Edgar Aristides Lemos Pereira
Licenciado em Medicina Nuclear
Compostos Radioiodados para Terapia Auger
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Química Bioorgânica
Orientador: Doutor António Rocha Paulo, IST-UL
Elemento de ligação: Professora Doutora Teresa Santos Silva, FCT-UNL
Júri:
Presidente: Professora Doutora Paula Cristina de Sérgio Branco, FCT-UNL Arguente: Doutora Maria Cristina das Neves Oliveira, C2TN-IST
Vogal: Doutor António Rocha Paulo, IST-UL
Edgar Aristides Lemos Pereira
Licenciado em Medicina Nuclear
Compostos Radioiodados para Terapia Auger
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Química Bioorgânica
Orientador: Doutor António Rocha Paulo, IST-UL
Elemento de ligação: Professora Doutora Teresa Santos Silva, FCT-UNL
Júri:
Presidente: Professora Doutora Paula Cristina de Sérgio Branco, FCT-UNL Arguente: Doutora Maria Cristina das Neves Oliveira, C2TN-IST
Vogal: Doutor António Rocha Paulo, IST-UL
Faculdade de Ciências e Tecnologia - Universidade Nova de Lisboa
Copyright
Edgar Aristides Lemos Pereira - FCT/UNL
O trabalho descrito nesta tese foi realizado no Grupo de Ciências Radiofarmacêuticas do
Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares (C
2TN) sob orientação do Doutor António
Rocha Paulo.
Em primeiro lugar, agradeço ao Doutor António Paulo pelo empenho, pelo apoio e pelo rigor com que orientou o trabalho que conduziu a esta tese. Por todos os conhecimentos que me transmitiu, pelo incentivo e pela disponibilidade.
Agradeço à minha co-orientadora, Professora Teresa Santos Silva, pela disponibilidade, pelas sugestões e conselhos.
Agradeço também à Doutora Isabel Rego dos Santos por ter aceitado a minha participação neste projeto do Grupo de Ciências Radiofarmacêuticas do Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares.
Devo também um sincero agradecimento aos restantes investigadores do grupo, em particular à Doutora Maria Cristina Oliveira, por todos os conhecimentos e apoio, fundamentais para o sucesso das marcações com Iodo-125, à Doutora Filipa Mendes pela ajuda preciosa com os ensaios com ADN plasmídico e à Doutora Paula Raposinho pelo apoio na realização e interpretação dos resultados dos ensaios com células.
Aos colegas do laboratório de Síntese Química onde trabalhei, o meu sincero agradecimento pelo apoio que sempre fizeram sentir, pelo bom ambiente de trabalho e pela amizade. À Elisa Palma, agradeço a disponibilidade e apoio. À Letícia Quental o meu enorme agradecimento, porque sem a tua ajuda e constante disponibilidade, tudo teria sido bastante mais difícil.
À Doutora Célia Fernandes, agradeço a disponibilidade para a realização e a ajuda na interpretação dos espectros de ESI-MS e à Dr.ª Vânia Sousa, agradeço pelas análises elementares de C,H,N.
À Ana Gonçalves, Elisa Palma, Elisabete Ribeiro, Filipe Vultos, Letícia Quental, Maria Belo, Vera Ferreira e Viviana Prado, agradeço também pela ajuda na realização dos espectros de RMN. Letícia, mais uma vez agradeço a tua ajuda na interpretação dos espectros de RMN.
À Doutora Ana Belchior, agradeço a ajuda para a realização e interpretação dos ensaios γ -H2AX.
Não posso deixar de utilizar um parágrafo desta folha para agradecer aos Professores que me fizeram entrar no mundo da Química Orgânica. Obrigado pela paciência com que me conseguiram transmitir o que hoje sei de Química. Em particular, gostava de agradecer à Professora Paula Branco pela sua exigência, orientação e ajuda, que foram fundamentais em todo este percurso.
Por último, mas não menos importante, agradeço à minha família e aos meus amigos, em particular aos meus pais, irmãos, sobrinhos, ao Luís e ao João, pelo apoio incondicional. Obrigado por compreenderem a minha constante falta de disponibilidade nestes últimos dois anos. Por estarem sempre presentes, nos bons e nos maus momentos, por desculparem o meu mau humor, a minha falta de paciência, sobretudo quando as coisas não corriam como previsto. Muito, muito obrigado!
Sem vocês, todo este processo teria sido muito mais difícil.
O desenho de radiofármacos emissores de eletrões Auger dirigidos ao ADN é um tópico cada vez mais investigado na Química Radiofarmacêutica atual. O trabalho descrito nesta tese insere-se nessa área de investigação e pretendeu demonstrar o interesinsere-se dos derivados do alaranjado de acridina (AO) marcados com 125I no desenho de radiofármacos para terapia Auger.
Assim, tendo em conta as propriedades de intercalação da AO com o ADN, sintetizámos novos derivados alquil-iodobenzamida da AO (6A, 6B, 6C), por N-alquilação do átomo de azoto central do seu anel heteroaromático. Os compostos congéneres marcados com 125I (125I-6A, 125 I-6B, 125I-6C) foram sintetizados via desmetalação de precursores estanilo e radioiodação oxidativa, tendo sido obtidos com elevada estabilidade in vitro e pureza radioquímica (> 95%) após purificação por HPLC.
A interação de 6A-C com ADN de timo de vitelo foi avaliada por técnicas espectroscópicas, que mostraram que estes compostos apresentavam elevada afinidade para o ADN, interatuando preferencialmente por intercalação. Estudos com ADN plasmídico ϕX174 demonstraram que os compostos 125I-6A e 125I-6B apresentavam capacidade de provocar quebras duplas de cadeia (DSB) no ADN, sem diferenças atribuíveis à presença de DMSO (0,07-0,09 DSB/decaimento e 0,05-0,04 DSB/decaimento, respetivamente), levando à conclusão que as DSB produzidas são devidas sobretudo aos efeitos diretos dos eletrões Auger. O composto 125I-6C não mostrou essa capacidade na presença deste scavenger de radicais livres, pelo que concluímos que o tamanho da sua cadeia alquílica apenas permite induzir danos no ADN por efeitos indiretos. Nos estudos de captação celular os compostos radioiodados mostraram boas taxas de captação às 4 horas, nas linhas celulares B16-F1 (13,5 a 26,9%) e PC-3 (13,9 a 28,0%). Ensaios preliminares de radiotoxicidade com o composto 125I-6B em células PC-3 revelaram mais de 35% de morte celular às 48 horas (ensaio MTT), o que certamente reflete a sua capacidade de induzir DSB no ADN de células vivas, como demonstrou o ensaio γ-H2AX.
Palavras Chave:
Química Radiofarmacêutica, Alaranjado de Acridina, Intercaladores doThe design of Auger-emitting radiopharmaceuticals for DNA-targeted therapy is an emerging field in contemporary Radiopharmaceutical Chemistry. The research work reported in this thesis aimed to contribute for the progress of this field by studying the potential of 125I-labelled Acridine Orange (AO) derivatives for Auger therapy.
For this purpose, and based on the DNA-intercalation properties of AO, we've synthesized three new alkyl-iodobenzamide AO derivatives (6A, 6B, 6C) by N-alkylation at the AO heteroaromatic ring nitrogen atom. The 125I-labeled congeners (125I-6A, 125I-6B, 125I-6C) were synthesized via oxidative radioiododestannylation of the corresponding tributilstannyl derivatives, and were obtained in high in vitro stability and radiochemical purity (> 95%) after HPLC purification.
The interaction of 6A-C with calf thymus DNA was evaluated trough spectroscopic techniques and all three compounds showed high affinity to DNA, acting mainly as intercalators. Evaluation of ϕX174 plasmid DNA showed that 125I-6A and 125I-6B induce double-strand breaks (DSB) yields per 125I decay in the range 0,07-0,09 and 0,05-0,04, respectively, with no significant difference in the presence of DMSO. These results led us to conclude that the produced DNA damage was mainly due to direct effects of emitted Auger electrons. By contrast, 125I-6C didn't show any ability to produce DSB in the presence of the free radical scavenger DMSO. This behavior shows that DNA damage provoked by 125I-6C is essentially due to indirect effects, certainly justified by its long alkyl chain, that places 125I nuclide far away from the DNA. Cellular uptake assays of this 125I-labelled compounds revealed good uptake rates, at 4 hours incubation, in B16-F1 (13,5 to 26,9%) and PC-3 (13,9 to 28,0%) cell lines. Preliminary radiocytotoxicity and DNA damage in living cells were conducted for 125I-6B. Results suggested more than 35% cell death (MTT assay) after 48 h incubation, which is certainly a consequence of its ability to produce DSB in the cellular DNA, as shown by the γ -H2AX assay.
Key Words:
Radiopharmaceutical Chemistry, Acridine Orange, DNA Intercalators, DNAAgradecimentos... v
Resumo e palavras-chave... vii
Abstract and key-words... xix
Índice de Figuras... xv
Índice de Tabelas... xix
Listade Abreviaturas e Símbolos... xxi
1. Introdução... ... 3
1.1 Medicina Nuclear: Diagnóstico e Terapêutica com Radionuclídeos... 3
1.2 Efeitos Biológicos das Radiações Ionizantes... 7
1.3 Radiofármacos para Terapia Auger... 9
1.3.1 Radionuclídeos Relevantes e o Efeito Auger... 9
1.3.2 Moléculas Radioiodadas para Terapia Auger... 13
1.4 Compostos com Afinidade para o ADN e Modos de Interação... 16
1.4.1 Estrutura do ADN e Tipos de Interação... 16
1.4.2 Derivados do Alaranjado de Acridina... 18
1.5 Objetivo do Trabalho... 19
2. Síntese e Caracterização dos Derivados Iodados do Alaranjado de Acridina... 23
2.1 Considerações Gerais... 23
2.2 Síntese e Caracterização dos Compostos Iodados Não Radioativos... 25
2.2.1 Síntese dos Compostos Bromo-ftalimida (1A, 1B e 1C) e Iodo-ftalimida-(2A, 2B e 2C)... ... 25
2.2.2 Síntese dos Derivados Amina..………... 27
2.2.3.1 Síntese do éster 4-iodobenzoato de tetrafluorofenilo (5)... 32
2.2.3.2 Síntese dos precursores amida (6A, 6B e 6C)... 33
2.2.4 Síntese dos Precursores Estanhados (7A, 7B e 7C)... 36
2.3 Síntese e Caracterização dos Compostos Radioiodados... 38
2.3.1 Radiosíntese e Purificação... 38
2.3.2 Estudos de Estabilidade dos Compostos Radioativos... 40
3. Interação com o ADN e Estudos com Células Tumorais... 45
3.1 Interação dos Compostos Não Radioativos com o ADN... 45
3.1.1 Espectroscopia de UV-Visível... 45
3.1.2 Espectroscopia de Fluorescência... 47
3.1.3 Dicroísmo Circular... 47
3.1.4 Determinação das Constantes de Ligação... 49
3.2 Avaliação in vitro dos Compostos Radioiodados: Estudos com ADN Plasmídico e-com Células Tumorais... 53
3.2.1 Estudos com ADN Plasmídico... 53
3.2.2 Estudos com Células Tumorais Humanas (PC-3) e de Origem Murina (B16-F1)... 60
3.2.2.1 Estudos de captação celular... 60
3.2.2.2 Radiotoxicidade e ensaio γ-H2AX em células tumorais... 62
4. Conclusões e Perspetivas... 67
5. Parte Experimental... 73
5.1 Solventes, Reagentes e Técnicas para Purificação e Caracterização... 73
5.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC)... 73
5.1.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)... 74
5.1.6 Espectrometria de Massa por Ionização ElectroSpray (ESI-MS)... 74
5.1.7 Análise Elementar de C,H,N... 74
5.1.8 Medição da Atividade das Soluções Radioativas... 75
5.2 Síntese Química... 75
5.2.1 Síntese de 2-(3-bromopropil)isoindol-1,3-diona (1A)... 75
5.2.2 Síntese de 2-(5-bromopentil)isoindol-1,3-diona (1B)... 75
5.2.3 Síntese de 2-(8-bromooctil)isoindol-1,3-diona (1C)... 76
5.2.4 Síntese de 2-(3-iodopropil)isoindol-1,3-diona (2A) ... 76
5.2.5 Síntese de 2-(5-iodopentil)isoindol-1,3-diona (2B) ... 77
5.2.6 Síntese de 2-(8-iodooctil)isoindol-1,3-diona (2C) ... 77
5.2.7 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(3-(1,3-dioxoisoindol-2-il)-propil) acridínio (3A)... 78
5.2.8 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(5-(1,3-dioxoisoindol-2-il)pentil) acridínio (3B)... ... 78
5.2.9 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(8-(1,3-dioxoisoindol-2-il)octil) acridínio (3C)... ... 79
5.2.10 Síntese de Iodeto de 10-(3-aminopropil)-3,6-bis(dimetilamino)acridínio (4A)... 79
5.2.11 Síntese de Iodeto de 10-(5-aminopentil)-3,6-bis(dimetilamino)acridínio (4B)... 80
5.2.12 Síntese de Iodeto de 10-(8-aminooctil)-3,6-bis(dimetilamino)acridínio (4C)... 81
5.2.13 Síntese do Éster 4-iodobenzoato de tetrafluorofenilo (5)... 82
5.2.14 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(3-(4-iodobenzamida)propil)acridínio (6A)... 82
5.2.17 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(3-(4(tributilestanil)benzamida)
propil)acridínio (7A)... 85
5.2.18 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(5-(4(tributilestanil)benzamida) pentil)acridínio (7B)... . 85
5.2.19 Síntese de Iodeto de 3,6-bis(dimetilamino)-10-(8-(4(tributilestanil)benzamida) octil)acridínio (7C)... 86
5.3 Radioiodação... 87
5.3.1 Considerações Gerais... 87
5.3.2 Síntese dos Compostos 125I-6A, 125I-6B e 125I-6C... 87
5.3.3 Estudos de Estabilidade Radioquímica... 88
5.4 Avaliação Biológica... 89
5.4.1 Estudos de Interação dos Compostos Não Radioativos com o ADN... 89
5.4.2 Ensaios com os Compostos Radioativos... 90
5.4.2.1 Ensaios com o ADN plasmídico... 90
5.4.2.2 Estudos com células tumorais humanas (PC-3) e de origem murina (B16-F1)... 91
Figura 1.1 Representação esquemática de um radiofármaco cujo agente químico é seletivo para
um dado alvo molecular... 3
Figura 1.2 Exemplos de radiofármacos emissores de partículas β, atualmente em utilização clínica como agentes terapêuticos... 5
Figura 1.3 Representação esquemática do percurso de partículas α, β e eletrões Auger no meio celular e subcelular... 8
Figura 1.4 À esquerda, representação esquemática do processo de conversão interna. À direita, representação esquemática da libertação de um eletrão Auger... 10
Figura 1.5 Processo de decaimento radioativo do 125I... 12
Figura 1.6 Complexos de 99mTc avaliados in vitro como emissores de eletrões Auger…... 13
Figura 1.7 Compostos radiomarcados com 125I, investigados para terapia Auger... 15
Figura 1.8 Compostos marcados com 123I, em investigação para diagnóstico de carcinoma da próstata. A2 foi já marcado com 124/131I para diagnóstico PET e terapia com partículas β………... 15
Figura 1.9 (a) Representação esquemática da estrutura da molécula de ADN; (b) Representação dos sulcos maior e menor do ADN... 16
Figura 1.10 Interação não-covalente de pequenas moléculas com o ADN. a) outside stacking; b) groove binding; c) intercalação... 17
Figura 1.11 Estrutura química do Alaranjado de Acridina (A) e da Acridina (B)... 19
Figura 1.12 Compostos finais sintetizados e avaliados neste trabalho... 20
Figura 2.1 Estratégia geral da síntese dos derivados iodados da AO... 23
Figura 2.2 Mecanismo envolvido no ataque de um nucleófilo a um átomo de carbono carboxílico... 24
Figura 2.3 Exemplo da reação de substituição eletrofílica de grupos estanilo para obtenção de compostos radioiodados... 25
Figura 2.4 Síntese dos compostos Bromo-ftalimida (1A-C) e Iodo-ftalimida (2A-C)... 25
Figura 2.5 Espectro de RMN 1H, em CDCl 3, do composto 1C (em cima) e do composto 2C (em baixo)... ... 26
Figura 2.6 Síntese dos compostos 3A-C... 27
Figura 2.9 Síntese dos compostos 4A-C... 29
Figura 2.10 Mecanismo reacional para a síntese dos compostos 3A-C, na abordagem com Hidrazina………... 30
Figura 2.11 Espectro de RMN 1H (em cima) e [1H,13C] HSQC (em baixo), em CD
3OD, do
composto 4B………... 31
Figura 2.12 Mecanismo da reação envolvido na síntese do éster 4-iodobenzoato de tetrafluorofenilo (5)………... 32
Figura 2.13 Espectro de RMN 1H, em CDCl
3, do composto 5... 33
Figura 2.14 Síntese dos compostos 6A-C... 33
Figura 2.15 Espectro de RMN [1H,1H] COSY (em cima) e 13C (em baixo), em CDCl 3, do
composto 6B………... 35
Figura 2.16 Síntese dos compostos 7A-C... 36
Figura 2.17 Espectro de RMN 1H, em CDCl
3, do composto 7B... 37
Figura 2.18 Síntese dos compostos 125I-6A, 125I-6B e 125I-6C... 39 Figura 2.19 Cromatogramas de HPLC dos compostos radioiodados 125I-6A, 125I-6B e 125I-6C,
eluídos simultaneamente com os análogos não radioativos 6A, 6B e 6C... 40
Figura 2.20 Estabilidade do composto 125I-6B em EtOH, aos 0, 12 e 20 dias... 41
Figura 2.21 Estabilidade do composto 125I-6B em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) e no meio de
cultura celular DMEM... 41
Figura 3.1 Espectros de absorção UV-Vis medidos para as soluções dos ligandos com adição de quantidades crescentes de CT-ADN. Em cima, à esquerda, composto 6A (7 μM); Em cima, à direita, composto 6B (4 μM); Em baixo, composto 6C (6 μM)……….. 46
Figura 3.2 Espectro de emissão de fluorescência para as soluções 7 µM de 6A (em cima, à esquerda), 4 µM de 6B (em cima, à direita) e 5,5 µM 6C (em baixo), e na presença de quantidades crescentes de CT-ADN, após subtração do espectro de emissão do
“branco”... 47
Figura 3.3 Espectro de CD característico do CT-ADN ([ADN] = 72 μM)………... 48
(em baixo) em função da concentração de CT-ADN. A curva representa um ajuste não linear à equação 1………... 50
Figura 3.6 Representação gráfica da função de I/I0 em função de 1/[ADN] para os ligandos 6A
(em cima, à esquerda), 6B (em cima, à direita) e 6C (em baixo), para a determinação do parâmetro P (ordenada na origem) ... 51 Figura 3.7 Ajuste de McGhee von Hippel para os dados de fluorescência obtidos para os
compostos 6A (em cima, à esquerda), 6B (em cima, à direita) e 6C (em baixo)... 52
Figura 3.8 Clivagem do ADN plasmídico ϕX174 após incubação com os diferentes compostos, a
4ºC em tampão Tris (pH 7,4) Nas tiras de eletroforese são apresentadas a forma circular (FC), linear (FL) e superenrolada (FSE) de ADN, na ausência e na presença de DMSO (-DMSO e +DMSO) ... 54
Figura 3.9 Evolução da percentagem das frações de FSE, FC e FL, ao longo do período de incubação, para os compostos 125I-6B (em cima) e 125I-6C (em baixo), na ausência (gráficos da esquerda) e na presença (gráficos da direita) de DMSO 0,2M……… 55
Figura 3.10 Número de decaimentos/cm3 acumulados ao longo do período de incubação, para os
compostos 125I-6A (a preto) 125I-6B (a vermelho) e 125I-6C (a azul) na ausência e na
presença de DMSO... 57
Figura 3.11 Desaparecimento da FSE de ADN em função do número de decaimentos/cm3, para os
compostos 125I-6A (em cima, à esquerda) 125I-6B (em cima, à direita) e 125I-6C (em
baixo), na ausência e na presença de DMSO 0,2 M... 57
Figura 3.12 DSB em função do número de decaimentos/cm3... 58
Figura 3.13 Percentagem total de atividade captada pelas células PC-3 (gráfico da esquerda) e respetiva internalização celular (gráfico da direita), após incubação a 37 ºC durante 4h.. 61
Figura 3.14 Percentagem total de atividade captada pelas células B16-F1 (gráfico da esquerda) e respetiva internalização celular (gráfico da direita), após incubação a 37 ºC durante 4h.. 62
Figura 3.15 Indução de DSB nas células PC-3, após incubação com o composto 125I-6B. Os focos
a verde assinalam os locais onde ocorreu a fosforilação da histona H2AX, correspondentes à ocorrência de DSB. A) Controlo (incubação sem 125I-6B); B)
Incubação com 1,5 µCi de 125I-6B; C) Incubação com 7,5 µCi de 125I-6B...
63
Figura 3.16 Número de focos (DSB) nas células PC-3, após incubação com o composto 125I-6B,
Tabela 1.1 Radionuclídeos em atual utilização clínica em medicina nuclear... 6
Tabela 1.2 Propriedades físicas de alguns radionuclídeos emissores de eletrões Auger... 11
Tabela 1.3 Espectro médio de emissão do isótopo 125I…... 12
Tabela 2.1 Valores de m/z obtidos para o pico predominante presente nos espectros ESI-MS (modo positivo) dos compostos 4B e 4C (comparação com os valores esperados para os respetivos iões moleculares)... 30
Tabela 2.2 Desvio químico (ppm) dos protões alifáticos adjacentes à função amida para os compostos 6A-C e protões correspondentes nos compostos 3A-C e 4A-C………….... 34
Tabela 2.3 Valores de m/z obtidos e valores esperados para os espectros de ESI-MS dos compostos 6A-C... 36
Tabela 2.4 Desvios químicos dos protões orto e meta, relativamente ao grupo SnBu3, do anel
benzénico da função benzamida nos compostos 6A-C e 7A-C…... 37
Tabela 3.1 Valores de comprimento de onda e absorvância UV-Vis máximas, na ausência e na presença de CT-ADN... 46
Tabela 3.2 Bandas de Dicroísmo Circular Induzido (nm) dos compostos 6A-C, observadas após interação com CT-ADN... 49
Tabela 3.3 Constantes de ligação ao ADN e outros parâmetros obtidos com a aplicação dos modelos de Kaminoh e McGhee von Hippel aos dados de emissão de fluorescência.... 52
Tabela 3.4 Percentagem da fração FSE de ADN, ao longo do período de incubação... 55
Tabela 3.5 Atividades (µCi) aplicadas na incubação de cada um dos compostos com ADN
plasmídico ϕX174, na ausência e na presença de DMSO 0,2 M…... 56
Tabela 3.6 Valores de D0(DSB) e de YDSB para 125I-6A-C na ausência e presença de DMSO... 59
Tabela 3.7 Percentagem total de composto captado e internalizado nas células, para cada uma das linhas celulares... 62
A
AcOEt– Acetato de etilo
ADN– Ácido desoxirribonucleico
AO– Alaranjado de Acridina (do inglês Acridine Orange)
B
Bq– Bequerel
C
CD– Dicroísmo circular (do inglês Circular Dichroism)
Ci– Curie
COSY– Espectroscopia de correlação homonuclear (do inglês HomonuclearCorrelation Spectroscopy)
CT-ADN– ADN de Timo de Vitelo (do inglês calf thymus)
D
DAPI– 4',6-diamidino-2-fenilindole
DCC – N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DCU– N,N´-diciclohexilureia
DIC – N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIPEA– N,N-diisopropiletilamina
DMEM–Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMF– Dimetilformamida
DMSO – Dimetilsulfóxido
DOTATATE– DOTA-(Tyr3)-octreotato
DSB– Quebras de cadeia duplas (do inglês Double-strand Breaks)
E
EDC– 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EDTA– Ácido etilenodiamino tetraacético
EDTMP – ácido etilenodiamino tetrametileno fosfórico
EP– Éter de petróleo
eq.– Equivalente
ESI– Ionização de Electrospray (do inglês Electrospray Ionization)
EtOH– Etanol
eV – eletrãoVolt
F
FC– Forma circular
FDA –Food and Drug Administration
FL– Forma linear
γ-H2AX – Fosforilação da Histona H2AX
H h– Hora
HPLC– Cromatografia Líquida de Alta Pressão (do inglês High Performance Liquid Chromatography)
HSQC – Coerência heteronuclear quântica única (do inglês Heteronuclear Single Quantum Coherence)
L
LET – Transferência Linear de Energia (do inglês Linear Energy Transfer)
M
MEOD– Metanol deuterado
MeOH– Metanol
MIBG – Meta-iodo benzilguanidina
min– Minuto(s)
MS– Espectrometria de Massa (do acrónimo inglês Mass Spectrometry)
MTT –brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
P
PBS– Tampão Phosphate Buffered Saline
PDT– Terapia Fotodinâmica (do inglês Photodynamic Therapy)
PET– Tomografia por Emissão de Positrões (do inglês Positron Emission Tomography)
ppm – partes por milhão; medida de desvio químico.
PSA – Antigénio específico da próstata (do inglês Prostate Specific Antigen)
PSMA– Antigénio da membrana específico da prostática (do inglês Prostate Specific Membrane Antigen)
R
RMN– Ressonância Magnética Nuclear
RPMI – Meio de cultura cellular Roswell Park Memorial Institute
S
SPECT– Tomografia computorizada de emissão de fotão único (do inglês Single Photon Emission Computed Tomography)
SSB – Quebra de cadeia simples (do inglês Single-strand Breaki)
T
t.a.– Temperatura ambiente
TAE– Tris-acetato-EDTA
TFA– Ácido trifluoracético
TLC– Cromatografia em camada fina (do inglês Thin Layer Chromatography)
TMS– Tetrametilsilano
t.r.– Tempo de retenção
Símbolos:
α – Alfa Å – Angstrom β – Beta β+– Positrão γ – Gama µ – Micro ϕ – Phi
η – Rendimento
1. INTRODUÇÃO
1.1 Medicina Nuclear: Diagnóstico e Terapêutica com Radionuclídeos
A medicina nuclear é uma especialidade médica na qual são empregues radiofármacos para diagnóstico ou terapêutica de um grande número de patologias.
Como representado na Figura 1.1, um radiofármaco é um composto que inclui na sua constituição um radionuclídeo (elemento com núcleo instável, que liberta o excesso de energia através de processos de decaimento radioativo, transformando-se espontaneamente noutro elemento mais estável e emitindo por isso radiação eletromagnética e/ou partículas carregadas) e um agente químico que o transporta de forma preferencial para um determinado órgão ou tecido. Estes dois constituintes do radiofármaco são determinantes para o seu funcionamento. As características do agente químico devem ser tais que promovam a maior seletividade possível na biodistribuição e, em simultâneo, uma boa capacidade de depuração do organismo. Por outro lado, o radionuclídeo deve apresentar características físicas adequadas para a finalidade que é empregue, nomeadamente em termos de quantidade e tipo de energia emitida. Em particular, as características das partículas ou radiação emitidas pelo radionuclídeo vão definir o seu potencial para aplicação em diagnóstico ou em terapêutica[1-3].
Figura 1.1: Representação esquemática de um radiofármaco cujo agente químico é seletivo para um dado alvo molecular.
segunda geração a ganhar uma posição cada vez mais favorável e de maior interesse. As características biológicas dos radiofármacos de segunda geração permitem que tenham uma localização mais específica no órgão ou tecido alvo[1-4].
Em suma, um radiofármaco deve apresentar propriedades físico-químicas, biológicas e farmacocinéticas favoráveis, que confiram elevada especificidade para o órgão ou tecido em estudo, mínima acumulação em órgãos não-alvo1, elevada estabilidade metabólica, semivida biológica2 e física3 adequadas ao processo em estudo e ser de fácil acesso ao utilizador final. Os radiofármacos utilizados em diagnóstico clínico representam a larga maioria dos radiofármacos atualmente comercializados e utilizados em medicina nuclear. Estes compostos têm na sua constituição radionuclídeos emissores de radiação gama (γ) que decaem por captura
eletrónica ou transição isomérica, para utilização em tomografia por emissão de fotão único (SPECT4); ou radionuclídeos emissores de positrões (β+) para utilização em tomografia por emissão de positrões (PET5).
Em particular, o uso de radiofármacos pode permitir o diagnóstico e seguimento das patologias através da chamada imagiologia molecular. A imagiologia molecular tem um carácter não invasivo que permite a visualização de processos químicos e biológicos, in vivo, sem interferir com os mecanismos que os controlam. Este procedimento inclui a introdução de uma pequena quantidade de radiofármaco no corpo do paciente, maioritariamente por via endovenosa, sem qualquer efeito tóxico. São adquiridas imagens com boa resolução espacial, que se relacionam com a biodistribuição do radiofármaco no corpo, através de equipamentos que detetam o local
onde os fotões γ são emitidos[1,4,5].
Embora a radioterapia convencional seja a modalidade mais utilizada para a terapêutica de doenças oncológicas, por definição não tem qualquer efeito sobre doença oculta ou secundária (metástases). Por outro lado, os agentes radiofarmacêuticos, de aplicação sistémica, são desenvolvidos para apresentarem seletividade para as células de determinado tipo de tumor, estejam estas localizadas na área do tumor primário, ou disseminadas por outras localizações anatómicas.
1 Órgãos não-alvo: órgãos que captam o radiofármaco mas que não são o órgão em estudo.
2 Semivida biológica: período de tempo necessário para que metade do radiofármaco desapareça do organismo por
eliminação metabólica.
3 Semivida física ou período de semidesintegração (T
1/2): período de tempo necessário para reduzir a metade o número de núcleos instáveis de um radioisótopo.
4 SPECT: Tomografia Computorizada por Emissão de Fotão Único, do inglês
Single Photon Emission Computed Tomography.
5 PET: Tomografia por Emissão de Positrões, do inglês
Neste sentido, um radiofármaco para fins terapêuticos deve apresentar emissão de partículas carregadas (pouco penetrantes) com capacidade para provocar danos no sistema biológico alvo,
nomeadamente radionuclídeos emissores de partículas beta (β), alfa (α) ou de eletrões Auger. A
toxicidade de um agente radioterapêutico é essencialmente devida aos efeitos das partículas ou radiação ionizantes e não à capacidade de o agente químico que o constitui interferir na replicação celular (como no caso da quimioterapia), devido às baixas concentrações que são administradas. Por esta razão, estes agentes químicos podem ser convenientemente derivatizados, no sentido de desenvolver moléculas com especial especificidade para determinado tecido ou tipo de células, sem que se manifestem eventuais efeitos nas células saudáveis. A aplicação de agentes radioterapêuticos tem assim como objetivo fazer chegar aos tecidos alvo, por exemplo às células de um determinado tipo de tumor, doses terapêuticas de radiação ionizante que impeçam a sua capacidade de replicação ou que conduzam à sua morte por apoptose. O alvejamento de um dado tecido ou tipo de células pode ser feito mediante interação dos radiofármacos com dadas moléculas-alvo, como recetores específicos, antigenes, enzimas ou genes.
Presentemente, a maioria dos radiofármacos em utilização clínica para terapêutica com radionuclídeos são emissores de partículas β. Alguns exemplos como o 153Sm-EDTMP, para o controlo paliativo da dor na sequência de metástases ósseas, o 131I-MIBG, para o tratamento de tumores neuroendócrinos (ver Figura 1.2) e mais recentemente o 177Lu-DOTATATE, para terapêutica de tumores neuroendócrinos, mais especificamente os que sobreexpressem recetores de somatostatina. Os efeitos deste tipo de partículas sobre os tecidos conduzem à destruição das células tumorais. Contudo, a captação do radiofármaco no órgão alvo deve ser seletiva, de modo a minimizar os efeitos secundários. A escolha do emissor β vai depender da energia das
partículas emitidas, das dimensões do tumor, da distribuição intratumoral e da farmacocinética do radiofármaco. Existe uma intensa investigação no sentido de desenvolver radiofármacos emissores α ou de eletrões Auger com interesse como agentes radioterapêuticos[1,5-8].
Figura 1.2:Exemplos de radiofármacos emissores de partículas β, atualmente em utilização clínica como
Embora não seja uma característica essencial para radiofármacos usados em terapia, a emissão concomitante de radiação gama de baixa energia (100-200 keV) pode ser uma vantagem, dada a utilidade clínica de poder haver monitorização cintigráfica simultânea.
Alguns radionuclídeos (ex.: 131I) ou pares de radionuclídeos (ex.: 99mTc/188Re) apresentam propriedades físicas ideais para aplicações de diagnóstico por imagem e, simultaneamente, para fins terapêuticos. O uso de radiofármacos para o diagnóstico e/ou terapêutica apresenta por isso uma relevância cada vez mais significativa, conduzindo à deteção precoce e terapia dirigida das patologias[9]. Por esta razão, a teranóstica6 é uma modalidade cada vez mais atrativa para o uso de radiofármacos.
Na Tabela 1.1 apresentam-se exemplos relevantes de radionuclídeos em atual utilização clínica, para diagnóstico ou terapêutica.
Tabela 1.1: Radionuclídeos em atual utilização clínica em medicina nuclear[10-12].
Radionuclídeo T1/2
Tipo de emissão
(energia) Aplicação clínica
18F 1,8 horas β+ (634 keV) Diagnóstico
PET
67Ga 3,2 dias γ (93, 185, 300, 394 keV) Diagnóstico
SPECT
68Ga 68,1 min β+ (1899 keV) Diagnóstico
PET
99mTc 6,0 horas γ (141 keV) Diagnóstico
SPECT
111In 2,8 dias γ (171 e 245 keV) Diagnóstico
SPECT
123I 13,2 horas γ (159 keV) Diagnóstico
SPECT
125I 59,4 dias γ (35,5 keV)
Radioimunoensaio
131I 8,0 dias γ (364 keV)
β (606 keV)
Diagnóstico + Terapêutica SPECT
177Lu 6,7 dias γ (113 e 208 keV)
β (490 keV) Terapêutica
153Sm 46,8 horas γ (103 keV)
β (máx: 634, 703 e 807 keV)
Terapêutica (permite imagem)
201Tl 3,04 dias γ (71, 135 e 167 keV) Diagnóstico
SPECT
1.2 Efeitos Biológicos das Radiações Ionizantes
As radiações ionizantes conduzem a diferentes eventos quando interagem com a matéria, podendo causar danos celulares. Muito embora os princípios radiobiológicos relativos à exposição da matéria a fontes externas de radiação (fotões) sejam os mesmos para a terapêutica com radionuclídeos (partículas), existem diferenças notáveis nos efeitos observados ao nível celular em mamíferos[7,13].
O ácido desoxirribonucleico (ADN) é a molécula mais radiossensível da célula, o que o torna por um lado a estrutura mais importante a proteger contra os efeitos nefastos das radiações ionizantes e, por outro, o alvo mais almejado para a terapêutica anti-carcinogénica, uma vez que é determinante para a sobrevivência celular. Os efeitos biológicos das radiações ionizantes com maior peso são os devidos a danos causados na dupla hélice do ADN. Estes danos podem ocorrer por interação da radiação diretamente com a molécula de ADN (efeitos diretos), causando ionização de um ou mais pares de bases nucleotídicas, ou por interação da radiação ionizante com outras moléculas presentes no meio intracelular, particularmente as moléculas de água. Neste caso, ocorre produção de espécies reativas de oxigénio (radicais livres), especialmente de radicais hidroxilo (OH•), por radiólise. Por sua vez, essas espécies radicalares interagem com a molécula de ADN, causando ionizações nucleotídicas (efeitos indiretos)[7,13]. As principais lesões causadas no ADN celular pelas radiações ionizantes caracterizam-se por quebras na cadeia nucleotídica. Estas quebras podem ser simples (SSB, do inglês Single-Strand
Breaks), quando ocorrem em apenas um dos lados da cadeia, ou duplas (DSB, do inglês
Double-Strand Breaks), quando ambos os lados da dupla hélice são danificados. Esses danos podem conduzir à morte celular por apoptose ou por necrose[13,14].
A presença de compostos antioxidantes e os mecanismos de reparação do ADN celular podem reduzir de forma significativa os efeitos das radiações ionizantes. Contudo, não são de forma geral muito eficientes contra radiações com elevada deposição de energia, estando ainda este tipo de radiação associada a efeitos diretos e a DSB, que conduzem a uma reduzida taxa de sobrevivência celular[7,13].
radiação com elevada LET. Esta grandeza tem particular importância no campo da terapêutica com radionuclídeos, uma vez que partículas α, β e eletrões Auger têm percursos diferentes na matéria biológica (ver Figura 1.3), que dependem da sua carga, massa e energia[11,13,14].
Figura 1.3:Representação esquemática do percurso de partículas α, β e eletrões Auger no meio celular e
subcelular.
A LET das partículas β é baixa e, dependendo da sua energia, estas partículas podem percorrer
até alguns milímetros a partir do local onde são depositadas. O diâmetro típico de uma célula é
de 5 a 20 µm. Assim, o alcance na matéria de uma partícula β corresponde ao diâmetro de várias
células (por exemplo, o alcance das partículas β emitidas pelos isótopos 177Lu, 131I e 153Sm é de 1,8 mm, 2,4 mm e 3,0 mm, respetivamente). Neste sentido, as células irradiadas por radiofármacos emissores não serão apenas as células alvo, mas também as células circundantes, sejam estas doentes ou saudáveis. Por este motivo, existe uma desvantagem na utilização deste tipo de radiofármacos, nomeadamente quando os tecidos circundantes ao tumor primário são tecidos com radiosensibilidade aumentada, como é o caso da medula óssea. Nos tumores de grandes dimensões, geralmente ocorrem alterações metabólicas que conduzem a um menor suprimento de vasos sanguíneos para as camadas celulares mais externas. Desta forma, a distribuição do radiofármaco neste tipo de tumor não será homogénea. Nestes casos de tumores ou metástases de grandes dimensões, existe uma vantagem clara na utilização de radiofármacos
que contenham radionuclídeos emissores de partículas β, uma vez que o seu relativamente longo
alcance vai permitir a irradiação do conjunto das células tumorais, mesmo que individualmente nem todas captem o radionuclídeo[11,13].
Por outro lado, as partículas α apresentam elevada LET, pelo que o seu percurso a partir do local
grandeza equivalente à dimensão de algumas células (menos de 100 nm), o que significa que muito pouca da energia emitida é depositada fora do grupo de células alvo. Contudo, uma das
desvantagens do uso de emissores de partículas α reside no facto de que estes radionuclídeos
têm que ser depositados em praticamente todas as células tumorais, sob pena de uma irradiação insuficiente do tumor, que poderia facilmente resultar numa recidiva tumoral.
Foi recentemente aprovado pela FDA (do inglês Food and Drug Administration) o primeiro
radiofármaco emissor de partículas α para terapêutica com radionuclídeos, o 223RaCl
2. Este tipo de radiofármacos é particularmente interessante para o tratamento de pequenas massas tumorais ou metastáticas de tumores da próstata com resistência à castração, que apresentem elevado suprimento sanguíneo e avidez metabólica[11,13].
Os eletrões Auger têm um alcance ainda mais curto do que as partículas α, percorrendo uma
distância máxima inferior à dimensão do núcleo celular, depositando por isso toda a sua energia num volume muito limitado (ver Figura 1.3). Para que apresentem radiocitotoxicidade, os emissores de eletrões Auger têm que ser depositados o mais próximo possível da dupla hélice de ADN das células alvo. Atualmente, não se encontra em utilização clínica corrente nenhum radiofármaco de emissores de eletrões Auger. No entanto, como discutido a seguir, radiofármacos com emissores de eletrões Auger são considerados bastante promissores, pois seriam muito adequados para o tratamento de metástases ou de pequenos tumores.
1.3 Radiofármacos para Terapia Auger
1.3.1. Radionuclídeos Relevantes e o Efeito Auger
Na sequência da transformação nuclear inerente ao processo de decaimento radioativo, o núcleo final ainda fica na maior parte das vezes num estado excitado. A libertação deste excesso de energia ocorre maioritariamente por emissão de radiação γ. Se o estado excitado tiver um tempo
de vida mensurável, estamos na presença de isómeros ditos metastáveis. Neste caso, o processo envolvido designa-se por transição isomérica, sendo o processo que ocorre no decaimento do 99mTc. Em alternativa, o excesso de energia do núcleo final é transferido diretamente para um
eletrão de uma orbital eletrónica interna (mais provavelmente da camada K), levando à sua ejeção por um processo que se designa "conversão interna".
ainda mais frequente em radioisótopos emissores de radiação gama de baixa energia. Na sequência deste processo, cria-se uma lacuna numa camada interna da distribuição eletrónica. É de salientar que o processo de decaimento radioativo designado por "captura eletrónica" também gera lacunas na camada mais interna da nuvem eletrónica. A captura eletrónica ocorre quando um eletrão da camada interna interage com um protão do núcleo para formar um neutrão[7,11,17].
Em qualquer um dos casos atrás descritos, a lacuna originada na camada interna por conversão interna ou por captura eletrónica é rapidamente preenchida, na sequência de uma cascata de transições eletrónicas, por eletrões das camadas mais externas (Figura 1.4). A diferença energética resultante deste rearranjo eletrónico pode, ou não, envolver a emissão de radiação ionizante, como por exemplo de fotões X de energia característica[10,15,16]. O processo de desexcitação que compete com esta emissão fotónica designa-se "efeito Auger". Como representado na imagem da direita da Figura 1.4, este efeito envolve a emissão de eletrões Auger, Coster-Kronig e Super Coster-Kronig, que se distinguem pela camada de origem envolvida do processo de transição eletrónica, mas é usual a designação comum de "eletrões Auger" para todos eles[10,15,16].
Figura 1.4: À esquerda, representação esquemática do processo de conversão interna. À direita, representação esquemática da libertação de um eletrão Auger.
O "efeito Auger" deve o seu nome ao físico francês Pierre Auger, que demonstrou a sua ocorrência durante a desexcitação eletrónica dos átomos. Durante vários anos, a importância deste fenómeno foi ignorada, sobretudo devido ao facto de a energia transportada por este tipo de eletrões ser negligenciável, quando comparada com a energia total libertada durante o decaimento radioativo[10,15-18].
energia depositada num raio de 1-2 nm), a sua LET é bastante elevada (4-26 keV/µm) quando comparada com os radionuclídeos atualmente em utilização clínica para terapêutica, como os emissores de partículas β (LET = 0,2 keV/µm), que apresentam alcances na ordem dos
milímetros (0,05-12 mm), como atrás referido[7,10,11,17]. Neste sentido, os eletrões Auger têm um grande potencial para utilização em terapêutica com radionuclídeos, sobretudo segundo o conceito da radioterapia dirigida.
Foi na década de 1970, na sequência de uma conferência organizada pelo Professor Feinendegen da Universidade de Düsseldorf, que começaram a ser feitos avanços consideráveis em relação à possível utilização de emissores de eletrões Auger para terapêutica antitumoral. Passados 10 anos, começaram a surgir estudos mais robustos que conduziram à melhor compreensão dos efeitos radiobiológicos dos eletrões Auger. Este tipo de decaimento resulta na emissão de eletrões de baixa energia, promovendo irradiação de elevada densidade eletrónica na vizinhança imediata do local de decaimento[10, 5, 6].
Estudos de microdosimetria permitiram concluir que os efeitos biológicos dos eletrões Auger apresentam uma dependência crítica à localização celular do radionuclídeo emissor, uma vez que quando esses isótopos se encontram no espaço extranuclear, não são detetados efeitos tóxicos relevantes nas células. Por outro lado, quando o decaimento ocorre próximo do ADN, os eletrões Auger provocam danos celulares característicos de radiação com elevada LET, nomeadamente quebras na cadeia nucleotídica, mutações, aberrações cromossómicas ou morte celular[11,15,16]. Por essa razão, o desenvolvimento da terapêutica com radionuclídeos emissores de eletrões Auger implica necessariamente que o radiofármaco seja captado pelo núcleo das células do órgão-alvo, sendo o ADN um alvo preferencial para os efeitos biológicos deste tipo de partículas[20,27-31].
Atualmente existe um número razoável de radionuclídeos emissores de eletrões Auger que são utilizados clinicamente em medicina nuclear para fins de diagnóstico. Na Tabela 1.2
apresentam-se alguns exemplos de isótopos emissores de eletrões Auger, como o Gálio-67 (67Ga), Tecnécio-99m (99mTc), Índio-111 (111In), Iodo-123 (123I), Iodo-125 (125I) e o Tálio-201 (201Tl). Contudo, cerca de metade dos radioisótopos cujo decaimento ocorre por transição isomérica ou por captura eletrónica são emissores de eletrões Auger[11,15,17].
Tabela 1.2: Propriedades físicas de alguns radionuclídeos emissores de eletrões Auger.
Radionuclídeo T1/2 Nr.º médio eletrões Auger emitidos por decaimento
99mTc 6,0 horas 4
111In 2,8 dias 14,7
123I 13,2 horas 14,9
125I 59,4 dias 24,9
O radioisótopo 125I é um dos emissores de eletrões Auger mais estudados. Para além do potencial interesse como emissor de eletrões Auger, o elevado período de semidesintegração do 125I e a emissão de radiação γ de baixa energia torna-o também atrativo para utilização em
ensaios preliminares de desenvolvimento de radiofármacos com 123I para imagiologia SPECT. Como descrito na Figura 1.5, o decaimento radioativo do 125I ocorre em duas etapas. Na primeira, o isótopo 125I, com um período de semidesintegração de cerca de 59,4 dias, decai por captura eletrónica para um estado excitado do Telúrio-125 (125Te), havendo emissão de radiação X característica e eletrões Auger provenientes da desexcitação eletrónica da camada L para a camada K. Este estado intermediário excitado tem um tempo de vida muito curto (cerca de 1,5 ns), e transforma-se em 125Tl (no estado fundamental) através de um processo de conversão interna, com emissão de fotões γ de 35,5 keV. Este processo de conversão interna conduz a nova emissão de eletrões Auger[19].
Figura 1.5: Processo de decaimento radioativo do 125I[19].
Os espectros dos radionuclídeos emissores de eletrões Auger são muito complexos, exigindo a aplicação de modelos computacionais e matemáticos sofisticados que têm vindo a evoluir ao longo das últimas décadas[10]. Fruto desses avanços, o Professor Roger Howell do grupo de trabalho de Medicina Nuclear da American Association of Physicists in Medicine publicou um estudo detalhado do espectro de emissão do isótopo 125I, que é apresentado na Tabela 1.3[19].
Além do 125I, outros radionuclídeos emissores de eletrões Auger têm sido estudados, sobretudo nos últimos anos, sendo de destacar o 99mTc e o 111In.
A maior parte dos radiofármacos em atual utilização clínica para diagnóstico corresponde a complexos de 99mTc. Do ponto de vista da aplicação dual, diagnóstico e terapia, existe muito interesse no desenvolvimento de radiofármacos tecneciados. Vários grupos têm dirigido a sua investigação para os efeitos decorrentes da emissão Auger do 99mTc. Recentemente, a importância dos eletrões Auger emitidos por este radioisótopo foi descrita por Cambien e colaboradores, que investigaram o fenómeno de hibernação das células do tecido tiroideu, por exposição in vivo ao ião 99mTc-pertecnetato (99mTcO4-). Outros grupos estudaram ainda os efeitos em ADN plasmídico de complexos de 99mTc com afinidade para o ADN, como derivados do antraceno, do DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindole) ou do alaranjado de acridina (Figura 1.6), entre outros[21-23].
(Derivado do 99mTc-DAPI) (Derivado da AO) (Derivado do Antraceno)
Figura 1.6: Complexos de 99mTc avaliados
in vitro como emissores de eletrões Auger. [21-23]
Vários radiofármacos utilizados para diagnóstico em medicina nuclear correspondem a péptidos ou anticorpos marcados com 111In. Este radionuclídeo emite cerca de 15 eletrões Auger por decaimento, o que faz com que haja interesse no estudo de potenciais radiofármacos marcados com 111In para terapêutica com radionuclídeos. Os grupos de investigação de Andreas Wicki e de Raymond Reilly têm desenvolvido trabalhos recentes que envolvem a utilização de péptidos ou anticorpos marcados com 111In, com o propósito de investigar o seu potencial enquanto radiofármacos para terapêutica por radionuclídeos emissores de eletrões Auger[24-26].
1.3.2 Moléculas Radiodadas para Terapia Auger
Com efeito, o primeiro radioisótopo utilizado na prática clínica foi o 131I, usado desde a década de 1940. O facto de ser um elemento com elevada afinidade para a glândula tiroideia e, simultaneamente, um emissor de partículas β, tornou-o atrativo para o tratamento do cancro da tiroideia, tendo sido posteriormente o primeiro radiofármaco em utilização clínica aprovado pela FDA[32,33]. Posteriormente, com o trabalho pioneiro de Hal Anger na década de 1960 que desenvolveu equipamentos capazes de obter imagens bidimensionais da distribuição de um radiofármaco no corpo de um paciente, a utilização de moléculas marcadas com 131I passou a poder ser seguida in vivo de forma mais fácil e não invasiva. Apesar das suas características físicas não serem as ideais para as Câmaras Gama (previamente designadas por Câmaras Anger) da medicina nuclear, ainda nos dias de hoje o isótopo 131I continua a ser utilizado extensivamente na clínica, sobretudo no âmbito da terapêutica com radionuclídeos.
Outros isótopos radioativos do Iodo são hoje em dia empregues para fins diagnósticos. Destaca-se o 123I com características físicas que se adequam melhor à obtenção de imagens nas modernas câmaras gama, largamente empregue em estudos cerebrais para diagnóstico de doença de Parkinson, com base no mapeamento in vivo da densidade do transportador dopaminérgico, utilizando um análogo da cocaína marcado com 123I. Mais recentemente, estudos sugerem a aplicabilidade de pequenas moléculas marcadas com 123I para diagnóstico do cancro da próstata e respetivas metástases que sobreexpressem o antigénio específico da próstata, PSA[34]. Têm também sido desenvolvidos estudos no sentido de apurar a utilidade clínica do uso do isótopo 124I, um emissor de positrões, para técnicas imagiológicas por PET[32,35,36].
Consideravelmente menos utilizado na prática clínica, o isótopo 125I foi bastante utilizado em radioimunoensaios. A sua utilização para imagiologia não é exequível uma vez que emite fotões
γ de apenas 35,5 keV, energia não adequada à deteção por SPECT. Mais recentemente, este
isótopo tem sido aplicado para braquiterapia, em doentes com carcinoma prostático[35,37,38]. Como já referido, o 125I é um isótopo do Iodo com grande relevância para desenvolvimento de radiofármacos para terapêutica Auger, área em que se insere o trabalho apresentado.
Existem diversas estratégias disponíveis para sintetizar moléculas marcadas com iodo radioativo (131I, 123I, 124I ou 125I), as quais foram desenvolvidas tendo em conta a química orgânica do elemento iodo e as restrições impostas pela elevada atividade específica7 dos radioisótopos do iodo. O desenvolvimento de compostos radioiodados para terapêutica Auger dirigida ao ADN envolve, de uma forma geral, a síntese e avaliação de compostos com capacidade de se incorporar na dupla hélice de ADN ou de estabelecer fortes interações intermoleculares com o ADN. Estas interações intermoleculares podem envolver a intercalação entre pares de bases ou interação com os sulcos maiores ou menores do ADN, como discutido com mais detalhe no subcapítulo 1.4[5]. Neste sentido, uma intensa investigação tem vindo a ser desenvolvida,
nomeadamente com compostos como o 123/125I-Iodoestrogénio, com especial afinidade para tumores com recetores de estrogénio, o 5-[125I]iodo-2'-desoxiuridina (125I-UDR), que substitui a timidina na estrutura do ADN, o 125I-iodoHoechst (125I-IH), que estabelece interação com o sulco maior do ADN, ou ainda derivados radioiodados de acridina, um conhecido intercalador do ADN (ver Figura 1.7)[28-30,40-44].
Figura 1.7: Compostos radiomarcados com 125I, investigados para terapia Auger.
É de referir que a utilização de radiofármacos de 125I enquanto emissores Auger tem também sido alvo de estudos recentes, com vista à terapêutica de tumores primários da próstata com sobreexpressão de PSMA e respetivas lesões secundárias. Os compostos representados na
Figura 1.8 foram já radiomarcados com 123I e têm comprovada utilidade para diagnóstico desta doença por SPECT. O composto representado por A1 foi também marcado com 125I para avaliação de efeito Auger e os estudos pré-clínicos em ratinho com tumor induzido mostraram uma resposta terapêutica com resultados bastante promissores[45].
A1 *123/125I A2
Figura 1.8: Compostos marcados com 123I, em investigação para diagnóstico de carcinoma da próstata.
A2 foi já marcado com 124/131I para diagnóstico PET e terapia com partículas β [45,46].
1.4 Compostos com Afinidade para o ADN e Modos de Interação
1.4.1. Estrutura do ADN e Tipos de Interação
A dupla hélice de ADN é um polímero que consiste em duas cadeias antiparalelas constituídas por açúcares (riboses) e grupos fosfato unidos por ligações fosfodiéster. Os pares de bases azotadas adenina/citosina e guanina/timina ligam-se por pontes de hidrogénio e associam-se às moléculas de ribose por ligações covalentes, como representado na Figura 1.9[47,48].
(a) (b)
Figura 1.9: (a) Representação esquemática da estrutura da molécula de ADN; (b) Representação dos sulcos maior e menor do ADN.
A arquitetura das duas cadeias polinucleotídicas da dupla hélice de ADN define uma conformação helicoidal da molécula, conferindo-lhe dois tipos de sulcos: o maior e o menor, tal como se representa na Figura 1.9[47,48].
Dada a importância do ADN como biomolécula e pelo facto de apresentar vários locais disponíveis para ligação, têm sido feitos esforços para desenhar novo compostos com capacidade para interagir com o ADN, que são particularmente interessantes pelo seu potencial como agentes terapêuticos contra vários tipos de patologias, nomeadamente o cancro[49,50]. Nesta área de investigação, um dos grandes desafios relaciona-se com a síntese de estruturas com capacidade de interação seletiva com o ADN, incluindo ADN de diferentes topologias[49].
Alguns compostos orgânicos interagem com o ADN de forma não-covalente, como representado na Figura 1.10. Neste tipo de interações, destacam-se as interações eletroestáticas (outside stacking), as interações por ligação aos sulcos maior e menor (major e minor groove
binding) e as interações por intercalação do composto entre os pares de bases
nucleotídicas[47-49,51].
Figura 1.10: Interação não-covalente de pequenas moléculas com o ADN. a) outside stacking; b) groove binding; c) intercalação.
As ligações eletroestáticas ocorrem devido à interação entre os grupos fosfato da dupla hélice de ADN, carregados negativamente, e as pequenas moléculas com carga positiva. A maioria dos corantes orgânicos tendem a formar este tipo de ligações. Alguns complexos metálicos, nomeadamente complexos catiónicos, interagem desta forma com os grupos fosfato do ADN. As interações de pequenas moléculas orgânicas do tipo groove binding ou por intercalação ocorrem devido ao envolvimento do π-π stacking, ligações por pontes de hidrogénio, forças de van der Waals ou interações hidrofóbicas. A diferença principal entre estas duas formas de interação reside no facto de, quando ocorre intercalação, surgir uma consequente distorção de conformação na estrutura do ADN, alteração que não se verifica nas interações do tipo major ou
minor groove binding[49-51].
A maioria dos compostos que interagem com o ADN por groove binding liga-se ao sulco menor. Nas interações do tipo groove binding, o composto interage diretamente com os pares de bases do ADN, nomeadamente com o par Guanina-Citosina (major groove) ou com o par Adenina-Timina (minor groove). Os groove binders não introduzem alterações conformacionais relevantes na estrutura do ADN. Este tipo de interação ocorre com compostos aromáticos ou heteroaromáticos[47-49].
a chamada interação por π-π stacking. Embora o processo de intercalação envolva geralmente um maior gasto energético do que outros processos de interação com o ADN, este tipo de ligação é bastante forte e estabilizada por forças de van der Waals, hidrofóbicas e eletrostáticas. A intercalação ocorre preferencialmente entre os pares de bases das sequências Citosina-Guanina e confere, como já mencionado, alguma distorção à conformação estrutural do ADN, reduzindo a sua liberdade de movimento[47-49,51].
Uma vez que a interação de pequenas moléculas com o ADN pode alterar a sua estrutura e consequentemente a sua função, torna-se essencial o estudo das propriedades físico-químicas dos complexos DNA-ligando resultantes, o que pode ser feito recorrendo a diferentes técnicas espectroscópicas, como discutido no capítulo 3[49,50,52].
1.4.2 Derivados do Alaranjado de Acridina
Vários derivados da acridina têm sido estudados pela sua capacidade de intercalação com as bases nucleotídicas do ADN para o desenvolvimento de fármacos com potencial ação quimio e radioterapêutica. O Alaranjado de Acridina (AO, do inglês Acridine Orange) é um composto heteroaromático planar, cuja estrutura se relaciona com a do antraceno e tem potencial como agente anticarcinogénico, o que motivou uma intensa investigação. Este foi o primeiro composto a ser proposto como modelo molecular para estudar a interação ligando-ADN, por Lerman, em 1961. Em 1977, Roger F Martin foi dos primeiros autores a publicar sobre a capacidade de indução de DSB no ADN por uma acridina radioiodada com 125I. Senait Ghirmai e colaboradores realizaram também uma extensiva investigação com compostos derivados da acridina marcados com 125I, sobre a sua capacidade de indução de danos irreversíveis na estrutura do ADN. Mais recentemente, estudos de Maryline Gardette mostraram o potencial de derivados da acridina marcados com 125I para terapêutica do melanoma com eletrões Auger[44,52-53,54-58].
Nos trabalhos desenvolvidos nesta tese utilizámos a AO como unidade intercaladora do ADN, com o objetivo de obter novos compostos marcados com 125I com potencial para terapêutica de tumores através de eletrões Auger.
Os derivados da acridina apresentam-se sob a forma de catião monovalente, como resultado da protonação no átomo de azoto da unidade aromática, mesmo sob condições neutras. Sabe-se também que a protonação neste átomo potencia a capacidade de o composto intercalar entre as bases nucleotídicas do ADN[49,53].
intercalação, que é potenciada por atrações eletrostáticas com os grupos fosfato. Derivados da AO são geralmente estáveis do ponto de vista químico e apresentam uma afinidade elevada para as moléculas de ADN. A sua elevada absorção de luz, intensidade de fluorescência e propriedades corantes faz com que esta estrutura molecular proporcione a realização de uma grande variedade de estudos espectroscópicos que facilitam o estudo da interação com o ADN, bem como a avaliação da captação celular dos compostos por microscopia de fluorescência[49,59]. Estas vantagens motivaram a escolha da AO como estrutura base dos derivados radioiodados que se descrevem nesta tese.
Figura 1.11: Estrutura química do Alaranjado de Acridina (A) e da Acridina (B).
É ainda de salientar que é bem conhecida a capacidade da AO se acumular seletivamente em sarcomas músculo-esqueléticos. Tem vindo a ser explorada a sua atividade fotossensibilizadora no tratamento in vivo desta doença por terapia fotodinâmica (PDT, do inglês Photodinamic
Therapy), através da irradiação com luz visível ou irradiação com baixas doses de radiação X.
Os resultados obtidos são promissores e a utilização clínica da AO para PDT neste tipo de tumores é já uma realidade[60,61]. Este comportamento favorável dos derivados de AO em terapia fotodinâmica leva-nos ainda a considerar que a obtenção dos congéneres radioiodados poderá potenciar novas aproximações teranósticas do cancro (PDT + imagiologia PET ou SPECT + Terapêutica Auger). No entanto, esta vertente encontra-se fora do âmbito do trabalho que é descrito nesta tese.
1.5 Objetivo do Trabalho
Nos últimos anos, tem sido feito um grande esforço para explorar as propriedades ionizantes dos emissores de eletrões Auger para terapia com radionuclídeos seletiva e dirigida. Entre os radionuclídeos emissores de eletrões Auger, o 125I apresenta particular interesse pois emite cerca de 20 eletrões por decaimento, em oposição aos 14 e 4 eletrões por decaimento emitidos pelo 111In e pelo 99mTc, respetivamente. Uma vez que os eletrões Auger apenas percorrem curtas
![Tabela 1.1: Radionuclídeos em atual utilização clínica em medicina nuclear[10-12].](https://thumb-eu.123doks.com/thumbv2/123dok_br/16502444.734097/36.892.136.761.501.1100/tabela-radionuclídeos-em-atual-utilização-clínica-medicina-nuclear.webp)
