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4.1) Amostragem
Neste trabalho foram utilizadas amostras de biópsias cervicais fixadas em formol e incluídas em parafina, obtidas dos arquivos do Laboratório Tafuri (LT), localizado em Belo Horizonte, Minas Gerais (MG).
Fundado em 1959, o LT realiza exames citológicos e anatomopatológicos particulares e de diversos convênios, incluindo o SUS. Este laboratório foi escolhido por ser o local para o qual são encaminhadas as biópsias de mulheres residentes em Ouro Preto.
A amostragem selecionada consistiu de 150 biópsias analisadas no LT, no período de 2006 a 2011, distribuídas de acordo com o diagnóstico histopatológico (Sellors & Sankaranarayanan, 2003) em 5 grupos de 30 amostras cada, sendo:
- LB: Lesão Benigna;
- NIC I: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I; - NIC II: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau II; - NIC III: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau III; - CEI: Carcinoma Epidermóide Invasor.
As mulheres residentes em Ouro Preto e Itabirito foram procuradas e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO 1) permitindo que seu material, anteriormente coletado e analisado pelo LT, fosse utilizado neste trabalho. O material proveniente de outras cidades foi avaliado com o consentimento do LT (ANEXO 2), devido à impossibilidade de contactar as mulheres.
O processo de seleção das amostras, bem como os procedimentos utilizados neste trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), CEP No 114/2010 (ANEXO 3).
4.2) Imuno-histoquímica
As amostras foram processadas através da técnica de imuno-histoquímica, utilizando anticorpos monoclonais anti-p16, anti-p53 e anti-L1/HPV. O sistema utilizado foi o EnVision Dakocytomation (EnVision® + system-HRP AEC, K4004, DAKO). Os passos realizados neste procedimento são descritos a seguir.
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4.2.1) Preparação das lâminas
Cortes histológicos com 4µm de espessura foram obtidos no micrótomo rotativo de parafina modelo MRP 09 – LUPETEC e distendidos em lâminas previamente preparadas através do procedimento de silanização (ANEXO 4). As lâminas silanizadas são usadas porque permitem melhor fixação dos cortes durante a realização da técnica.
4.2.2) Desparafinização
As lâminas contendo os cortes histológicos foram desparafinizadas por imersão em xilol e hidratadas em concentrações decrescentes de álcool, seguidas por água destilada. O procedimento foi realizado a temperatura ambiente e está detalhado no ANEXO 5.
4.2.3) Recuperação antigênica
Após desparafinização, os cortes foram imersos em tampão citrato 1mM, pH=6,0 e submetidos a aquecimento em forno de micro-ondas por 12 minutos para recuperação dos sítios antigênicos. Antes da utilização, o tampão foi pré-aquecido por 6 minutos em micro-ondas.
4.2.4) Bloqueio da atividade da peroxidase endógena
O bloqueio é necessário para evitar interferência da peroxidase tecidual na coloração imuno-histoquímica e foi realizado com solução 1% de peróxido de hidrogênio em metanol. Os cortes histológicos foram incubados nessa solução durante 30 minutos. Em seguida, foram realizadas 3 lavagens (5 minutos cada) com solução de TBST (Tris-HCl 0,05M, NaCl 0,15M, pH 7,6; Tween 20 0,05%).
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4.2.5) Anticorpo primário
Os cortes foram incubados com anticorpo primário (anti-p16, anti-p53 ou anti- L1/HPV), durante a noite, em câmara úmida a temperatura de 4 a 8o C.
Os anticorpos foram diluídos em Tris-HCl 0,05M contendo Tween 0,1% (antibody diluent; S3022, DAKO).
Como controle negativo foi utilizado um coquetel de imunoglobulinas de camundongos – IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgM (Universal Negative Control Reagent; IS750, DAKO).
A Tabela 2 descreve os anticorpos utilizados, as diluições que foram testadas assim como o padrão de marcação considerado neste trabalho para cada proteína analisada.
4.2.6) Anticorpo secundário
Após a incubação com o anticorpo primário, foram realizadas 3 lavagens em solução de TBST (5 minutos cada) e as lâminas com os cortes foram incubadas com anticorpo secundário (EnVision® + system-HRP AEC, K4004,DAKO) ligado à enzima peroxidase (goat anti IgG mouse conjugado com polímero marcado com peroxidase), por 60 minutos, à temperatura ambiente.
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Tabela 2: Anticorpos primários e condições utilizadas na imuno-histoquímica.
4.2.7) Revelação
Finalizada a reação com o anticorpo secundário, os cortes foram novamente lavados com TBST (3 vezes, 5 minutos cada) e incubados com o substrato cromógeno (3-amino-9-ethylcarbazole e H2O2). O tempo de incubação do substrato cromógeno para p53, p16 e HPV foi padronizado em 20, 15 e 10 minutos, respectivamente. A indicação da presença das proteínas é representada por precipitado de coloração vermelha no sítio do antígeno.
4.2.8) Contra-coloração e montagem das lâminas
Após a revelação, os cortes foram lavados 3 vezes (5 minutos cada) em água destilada. Em seguida, as lâminas foram imersas durante 1 minuto em Hematoxilina de Mayer (DAKO) e lavadas novamente com água destilada. Finalmente, foram rinsadas em uma solução de hidróxido de amônio 37mM (LabSynth) por 10 vezes e
Proteína analisada Anticorpo Fornecedor Diluições testadas
Padrão de coloração analisado
p16
Monoclonal mouse anti- p16 INK4/CDKN2 antibody SIGMA (K4798) 1:100 1:125 1:150 Nuclear (Wentzensen et al., 2007). p53
Monoclonal mouse anti- human p53 protein DAKO (M7001) 1: 50 1: 75 1: 100 Nuclear (Tan et al., 2008). L1/HPV
Monoclonal mouse anti- human Papillomavirus (HPV) DAKO (M3528)
1:10 1:50 1:100
Nuclear, com ocasional imunorreatividade
citoplasmática (Iwasaka et al., 1992).
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posteriormente montadas com meio aquoso Faramount Mounting Medium (S3025, DAKO).
As lamínulas, previamente limpas com detergente extran e álcool 70%, foram fixadas à lâmina com base para unhas.
4.3) Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)
Cortes histológicos, das mesmas amostras submetidas ao procedimento de imuno-histoquímica, foram corados com Hematoxilina-Eosina (HE).
Após desparafinização os cortes foram corados pela Hematoxilina, por 10 minutos e lavados em água corrente, para retirada do excesso do corante. A seguir, foram diferenciados em álcool acidulado (100 mL de álcool absoluto e 10 gotas de ácido clorídrico) e novamente lavados em água corrente para evitar acidificação excessiva. Posteriormente, foram corados pela Eosina, por 30 segundos. Após a última lavagem em água corrente, foram desidratados, em 2 banhos de álcool absoluto e levados à estufa a 56ºC para secagem. As lâminas foram montadas com lamínula e Entellan (Merck).
4.4) Fotodocumentação e análise da marcação imuno-histoquímica
Neste estudo foram documentadas para análise, especificamente, células da junção escamo-colunar (JEC) ou zona de transformação cervical, região de metaplasia escamosa ativa, onde o epitélio escamoso estratificado da ectocérvice progressivamente substitui o epitélio glandular da endocérvice.
As fotos foram obtidas no Laboratório Multiusuários do NUPEB, UFOP. As lâminas foram observadas em microscopia convencional em campo claro, objetiva de 40X e a imagem foi capturada por uma microcâmera digital Leica DFC340FX acoplada ao microscópio DM5000B.
A documentação foi realizada em 10 campos por lâmina, selecionados ao acaso. Somente a coloração nuclear foi considerada como marcação positiva, independente da intensidade de coloração para as análises quantitativa e qualitativa.
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Na análise quantitativa foi realizada a contagem dos núcleos positivos e negativos nos campos fotografados (Schäffer, 2009; Yonamine et al., 2009), utilizando o software ImageJ, disponível gratuitamente na Internet (macbiophotonics.ca). A contagem possibilitou a determinação do Índice de Marcação (IM) de cada amostra, ou seja, a porcentagem de núcleos positivos em relação ao número total de células quantificadas:
Na análise qualitativa (escore) o padrão de imunorreatividade foi observado nos 10 campos fotografados de cada amostra e estas foram classificadas de acordo com três parâmetros, ilustrados na Figura 6:
(a) distribuição, segundo Klaes et al., 2001: esporádica (<5% de imunorreatividade), focal (> 5% e <25% de imunorreatividade) ou difusa (>25 % das células foram imunorreativas);
(b) intensidade, graduada como: imunorreatividade fraca, intermediária ou forte; (c) topografia, marcação em 1/3 basal, 2/3 basais ou na espessura total do epitélio.
4.5) Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas no software SPSS versão 17.0.
Como os dados não apresentaram distribuição normal foram escolhidos testes não paramétricos para as análises.
Para avaliar a expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV de acordo com o diagnóstico histopatológico foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis e Mann- Whitney (análise quantitativa) e o teste Exato de Fisher (análise qualitativa).
O teste exato de Fisher e o teste da correlação de Spearman também foram utilizados para correlacionar a expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV.
A comparação entre os métodos de análise quantitativa e qualitativa foi realizada utilizando o coeficiente Kappa. Este tem como valor máximo o 1, que representa total concordância entre os métodos avaliados. Valores próximos de 0 indicam nenhuma concordância.
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A utilização das análises imuno-histoquímicas das proteínas p16, p53 e L1/HPV no prognóstico e diagnóstico do câncer cervical foi avaliada pela Curva ROC (Receiver
Operating Characteristic) e pelo cálculo da eficiência (Ef) dos testes. As medidas de qualidade das análises imuno-histoquímicas (sensibilidade e especificidade), de qualidade do diagnóstico (valores preditivos positivo, VPP e negativo,VPN), a acurácia e a área sob a curva ROC das análises das referidas proteínas foram calculados (ANEXO 6).
O diagnóstico histopatológico foi utilizado como padrão-ouro nos cálculos das medidas de qualidade do teste e do diagnóstico. As mulheres que apresentavam diagnóstico de LB foram consideradas como negativas e aquelas que apresentavam qualquer tipo de lesão (NIC I, II, III ou CEI) como positivas.
Valores de p<0,05 foram considerados como evidência de associação significativa em todos os testes. Também foi calculado intervalo de confiança de 95%, quando apropriado.
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