausen, 2009; Munday et al., 2010; Marklund et al., 2011).
3.1) Papilomavírus Humano (HPV)
3.1.1) Estrutura e organização do genoma viral
8
específicos de PVs, associadas a determinados fatores de risco, podem evoluir para um tumor maligno (Matsukura & Sugase, 2001; zur Hausen, 2002; Clifford et al., 2003; Muñoz et al., 2003).
O Papilomavírus Humano (HPV) é um vírus não envelopado, com simetria icosaédrica, cujo genoma consiste em dupla fita de DNA circular, com aproximadamente 8000 pares de bases, envolvido em uma capa protéica, o capsídeo viral, com 72 capsômeros e diâmetro aproximado de 54nm (de Villiers et al., 2004).
O genoma do HPV é dividido em 8 regiões abertas de leitura (Open Reading Frames, ORF) e uma região de controle (Long Control Region, LCR). Os genes são denominados E (early) ou L (late), de acordo com a sua expressão, mais precoce (E) ou mais tardia (L), nos estágios de diferenciação do epitélio do hospedeiro (Figura 1). Inicialmente, são expressos E1, E2, E5, E6 e E7. A expressão de E4 ocorre durante todo o processo. Posteriormente, nos estágios finais da diferenciação, são expressos os genes estruturais, L1 e L2 (Schiffman et al., 2007; Steben & Duarte-Franco, 2007). Os genes contidos nas ORFs expressam proteínas específicas, com funções distintas (Figura 1). As ORFs E1 e E2 codificam proteínas envolvidas na regulação da replicação do DNA viral; sendo que E2 também está envolvida na transcrição do DNA viral. A proteína E4 contribui diretamente para a liberação de novos vírus na superfície epitelial, pois desestabiliza as redes de citoqueratina das células. As proteínas codificadas pelas ORFs E5, E6 e E7 são oncoproteínas responsáveis pela transformação celular acarretada pela infecção viral. Os genes L1 e L2 codificam as proteínas capsídicas, principal e secundária, respectivamente (Doorbar, 1996; Hamid et al., 2009; D'abramo & Archambault, 2011).
A LCR é responsável por regular a expressão e transcrição dos genes virais. Esta região também contém sítios de ligação para as proteínas virais E1 e E2 e numerosos sítios de ligação para fatores de transcrição celular (Butz et al., 1993; Kurvinen et al., 2000; Stoler, 2003; Howley et al., 2006).
3.1.2) Classificação dos Papilomavírus
9
Figura 1: Organização estrutural do genoma do HPV, destacando a localização e algumas funções da região reguladora LCR e das ORFs E e L. Fonte: D’Abramo & Archambault, 2011, modificado.
Um PV é reconhecido como novo tipo viral se ele tiver seu genoma clonado e a sequência de DNA da ORF L1 diferir em mais de 10% de um tipo viral já conhecido. Diferentes gêneros de PVs compartilham menos de 60% de similaridade da sequência da região L1. Diferentes espécies, contidas no mesmo gênero, compartilham entre 60 e 70%. Diferenças entre 2 e 10% da sequência da ORF L1 identificam um novo subtipo viral e divergências abaixo de 2% identificam uma nova variante (de Villiers et al., 2004; de Villiers & Gunst, 2009).
Até 2010 foram descritos 29 gêneros da família Papillomaviridae, que abrigam 189 tipos de PVs, dentre os quais 120 foram isolados de humanos, 64 de mamíferos não humanos, 3 de aves e 2 de reptéis (Bernard et al., 2010).
10
Os HPVs considerados de baixo risco oncogênico, como os tipos 6 e 11, são responsáveis pelas lesões benignas que atingem a região anogenital, como as verrugas genitais (condilomas) e uma porcentagem das lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), que geralmente possuem tendência à regressão (Greer et al., 1995; Koutsky, 1997; Ho et al., 1998). Os HPVs de alto risco oncogênico mais prevalentes são os tipos 16 e 18. Estes são responsáveis por causar 41-67% das lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL), 16-32% das lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL) e 6-27% das células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US) (Clifford et al., 2006). Estima-se que 70% das neoplasias cervicais sejam causadas pelos tipos 16 e 18 e em 99,7% dos cânceres de colo de útero encontra-se algum tipo viral (Koutsky, 1997; Walboomers et al., 1999).
Existem tipos de HPV considerados de risco indeterminado, dependendo da sua relação com a ocorrência do câncer cervical (Bernard et al., 2010).
3.2) Desenvolvimento do câncer cervical
As neoplasias cervicais surgem via uma série de passos: (1) transmissão do HPV, (2) infecção viral, (3) remissão ou persistência da infecção, (4) progressão de um clone de células infectadas para pré-câncer e invasão (Schiffman et al., 2007).
11
Figura 2: Etapas da carcinogênese cervical. Imagens de: esfregaço cervical coletado em exame citológico (A); biópsias de colo uterino obtidas em exame anatomopatológico (B); colo do útero provenientes de colposcopia. Modelo esquemático dos principais passos no desenvolvimento do câncer cervical (D). O losango verde representa a transmissão do HPV. Fonte: Schiffman et al.,
2007, adaptado.
3.2.1) Transmissão viral
A transmissão do HPV ocorre através do contato direto com o tecido epitelial (Burchell et al., 2006; Roberts et al., 2007), sendo a relação sexual com um parceiro infectado a via de infecção mais comum (Gavillon et al., 2010). A probabilidade de adquirir HPV através de um único contato entre pessoas com lesões genitais está em torno de 60 a 80% (Oriel, 1971; Barrasso et al., 1987; Boon et al., 1988; Tortolero-Luna, 1999; Muller & Bauch, 2010).
Embora as relações sexuais com penetração sejam importantes na transmissão, admite-se que a aquisição do HPV possa ocorrer, também, de outras formas, como: contatos sexuais sem penetração, fômites (toalha, roupas íntimas), auto-inoculação ou perinatal (Marrazo et al., 2001; Schiffman & Kjaer., 2003; Winer et al., 2003). Independente da forma de contágio, a entrada do vírus nas células epiteliais ocorrerá
A
B
C
12
através de microlesões que promovem a perda da integridade da pele ou da mucosa (Frazer, 2004).
Estudos sugerem que heparan sulfato proporciona a fixação inicial do HPV no tecido epitelial (Longworth & Laimins, 2004). O vírus entra na célula por endocitose mediada por clatrina ou caveolina (Bousarghin et al., 2003; Day et al., 2003). Uma outra via endocítica, sinalizada por tirosina quinase, que transporta o vírus ao endossomo tardio/lisossomo também foi descrita (Nicol et al., 2010).
3.2.2) Infecção pelo HPV
Nas mulheres, a infecção pelo HPV é de grande interesse e constitui objeto da maioria dos estudos sobre esse vírus, devido a sua associação com o câncer cervical. O HPV infecta também as células epiteliais da região genital masculina, e aproximadamente 40-48% dos tumores de pênis são atribuídos à infecção pelo papilomavírus (Chaux & Cubilla, 2012).
No sexo feminino, o HPV infecta o epitélio escamoso estratificado da região denominada junção escamo-colunar (JEC) e o seu ciclo de vida está diretamente ligado à diferenciação das células epiteliais (Bodily & Laimins, 2011).
A JEC (Figura 3A) consiste na região de encontro entre o epitélio escamoso estratificado (ectocérvice) e o epitélio escamoso colunar (endocérvice) (Schiffman et al., 2007) (Figura 3A).
A localização da JEC é variável, uma vez que ela pode encontrar-se ao nível do orifício externo do canal endocervical (recém-nascidas) ou mover-se para fora do mesmo (menarca). Essa dinâmica depende da influência de alguns fatores como idade, hormônios e período do ciclo menstrual (Crum, 2005).
13
DNA, utilizando as proteínas virais E1 e E2, primeiras a serem expressas, e a maquinaria de replicação da célula hospedeira. Nesta fase, o genoma viral encontra-se como um plasmídio extra-cromossômico (epissomo), separado do DNA celular. Posteriormente poderá haver a expressão das proteínas virais E6 e E7, que atuam nos reguladores do ciclo celular, promovendo uma desregulação e um atraso na diferenciação do epitélio. Este atraso permite a replicação do DNA epissomal viral nas células epiteliais supra-basais, coordenadamente a replicação dos cromossomos da célula hospedeira e o genoma do vírus é distribuído para as células filhas. Finalmente, quando a diferenciação das células epiteliais para queratinócitos maduros ocorre, as proteínas estruturais do HPV, L1 e L2, são expressas no núcleo da célula. A montagem dos vírus maduros é iniciada e eles são liberados, tornando-se aptos a infectarem novas células (Jeon & Lambert, 1995; Frazer, 2004; Bodily & Laimins, 2011).
Figura 3: Epitélio cervical. A) Colo uterino, evidenciando a localização do epitélio da endocérvice e da ectocérvice; B) Ampliação do epitélio escamoso estratificado da ectocérvice, epitélio colunar da endocérvice e da zona de transformação. Os núcleos das células estão coloridos para indicar a expressão das proteínas virais na diferenciação do epitélio. O losango verde representa o HPV. Fonte: Bodily & Laimins, 2011, modificado.
14
A infecção por HPVs de alto risco resulta na integração do DNA epissomal ao genoma da célula hospedeira. Esta integração promove a ruptura do gene viral E2, causando a superexpressão dos genes E6 e E7, devido à perda da repressão da transcrição mediada por E2. Por outro lado, nas infecções por HPVs de baixo risco, que levam à formação de lesões benignas (verrugas), não ocorre integração do DNA viral ao genoma do hospedeiro (Frazer, 2004).
Ainda não é claro porquê somente em alguns casos ocorre a integração viral, sendo esta uma das condições necessárias para transformação maligna das células epiteliais (Southern & Herrington, 1998; Ferenczy & Franco, 2002).
Em resumo, o ciclo da infecção pelo HPV divide-se em: (a) fase “produtiva”, que consiste no estabelecimento da infecção viral, através da replicação do DNA e expressão das proteínas virais e/ou (b) fase de “transformação”, característica de HPVs de alto risco, onde ocorre a integração do DNA viral ao da célula hospedeira (Doorbar, 2005; Schiffman et al., 2007).
A infecção pelo HPV pode manifestar-se de três formas: clínica, latente ou persistente.
A forma clínica é visível a olho nu e consiste em lesões benignas, as verrugas genitais (condilomas), formadas a partir da proliferação das células do epitélio escamoso, local onde ocorre a replicação do DNA do HPV (Stoler, 2003).
Na forma latente, o HPV só pode ser diagnosticado através da pesquisa do DNA viral, uma vez que o indivíduo não apresenta nenhuma manifestação clínica e possui citologia/histologia normais. Nesse caso, o DNA viral não se encontra integrado ao genoma da célula hospedeira e sua replicação ocorre em níveis muito baixos (Stoler, 2003). Não se sabe quanto tempo o vírus pode permanecer no estado de latência (Schiffman & Kjaer, 2003). A emergência do estado latente explicaria o surgimento de picos secundários de infecção em mulheres mais velhas (pós-menopausa) e em indivíduos HIV positivos imunossuprimidos (Sawaya et al., 2003; Strickler et al., 2005).
15
3.2.3) Remissão ou persistência da infecção por HPV e/ou das lesões precursoras
3.2.3.1) Remissão
Geralmente a infecção pelo HPV é eliminada 12 a 18 meses após a exposição ao vírus. Aproximadamente 10% das mulheres não conseguem eliminar a infecção (Richardson et al., 2003; Stanley, 2008).
A regressão dos estágios pré-câncer para a normalidade, embora menos frequente que a reversibilidade da infecção viral, também ocorre. Mulheres com diagnóstico de lesões precursoras, principalmente as de baixo grau podem apresentar regressão espontânea sem graves consequências clínicas (Wright Jr. et al., 1994; Zhang et al., 2010).
A remissão da infecção por HPV ou das lesões pré-cancerosas pode ser atribuída à atuação de mecanismos imunológicos humorais (Bontkes et al., 1999) e celulares (de Gruijl et al., 1999). A imunidade mediada por células, com atuação das células T CD8+ (citotóxicas) e TCD4+ (auxiliares), é responsável por eliminar a infecção pelo HPV (Stanley, 2008). Uma apresentação adequada aos linfócitos, realizada pelas proteínas HLA de classe II (Human Leukocytes Antigens), é necessária para uma resposta imune eficaz. Diversos estudos demonstraram associações entre os alelos ou haplótipos HLA e a infecção pelo HPV (Araújo-Souza et al., 2008).
As células de Langerhans encontradas no epitélio escamoso são responsáveis por desencadear uma resposta imune anti-HPV. No entanto, esta função é inibida pelas mudanças na expressão de citocinas, no tecido infectado (Stanley, 2008).
Diversos fatores afetam o status imune do indivíduos e, portanto, podem interferir na remissão da infecção por HPV e das lesões pré-neoplásicas, determinando o retorno à normalidade ou a persistência e progressão ao câncer. Estes fatores vem sendo alvo de muitos estudos atualmente (Schiffman et al., 2007; Araújo-Souza et al., 2008; Stanley, 2009).
3.2.3.2) Persistência
16
Define-se como persistência viral a detecção de um mesmo tipo de HPV duas ou mais vezes em um período de aproximadamente 6 a12 meses (Franco et al., 1999; Liaw et al., 2001; Schiffman & Kjaer, 2003).
A capacidade do vírus HPV de driblar o sistema imune está diretamente ligada a dois fatos: (1) maior concentração de antígenos virais nas células em estágios finais da diferenciação epitelial, que estão programadas para a morte celular natural e, portanto, distantes da vigilância do sistema imune e (2) a replicação viral não induz citólise, viremia ou qualquer outro sinal que possa desencadear uma resposta inflamatória (Stanley, 2009).
Se a infecção viral persistir por longos períodos, uma série de eventos irreversíveis causados pelo vírus pode levar a progressão das lesões nas células do hospedeiro e, consequentemente, ao desenvolvimento do câncer.
3.2.4) Progressão de um clone de células infectadas para pré-câncer e invasão
A progressão para o câncer cervical está diretamente ligada à atuação das oncoproteínas E6 e E7 do HPV na maquinaria de controle do ciclo celular, promovendo a desregulação do mesmo (Boulet et al., 2007; Moody & Laimins, 2010
3.2.4.1) Ciclo celular
O ciclo celular é um processo complexo que envolve proteínas regulatórias que direcionam a célula através de uma sequência específica de eventos, que resultam na divisão celular e produção de duas células-filhas (Ward, 2002). É dividido em intérfase (G1, S e G2) e mitose (M) (Figura 4).
A integridade genômica durante a divisão é verificada por reguladores específicos, nos pontos de checagem (checkpoints). Caso alguma anormalidade seja detectada, a progressão do ciclo é interrompida, até que o reparo seja realizado. Se o reparo não ocorrer, a célula sofre apoptose (Schafer, 1998).
17
S e de G2 para M (Figura 4). As CDKs são ativadas e inativadas ao longo do ciclo. No estado ativado, determinado, em parte, pelas ciclinas, as CDKs promovem a fosforilação de proteínas que regulam os principais eventos do ciclo celular. Os níveis de ciclinas oscilam durante as fases do ciclo celular, uma vez que estas proteínas são sintetizadas em etapas específicas, de acordo com as necessidades celulares, sendo degradadas após a utilização (Paulovich et al., 1997).
Figura 4: Complexos ciclinas-CDKs nas fases do ciclo celular. A atividade ciclina/CDK é bloqueada por uma série de inibidores específicos. CDK = quinase dependente de ciclina; CIC = ciclina. Fonte: Ward, 2002, modificado.
Fatores de crescimento, provenientes do meio externo, se ligam a receptores específicos na membrana plasmática das células e induzem as mesmas a entrarem no processo de divisão celular. Imediatamente ocorre a síntese de ciclina D, que irá se ligar às CDKs 4 e 6, ativando-as, permitindo a progressão pela fase G1 do ciclo (Jeannon & W.J., 1998) (Figura 4).
A formação do complexo ciclina E-CDK2 permite o início da fase S e a duplicação do DNA (Figura 4). A transição de G2 para M é iniciada pela expressão da ciclina A, que irá formar o complexo ciclina A-CDK2. Na mitose o complexo ciclina B-CDK1 estimula a célula a entrar em processo de divisão (Stewart & Pietenpol, 2003).
18
complexo ubiquitina e pela presença ou ausência de proteínas inibidoras de CDKs, denominadas CDKIs (Bahnassy et al., 2006).
Duas classes de CDKIs foram descritas: a família Cip/Kip, que compreende as proteínas p21, p27 e p57 e a família INK4a, que compreende as proteínas p15, p16, p18 e p19(Sherr & Roberts, 1999). Os CDKIs da família INK4a são específicos sobre os complexos ciclina D/CDK 4 e 6, que atuam em G1. Já os CDKIs da família Cip/Kip são inespecíficos, atuando sobre diversos tipos de complexos ciclinas/CDKS, como ciclina E/CDK2, A/CDK2 e ciclina B/CDK1 (Clarke & Chetty, 2001). A Figura 4 indica os locais de atuação dos complexos ciclinas-CDKs e das CDKIs nas fases do ciclo celular.
3.2.4.2) Mecanismo carcinogênico
Os genes codificadores de proteínas que atuam induzindo ou estimulando a progressão do ciclo celular são chamados proto-oncogenes. Estes, ao sofrerem algum tipo de mutação se tornam oncogenes. Já as proteínas envolvidas na repressão do ciclo são codificadas pelos genes denominados supressores tumorais (Ward, 2002).
As oncoproteínas E7 e E6 do HPV interferem na ação das proteínas supressoras tumorais pRB e p53, respectivamente. A inibição dos mecanismos exercidos por estas proteínas, por meio do HPV, permite a instalação do fenótipo maligno (Moody & Laimins, 2010).
No ciclo celular normal, a pRB encontra-se no seu estado ativo, hipofosforilado, ligada ao fator de transcrição E2F, impedindo a progressão das células da fase G1 para a fase S (Figura 5A). Quando a célula é estimulada a se dividir, a associação das ciclinas D ou E com suas respectivas quinases formam um complexo ativo que promove a fosforilação da pRB e a liberação de E2F. Ao ser ativado, este fator induz a transcrição de genes que codificam proteínas importantes na fase S, entre elas, a proteína p16 (Schafer, 1998; Ward, 2002). Esta tem a função de inibir o complexo ciclina D1/CDK 4 e 6 e, consequentemente, a fosforilação da pRB, impedindo a liberação do fator E2F e a transição da fase G1 para S (Figura 5A).
19
Boyer et al., 1996; Kim & Zhao, 2005; Mansour et al., 2007). E7 também afeta a expressão de genes da fase S pela interação direta com o fator E2F e com histonas diacetilases (HDACs), propiciando um ambiente favorável à replicação viral (Hwang et al., 2002; Longworth & Laimins, 2004).
Por outro lado, a proteína p53, em condições normais, é ativada em resposta a danos ocorridos na molécula de DNA. A fim de reparar a lesão no material genético a p53 induz a transcrição do gene p21wap1/cip1, que inibe a fosforilação da pRB e acarreta a permanência da célula na fase G1 (Figura 5A). Caso o reparo não seja possível, a célula será encaminhada para a apoptose através da ativação da transcrição de genes pró-apoptóticos como bax, bcl-2 e c-myc (El-deiry, 1993; Hunter & Pines, 1994; Graña & Reddy, 1995; Pluquet & Hainault, 2001; Cadwell & Zambetti, 2001).
A atividade transcricional da p53 pode ser inibida quando ela se liga à proteína MDM-2, uma ligase de ubiquitina que irá marcá-la para degradação (Figura 5A). No entanto, a p53 exerce uma auto-regulação sobre a transcrição do gene MDM-2. Em resposta a estímulos celulares, ocorre a ativação da transcrição do gene CDKN2A, que codifica a proteína p14, que tem como função ligar-se à MDM-2 e impedir a degradação da p53 (Finlay, 1993; Wu et al., 1993; Haines et al., 1994; Zhang et al., 1998).
No epitélio infectado pelo HPV, uma das maiores consequências da ação de E7 sobre a pRB é o aumento nos níveis da proteína p53 (Figura 5B). Em contrapartida, a oncoproteína E6 do HPV utiliza muitos mecanismos para inibir a atividade da p53 (Demers et al., 1994).
E6 recruta a proteína E6-AP (E6 associated protein ligase), formando o complexo E6-E6AP, que se liga à p53, marcando-a para degradação proteolítica através da via da ubiquitina. A degradação da p53 resulta em diminuição da apoptose e imortalização celular (Scheffner et al., 1990; Boulet et al., 2007). A Figura 5B ilustra a interação de E6 e p53.
20
Figura 5:Mecanismos de controle do ciclo celular. (A) Epitélio normal. (B) Epitélio infectado pelo HPV, destacando a ação das oncoproteínas E7 e E6 sobre as proteínas pRB e p53, respectivamente.. Fonte: Pinto et al, 2012, modificado.
3.3) Diagnóstico das lesões intraepiteliais cervicais e do HPV
21 3.3.1) Citologia
Introduzida pelo médico George Papanicolaou na década de 40, a avaliação citológica das células da cérvice e da vagina foi proposta como forma de triagem do câncer cervical. Apesar de ser a primeira técnica de rastreamento usada para detecção de alterações citológicas, ainda hoje é preconizada como a principal estratégia no controle do câncer do colo do útero, sendo denominado exame preventivo ou de Papanicolaou (INCA, 2011).
O exame citológico consiste na avaliação das células descamadas esfoliadas da ectocérvice e endocérvice do colo uterino. A Tabela 1 expõe as nomenclaturas citopatológica e histopatológica utilizadas desde 1941 para o diagnóstico das lesões cervicais escamosas, bem como suas equivalências.
A nomenclatura dos exames citopatológicos utilizada no Brasil é baseada no Sistema de Bethesda (2001). Para os exames histopatológicos, é usada a nomenclatura de Richart (1965;1967) (INCA, 2011).
Tabela 1: Sistemas de classificação das lesões cervicais.
NIC: neoplasia intraepitelial cervical. ; HSIL: lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau; LSIL: lesõesintra-epiteliais escamosas de baixo grau; AIS: adenocarcinoma in situ. Fonte: INCA, 2011, modificado.
intra-22
epitelial escamosa (SIL) abrange o espectro de atipias escamosas não invasivas associadas ao HPV, que variam desde alterações celulares associadas a uma infecção transitória pelo HPV até alterações celulares anormais que representam precursores de alto grau para um câncer escamoso invasor. Esse espectro se divide nas categorias de baixo grau (LSIL) e de alto grau (HSIL). As lesões de baixo grau abrangem as alterações celulares anteriormente denominadas displasia leve e NIC I ao passo que as lesões de alto grau abrangem displasia moderada, displasia acentuada ou NIC II, NIC III. Outro conceito adotado, são as células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), que agrupam as atipias que não estão relacionadas à reatividade nem a lesões pré-neoplásicas e neoplásicas (INCA, 2011).
Os critérios clássicos para o diagnóstico citológico do HPV, que acometem as células escamosas são representados pela coilocitose, que pode ser definida como alteração em células escamosas maduras contendo um, dois ou mais núcleos discarióticos apresentando uma grande cavidade ou área clara que circunda o núcleo proeminente, com bordas bem definidas e a zona periférica amiúde em borrão (Koss & Durfee, 1956; Meisels & Fortin, 1976); e pela disceratose que é um processo anormal de maturação das células profundas que se apresentam arredondadas, com citoplasma densamente eosinofílico e núcleo picnótico (Purola & Savia, 1977).
Apesar de a literatura ser unânime em apresentar a coilocitose como critério patognomônico para o diagnóstico de HPV, tem-se estudado a introdução de novos critérios morfológicos denominados não clássicos ou secundários para o diagnóstico de HPV com o objetivo de ampliar a sensibilidade do teste de Papanicolaou aproximando-se da aproximando-sensibilidade obtida em análiaproximando-ses histológicas e em métodos de detecção do DNA/HPV por captura híbrida ou reação em cadeia da polimerase (Collaço & Pinto, 1994). Alguns exemplos de critérios não clássicos são: Bi ou Multinucleação (Luzzatto et al., 1990); Disceratose Leve (De Borges et al.,1989); Núcleo Hipercromático (Cecchini et al., 1990); Núcleo em Borrão (Cavaliere et al., 1990); Queratinização (Hudock et al., 1995), entre outros.
23
Muitas variáveis podem influenciar na qualidade dos esfregaços cervicais, como: o método de coleta, preparação da lâmina, fixação do material, coloração, o que pode gerar resultados falso-positivos e falso-negativos (Perez, 2001; Grace et al., 2002). Sendo assim, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas visando a melhoria da qualidade e sensibilidade do exame citopatológico, como a citologia em meio líquido e a leitura automatizada das lâminas (Arbyn et al., 2008; Anttila et al., 2011).
A frequência de realização do exame citopatológico é variável dependendo do país, porém, os protocolos da American Cancer Society (ACS) e American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) recomendam realização anual entre os 21 e 30 anos e a cada dois ou três anos para mulheres com 30 anos ou mais, caso três exames consecutivos sejam negativos (Wright et al., 2003, CDC, 2005).
Atualmente, no Brasil, o Ministério da Saúde preconiza que a realização do exame citopatológico deve iniciar aos 25 anos para as mulheres que já tiveram atividade sexual e seguir até os 64 , uma vez por ano e, após dois exames anuais consecutivos negativos, a cada 3 anos (INCA, 2011).
Na ocorrência de alterações importantes na citologia, os exames colposcópico e histológico são recomendados, com o intuito de confirmar a presença da lesão e classificar a alteração citológica (INCA, 2011).
3.3.2) Colposcopia
A colposcopia é realizada por um aparelho conhecido como colposcópio, que permite visualizar o colo uterino, sob luz brilhante, com aumento de 10 a 40 vezes (Silva Filho et al., 2000). As imagens permitem verificar pequenas alterações impossíveis de serem vistas sem o equipamento. Produtos químicos e corantes para utilizados para o realce de áreas a serem avaliadas.
O exame é indicado para mulheres que apresentaram resultado anormal do exame de Papanicolaou. A colposcopia permite um melhor direcionamento da área na qual será realizada a biópsia (Ferris et al., 1991).
3.3.3) Histologia
24
realizado em amostras retiradas de uma superfície suspeita de presença de lesão ou malignidade. A nomenclatura utilizada (classificação de Richart) reúne as lesões intraepiteliais escamosas em um grupo denominado neoplasia intraepitelial cervical (NIC), subdividido em NIC I, II e III conforme o grau da lesão (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
A classificação histopatológica vigente é categorizada em graus I, II e III, dependendo da proporção da espessura do epitélio que apresenta células maduras e diferenciadas (INCA, 2011).
Em NIC I, a maturação está presente em dois terços do epitélio e as células epiteliais contêm atipias variáveis que podem incluir o efeito citopático do HPV (coilocitose). Além disso, estão presentes discretas anormalidades nucleares, assim como ocasionais figuras mitóticas presentes no terço basal (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
Em NIC II a maturação está presente em mais da metade do epitélio e a atipia nuclear é evidente em ambas as camadas epiteliais. Figuras mitóticas estão presentes em dois terços da camada basal do epitélio (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
Já em NIC III a maturação pode estar ausente ou confinada ao terço superior do epitélio. As anormalidades nucleares estão presentes na maioria ou em toda espessura do epitélio, figuras mitóticas são encontradas em todos os níveis do epitélio e mitoses atípicas são freqüentes (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
O diagnóstico de carcinoma escamo-celular microinvasivo é baseado na profundidade da invasão do estroma e atribui-se um limite superior, que de acordo com a literatura varia de 3 a 5 milímetros. O carcinoma invasor de células escamosas é composto por células escamosas de grau variado de diferenciação (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
3.3.4) Técnicas moleculares para detecção do DNA do HPV
25
Dentre as metodologias disponíveis para a detecção do DNA-HPV podemos citar: Hibridação In Situ, Hibridação Southern Blotting, Captura Híbrida, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Para a genotipagem do HPV existem as seguintes técnicas: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Hibridação em Microplaca, Hibridação Reversa, Microarray (chips de DNA), Sequenciamento, PCR tipo-específica (Saiki, 1988; Eluf-Neto et al., 1994; Lorincz, 1996; Villa et al., 2000; Iftner & Villa, 2003; Lie et al., 2005; Molijn et al., 2005; Molden et al., 2005; Rosenblatt et al., 2005; Dalstein et al., 2009; Nicol et al., 2010).
A possibilidade do uso dos testes moleculares para detecção do DNA-HPV no rastreamento do câncer cervical está sendo analisada. Foi comprovada a maior sensibilidade dessas técnicas em comparação ao exame citopatológico, embora a especificidade seja menor, levando mais mulheres para a colposcopia (Cuzick et al., 2008). Outra alternativa para evitar que muitas mulheres saudáveis sejam encaminhadas desnecessariamente para a colposcopia é encaminhar somente aquelas que apresentaram teste positivo para HPV e exame citopatológico alterado (Leinonen et al., 2009).
É importante destacar que a redução da mortalidade por câncer do colo do útero é decorrente da realização periódica do exame citopatológico. O teste de HPV, embora importante, ainda não é usado rotineiramente como método de rastreamento (INCA, 2011).
3.4) Biomarcadores e o diagnóstico do câncer cervical
Um rastreamento eficiente e completo do câncer cervical deve consistir na realização da citologia cérvico-vaginal. Entretanto, há um interesse na pesquisa de marcadores moleculares que possam aumentar a especificidade destes testes além de indicar lesões pré-neoplásicas que apresentem a possibilidade de evolução para o carcinoma invasor. Assim, os biomarcadores representariam uma alternativa futura para o prognóstico de lesões nos estágios pré-malignos, auxiliando no tratamento (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
26
para liberação de resultados e a incapacidade de diferenciar as lesões com probabilidade de regredir ou progredir para carcinoma invasivo estão sob questionamentos (Wang et al., 2004).
As condutas clínicas referente às lesões intraepiteliais escamosas de baixo (LSIL) e alto grau (HSIL) são muito bem definidas e constam no guia de conduta elaborado pelo INCA denominado “Diretrizes Brasileiras para o Rastreamento do Câncer do Colo do Útero” (INCA, 2011). No entanto, a identificação de biomarcadores pode fornecer informações importantes a respeito da gravidade destas lesões (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
Biomarcador é qualquer molécula que possa ser detectada e medida revelando processos biológicos normais ou patológicos (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
Um marcador eficiente na triagem do câncer cervical precisa ser sensível e específico, para não subdiagnosticar os casos que necessitam de tratamento e para identificar apenas os casos realmente positivos. O marcador deve estar especificamente associado à progressão da doença, apresentando a capacidade de discriminar lesões de baixo e alto grau com risco de progredir daquelas com maior chance de regredir espontaneamente (Wentzensen & von Knebel Doeberitz, 2007).
27 3.4.1) Proteína p53
Descrito pela primeira vez em 1979, o gene P53 codifica uma fosfoproteína nuclear de 53 KD e 393 aminoácidos, nomeada p53 (Lee & Bernstein, 1995; Wang & Wang, 1996; Akasi & Koeffler, 1998). A proteína p53 tem um papel fundamental na proliferação das células, uma vez que exerce mecanismos de controle no ciclo celular (Finlay et al., 1989; Harris, 1996; Wang & Harris, 1997; Brenna & Syrjänen, 2003).
O gene p53 é caracterizado como o mais frequentemente mutado em cânceres humanos. É possível encontrá-lo com alguma anormalidade em até 50% de neoplasias de diferentes origens histológicas (Pietsch et al., 2006).
A p53, em seu estado mutado, acumula-se no núcleo da célula devido ao aumento na sua estabilidade e redução no processo de degradação (Nataraj et al., 1995). Por apresentar uma maior sobrevida, a proteína pode ser detectada pelo método de imuno-histoquímica. Estudos relatam que imuno-histoquímica positiva para p53 ocorre na maioria dos casos de câncer cervical (Tan et al., 2008).
A relação entre a expressão da p53 e a infecção pelo HPV de alto risco não é muito bem delineada, uma vez que a porcentagem de positividade da expressão desta proteína entre grupos HPV positivos e negativos é muito semelhante (Troncone et al., 1998). Muitos pesquisadores relatam não ter encontrado relação significativa entre a expressão da p53 e o prognóstico do câncer cervical, o que poderia ser explicado pelo mecanismo de atuação do HPV sobre a p53, uma vez que a oncoproteína viral E6 promove a degradação desta proteína (Skomedal et al., 1999; Horner et al., 2004; Bastos, 2007; Bragança et al., 2008; Hanprasertpong et al., 2010; Tosun et al., 2010).
A detecção de anormalidades na proteína p53 em neoplasias é um alvo importante de vários estudos. Agentes que podem restaurar ou mimetizar a função da p53 parecem ser uma proposta promissora para terapia do câncer em geral. (Lowe, 1995).
3.4.2) Proteína p16
28
Diversos estudos vêm sendo realizados sobre a função da p16 na gênese do câncer cervical (Hirama et al., 1996; Kim et al., 1998; Klaes et al., 2001; Sano et al., 2002).
A alta frequência das deleções da p16 em linhagens tumorais sugeriu um papel importante desta proteína na carcinogênese (Soufir & Basset-Seguin, 2001; Sharpless et al., 2003).
A hiperexpressão da p16 é uma característica de alterações displásicas e neoplásicas do epitélio cervical e tem sido atribuída às infecções de HPV de alto risco oncogênico (Sano et al., 1998; Agoff et al., 2003; Eleutério et al., 2007). Portanto, a p16 poderia representar um sensível marcador de células com expressão ativa da infecção pelo HPV (Klaes et al., 2001; Sano et al., 2002).
Outros estudos não confirmam as mutações da p16 nas lesões precursoras do câncer cervical (Dong et al., 2001). Alguns artigos relatam que a mutação e deleção da p16 em neoplasia cervical é um evento raro, sendo que não foram detectadas alterações no gene desta proteína em muitos estudos (Hirama et al., 1996; Tsuda et al., 2003).
Atualmente, a p16 tem sido sugerida como um biomarcador no diagnóstico de lesões escamosas cervicais de alto grau e também no prognóstico relacionado à evolução dessas lesões. Acredita-se que a p16 tenha potencial para ser utilizada como um teste auxiliar aos métodos de rastreamento do câncer cervical (Murphy et al., 2004; von Knebel Doeberitz, 2001; Godoy et al., 2008;Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
3.4.3) Teste para análise dos biomarcadores
Alguns marcadores podem ser identificados através da técnica de imuno-histoquímica que consiste na identificação de antígenos nos tecidos utilizando anticorpos (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
Inicialmente, o antígeno liga-se a um anticorpo primário, que por sua vez irá se ligar a um anticorpo secundário, o qual está associado a um complexo de visualização (complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação) (Leong et al., 2010).
29
Atualmente está disponível um grande número de anticorpos primários para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos de parafina, permitindo o exame imuno-histoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias arquivados por muitos anos. Esfregaços citopatológicos também podem ser avaliados por exames imuno-citoquímicos (Leong et al., 2010).
O antígeno tecidual deve permanecer insolúvel e a sua estrutura terciária não deve estar alterada para que o sítio antigênico se ligue ao anticorpo. No entanto, as múltiplas ligações decorrentes do longo período de fixação do tecido em formalina podem bloquear o acesso de anticorpos aos epítopos alvos, mascarando o antígeno. Dessa forma, faz-se necessária a recuperação antigênica, que pode ocorrer através de métodos enzimáticos ou através do calor (Leong et al., 2010).
A técnica de imuno-histoquímica pode sofrer interferência de muitas variáveis pré-analíticas que influenciam na leitura dos resultados, como: fixação do tecido, processos de recuperação antigênica, diluição dos anticorpos, tipos de anticorpos, reagentes utilizados, entre outros. Dessa forma, é imprescindível a padronização de uma forma de interpretação dos resultados que forneça segurança ao observador (Mulvany et al., 2008).
Geralmente a análise da imuno-histoquímica é realizada de maneira qualitativa, o que gera muitas dúvidas em relação à segurança dos resultados. Estudos vêm sendo realizados com o objetivo de estabelecer uma forma quantitativa de análise, o que seria um método mais sensível e específico (Sullivan & Chung,2008).
3.5) Tratamento
Não existe um tratamento definitivo ou de rápida resolução contra a infecção pelo HPV. Em geral o combate ao vírus depende muito do sistema imunológico de cada indivíduo, uma vez que a maioria das mulheres que entram em contato com o HPV tem a capacidade de eliminá-lo espontaneamente (Rosenblatt et al., 2005).
30
quadrivalente (Gardasil®), produzida pelo Laboratório Merck Sharp & Dohme, que protege contra os tipos 6, 11, 16 e 18 (Lowy & Schiller, 2006; Villa et al., 2005; Villa et al., 2011). A outra é a vacina bivalente, aprovada em 2008, que protege contra os tipos de HPV 16 e 18 (Cervarix®, GlaxoSmithKline Biologicals) (Deschuyteneer et al., 2010).
As vacinas quadrivalente (tipos 6, 11, 16 e 18) e bivalente (tipos 16 e 18) também podem oferecer proteção cruzada contra os tipos 31 e 45, não cobertos pela vacina (Einsten et al., 2011).
As vacinas terapêuticas são baseadas na indução da imunidade celular contra células expressando antígenos virais, visando a regressão das lesões associadas ao HPV. Ainda não há nenhuma vacina terapêutica disponível no mercado. Estudos com VLPs combinadas com as proteínas E7/L1 demonstraram algum efeito terapêutico em modelos animais, mas em humanos têm mostrado pouca eficácia; algumas mulheres com NIC tiveram regressão da lesão (Thomisson et al., 2008).
Vários aspectos devem ser levantados sobre a vacinação. Embora dados tenham demonstrado sua eficiência na proteção de mulheres não infectadas, muitas questões devem ser discutidas, como: faixa-etária da vacinação, grupo a ser vacinado (homens, crianças), preço, inserção no serviço público e o fato da vacina não proteger contra muitos tipos virais, entre outros itens (zur Hausen, 2008).
Em relação às alterações citológicas, o Ministério da Saúde preconiza o seguimento pelos profissionais da saúde, após resultado de exame citopatológico alterado, de condutas clínicas padronizadas no documento: “Diretrizes Brasileiras para o rastreamento do Câncer do Colo do Útero (INCA, 2011).
32 4.1) Amostragem
Neste trabalho foram utilizadas amostras de biópsias cervicais fixadas em formol e incluídas em parafina, obtidas dos arquivos do Laboratório Tafuri (LT), localizado em Belo Horizonte, Minas Gerais (MG).
Fundado em 1959, o LT realiza exames citológicos e anatomopatológicos particulares e de diversos convênios, incluindo o SUS. Este laboratório foi escolhido por ser o local para o qual são encaminhadas as biópsias de mulheres residentes em Ouro Preto.
A amostragem selecionada consistiu de 150 biópsias analisadas no LT, no período de 2006 a 2011, distribuídas de acordo com o diagnóstico histopatológico (Sellors & Sankaranarayanan, 2003) em 5 grupos de 30 amostras cada, sendo:
- LB: Lesão Benigna;
- NIC I: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I; - NIC II: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau II; - NIC III: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau III; - CEI: Carcinoma Epidermóide Invasor.
As mulheres residentes em Ouro Preto e Itabirito foram procuradas e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO 1) permitindo que seu material, anteriormente coletado e analisado pelo LT, fosse utilizado neste trabalho. O material proveniente de outras cidades foi avaliado com o consentimento do LT (ANEXO 2), devido à impossibilidade de contactar as mulheres.
O processo de seleção das amostras, bem como os procedimentos utilizados neste trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), CEP No 114/2010 (ANEXO 3).
4.2) Imuno-histoquímica
33 4.2.1) Preparação das lâminas
Cortes histológicos com 4µm de espessura foram obtidos no micrótomo rotativo de parafina modelo MRP 09 – LUPETEC e distendidos em lâminas previamente preparadas através do procedimento de silanização (ANEXO 4). As lâminas silanizadas são usadas porque permitem melhor fixação dos cortes durante a realização da técnica.
4.2.2) Desparafinização
As lâminas contendo os cortes histológicos foram desparafinizadas por imersão em xilol e hidratadas em concentrações decrescentes de álcool, seguidas por água destilada. O procedimento foi realizado a temperatura ambiente e está detalhado no ANEXO 5.
4.2.3) Recuperação antigênica
Após desparafinização, os cortes foram imersos em tampão citrato 1mM, pH=6,0 e submetidos a aquecimento em forno de micro-ondas por 12 minutos para recuperação dos sítios antigênicos. Antes da utilização, o tampão foi pré-aquecido por 6 minutos em micro-ondas.
4.2.4) Bloqueio da atividade da peroxidase endógena
34 4.2.5) Anticorpo primário
Os cortes foram incubados com anticorpo primário (p16, p53 ou anti-L1/HPV), durante a noite, em câmara úmida a temperatura de 4 a 8o C.
Os anticorpos foram diluídos em Tris-HCl 0,05M contendo Tween 0,1% (antibody diluent; S3022, DAKO).
Como controle negativo foi utilizado um coquetel de imunoglobulinas de camundongos – IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgM (Universal Negative Control Reagent; IS750, DAKO).
A Tabela 2 descreve os anticorpos utilizados, as diluições que foram testadas assim como o padrão de marcação considerado neste trabalho para cada proteína analisada.
4.2.6) Anticorpo secundário
35
Tabela 2: Anticorpos primários e condições utilizadas na imuno-histoquímica.
4.2.7) Revelação
Finalizada a reação com o anticorpo secundário, os cortes foram novamente lavados com TBST (3 vezes, 5 minutos cada) e incubados com o substrato cromógeno (3-amino-9-ethylcarbazole e H2O2). O tempo de incubação do substrato cromógeno para p53, p16 e HPV foi padronizado em 20, 15 e 10 minutos, respectivamente. A indicação da presença das proteínas é representada por precipitado de coloração vermelha no sítio do antígeno.
4.2.8) Contra-coloração e montagem das lâminas
Após a revelação, os cortes foram lavados 3 vezes (5 minutos cada) em água destilada. Em seguida, as lâminas foram imersas durante 1 minuto em Hematoxilina de Mayer (DAKO) e lavadas novamente com água destilada. Finalmente, foram rinsadas em uma solução de hidróxido de amônio 37mM (LabSynth) por 10 vezes e
Proteína analisada Anticorpo Fornecedor Diluições testadas
Padrão de coloração analisado
p16
Monoclonal mouse anti-p16 INK4/CDKN2 antibody SIGMA (K4798) 1:100 1:125 1:150 Nuclear
(Wentzensen et al., 2007).
p53
Monoclonal mouse anti-human p53 protein
DAKO (M7001)
1: 50 1: 75 1: 100
Nuclear (Tan et al., 2008).
L1/HPV
Monoclonal mouse anti-human Papillomavirus (HPV) DAKO (M3528)
1:10 1:50 1:100
Nuclear, com ocasional imunorreatividade
