Faculdade de Farmácia
BIOQUÍMICA CLÍNICA NA GRAVIDEZ
Rubina Vanessa Dias Cassaca
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Maria João
Monteiro dos Santos Ferreira da Silva e coorientado pela Professora
Doutora Maria Cristina Crespo Ferreira Silva Marques
Mestrado em Análises Clínicas
Faculdade de Farmácia
BIOQUÍMICA CLÍNICA NA GRAVIDEZ
Rubina Vanessa Dias Cassaca
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Maria João
Monteiro dos Santos Ferreira da Silva e coorientado pela Professora
Doutora Maria Cristina Crespo Ferreira Silva Marques
Mestrado em Análises Clínicas
III
Agradecimentos
Agradeço, especialmente, à supervisora de estágio, que acompanhou e prestou todo o seu apoio, não só durante a realização do estágio, como também na elaboração do relatório de estágio.
Doutora Ana Catarina Ferreira Rombo (Especialista em Análises Clínicas, do Laboratório de Análises Clínicas Dr. Joaquim Chaves).
Expresso os meus agradecimentos à orientadora da monografia, pela disponibilidade, assim como pela contribuição das sua preciosas críticas e sugestões, e à orientadora do estágio pela revisão do relatório e sugestões.
Doutora Maria João Monteiro dos Santos Ferreira da Silva (Professora Auxiliar, da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa) e à Doutora Maria Cristina Crespo Ferreira Silva Marques (Professora Auxiliar, da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa).
A todos os Técnicos e Especialistas em Análises Clínicas do Laboratório Dr. Joaquim Chaves dirijo o meu agradecimento, pela disponibilidade e simpatia.
Finalmente, o meu especial agradecimento aos meus pais que sempre me apoiaram incondicionalmente.
IV
Faculdade de Farmácia
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
Rubina Vanessa Dias Cassaca
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Maria Cristina
Crespo Ferreira Silva Marques e supervisionado pela Especialista em
Análises Clínicas, Doutora Ana Catarina Ferreira Rombo
Mestrado em Análises Clínicas
V O presente relatório de estágio resulta da componente Estágio Laboratorial/Monografia integrada no plano de estudos do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Este trabalho descreve parâmetros analíticos, assim como metodologias e equipamentos contactados durante o estágio profissional no Laboratório Dr. Joaquim Chaves nas áreas de Microbiologia, Bioquímica, Hematologia, Imunologia, Radioimunoensaio, Química Analítica e Fase Pré-Analítica.
Palavras-chave:
Análises clínicas; microbiologia; bioquímica; hematologia; imunologia
ABSTRACT
This internship report results from the Laboratory Internship/Monograph component integrated in the study plan of the Master in Medical Laboratory of the Faculty of Pharmacy, University of Lisbon. This work describes analytical parameters, as well as, methodologies and equipment contacted during the professional internship at the Laboratory Dr. Joaquim Chaves in the areas of Microbiology, Biochemistry, Hematology, Immunology, Radioimmunoassay, Analytical Chemistry and Preanalytical Phase.
Keywords:
VI
Resumo ... V
Abstract... V
Índice de Figuras ... VIII Índice de Tabelas ... VIII Abreviaturas ...IX Introdução ... 1 1. Fase Pré-Analítica ... 2 2. Microbiologia ... 3 2.1. Métodos ... 4 2.1.1. Exame Microscópico ... 4 2.1.2. Exame Cultural ... 6
2.2. Testes de Identificação Microbiológica ... 11
2.3. Equipamentos de Ensaio ... 14
2.3.1. Vitek® 2 Systems 05.01... 14
2.3.2. Cirtómetro Sysmex UF - 1000i ... 16
2.3.3. Sistema BacT/Alert 3D - 60 ... 17
2.4. Produtos Biológicos ... 17
2.4.1. Urina Asséptica ... 18
2.4.2. Trato Urogenital ... 22
2.4.3. Fezes ... 29
2.4.4. Exsudado Ocular e Exsudado Auricular ... 34
2.4.5. Sistema Respiratório Superior ... 37
2.4.6. Sistema Respiratório Inferior ... 39
2.4.7. Hemocultura ... 42
2.5. Antibiograma ... 44
2.5.1. Microdiluição ... 44
2.5.2. E-test ... 45
2.5.3. Método de difusão em placa de Kirby-Bauer ... 46
3. Core Laboratorial... 48
4. Hematologia ... 48
4.1. Hemograma... 49
4.2. Equipamentos de Ensaio ... 50
4.2.1. ADVIA® 2120 Hematology System ... 50
4.2.2. ADVIA® 2120 Hematology System with Autoslide ... 57
4.2.3. Analisador de Velocidade de Sedimentação VES - MATIC cube 200 ... 59
4.2.4. Analisador Imunohematológico AutoVue® Innova ... 60
4.2.5. VARIANT™ II Hemoglobin Testing System ... 62
4.2.6. Analisador BCS® XP ... 63
4.3. Técnicas Manuais ... 65
4.3.1. Determinação do Índice de Atividade da Fosfatase Alcalina Leucocitária ... 65
5. Bioquímica ... 66
VII
5.1.4. IMMULITE® 2000 Immunoassay System ... 70
5.1.5. COBAS e411 ... 70
5.1.6. CAPILLARYS® 2 ... 72
5.2. Analitos ... 72
5.2.1. Metabolismo Proteico ... 72
5.2.2. Metabolismo Lipídico ... 76
5.2.3. Metabolismo dos Hidratos de Carbono ... 78
5.2.4. Função Hepática ... 80 5.2.5. Função Renal ... 83 5.2.6. Função Pancreática ... 87 5.2.7. Função Tiroideia ... 89 5.2.8. Metabolismo Ósseo ... 90 5.2.9. Eletrólitos ... 92 5.2.10. Marcadores Cardíacos... 93 5.2.11. Marcadores Tumorais ... 94 6. Química Analítica ... 96 7. Imunologia ... 97 7.1. Técnicas de Diagnóstico ... 97 7.1.1. ELISA ... 97 7.1.2. Imunofluorescência ... 98 7.1.3. Imunoblot ... 98 7.1.4. Imunodifusão ... 99 7.1.5. Imunocromatografia ... 99 7.1.6. Aglutinação ... 100 7.2. Serologia Infeciosa ... 100 7.2.1. Hepatite A ... 100 7.2.2. Hepatite B ... 101 7.2.3. Hepatite C ... 103 7.2.4. VIH ... 103 7.3. Rastreio na Gravidez ... 105 7.3.1. CMV ... 105 7.3.2. Rubéola ... 107 7.3.3. Toxoplasma gondii ... 108 7.3.4. Sífilis ... 109 7.4. Autoimunidade ... 110 8. Radioimunoensaio ... 111 9. Controlo da Qualidade ... 112
9.1. Controlo de Qualidade Interno ... 112
9.2. Controlo de Qualidade Externo ... 113
Conclusão ... 114
VIII
Figura 2: Histograma de volume de eritrócitos ... 53
Figura 3: Histograma de concentração de hemoglobina de eritrócitos ... 54
Figura 4: Citograma de volume e concentração de hemoglobina dos eritrócitos ... 54
Figura 5: Citograma de dispersão de plaquetas ... 55
Figura 6: Citograma de absorção e dispersão de reticulócitos ... 56
Figura 7: Citogramas PEROX ... 57
Figura 8: Ilustração e classificação da reação CAT ... 60
Figura 9: Imunoensaio de captura de anticorpos ... 70
Figura 10: Reação de eletroquimioluminescência à superfície do elétrodo ... 71
Índice de Tabelas Tabela 1: Níveis de identificação ... 15
Tabela 2: Microrganismos causadores de ITU ... 19
Tabela 3: Defesas do trato urogenital e flora saprófita colonizadora ... 22
Tabela 4: Infeções genitais e respetivos agentes patogénicos ... 23
Tabela 5: Doenças mais comuns no trato urogenital masculino e feminino ... 24
Tabela 6: Meios de cultura (trato urogenital) ... 29
Tabela 7: Agentes causadores de disenteria ... 30
Tabela 8: Principais mecanismos fisiopatológicos e os respetivos agentes patogénicos 31 Tabela 9: Meios de cultura utilizados na coprocultura ... 31
Tabela 10: Parasitas intestinais mais frequentes ... 33
Tabela 11: Meios de cultura (exsudado ocular e auricular) ... 36
Tabela 12: Microrganismos causadores de infeção no sistema respiratório superior... 37
Tabela 13: Meios de cultura (sistema respiratório superior) ... 38
Tabela 14: Agentes patogénicos causadores de infeção no trato respiratório inferior ... 40
Tabela 15: Critérios de classificação para amostras de expetoração ... 41
Tabela 16: Critérios de semiquantificação aplicados a BAAR ... 41
Tabela 17: Meios de cultura (expetoração) ... 41
Tabela 18: Meios de cultura utilizados na hemocultura ... 43
Tabela 19: Antibióticos testados nas cartas de TSA, adaptadas ao sistema Vitek® 2 ... 45
Tabela 20: Antibióticos utilizados no método de Kirby-Bauer ... 47
Tabela 21: Alterações morfológicas reportáveis ... 58
Tabela 22: Alarmes emitidos pelo equipamento Advia® 2120 ... 59
Tabela 23: Fenotipagem ABO/Rh ... 61
Tabela 24: Proteínas plasmáticas e as suas respetivas frações ... 74
Tabela 25: Constituição do imunoblot para o VIH 1 e 2 ... 104
IX ADN Ácido Desoxirribonucleico
AES Advanced Expert System™
AgHBc Antigénio do core do Vírus da hepatite B
AgHBe Antigénio de replicação viral do Vírus da hepatite B AgHBs Antigénio de superfície do Vírus da hepatite B ALT Alanina Oxoglutarato Aminotransferase ARN Ácido Ribonucleico
AST Aspartato Oxoglutarato Aminotransferase BAAR Bacilos Álcool-Ácido Resistentes
CAM Gelose Campylosel
CAN Gelose chromIDTM Candida
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CHGM Concentração de Hemoglobina Globular Média CK-MB Creatina Quinase fração MB
CLED Gelose CLED
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CMI Concentração Mínima Inibitória CMV Citomegalovírus
CNA Gelose Columbia ANC COS Gelose Columbia CPS Gelose chromIDTM CPS
CQE Controlo de Qualidade Externo CQI Controlo de Qualidade Interno
CRSS Consortium for Retrovirus Serology Standardization
cTnI Troponina I cTnT Troponina T
DGS Direção-Geral da Saúde EAM Enfarte Agudo do Miocárdio EA Éster de Acridina
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ESBL Extended-Spectrum Beta-Lactamases
FA Fosfatase Alcalina
FTA-abs Fluorescent Treponemal Antibody absorption GAR Gelose Gardnerella
GFR Glomerular filtration rate - Taxa de Filtração Glomerular
GN Gram Negativos
GP Gram Positivos
HAEM Gelose Chocolate Haemophilus
Hb Hemoglobina
HbA1c Hemoglobina Glicada HDL Higth Density Lipoproteins
HEKT Gelose Hektoen
HGM Hemoglobina Globular Média
HPFH Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal
Ht Hematócrito
X IRA Índice Relativo de Avidez
ITU Infeções do Trato Urinário LDL Low Density Lipoprotein
LJ-T Meio de Lowenstein-Jensen LMC Leucemia Mieloide Crónica
MCK Gelose MacConkey
MSA Gelose Chapman
NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótico oxidado NADH Nicotinamida adenina dinucleótico reduzido PAI Pesquisa de Anticorpos Irregulares
PCR Polymerase Chain Reaction
PTH Parathormone - Paratormona
PTOG Prova de Tolerância Oral à Glicose PVX Gelose Chocolate PolyViteX RBC Contagem de Eritrócitos
RDW Índice de Dispersão Eritrocitário RIA Radioimunoensaio
SCS Gelose Schaedler
SGC Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol STRB Gelose chromIDTM Strepto B
TA Temperatura Ambiente TP Tempo de Protrombina
TPHA Treponema pallidum haemaglutination assay
TSA Teste de Suscetibilidade a Antibióticos
TSH Thyroid-stimulating hormone - Hormona Estimuladora da Tiroide
TT Tempo de Trombina
TTPa Tempo de Tromboplastina Parcial ativada T3 Triiodotironina
T4 Tetraiodotironina (T4)
UFC Unidades Formadoras de Colónias VDRL Venereal Disease Research Laboratory
VGM Volume Globular Médio VHA Vírus da Hepatite A VHB Vírus da Hepatite B VHC Vírus da Hepatite C
VIH Vírus da Imunodeficiência Humana VLDL Very Low Density Lipoproteins
VS Velocidade de Sedimentação
WHO World Health Organization
1
Introdução
O presente relatório de estágio resulta do Estágio de natureza profissional em Análises Clínicas, como parte integrante do plano de estudos do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Realizei o estágio no Laboratório de Análises Clínicas Dr. Joaquim Chaves, entre fevereiro e agosto de 2016, com a duração de 1080 horas, sob a orientação da Dr.ª Maria Cristina Crespo Ferreira Silva Marques, Professora Auxiliar, da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, e supervisão da Dr.ª Ana Catarina Ferreira Rombo, Especialista em Análises Clínicas pela Ordem dos Farmacêuticos, Responsável de área substituta do Core Laboratorial.
A atividade técnica do Laboratório Dr. Joaquim Chaves é coordenada pelo Diretor Técnico, Dr. Carlos Cardoso. O laboratório efetua análises no âmbito da Bioquímica Clínica, Endocrinologia, Hematologia, Imunohematologia, Imunologia, Alergologia, Microbiologia, Biologia Molecular, Genética Médica e Anatomia Patológica. O laboratório é uma entidade certificada, de acordo com os requisitos da Norma NP-EN-ISO 9001:2008, associada à Norma NP-EN-NP-EN-ISO-IEC-17025:2005 que define os requisitos gerais de competência para o laboratório de ensaio e calibração.
O presente estágio foi realizado com o intuito de providenciar a integração no meio profissional e contactar com os profissionais da área e, deste modo, aprofundar conhecimentos técnico-científicos relacionados com os processos envolvidos na rotina laboratorial, como também a aplicação de conhecimentos adquiridos ao longo da parte curricular do mestrado, e da observação prática do funcionamento laboratorial, nomeadamente das técnicas aplicadas na análise de parâmetros de rotina, como dos parâmetros não considerados de rotina, das técnicas de colheita adequadas para cada determinação em diversos produtos biológicos, dos processos envolvidos no controlo e garantia da qualidade e da correta interpretação dos resultados obtidos.
O presente relatório de estágio descreve os principais parâmetros analíticos aprendidos em cada valência, nomeadamente métodos aplicados, descrição dos equipamentos utilizados e a importância/significado clínico. Uma vez que o Laboratório Dr. Joaquim Chaves realiza uma vasta quantidade de parâmetros analíticos, sendo-me impossível descreve-los todos, limitei-me a referir, no meu entender, alguns dos parâmetros mais importantes e/ou frequentes no laboratório.
2
1. Fase Pré-Analítica
A fase pré-analítica engloba todos os processos envolvidos, desde da preparação do Utente, colheita da amostra, triagem, até ao envio da amostra para análise.
A grande maioria dos erros laboratoriais estão associados à fase pré-analítica. Os erros podem ser minimizados cumprindo os requisitos relacionados com a preparação do paciente, a colheita (técnica, material utilizado e identificação das amostras biológicas), acondicionamento, conservação, transporte para o laboratório, receção, verificação e processamento para posterior análise.
Na colheita da amostra deve-se considerar as variáveis controláveis que influenciam os resultados, as quais incluem variações associadas a fatores biológicos controláveis como, exercício e treino físico, variação circadiana, influência da dieta e fármacos, postura e imobilização. Quanto aos fatores não controláveis (idade, género, medicação, doenças existentes, etc.) deve-se ter o seu conhecimento, para tal é realizado um inquérito na altura da colheita, de modo a que os resultados estejam adaptados à situação do utente (Burtis C. et al., 2015).
Na área reservada às colheitas, no laboratório central, são colhidos vários tipos de amostras biológicas, como urina, sangue, saliva, suor e exsudados. Durante o estágio tive a oportunidade de observar a prática de colheitas de sangue venoso. Alguns dos aspetos importantes durante o procedimento da punção venosa são: a confirmação dos dados e a obtenção de informações relevantes (inquérito) acerca do utente (universal a qualquer tipo de colheita); a confirmação da prescrição médica, verificado o tipo de análises necessárias e a entrega das restantes amostras solicitadas (exemplo: urina e fezes); a correta rotulagem de todos os tubos necessários; a utilização adequada do tipo de agulha e a sua correta inserção, evitando hematomas, de forma a obter uma amostra integra (sem hemólise) e com volume suficiente; a duração da aplicação do garrote, quando este se prolonga por mais de 2-3 minutos pode causar hemoconcentração; homogeneização adequada e transporte atempado.
Existem vários tipos de tubos de colheita, designadamente sem anticoagulante (ativa a cascata da coagulação, obtém-se o soro, usado sobretudo em bioquímica), e com anticoagulante, nomeadamente o EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid) de sódio ou potássio (obtém-se sangue total, utilizado em técnicas moleculares e na hematologia, por exemplo, na execução de hemogramas), o citrato trissódico (obtém-se plasma, utilizado na hematologia para provas da coagulação) e a heparina (colhe-se sangue total, utilizado
3 na determinação de metais e gasometria). O EDTA previne a coagulação ao remover o cálcio ionizado, através de um processo de quelação, resultando a formação de um complexo entre o cálcio e o EDTA, e permite a preservação celular, assim como a conservação da morfologia celular. O citrato impede a coagulação ao neutralizar os iões de cálcio, os quais formam um complexo não ionizado (citrato de cálcio). A heparina é um anticoagulante natural (produzida por basófilos e mastócitos) que inibe a coagulação ao impedir a formação da rede fibrina, através da catalisação da inativação do fator trombina (IIa), pois a heparina atua como co-fator de ativação da enzima anti-trombina, a qual inativa vários fatores de coagulação, principalmente, a trombina (Bishop M. et al., 2010; Burtis C. et al., 2015).
A triagem das amostras provenientes dos vários postos de colheita, hospitais e domicílios, ocorre no laboratório central. A triagem inicia-se com o registo manual de entrada, no sistema informático (eDeiaLab), dos vários tipos de amostras, através de um sistema de leitura de código de barras, onde é assinalado os tubos em falta associados à prescrição médica (caso se aplique). Na triagem efetua-se a centrifugação dos tubos, a fim de se separar o plasma, ou soro, dos restantes componentes celulares sanguíneos, e a medição do volume das amostras de urina a tempo determinado. Nesta área encontram-se os equipamentos Genesis FE500 (Tecan), os quais efetuam a encontram-separação das várias amostras, através da leitura do código de barras, pelas diferentes valências, de acordo com os testes requisitados. As amostras não separáveis pelo equipamento, como as amostras destinadas as valências de Microbiologia, Anatomia Patológica e Biologia Molecular, são separadas manualmente.
2. Microbiologia
A área da Microbiologia Clínica compreende a bacteriologia, micologia e a parasitologia. O laboratório realiza a análise de diversos produtos biológicos, sendo os mais frequentes as urinas assépticas, as coproculturas e os exsudados, sobretudo os vaginais.
A atividade da área de Microbiologia inicia-se com a triagem dos produtos biológicos, efetuada pelos Técnicos de Análises Clínicas da área, de acordo com a diferenciação requerida face às exigências impostas relacionadas com a segurança e procedimentos técnicos específicos (exemplo: condições de conservação, acondicionamento e processamento pré-analítico), de forma assegurar a viabilidade dos
4 microrganismos patogénicos e evitar a contaminação ou desenvolvimento da flora comensal.
A área está organizada de modo a que o fluxo de trabalho cumpra, sempre que possível, o princípio de “marcha em frente”, reduzindo ao máximo o risco de contaminação cruzada. Portanto, a área encontra-se dividida em zonas específicas, nomeadamente triagem de amostras, processamento de produtos, identificação e antibiograma, avaliação de exames microbiológicos, parasitologia e citometria de fluxo (urinas).
2.1. Métodos:
2.1.1. Exame Microscópico:
Exame direto (a fresco):
O principal objetivo do exame é a observação (forma e mobilidade celular) dos microrganismos vivos (parasitas, bactérias, leveduras e fungos), na amostra biológica. É utilizado na deteção e identificação de parasitas nas fezes e em exsudados vaginais. O exame é, também, útil na avaliação semiquantitativa de elementos celulares e não celulares e de microrganismos.
Exame direto após coloração:
Utiliza-se a coloração de Gram e, em determinadas situações, a coloração Álcool-ácido. Este exame é útil para avaliar qualitativamente e semiquantitativamente a riqueza da amostra em elementos celulares e microbiológicos, bem como a sua disposição e morfologia. A coloração é efetuada pelo aparelho de coloração VWR (MIDAS/Mirastainer).
Coloração Gram:
É uma técnica de diferenciação microbiológica sobretudo utilizada para distinguir as bactérias Gram positivas das Gram negativas. Permite a determinação da morfologia celular, tamanho e disposição. É utilizada em produtos biológicos e em colónias provenientes dos meios de cultura, sendo, usualmente, o primeiro teste de diferenciação. Em alguns casos permite-nos a identificação presuntiva de um microrganismo ou a eliminação da hipótese de estar presente um determinado microrganismo.
A técnica consiste em utilizar uma coloração primária com um corante básico (cristal violeta), após a fixação da amostra. Seguidamente, aplica-se uma solução
5 contendo iodo (agente fixador - forma um complexo com o corante, permitindo o aumento da afinidade da célula para o mesmo). Depois, procede-se à descoloração com álcool (remove a coloração das bactérias Gram negativas). Por fim, aplica-se a safranina (corante básico) que cora as Gram negativas. As bactérias Gram positivas adquirem uma coloração púrpura, enquanto as Gram negativas obtêm uma coloração vermelho a rosa (Leboffe M.
et al., 2011).
A técnica baseia-se na diferença da constituição das paredes celulares entre as Gram negativas e as Gram positivas. O agente descorante (álcool) atua nos lípidos (extrai-os), tornando a parede mais porosa das Gram negativas e incapaz de reter o complexo cristal violeta/iodo. Contrariamente, as Gram positivas, devido ao facto de terem uma camada mais espessa de peptidoglicano e um maior número de cross-linking (devido aos ácidos teicóicos), retêm o complexo com uma maior eficácia, o que as torna menos suscetíveis à descoloração (Leboffe M. et al., 2011; Tortora G. et al., 2013).
Coloração Álcool-ácido:
Neste caso, utiliza-se o método de Kinyoun (uma variação da coloração de Ziehl-Neelson). É uma coloração diferencial, utilizada para identificar e quantificar Bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), na pesquisa de bactérias do género Mycobacterium. A técnica é útil no diagnóstico preliminar da tuberculose, tendo um valor preditivo superior a 90% em amostras de expetoração. Também, é útil para a monitorização da terapêutica antibiótica e para a determinação do grau de contagiosidade. O método baseia-se na presença de ácido micólico na parede celular de bactérias álcool-ácido resistentes. Este componente da parede possibilita uma maior afinidade para a coloração e uma maior resistência à descoloração microbiológica, pelo tratamento com uma solução ácido-álcool. Primeiro, faz-se uma coloração com a carbolfucsina (composto fenólico e lipossolúvel, com a capacidade de penetrar na parede celular). Uma vez que o corante está concentrado e, também, devido à sua elevada lipossolubilidade, não é necessário aquecimento da preparação (utilizado no método de Ziehl-Neelsen), pois o corante entra, igualmente, para o interior da célula. Depois, procede-se à descoloração com uma solução ácido-álcool (remove a coloração de células não BAAR) e, por fim, aplica-se o azul de metileno (contraste). O fundo é corado de azul para facilitar a visualização dos BAAR, os quais apresentam uma coloração vermelha a púrpura e são os únicos que resistem à coloração álcool-ácido (Koneman E. et al., 1997; Leboffe M. et al., 2011; Tortora G. et
6
2.1.2. Exame Cultural
No diagnóstico de infeções bacterianas é fundamental a realização da pesquisa do agente por exame cultural. Note-se que no diagnóstico do agente infecioso é, também, importante, quando aplicável, a realização do teste de suscetibilidade aos antimicrobianos e a pesquisa de antigénios específicos.
Neste exame é crucial a manutenção da viabilidade da bactéria, logo é importante o cumprimento das normas de colheita e de transporte, a fim de não destruir as bactérias ou de inibir o crescimento microbiológico. Deve ser efetuado, sempre que possível, antes da terapêutica antimicrobiana, de forma a obtermos uma resposta fiável.
No exame cultural é importante selecionarmos corretamente os meios, de acordo com os microrganismos que esperamos encontrar em cada produto biológico, assim como adequarmos corretamente as condições de incubação (atmosfera e temperatura) ótimas ao desenvolvimento dos microrganismos de interesse.
O objetivo é detetar e isolar o(s) microrganismo(s) de interesse, logo é importante selecionar as colónias a isolar, a fim de proceder à identificação e/ou antibiograma.
Meios de Cultura (Manual de Meios de Cultura e Suplementos, 2013)
✓ Gelose Columbia + 5% de Sangue de Carneiro (COS)
O COS (meio não seletivo) contém uma mistura de peptonas, que torna o meio indicado para o crescimento de bactérias exigentes, como Streptococcus e Listeria, e sangue de carneiro que permite o crescimento da maior parte das espécies bacterianas e a visualização da hemólise, a qual é um critério fundamental para a orientação da identificação. Pode, também, ser utilizado para o isolamento de microrganismos anaeróbios.
Quanto à expressão da hemólise, esta pode ser uma α-hemólise (observando-se uma coloração esverdeada, contornando as colónias) ou uma β-hemólise (visualiza-se uma zona clara por baixo ou à volta das colónias).
✓ Gelose Mac Conkey (MCK)
O meio seletivo permite a diferenciação de enterobactérias. A gelose contém cristal violeta, que possibilita a demonstração da fermentação da lactose pela mudança da coloração do meio (vermelho neutro). Deste modo, as bactérias fermentadoras da lactose originam colónias vermelhas ou rosa, por vezes, contornadas por um halo de sais biliares.
7 Os microrganismos não fermentadores da lactose geram colónias incolores ou bege ténue. Os sais biliares, juntamente com o cristal violeta, inibem o crescimento da maioria das bactérias Gram positivas.
✓ Gelose Chocolate Haemophilus (HAEM)
É um meio seletivo que permite, a partir de uma amostra polimicrobiana, o isolamento das diferentes espécies de Haemophilus. Contém uma base nutritiva, enriquecida em hemina e NAD (nicotinamida adenina dinucleótico), os quais advêm do
PolyViteX e da hemoglobina. Inclui, igualmente, uma associação de antifúngicos e
antibióticos, que inibem o crescimento da maioria das bactérias Gram positivas e das leveduras, tornando o meio seletivo.
✓ Gelose Chocolate PolyViteX (PVX)
É um meio de isolamento, concebido para espécies com necessidades nutricionais exigentes, como a Neisseria, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus. O isolamento de espécies exigentes é proporcionado pela adição de hemina e NAD, ao meio.
✓ Gelose Chapman (MSA)
Destina-se ao isolamento de Staphylococcus. O meio contém manitol que permite distinguir as bactérias fermentadoras, das não fermentadoras, do manitol. As bactérias fermentadoras originam colónias amarelas (critério para a orientação da identificação de
Staphylococcus aureus). O meio contém um elevado teor em cloreto de sódio que
restringe o crescimento de alguns microrganismos. ✓ Gelose Gardnerella (GAR)
É um meio de isolamento seletivo para a Gardnerella vaginalis. Contém antibióticos (inibem a maioria das leveduras e microrganismos) e sangue humano, que facilita o crescimento e possibilita a visualização da β-hemólise à volta das colónias, que quando obtida, em gelose de sangue humano, significa que existe uma elevada probabilidade de ser G. vaginalis.
✓ Gelose Schaedler + 5% de Sangue de Carneiro (SCS)
A gelose é um meio de isolamento, reservado à pesquisa de microrganismos estritamente anaeróbios e anaeróbios facultativos, em hemoculturas. O meio contém fatores de crescimento, como a hemina, extrato de levedura, vitamina K3 e sangue de
8 carneiro. O desenvolvimento das espécies anaeróbias é favorecido pela adição de um agente redutor (L-cistina) e glucose altamente concentrada.
✓ Gelose CLED (CLED)
Este meio de isolamento destina-se a amostras urinárias. A gelose permite a diferenciação dos microrganismos fermentadores da lactose (exemplo: E. coli) e impede o desenvolvimento de Proteus. As bactérias lactose positivas, através da acidificação do meio, geram colónias amarelas a amarelas-pálidas, enquanto os microrganismos não fermentadores da lactose originam colónias verdes, azuis ou incolores.
✓ Gelose Hektoen (HEKT)
Destina-se ao isolamento seletivo e diferencial de Salmonella e Shigella, em coproculturas. O meio tem como princípio a fermentação, de um, dos três açúcares, incluídos no meio (lactose, sacarose e salicina). As colónias de interesse são verdes ou azuis-esverdeadas (não há acidificação do meio), já as restantes são amarelas-salmão ou amarelas (devido à acidificação do meio). O meio contém sais biliares e corantes (citrato de ferro amoniacal, azul de bromotimol e fuscina ácida) que inibem o desenvolvimento de bactérias Gram positivas e limitam o crescimento de Proteus. O meio, também, contém hipossulfito de sódio, o que permite a distinção de bactérias produtoras de sulfureto de hidrogénio (H2S - reduzem o composto adicionado ao meio), através da formação de um
centro negro, na colónia. Após a incubação, as colónias de Salmonella são verdes ou azuis-esverdeadas, com ou sem centro negro, enquanto as de Shigella são da mesma cor, mas sem centro negro.
✓ Gelose Yersinia CN (YER)
Meio de isolamento seletivo de Yersinia (coproculturas). O meio contém cefsulodina, irgasan e novobiocina, responsáveis pela seletividade do meio. O irgasan (contém colato, desoxicolato, cristal violeta e antibióticos) inibe o desenvolvimento de bactérias Gram positivas e a maioria das bactérias Gram negativas. O manitol e o vermelho neutro, possibilitam a diferenciação da espécie pretendida, através da coloração. As colónias de Yersinia diferenciam-se das restantes bactérias, pela coloração rosa escuro a vermelho (devido à fermentação do manitol) ou, por vezes, incolor com centro colorido, e, ainda, podem apresentar um precipitado (à volta da colónia).
9 ✓ Sangue Desfibrinado de Carneiro ou Cavalo (Todd Hewitt Quilaban)
Meio de enriquecimento, adaptado ao crescimento de bactérias com necessidades nutricionais exigentes. Além de permitir o desenvolvimento de bactérias com um crescimento, ligeiramente mais lento, também permite a visualização da hemólise. Após a utilização do meio, a cultura é repicada para meios seletivos.
✓ Caldo Selenito F
O caldo é um meio de enriquecimento que favorece o crescimento da Salmonella (em colheita de fezes). O caldo é constituído por peptonas de caseína, carne e lactose, que favorecem o crescimento das espécies bacterianas, sobretudo as de crescimento mais lento, como a Salmonella. Após o enriquecimento, a cultura é repicada para meios seletivos.
✓ Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol (SGC)
Meio seletivo, indicado para o isolamento de fungos filamentosos e leveduras. A presença de glicose e peptonas, favorece o crescimento de espécies fúngicas. A gentamicina e o cloranfenicol inibem a maioria das bactérias Gram positivas e Gram negativas e melhora a seletividade, em relação a algumas espécies que possam exibir resistência à gentamicina, como o Streptococcus e o Proteus.
✓ Gelose Columbia ANC + 5% de Sangue de Carneiro (CNA)
Indicado para o isolamento seletivo de espécies bacterianas exigentes (bactérias Gram positivas). O meio contém ácido nalidíxo e colimicina, que inibem a maioria dos Gram negativos e dos Bacillus. Permite a visualização da hemólise, devido à presença de sangue. Também contém uma mistura de peptonas adaptadas a bactérias exigentes, como a Listeria e Streptococcus.
✓ Gelose Campylosel (CAM)
Utilizada no isolamento seletivo de Campylobacter intestinais, como C. jejuni e
C. coli em coproculturas. O meio contém antibióticos, antifúngicos e sangue de carneiro,
que facilitam o crescimento da espécie em causa. O Campylobacter cresce em colónias pequenas e cinzentas, ao longo das estrias da sementeira.
10 ✓ Gelose chromIDTM Strepto B (STRB)
Meio cromogénico seletivo para a deteção de Streptococcus do grupo B de Lancefield, nomeadamente S. agalactiae, em recém-nascidos e mulheres grávidas. É composta por uma mistura de peptonas, três substratos cromogénicos e antibióticos, que permitem a deteção de S. agalactiae (exibe uma coloração rosa-vermelho).
✓ Meio de Lowenstein-Jensen (LJ-T)
Destina-se à cultura de micobactérias, como o Mycobacterium tuberculosis. É um meio de enriquecimento, constituído por ovo, asparagina e fécula, os quais beneficiam o crescimento de micobactérias. Após a incubação, o M. tuberculosis apresenta colónias com aspeto “couve-flor”.
✓ Gelose chromIDTM CPS® (CPS)
É um meio cromogénico destinado ao isolamento e identificação de espécies bacterianas em colheitas urinárias. Possibilita a identificação direta de Escherichia coli,
Enterococcus, KESC (Klebsiella, Enterobacter, Serratia e Citrobacter) e Proteeae. O
meio permite a contagem das bactérias (unidades formadoras de colónias - UFC), através da utilização de um método padronizado de sementeira. O meio é composto por uma base nutritiva (mistura de peptonas) e dois substratos cromogénicos, que revelam a respetiva atividade enzimática. A gelose também contém uma elevada concentração de agar, que delimita a invasão do meio pelo Proteus.
Relativamente à identificação, as colónias de E. coli apresentam uma coloração rosa a vermelho escuro (ou translúcida com o centro rosa a vermelho escuro), enquanto os KESC exibem uma coloração verde azulado a azulado-cinza, Enterococcus turquesa e
Proteus beije com um halo castanho. Utiliza-se o meio só para a identificação direta de E. coli.
✓ Gelose chromIDTM Candida (CAN)
Meio cromogénico destinado ao isolamento seletivo de leveduras e à identificação direta de Candida albicans. Permite a identificação presuntiva de um conjunto de espécies, que incluem C. tropicalis, C. lusitaniae e C. Kefyr. A C. albicans apresenta uma coloração azul, devido à hidrólise específica de um substrato cromogénico de hexosaminidase.
11
2.2. Testes de Identificação Microbiológica:
✓ Teste da Catalase
Permite identificar a presença da enzima catalase. É utilizado na distinção dos
Staphylococcus (catalase positiva), dos Streptococcus (catalase negativa), orientando a
identificação definitiva. A enzima hidrolisa o peróxido de hidrogénio (H2O2) em água
(H2O) e oxigénio (O2). Verifica-se a realização da hidrólise pela libertação de oxigénio
(há a formação de “pequenas bolhas”).
✓ Identificação de Staphylococcus aureus
Utiliza-se o Kit de identificação rápida Pastorex™ Staph-Plus. O teste contém partículas de látex (reagente) sensibilizadas com anticorpos monoclonais específicos, que permitem detetar os polissacarídeos capsulares de S. aureus, a proteína A (presente na parede celular) e, também, possui um fator de afinidade do fibrinogénio (igualmente, denominado de coagulase ligada ou fator de aglutinação). O teste permite detetar bactérias altamente capsuladas através dos anticorpos anti-capsulares, como também estirpes de S.
aureus mal encapsuladas. As estirpes não encapsuladas são detetadas através do
fibrinogénio e da IgG (sensibilizada para a proteína A). O reagente é adicionado a uma amostra proveniente de um isolamento e, caso haja aglutinação visível, o resultado indica a presença de S. aureus (Bula Pastorex™ Staph-Plus, 2007).
✓ Teste da Oxidase
O teste rápido baseia-se na deteção da enzima intracelular oxidase. As bactérias que apresentam um sistema de transporte de eletrões (cadeia respiratória), designado citocromo oxidase, têm a capacidade de oxidar o citocromo, ao reduzir o oxigénio molecular (aceitador de eletrões da cadeia, em aeróbios). Desta forma, os recetores de eletrões da cadeia podem ser substituídos por substratos artificiais, onde a oxidação dos substratos pelo citocromo oxidase, na presença de oxigénio, produz um produto colorido. As bactérias oxidase positiva são aeróbias, mas tal não significa que sejam estritamente aeróbias, pois também podem ser oxidase negativa (quando não possuem citocromo oxidase) (Leboffe M. et al., 2011).
Se o resultado for positivo visualiza-se, em cerca de 10 a 30 segundos, após a adição do reagente oxidase (discos de papel), uma coloração entre o violeta e púrpura. Se o resultado for negativo há ausência de cor (Bula Oxidase Reagent, 2005).
12 Utiliza-se o teste na identificação de bactérias Gram negativas, nomeadamente para distinguir as Pseudomonadeceae (oxidase positiva) das Enterobacteriaceae (oxidase negativa). O teste é, igualmente, útil na identificação das Neisseriaceae, pois são oxidase positiva.
✓ Teste da Bacitracina
A bacitracina é um antibiótico polipeptídeo, produzido pela bactéria Bacillus
subtilis. Este antibiótico interfere com a síntese do peptidoglicano, composto maioritário
das paredes celulares, principalmente, nos Gram positivos. A bacitracina, em pequenas concentrações, inibe o crescimento de Streptococcus β-hemolíticos do grupo A de Lancefield. Os Streptococccus dos outros grupos de Lancefield são, normalmente, resistentes. Esta sensibilidade à bacitracina dos Streptococcus do grupo A permite a sua identificação presuntiva (Leboffe M. et al., 2011).
Na presença de colónias β-hemolíticas, na cultura, sugestivas dos microrganismos anteriormente referidos, semeia-se a partir de uma colónia isolada, uma placa de Columbia (com um disco do respetivo antibiótico). Se se verificar, após incubação até 24 horas, uma zona de inibição à volta do disco ≥ 15 mm, significa que se trata da presença de um Streptococcus do grupo A, numa situação contrária (há crescimento à volta do disco) sugere que é uma espécie pertencente aos restantes grupos de Lancefield.
✓ Teste da Optoquina
Utiliza-se na identificação presuntiva de Streptococcus pneumoniae. Ao contrário das restantes espécies de Streptococcus α-hemolíticos, o S. pneumoniae é sensível à optoquina. O composto químico atua ao nível da membrana celular do S. pneumoniae, provocando a lise da membrana através da alteração da pressão osmótica.
Inoculam-se no meio Columbia, colónias isoladas com α-hemólise sugestivas de
S. pneumoniae. Coloca-se um disco de optoquina e incuba-se durante 18-24 horas. A
formação de um halo de inibição ≥ 15 mm é sugestivo da presença de S. pneumoniae. Embora seja raro, pode existir estirpes de S. pneumoniae resistentes ao respetivo composto e, nesta situação, os halos são < 5 mm ou não há inibição.
✓ Teste CAMP
O teste CAMP (acrónimo para "Christie-Atkins-Munch-Petersen") reserva-se à identificação presuntiva de Streptococcus β-hemolíticos do grupo B de Lancefield. Na
13 gelose de sangue (meio COS) inocula-se o Staphylococcus CAMP, realizando uma única estria, em linha reta, que divide o meio em duas partes iguais. Seguidamente, semeia-se no meio uma colónia sugestiva de S. agalactiae, realizando uma única estria reta (afastada 2-3 mm e perpendicular ao inóculo de Staphylococcus CAMP) e incuba-se a placa durante 18-24 horas a 35±2ºC em estufa normal. Caso seja Streptococcus do grupo B (o teste é positivo para o fator CAMP), se observa uma hemólise completa em “seta” entre a junção da bactéria a testar e do S. aureus CAMP. O teste é negativo quando não ocorre uma hemólise reforçada.
O teste deteta uma proteína termo estável extracelular, produzida por S. agalactiae (fator CAMP), que atua sinergicamente na presença de uma β-hemolisina (produzida por
S. aureus) e, deste modo, induz um aumento reforçado da hemólise dos eritrócitos na
gelose de sangue (Mahon C. et al., 2011).
✓ Teste de Grupagem para identificação de Streptococcus β-hemolíticos
Efetua-se o teste utilizando o Kit de identificação rápida Pastorex™ STREP. O
Kit é um teste de aglutinação que agrupa as espécies de Streptococcus, de acordo com a
classificação de Lancefield. O teste baseia-se na reação anticorpo-antigene e utiliza suspensões de partículas de látex sensibilizadas com anticorpos específicos para os grupos A, B, C, D, F e G. O teste requer uma extração enzimática antes da identificação do antigénio polissacarídeo específico de cada grupo. As partículas de látex, que contêm anticorpos homólogos group-specific, aglutinam na presença do antigénio homólogo. O teste apenas faz uma identificação presuntiva, sendo necessários testes complementares para obter um resultado definitivo. A identificação de Streptococcus β-hemolíticos é complicada, por exemplo, algumas estripes têm dois grupos de antigénios (C e G) e alguns α-hemolíticos apresentam antigénios do grupo C (Bula Pastorex™ STREP Grouping
Streptococci, 2007).
✓ Galeria de identificação de Neisseria, Haemophilus e Moraxella
catarrhalis
A identificação de Neisseria, Haemophilus e Moraxella catarrhalis, executada por galeria de identificação API® NH, engloba uma série de mini-testes e uma base de
dados. A galeria permite a biotipagem de Haemophilus influenzae e Haemophilus
parainfluenzae e, também, a deteção de uma penicilinase. Contém 10 microtubos com
14 reações enzimáticas ou fermentativas de açúcares, realizadas pelos microrganismos. As reações traduzem-se pela mudança de cor, espontânea ou revelada (através da adição de reagentes). Após a leitura (quadro de leitura), a identificação é obtida consultando a lista de perfis do folheto informativo ou os sistemas de identificação correspondentes (Bula API® NH, 2010).
2.3. Equipamentos de Ensaio:
2.3.1. Vitek® 2 Systems 05.01 (bioMérieux)
O sistema Vitek® 2 destina-se à identificação de bactérias e leveduras, assim como
à realização do teste de suscetibilidade a antibióticos (TSA) e à deteção de mecanismos de resistência aos mesmos.
O ensaio inicia-se com a introdução do número de identificação das amostras no sistema, leitura do código de barras das cartas necessárias, colocação das cartas nas suas posições da cassete e preparação da suspensão padronizada da amostra com uma determinada turvação, de acordo com as especificações do fabricante. Todas as etapas anteriores ocorrem na estação de trabalho. Seguidamente, retira-se a cassete da estação de trabalho e coloca-se no Vitek® 2. Cada carta é inoculada por vácuo, selada, e colocada nos compartimentos de incubação e de leitura, automaticamente. A incubação ocorre
on-line a 35.5±1.0ºC, são efetuadas leituras da turvação e da cor, pelo sistema ótico, em
intervalos de 15 minutos, durante todo o processo. O tempo de incubação varia consoante o teste. Durante a leitura (por espectrofotometria) é medido a transmitância a vários comprimentos de onda no espetro visível. Posteriormente, os dados são analisados e interpretados pelo sistema (Manual Vitek® 2 Systems 05.01, 2006).
O equipamento possui uma base de dados e um software, o Advanced Expert
System™ (AES), que compara a informação obtida nas cartas de identificação com os
resultados das cartas de TSA. Tal, possibilita uma avaliação da concentração mínima inibitória (CMI) e a deteção do fenótipo do agente patogénico. A análise feita pelo AES tem em conta, não só cruzamento de dados da ID (Identificação Microbiológica) com o TSA, como, também, o fenótipo obtido, as resistências naturais do microrganismo, a coerência/comportamento dos antibióticos, entre outros aspetos. No final, o sistema emite os resultados, onde avalia o nível de confiança entre antibiograma e a espécie identificada. Desta forma, o equipamento permite reduzir o tempo necessário de identificação do microrganismo e de execução do TSA (Manual Vitek® 2 Systems 05.01, 2006).
15 Testes de Identificação:
A análise baseia-se em métodos bioquímicos. Os substratos utilizados permitem a determinação da atividade enzimática dos microrganismos, relacionada com a acidificação, a alcalinização e a hidrólise. Nos microrganismos Gram negativos efetua-se também a avaliação das resistências naturais aos antibióticos, nomeadamente à optoquina, bacitracina, novobiocina e polimixina.
No laboratório utilizam-se cartas adaptadas à: - Identificação de bacilos Gram negativos (GN) - Identificação de cocos Gram positivos (GP)
- Identificação de bactérias anaeróbias (ANC TEST KIT) - Identificação de leveduras (ID YST)
- Identificação de Neisseria, Haemophilus, Campylobacter sp., Moraxella catarrhalis e
G. vaginalis (ID NH)
A carta GP destina-se à identificação da maioria dos cocos Gram positivos, como os Enterococcus, Staphylococcus e Streptococcus, é constituída por 43 poços e o resultado é emitido após 8 horas. A carta GN permite a ID de bacilos Gram negativos fermentadores e não fermentadores, contém 47 testes bioquímicos e um poço de controlo negativo para a descarboxílase (usado como referência do valor base para o respetivo teste) e os resultados finais estão disponíveis após 10 horas. A ID YST identifica a maior parte dos fungos, incluindo a Candida e Crytococcus neoformans, apresenta 46 testes bioquímicos e o resultado é fornecido, aproximadamente, em 15 horas. A ID NH é composta por 30 testes bioquímicos que são finalizados em cerca de 6 horas.
Os resultados são expressos em níveis qualitativos de identificação (tabela 1) com base num cálculo estatístico realizado pelo sistema.
Tabela 1: Níveis de identificação.
Nível de confiança Probabilidade (%)
Excelente 96 – 99
Muito bom 93 – 95
Bom 89 – 92
Aceitável 85 – 88
Fraca discriminação Necessita testes suplementares, de forma a haver correspondência com a carta de sensibilidade.
16 Testes de suscetibilidade aos antibióticos:
O teste pode ser feito qualitativamente ou quantitativamente, pelo Vitek® 2 Systems, a partir do isolamento de colónias de microrganismos com interesse clínico. O
princípio das cartas de antibiograma assenta na determinação do CMI (utiliza a técnica de microdiluição). Cada carta contém uma combinação de fármacos específicos, adequados ao tipo de microrganismo que pretendemos analisar. Os resultados facultados pelo equipamento são reportados para cada fármaco, como “sensível”, “intermédio” ou “resistente”.
A consistência do antibiograma é feita automaticamente pelo software do equipamento. Caso não seja automaticamente validado após a interpretação pelo AES, ou se houver inconsistência nos resultados, tendo em conta a identificação (mais de 2 antimicrobianos com CMIs fora dos limites), o microrganismo deve ser retestado.
São utilizadas as seguintes cartas de TSA:
- Antibiograma Automatizado para Bacilos Gram Negativos (AST- N215, AST – N200, AST – N244 e AST- N222)
- Antibiograma Automatizado para Cocos Gram Positivo (AST P586, AST P619 e AST P576)
- Antifungigrama Automatizado para Fungos Leveduriformes (AST YS06)
Os antibiogramas e antifungigramas destinam-se à determinação da suscetibilidade do microrganismo in vitro aos antimicrobianos. Quanto às cartas para os Gram negativos, estas podem ser divididas em: avaliação da suscetibilidade da família
Enterobactereaceae (AST- N215, AST – N200 e AST – N244); Pseudomonas e outros
bacilos não fermentadores (AST – N222). Relativamente, aos Gram positivos as cartas AST-P586 destinam-se aos Enterococcus e S. agalactiae, a AST-P619 aos
Staphylococcus e a AST-P576 a S. pneumoniae.
Cada carta é composta por 64 poços, incluindo o poço de controlo. Cada poço contém uma determinada quantidade de um agente antimicrobiano, associado ao meio de cultura. O Vitek®2 permite a avaliação do crescimento do microrganismo em cada poço,
durante 18 horas, e no final da incubação é determinada a CMI.
2.3.2. Cirtómetro Sysmex UF - 1000i
O analisador automático associa a citometria de fluxo à impedância, possibilitando a contagem dos elementos presentes em urinas e em outros produtos
17 biológicos, como derrames de serosas. O equipamento utiliza a citometria de fluxo fluorescente, que permite a determinação do tamanho, da complexidade interna e da quantidade de material genético das partículas presentes na amostra.
O equipamento efetua a homogeneização, aspiração, diluição e coloração da amostra, e reporta os seguintes parâmetros: eritrócitos (RBC), leucócitos (WBC), células epiteliais (EC), cilindros (CAST) e bactérias (BACT). Também alerta para a presença de elementos, como cilindros, cristais, muco, esperma, leveduras e células pequenas redondas (células tubulares renais e do epitélio de transição).
2.3.3. Sistema BacT/Alert 3D-60 (bioMérieux)
O equipamento, utilizado na deteção microbiana, é um sistema analítico automatizado de incubação, agitação e monitorização de hemoculturas, onde são incubados os meios específicos para aeróbios e anaeróbios. O sistema permite identificar o desenvolvimento dos microrganismos numa fase precoce do processo. Este utiliza um sensor colorimétrico que identifica a presença de dióxido de carbono (CO2), dissolvido
no meio de cultura. Caso exista microrganismos na amostra a testar, o CO2 produzido
(resultante da metabolização dos substratos existentes no meio) é revelado pela mudança progressiva de cor de verde-azulado para amarelo, do sensor permeável ao gás (presente no fundo de cada frasco de hemocultura (meio de cultura)). Esta alteração de cor é identificada e monitorizada, automaticamente, por espetrofotometria de refletância a cada 10 minutos. O resultado final é negativo, quando o sistema não deteta o desenvolvimento de microrganismos após 7 dias (Manual BacT/Alert 3D-60, 2010).
2.4. Produtos Biológicos:
Após a avaliação dos exames microbiológicos, caso não haja crescimento de bactérias patogénicas, o resultado é expresso no boletim como “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”. Caso contrário (houve desenvolvimento de bactérias patogénicas), no boletim reporta-se a identificação do microrganismo e o respetivo teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (quando aplicável), de acordo com as regras EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) e/ou CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).
18
2.4.1. Urina Asséptica
As infeções do trato urinário (ITU) são o segundo tipo de infeção mais prevalente no Homem. Podem ocorrer em todas as faixas etárias, sendo mais prevalentes no sexo feminino. Estima-se que cerca de 50% das mulheres desenvolvem uma ITU ao longo da sua vida (Pommerville J., 2011). As ITU podem envolver o parênquima renal (pielonefrite), ureteres (ureterites), a bexiga (cistite) e a uretra (uretrite), e, nos homens, a próstata (prostatite) e o epidídimo (epididimite). Estas podem ser circunscritas a um caso isolado ou, ainda, recorrentes, recaídas e reinfeções. Uma ITU pode ser adquirida por três vias: via ascendente (é a mais frequente), a qual deve-se sobretudo à ocorrência de contaminação por flora perianal e fecal, onde o microrganismo poderá atingir, através da uretra, outros órgãos do sistema urinário; via hematógena ou descendente (infeção secundária a uma septicémia); via iatrogénea, induzida pela introdução de um cateter ou sondas vesicais (Mahon C. et al., 2011).
As manifestações clínicas dependem do hospedeiro (resposta inflamatória), da porção do sistema urinário envolvido, do agente etiológico e da gravidade da infeção. Os sinais e sintomas clínicos caracterizam-se, normalmente, por disúria, leucocitúria (urina turva devido ao pus), hemoglobinúria (urina escura) e polaciúria (ITU baixa), e, também, por febre e dor lombar (estão mais associadas a ITU alta) (Pommerville J., 2011).
É importante diferenciar a bacteriúria assintomática de sintomática (é aplicado de imediato o tratamento). A presença de leucocitúria é marcador de infeção urinária. Em certas situações uma bacteriúria assintomática pode evoluir para ITU, sendo necessário realizar tratamento antimicrobiano, nomeadamente em grávidas, idosos e pacientes cateterizados (IX Cong. Bras., 2004).
A maioria dos agentes patogénicos causadores de ITU são bacilos Gram negativos da família das Enterobacteriaceae, nomeadamente a E. coli (sendo mais associada à ITU não complicada), constituindo cerca de 95% do total das ITU (Cowan M., 2016). Contudo, outros agentes microbiológicos também podem causar uma ITU (tabela 2). As ITU complicadas, normalmente, são polimicrobianas (exemplo: doentes com pedras renais) e multirresistentes a fármacos (Mahon C. et al., 2011).
19 Tabela 2: Microrganismos causadores de ITU (Mahon C. et al., 2011; Pommerville J., 2011).
Frequentes Menos comuns Associada a doenças sistémicas Enterococcus (incluindo os vancomycin-resistant) Streptococcus agalactiae Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus Candida spp. Gardnerella vaginalis Ureaplasma urealyticum Mycoplasma hominis Mobiluncus spp. Leptospira spp. Mycobacterium spp. Chlamydia trachomatis (homens) Salmonella spp. (associado a gastroenterites) Schistosoma haematobium Cryptococcus neoformans Trichosporon beigelii Trichomonas vaginalis Aspergillus spp. Penicillium spp. Colheita:
Efetuar uma colheita de urina assética corretamente é determinante para obtermos resultados fiáveis. Embora a urina seja estéril, ao passar pela uretra durante a micção, arrasta flora microbiana consigo e, assim, pode induzir a erros na interpretação (exame cultural). Neste laboratório, para o diagnóstico de infeção no trato urinário, a maioria das urinas assépticas são colheitas do jato médio. Com menor frequência são recebidas amostras provenientes da punção de cateter urinário (algália), do saco coletor (bebés ou crianças sem o controlo dos esfíncteres), punção supra-púbica e punção renal (as punções são, exclusivamente, um ato médico). O laboratório disponibiliza-se só para a colheita de urina assética (jato médio) e do saco coletor.
Procedimento de colheita de Urina Asséptica:
Deve ser recolhida a primeira urina da manhã ou após retenção vesical de 2 a 3 horas. O utente deve lavar as mãos e limpar os genitais externos, a fim de diminuir ao máximo a contaminação da amostra. Na mulher a limpeza deve ser feita sempre da frente para trás e no homem na zona da glande. O utente deve descartar as primeiras gotas de urina e colher o jato médio para o coletor de urina asséptica. Após a colheita para coletor, transfere-se a amostra para um tubo com conservante por vácuo, posteriormente ambos os recipientes são enviados para o laboratório.
No caso de colheitas em bebés (saco coletor), o técnico deve lavar as mãos antes de iniciar o procedimento. Retira-se a fralda e faz-se uma limpeza da região perineal. Seguidamente, fixa-se o saco coletor de urina à volta do meato urinário. Caso o bebé não tiver urinado num intervalo de 30 minutos, o processo é repetido até se obter uma amostra.
Procedimento Laboratorial e Interpretação dos Resultados:
Todas as colheitas de urinas são analisadas pelo Citómetro, exceto se amostra apresentar um volume total inferior a 1 ml, realizando-se de imediato o exame cultural,
20 sem exame citobacteriológico, devendo-se alertar para o facto no boletim no campo das observações. Urinas que tenham uma elevada quantidade de muco também não são analisadas no Citómetro, pois podem comprometer o correto funcionamento do mesmo, como alternativa faz-se sempre a análise do sedimento. Todas as amostras são refrigeradas entre 2 a 8ºC até sair o resultado, no caso de ser necessário mais amostra para testes posteriores (exemplo: análise do sedimento).
Após a impressão da lista de trabalho, sempre que o equipamento emite um alerta “UTI” (possível infeção urinária), significa que a amostra possui um valor > 20 WBC/µl e > 30 BACT/µl ou com > 500 BACT/µl, deve-se semear a amostra em meio CLED. Também são semeadas todas as amostras que apresentem um valor > 20 WBC/µl ou > 400 BACT/µl (equipamento pode não alertar), assim como todas as urinas de bebés e amostras processadas em regime de urgência. Quando o equipamento emite o alerta “REV” (rever), significa que um ou mais parâmetros têm um valor anormal (exemplo: elevado número de eritrócitos ou presença de espermatozoides), e, nestes casos, efetua-se efetua-sempre a cultura e análiefetua-se do efetua-sedimento, de forma a confirmar/descartar o alerta facultado pelo equipamento.
Do total dos parâmetros analisados pelo Citómetro é sobretudo valorizado o número de leucócitos e de bactérias. O número de células epiteliais é útil para averiguar a correta execução da colheita.
Exame do sedimento urinário:
Centrifuga-se 10 ml de urina (do balão inicial) a 1500 rpm, durante 5 minutos e a partir do sedimento, faz-se o exame citológico. Ao microscópio ótico, avalia-se a presença de células epiteliais, leucócitos, espermatozoides, eritrócitos, cilindros, bactérias, leveduras e parasitas, bem como as possíveis interferências no resultado do Citómetro de fluxo. Quantificam-se os elementos com a ampliação de 400x. O valor reportado resulta da média do número obtido em 10 campos, multiplicado pelo fator 5, de forma a obter o nº/µl de amostra.
Exame cultural:
A urina é semeada no meio CLED com uma ansa descartável (calibrada de 10 µl). A incubação dá-se a 35±2ºC, durante 18-24 horas em estufa normal. Em situações pontuais, por exemplo, utente está a fazer terapêutica com antibióticos, a incubação pode-se prolongar até 48-72 horas, caso a cultura pode-seja negativa às 24 horas.
21 A valorização clínica das amostras, para além de ter em conta os dados obtidos pelo Citómetro, tem em consideração a contagem das colónias:
10 colónias = 1000 UFC/ ml (103) 100 colónias = 10 000 UFC/ ml (104) 1000 colónias = 1000 UFC/ ml (105)
Considera-se positivo culturas com contagens ≥ 105 UFC/ml, exceto nas seguintes
situações: nas crianças e diabéticos e, sempre que a informação clínica justifique, são valorizadas contagens de 103 ou104 UFC/ml. A informação clínica é imprescindível na
valorização da cultura, por exemplo, nas situações em que o utente apresenta polaciúria (urina é mais diluída) ou esteja a fazer tratamento com antimicrobianos, valorizam-se culturas com 103 UFC/ml.
Valorizam-se culturas com um microrganismo predominante. No caso de culturas mistas, normalmente, solicita-se repetição da colheita a fim de confirmar os resultados. Se com nova colheita surgir a mesma situação, coloca-se a hipótese de se tratar de uma infeção dupla. Note-se que podem ocorrer situações pontuais de uma infeção provocada por duas bactérias diferentes, especialmente, em pessoas de risco, pois numa pessoa saudável é incomum. Podem surgir infeções duplas por dois Gram negativos e, também, situações que a cultura apresenta um Gram positivo e outro negativo, em que provavelmente um é o agente infetante e o outro o colonizador. Nas culturas mistas nem sempre é possível isolar o agente patogénico, o que pode comprometer o resultado.
Se o exame citobacteriológico for positivo e se for considerado clinicamente valorizável, procede-se à respetiva identificação do microrganismo e execução do TSA.
Identificação e Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA):
Quando se obtêm colónias sugestivas de E. coli no meio CLED, procede-se à sua repicagem (meio CPS), a fim de realizar a sua identificação presuntiva. O meio CPS é incubado durante 18-24 horas (35±2ºC). O crescimento de colónias com uma coloração rosa a vermelho em CPS, possibilita a identificação direta da E. coli. Posteriormente, realiza-se o respetivo TSA no Vitek® 2.
Quanto ocorrem culturas não sugestivas de E. coli no meio CLED, através da observação macroscópica das colónias, pode-se deduzir que se trata de uma bactéria Gram positiva ou negativa. Embora o meio CLED seja dirigido para o crescimento bacteriológico, também pode ocorrer crescimento de leveduras. Se necessário, recorre-se
22 à coloração de Gram, caso seja insuficiente utilizam-se testes complementares de identificação. Quando é necessário isolar o agente patogénico, os Gram negativos são repicados para meio MCK, enquanto os Gram positivos são repicados para o meio CNA. Após isolamento efetua-se a identificação e TSA automático.
No caso de se valorizar o crescimento de leveduras (Candida spp.) em meio CLED, as colónias são repicadas para o meio CAN (permite a identificação direta de C.
albicans (colónias azuis)). No caso de a identificação ser inconclusiva, procede-se à
identificação e TSA no Vitek® 2 (se solicitado pelo médico), caso contrário o resultado é
reportado no boletim como Candida spp.
No Boletim Clínico, caso o exame bacteriológico seja positivo, para além dos resultados obtidos na análise do sedimento urinário, reporta-se a identificação e o resultado do TSA. Relativamente ao TSA, reportam-se as resistências (se houver) e as sensibilidades.
2.4.2. Trato Urogenital
O trato genital contém uma flora saprófita (microbiota), que varia consoante o sexo e, também, individualmente. Esta flora, juntamente com as defesas locais (tabela 3), impede o desenvolvimento da maioria dos microrganismos (Cowan M., 2016).
Tabela 3: Defesas do trato urogenital e flora saprófita colonizadora (Cowan M., 2016).
Defesas locais Microbiota
Trato urinário
(masculino e feminino)
Saída da urina que lava a zona e arrasta células epiteliais; pH urina, IgA secretora, lisozima e
lactoferrina da urina
Streptococcus não hemolíticos, Staphylococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, Prevotella,
Veillonella, Gardnerella Trato genital feminino
(crianças e pós-menopausa)
Secreção de muco e IgA secretória Igual à do trato urinário
Trato genital masculino Igual à do trato urinário
A uretra é uma zona estéril exceto zona exterior, onde a flora é igual à do trato urinário. A zona exterior do pénis contém Pseudomonas e
Staphylococcus e bactérias Gram
negativas anaeróbias
Na mulher a cavidade uterina, endocolo, trompas e ovário, são estéreis, enquanto a vulva, vagina e exocolo, contêm uma flora própria. As bactérias mais abundantes na vagina, os Lactobacillus, são importantes na manutenção do pH ácido vaginal (3,8 a 4,5), através da produção de ácido láctico. Também produzem peróxido de hidrogénio que, em conjunto com o ácido láctico, inibe a maioria dos outros microrganismos. O estrogénio tem um papel fundamental no desenvolvimento dos Lactobacillus. Esta hormona sexual
23 é produzida em maiores quantidades durante a idade fértil feminina e promove o aumento da produção de glicogénio no epitélio vaginal, que se degrada em glicose, sendo posteriormente metabolizada pelos Lactobacillus em ácido láctico (Cowan M., 2016; Pommerville J., 2011).
Os agentes patogénicos mais frequentes, causadores de infeções no trato genital feminino, são a Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae,
Mycoplasma sp. e Chlamydia trachomatis. Enquanto que no homem é mais recorrente o
aparecimento de infeções, causadas por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,
Pseudomonas spp. e Enterobacteriaceae (IX Cong. Bras., 2004). O tipo de infeção, de
acordo com a sua localização e agente patogénico frequentemente associado, bem como o tipo de doenças mais comuns no trato urogenital e respetiva sintomatologia, encontram-se descritos nas tabelas 4 e 5.
Tabela 4: Infeções genitais e respetivos agentes patogénicos (Cowan M., 2016; Mahon C. et al., 2011; Pommerville J., 2011; IX Cong. Bras, 2004).
Tipo de infeção Microrganismo
Femenino
Vulvovaginites
Candida spp., Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Prevotella, Porphyromonas, Peptostreptococcus, Mobiluncus, Mycoplasma Hominis e Ureaplasma spp.
Bartolinite N. gonorrhoeae, U. urealyticum e Enterobacteriaceae. Com menos incidência: anaeróbios, C. trachomatis, S. aureus
Cervicites Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, Mycoplasma, Ureaplasma
urealyticum
Endometrites/Salpingite
Bacteroides spp, C. trachomatis, N. gonorrhoeae (principalmente em
salpingite), Enterococcus spp., S. agalactiae, enterobactérias, L.
monocytogenes, Actinomyces spp. (associado ao DIU).
Uretrite (ambos os sexos)
Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma sp., Haemophilus spp. (no
homem)
Masculino
Epididimite/Orquite Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, Enterobacteriaceae,
Pseudomonas spp.
Prostatite
Flora gastrointestinal, Chlamydia trachomatis e Neisseria
gonorrhoeae (normalmente resulta de uma infeção prévia do trato
