68
A associação da análise de biomarcadores aos métodos de rastreamento e diagnóstico do câncer cervical pode melhorar a sensibilidade e a especificidade destes, reduzindo a grande variabilidade intra e inter-observador nas classificações morfológicas de citologia e biópsia. Portanto, atualmente, há um grande interesse na pesquisa de novos marcadores e na possível associação e utilização dos já existentes para triagem e diagnóstico. Dentre os biomarcadores promissores atualmente
investigados estão as proteínas regulatórias do ciclo celular, principalmente p16
(Tsoumpou et al., 2009; Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010). No sentido de melhoria
dos programas de triagem e diagnóstico do câncer cervical também muito se discute sobre a inclusão de testes para pesquisa de HPV (Schiffman et al., 2011).
Neste trabalho, a análise do padrão de expressão das proteínas do ciclo celular p16 e p53 e da proteína L1 do HPV em amostras de biópsia de lesões benignas, neoplasias de diferentes graus e carcinomas forneceu informações interessantes acerca da possível utilização dessas proteínas no prognóstico e diagnóstico do câncer cervical.
6.1) Proteínas do ciclo celular: p16 e p53
A expressão da p16 aumentou significativamente com a gravidade da lesão neste estudo. Padrão similar foi encontrado por outros pesquisadores, confirmando que a evolução das lesões benignas ao câncer cervical é acompanhada de uma crescente expressão desta proteína (Klaes et al., 2001; Wang et al., 2004; Queiroz et al., 2006a; Focchi et al., 2007; Mulvany et al., 2008; Salcedo et al., 2008; Huang et al., 2010; Yonamine et al., 2009; Missaoui et al., 2010; Reuschenbach et al., 2011).
Embora a relação entre a imunoreatividade para p16 e a gravidade das lesões seja muito estudada e pareça bem estabelecida na literatura, grande variabilidade de resultados tem sido observada quando se analisa a diferença de expressão entre os graus
da neoplasia. Como a maioria das lesões NIC I e um considerável número de lesões
NIC II regridem espontaneamente, a capacidade para prever o grau da neoplasia constitui uma questão importante e menos explorada no contexto de prevenção, diagnóstico e tratamento do câncer cervical.
Neste estudo, foi observado aumento significativo de expressão da p16 entre NIC I/NIC II e NIC III/CEI, mas não entre NIC I e NIC II ou NIC III e CEI. Portanto, os resultados apontam que p16, além de ser bom marcador para diferenciar LB de
69
qualquer grau de lesão, poderia diferenciar lesões de alto grau, no estágio de NIC II para NIC III.
A maioria dos estudos aborda apenas que a expressão da p16 aumenta com o grau da lesão e não enfatiza a diferença de expressão existente entre os graus da neoplasia. Wang et al. (2004) detectaram expressão da p16 significativamente maior em NICs e carcinoma quando comparada à cérvice normal ou apresentando apenas inflamação. Do
mesmo modo, Reuschenbach et al. (2011) encontraram uma expressão da p16 com
distribuição focal (5 - 25%) em lesões benignas e difusa (>25%) em NIC I, NIC II, NIC III e carcinoma.
O padrão de imunorreatividade da p16 com intensidade forte e marcação no epitélio total foram predominantes em lesões mais graves. De acordo com a literatura, este padrão de expressão sugere infecção por HPV de alto risco (Wang et al., 2004; Dray et al., 2005; Hariri & Oster, 2007, Omori et al., 2007; Dijkstra et al., 2010).
A graduação histológica precisa das NICs é de suma importância para o manejo clínico das pacientes (Martin & O'leary, 2011). Neste contexto, o uso da reação imuno- histoquímica para a p16 pode auxiliar na redução das discordâncias diagnósticas e fornecer informações a respeito do comportamento de lesões com capacidade de regressão ou progressão.
O padrão de expressão da p53, outra proteína de ciclo celular investigada em neoplasias intraepiteliais cervicais, é muito menos previsível que o da p16 (Vassallo et
al., 2000; Queiroz et al., 2006a; Tan et al., 2008). Os resultados deste estudo corroboram com os achados de outros pesquisadores, nos quais a expressão da p53 não variou com a gravidade da lesão (Skomedal et al., 1999; Bastos, 2007; Bragança et al., 2008; Hanprasertpong et al., 2010; Tosun et al., 2010). Por outro lado, Wang et al. (2004) detectaram expressão diminuída ou estável da p53 em relação à progressão de gravidade da NIC.
Algumas hipóteses são levantadas para explicar o padrão de expressão diferenciado da p53 obtido em diversos estudos. Uma delas ressalta a mutação da p53. O gene mutado expressa uma proteína que apresenta maior meia-vida do que a p53 selvagem, levando ao acúmulo no núcleo celular e consequente detecção imuno- histoquímica em células neoplásicas (Nataraj et al., 1995; Weller, 1998). Por outro lado, a inativação da proteína p53 pelo oncogene E6 do HPV de alto risco acarretaria uma baixa expressão deste marcador em células infectadas (Horner et al., 2004). Dessa
70
forma, a obtenção de resultados contraditórios entre muitos pesquisadores induz questionamentos sobre o papel da p53 no prognóstico das lesões precursoras do câncer cervical. Portanto, os relatos da literatura sugerem que a imunoexpressão da proteína p53 não tem valor na avaliação de qualquer grau de NIC ou carcinoma.
Uma limitação importante nos estudos é que cada proteína estudada é apenas uma pequena parte de uma maquinaria complexa de controle do ciclo celular. A expressão da p16 e p53 deveria refletir os efeitos da ação dos oncogenes virais E6 e E7 sobre as células do hospedeiro e, por isso, diferenciar os graus de lesão intraepitelial cervical (Moody & Laimins, 2010). Entretanto, os estudos confirmam que apenas a proteína p16 apresenta expressão crescente com a gravidade da lesão, sugerindo-a promissora como marcador na carcinogênese cervical.
Como relatado, a maioria dos estudos sobre p16 foca a correlação entre a
expressão da proteína e o grau de anormalidade citológica ou histológica (Salcedo et al.,
2008; Missaoui et al., 2010; Tosun et al., 2010).). Apenas alguns discutem a inclusão da análise da p16 como marcador de risco de progressão das lesões displásicas do colo
uterino (Wang et al., 2004; Queiroz et al., 2006a; Yonamine et al., 2009; Reuschenbach
et al., 2011) e a importância da análise imuno-histoquímica da referida proteína no rastreamento ou triagem do câncer em associação ao teste de HPV ou de outros
marcadores (Agoff et al., 2003; Holladay et al., 2006; Bragança et al., 2008; Godoy et
al., 2008;Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
6.2) Análise do HPV
A comparação dos dados dos laudos anatomopatológicos fornecidos pelo LT com os resultados da imuno-histoquímica da L1/HPV mostraram diferenças apenas no grupo LB. De acordo com o laudo, não foram encontrados coilócitos, ou outras alterações sugestivas de HPV, nas amostras de mulheres com diagnóstico de LB. Porém, pela análise imuno-histoquímica, no grupo LB, 87% das amostras (n=26) apresentaram expressão da proteína viral. Na cito/histopatologia a presença de coilócitos é indicativa da de infecção viral. Porém, estudos relataram que a ausência de coilocitose não implica necessariamente na ausência de HPV. Segundo estes pesquisadores a visualização de um coilócito característico pode depender de uma elevada carga viral (Abadi et al., 1998; Kruse et al., 2003).
71
Nos últimos anos, a inclusão de exames para pesquisa de HPV na triagem do câncer cervical tem sido amplamente discutida. Embora o teste de HPV seja predominantemente realizado em amostras de citologia cervical, informações sobre a presença e tipo viral são também importantes para auxiliar o patologista na revisão do caso e na avaliação do grau de NIC (Agoff et al., 2003; Godoy et al., 2008; Gatta et al., 2011; Martin & O'leary, 2011).
Na literatura, a maioria dos trabalhos envolvendo HPV está voltada para detecção de DNA viral. Os testes para detecção de DNA/HPV não permitem diferenciar entre infecções latente, subclínica ou clínica. No entanto, a discriminação do estado infeccioso é importante para o diagnóstico de lesões pré-cancerosas. Poucos e mais recentes estudos analisam a detecção imuno-histoquímica da proteína do papilomavírus. Diferentemente da análise de DNA viral, que é sensível e precisa na indicação da presença do HPV, a imunoreatividade da L1 depende da expressão da proteína viral naquela condição avaliada e pode indicar a fase da infecção (Yoshida et al., 2008; Galgano et al., 2010; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010; Gatta et al., 2011)
Neste trabalho, a expressão da proteína L1/HPV aumentou do grupo LB para NIC II e diminuiu de NIC II para CEI, reforçando os achados de outros pesquisadores. Huang et al. (2010) também mostraram uma correlação negativa entre L1/HPV e a gravidade das lesões cervicais, sendo a expressão da L1 estatisticamente maior em NIC I do que em NIC II, NIC III e carcinoma. Yoshida et al. (2008) também mostraram que a expressão da proteína L1/HPV reduziu de LSIL para HSIL e carcinoma.
A L1 é uma proteína capsídica do HPV expressa na fase “produtiva” do ciclo de infecção viral. Na fase de “transformação”, quando ocorre a integração do DNA do HPV ao da célula hospedeira, a expressão da L1 é gradualmente suprimida (Hilfrich et
al., 2008). Portanto, L1 pode ser detectada frequentemente nas displasias leves e moderadas, mais raramente nas displasias graves, podendo não ser observada em carcinomas (Yoshida et al., 2008). Este raciocínio explica os resultados encontrados neste e em outros estudos.
Foi também sugerido que a ausência da L1/HPV pode reduzir a resposta imune celular, promovendo assim a progressão das lesões (Hagensee et al., 2000; McMurray et
72
6.3) Proteínas do ciclo celular e HPV
Neste estudo, não foi observada correlação entre p53 e L1/HPV. Estudos similares, avaliando a proteína L1 viral, não foram encontrados na literatura.
Por outro lado, estudo realizado por Vassallo et al.(2000) avaliou a expressão da p53 e a presença de DNA/HPV em neoplasias intraepiteliais cervicais. A expressão desta proteína foi significativamente maior em NIC I quando comparada a NIC II e III e nenhuma correlação foi encontrada com a presença do vírus.
Quanto à relação da p16 com HPV, alguns estudos mostraram que a hiperexpressão da p16 em lesões pré-malignas e carcinomas da cérvice uterina pode ser atribuída às infecções pelo HPV de alto risco oncogênico (Sano et al., 1998; Agoff et
al., 2003; Eleutério et al., 2007). Isto é explicado porque a perda da repressão habitualmente mediada pelo complexo pRB/E2F sobre o gene da p16 ocorre devido ao HPV, uma vez que a pRB é inativada pela oncoproteína viral E7. Sendo assim, o fator E2F livre ativa a transcrição do gene da p16 e de muitos outros necessários para a progressão para a fase S do ciclo celular, imortalizando a célula (Wang et al., 2004; Mansour et al., 2007). Neste caso, como a atividade transcricional do E2F não ocorre via quinases CDKs 4 e 6, a p16 não exerce nenhum tipo de controle no ciclo celular. Esta proteína apenas se acumula na célula ao longo do tempo, podendo ser útil como um marcador na infecção ativa por HPVs de alto risco e na evolução das lesões cervicais (Martin & O'leary, 2011).
Estudos recentes vêm indicando as proteínas p16 e L1/HPV como biomarcadores interessantes para prognóstico e diagnóstico da infecção pelo HPV e de neoplasias intraepiteliais cervicais (Yoshida et al., 2008; Galgano et al., 2010; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010; Gatta et al., 2011)
Foi relatado que a análise imunohistoquímica da p16 e L1 poderia ser útil para estimar o potencial biológico das lesões cervicais. Particularmente, quando é difícil avaliar morfologicamente o grau da lesão, o padrão de expressão da p16/L1-HPV poderia complementar a análise, direcionando o acompanhamento e tratamento das pacientes.
Neste trabalho, como em outros estudos (Yoshida et al., 2008; Galgano et al., 2010; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010; Gatta et al., 2011), a marcação de L1/p16 foi dividida em 4 grupos, com significância biológica
73
diferente: L1(-)/p16(-); L1(+)/p16(-); L1(+)/p16(+) e L1(-)/p16(+), visando análise conjunta da expressão das referidas proteínas.
L1(-) pode indicar infecção viral latente ou integração de DNA do HPV no genoma do hospedeiro e L1(+) indica que o DNA viral está presente como uma forma produtiva. Por outro lado, p16 indica alteração (p16 +) ou não (p16 -) no ciclo celular.
Portanto, pressupondo teste de DNA/HPV positivo: (a) L1(-)/p16(-) sugere que o DNA está presente sem qualquer replicação viral ou alteração do ciclo celular em um estado de latência; (b) L1(+)/p16(-) sugere que o vírus está sendo produzido, mas sem alteração do ciclo celular; (c) L1(+)/p16(+) sugere fase produtiva de infecção viral com alteração do ciclo celular e (d) L1(-)/p16(+) sugere integração do DNA/HPV no genoma do hospedeiro com alteração do ciclo celular.
Assim, alguns estudos mostraram que a seqüência do estado de expressão L1/p16 altera com o aumento da gravidade da lesão cervical na ordem de L1(-)/p16(-); L1(+)/p16(-); L1(+)/p16(+) e L1(-)/p16(+) (Yoshida et al., 2008; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010). A análise qualitativa deste estudo, similar à realizada nos referidos trabalhos, apontaram na mesma direção.
Entretanto, na avaliação quantitativa das amostras deste estudo, o padrão L1(+)/p16(+) foi mais freqüente nas lesões mais graves do que L1(-)/p16(+). Isto pode ter ocorrido devido a diferenças no método de análise da marcação (quantitativo ou qualitativo) e/ou limitações inerentes a imuno-histoquímica em tecidos parafinados.
6.4) Eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas p16, p53 e L1/HPV
A análise da eficiência diagnóstica da proteína p53 não apresentou nenhum dado significativo, mesmo quando ela foi associada com as outras proteínas. Este resultado era esperado, uma vez que a expressão da p53 não apresentou nenhuma diferença significativa entre os grupos analisados. Sendo assim, optou-se por apresentar apenas os resultados da p16 e L1/HPV.
Neste estudo, independente do critério de análise utilizado (quantitativo ou qualitativo), p16 mostrou-se melhor teste em comparação à L1/HPV: sensibilidade e especificidade altas e área sobre a curva ROC mais próxima de 1.
74
A associação das proteínas L1 e p16 não aumentou a acurácia diagnóstica do teste em relação à análise das proteínas isoladas. Este resultado é contrário aos achados de outros pesquisadores. Huang et al. (2010) e Ungureanu et al. (2010) mostraram que a associação de L1 e p16 apresentaram maior acurácia diagnóstica, sugerindo que as proteínas combinadas são mais eficientes na detecção de lesões precoces com potencial de evolução. Tal discordância pode ser atribuída aos critérios subjetivos adotados nos métodos de análise, que contribui para a variabilidade de resultados entre os observadores.
A eficiência (Ef) no diagnóstico do câncer cervical, calculada com base nos valores preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN), do teste da proteína p16 foi maior quando comparada à L1, mesmo quando elas foram analisadas em conjunto. Este resultado reforça a idéia de que a associação das proteínas não apresentou uma especificidade diagnóstica superior.
Dessa forma, percebe-se que a proteína p16 pode ser um útil biomarcador na progressão e diagnóstico do câncer cervical. Este teste pode oferecer suporte ao seguimento de pacientes com diagnóstico de lesão de baixo grau (NIC I). No entanto, não se pode descartar a utilidade da L1, pois a análise da expressão desta proteína em conjunto com a p16 pode fornecer informações importantes acerca do comportamento das lesões cervicais.
6.5) Análise imuno-histoquímica
As discrepâncias na interpretação dos testes imuno-histoquímicos tanto em histologia como em citologia reduzem a reprodutibilidade e dificultam a análise comparativa dos dados de diferentes estudos (Tsoumpou et al., 2009; Martin & O'leary, 2011).
A imuno-histoquímica é uma técnica útil para detecção de biomarcadores em pesquisa e também no diagnóstico e prognóstico do câncer. No entanto, muitos pesquisadores destacam que esta técnica requer a normalização e padronização das muitas variáveis envolvidas, incluindo pré-tratamento da amostra, condições de fixação do tecido, processo utilizado para recuperação antigênica, especificidade/diluição dos anticorpos, sistemas de detecção. Outro ponto complexo e altamente discutido e divergente na literatura é a escolha do método de avaliação da marcação e interpretação
75
dos resultados gerados ( Taylor & Levenson, 2006; Mulvany et al., 2008; Leong et al., 2010).
Poucos estudos descrevem claramente a localização da marcação considerada (nuclear, citoplasmática ou ambas), a região do epitélio avaliada e o número de campos ou de células analisados. A maioria ainda utiliza o método de análise qualitativo, embora muito se discuta sobre avaliação quantitativa e sua automação (Klaes et al., 2001; Sullivan & Chung, 2008; Yonamine et al., 2009).
Neste estudo, foi escolhida a análise/quantificação apenas da marcação nuclear por ser predominante, mais fácil de ser observada e por possibilitar maior reprodutibilidade dos resultados. Alguns estudos também consideraram apenas a marcação nuclear da p16, enquanto outros compararam as colorações citoplasmáticas e nucleares (Wang et al., 2004; Wentzensen et al., 2007; Koo et al., 2009). Apesar de não ter sido quantificada neste estudo, a marcação citoplasmática da p16 foi mais acentuada a partir de NIC III, similar a outros trabalhos (Koo et al., 2009).
Em relação à proteína p53, a maiorira dos trabalhos considera somente a marcação nuclear como positiva (Wang et al., 2005; Tan et al., 2008). Neste estudo, independente do grau da lesão, a marcação nuclear foi predominante.
Na literatura de um modo geral o padrão de marcação considerado como positivo para a proteína L1/HPV é nuclear (Yoshida et al., 2008; Galgano et al., 2010; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010). No entanto, Iwasaka et al. (1992) relataram a ocorrência de imunorreatividade citoplasmática, o que corrobora com os achados deste estudo. A presença de marcação citoplasmática foi uma constante em todos os tipos de lesão, acompanhando a marcação nuclear.
Em relação à área do epitélio, neste estudo, optou-se pela avaliação da junção escamo-columar por se tratar da região mais propensa à infecção por HPV. Os outros estudos relatam apenas ter avaliado o epitélio, sem definição da área fotografada para avaliação (Vassallo et al., 2000; Klaes et al., 2001; Wang et al., 2004; Queiroz et al., 2006a; Focchi et al., 2007; Wentzensen et al., 2007; Godoy et al., 2008; Mulvany et al., 2008; Salcedo et al., 2008; Huang et al., 2010; Yonamine et al., 2009; Missaoui et al., 2010; Reuschenbach et al., 2011).
Depois de definida a localização da marcação que será considerada e a área do epitélio, o número de campos ou de células a ser analisado deve ser definido e o método de análise deve ser escolhido.
76
Não está bem definido nos estudos, o número de campos ou células analisados (Salcedo et al., 2008; Yonamine et al., 2009 ). Neste trabalho, foram fotografados 10 campos e procedidas as análises qualitativa e quantitativa.
Na literatura foram descritos métodos de avaliação dos biomarcadores pela técnica imuno-histoquímica qualitativos e/ou semi-quantitativos (com diferentes escores) e quantitativos (Queiroz et al., 2006; Yıldız et al., 2007; Godoy et al., 2008; Salcedo et al., 2008; Yoshida et al., 2008; Koo et al., 2009; Kurshumliu et al., 2009; Yonamine et al., 2009; Huang et al., 2010). No entanto, escores de pontuação diferentes são usados na avaliação qualitativa, alguns levando em conta o grau e a intensidade da marcação e outros baseando-se no percentual de células marcadas. Além disso, os pontos de corte para a avaliação se um tecido é "positivo" ou "negativo" não estão padronizados e variam para o mesmo antígeno nos diversos estudos (Klaes et al., 2001; Agoff et al., 2003; Wang et al., 2004).
O método qualitativo (escore) proposto por Klaes et al. (2001) é o mais amplamente utilizado para análise de biomarcadores associados às neoplasias intraepiteliais cervicais. Porém, por ser baseado em critérios subjetivos, apresenta uma elevada discordância entre os resultados nos diversos estudos devido às variações inter- observador.
O método quantitativo mensura exatamente o nível da expressão da proteína in
situ. A quantificação é uma análise muito mais precisa e a difusão deste método poderia reduzir a variabilidade entre os resultados (Cregger et al., 2006; Sullivan & Chung, 2008). Entretanto, a quantificação ainda é realizada, na maioria dos casos, manualmente e depende da experiência e atenção do analista. A análise automatizada poderia melhorar a capacidade de quantificar os resultados e possibilitar a padronização, facilitando a interpretação dos estudos e tornando possível a aplicação dos biomarcadores no prognóstico e diagnóstico das neoplasias (Cregger et al., 2006; Taylor & Levenson, 2006; Sullivan & Chung, 2008; Leong et al., 2010).
Apesar de muitos softwares estarem disponíveis, a forma automatizada da leitura da imuno-histoquímica ainda não está totalmente padronizada. Dependendo do tipo de material analisado, devido ao padrão de marcação obtido, pode não ser possível a realização da análise por meio destes programas. Sendo assim, é evidente a necessidade de evolução desta metodologia, para que cada vez mais ela possa ser aplicável a diferentes amostras. Os softwares disponíveis ainda não foram adequados à análise de
77
biomarcadores associados às neoplasias intraepiteliais cervicais (Cregger et al., 2006; Taylor & Levenson, 2006; Sullivan & Chung, 2008; Leong et al., 2010).
Como mencionado anteriormente, neste trabalho os resultados foram analisados pela quantificação dos núcleos marcados e pela análise qualitativa da distribuição, intensidade e topografia da marcação (determinação do escore). O parâmetro distribuição da avaliação qualitativa foi considerado nesta análise como equivalente à avaliação quantitativa para efeito de comparação entre os métodos.
Foram detectadas algumas diferenças nas análises quantitativa e qualitativa das proteínas p16 e L1/HPV. Em relação à proteína p53, não foram encontradas diferenças