A ação espasmolítica do óleo essencial de
Lippia microphylla
Cham. e de seus constituintes majoritários envolve o bloqueio do
influxo de cálcio em íleo de cobaia
Universidade Federal da Paraíba
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais
e Sintéticos Bioativos
A ação espasmolítica do óleo essencial de Lippia microphylla Cham. e de seus constituintes majoritários envolve o bloqueio do influxo de cálcio em
íleo de cobaia
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS
BIOATIVOS. Área de Concentração: FARMACOLOGIA
ORIENTADORA: Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
O48a Oliveira, Gislaine Alves de.
A ação espasmolítica do óleo essencial de Lippia
microphylla Cham. e de seus constituintes majoritários envolve o bloqueio do influxo de cálcio em íleo de cobaia / Gislaine Alves de Oliveira.- João Pessoa, 2013.
111f. : il.
Orientadora: Bagnólia Araújo da Silva Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS
1. Produtos naturais. 2. Lippia microphylla. 3. Timol. 4. Carvacrol. 5. Ação espasmolítica.
A ação espasmolítica do óleo essencial de Lippia microphylla Cham. e de seus constituintes majoritários envolve o bloqueio do influxo de cálcio em
íleo de cobaia
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS
BIOATIVOS. Área de Concentração: FARMACOLOGIA
Aprovada em18/02/13
Oliveira. Mainha e Painho, essa vitória é de vocês, por tudo que têm feito por mim desde sempre e pela confiança em mim depositada. Por se doarem tanto e esperarem nada em troca. Por serem meu refúgio e meu alicerce. Sem vocês nada seria possível.
Ao irmão mais lindo do mundo, Gerfesson Alves de Oliveira, pelas horas de aperreio, de músicas trocadas, piadas ditas, risos frouxos que me levaram para longe do estresse do dia a dia e me fizeram ver que o trabalho não era o mais importante.
À avó mais maravilhosa que alguém pode ter, Maria Inês da Silva. A senhora é o maior exemplo de lutas e vitórias, é o melhor livro, a melhor história. Por todo o amor que recebi de ti, por cada oração e por acreditar em mim de maneira incondicional. Amo-te completamente e isso ainda é pouco.
e incentivo, broncas, puxões de orelha, ombros amigos para suportar as lamúrias dos experimentos que deram errado, orações, o simples fato de acreditar. Atos simples, mas que fazem o caminho mais suave e as dificuldades mais fáceis de suportar. Por isso agradeço:
À Força Superior que governa esse Universo, a quem costumeiramente chamamos de Deus, por ser tão maravilhoso em minha vida, por tornar possível realizar tantas coisas, mesmo com todas as dificuldades apresentadas, as quais só me tornaram mais forte. Por me mostrar que a música é a maneira mais rápida e bela de encontrar as respostas, chorar as queixas e agradecer pelas bênçãos.
À Bagnólia Araújo da Silva, minha orientadora, por ter me acolhido desde a Iniciação Científica e ter continuado comigo durante o Mestrado. Obrigado por tantas vezes ter mostrado qual o melhor caminho, por me permitir expressar quando as coisas não iam bem, pelas conversas na salinha do café e por mostrar que as coisas sempre vão melhorar. Agradeço-te por incentivar sempre o pensamento crítico, por mostrar que o que já vem pronto não é tão bom quanto aquilo que podemos conquistar através da força própria e pela confiança em mim.
Ao Prof. Josean Fechine Tavares e sua aluna Paula Ferreira dos Santos pela gentileza em ceder o óleo objeto de estudo deste trabalho.
À Profa. Viviane L. A. Nouailhetas e à técnica Vera L. S. Rigone do Laboratório de Eletrofisiologia da UNIFESP, pelo suporte para execução dos experimentos de medidas de cálcio citosólico.
em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, em especial a: Eduardo Oliveira, Demétrius Araújo, Maria de Lourdes Pereira e Bagnólia Araújo, por mostrarem que uma Pós-graduação deve ser feita com pensamento crítico aguçado, deixando sempre claro que ser Professor não é apenas transmitir o conhecimento e sim extrair do aluno aquilo que de melhor ele tem.
A todos os colegas que estão ou passaram pelo Laboratório de Farmacologia Funcional Prof. George Thomas, entre eles, Alice Bezerra, Aline Brito, Ana Carolina Correia, Ana Caroline Lima, Anne Abreu, Cibério Macêdo, Fabiana Cavalcante, Fabio Monteiro, Fernando Queiroga, Filipe Oliveira, Giulyane Moreno, Hannah Olga, Iara Luna, Italo Martins, Joedna Cavalcante, Joelmir Silva, Juliana Carreiro, Layanne Cabral, Luiz Henrique César, Maria da Conceição, Massilon Junior, Núbia Melo, Polyana Silva, Rafael Travassos, Rosimeire Ferreira, Sarah Rebeca e Tamyris Freire pela ajuda, amizade, boa convivência e discussões científicas nas reuniões por vezes intermináveis, mas imprescindíveis.
À Ana Carolina Correia, pelos experimentos realizados na UNIFESP, pela disposição em trabalhar em conjunto em prol de algo maior, pelas dúvidas esclarecidas e por compartilhar o conhecimento.
Aos amigos que fiz durante este tempo no Laboratório de Farmacologia Funcional Prof. George Thomas, Ana Caroline Lima, Iara Luna, Italo Martins, Joedna Cavalcante, Luiz Henrique César, Rafael Travassos e Rosimeire Ferreira, por transformarem trabalho em diversão, pelas gargalhadas inacabáveis na sala do café, pelos sábados trabalhados em conjunto, pelas happy hours no fim do
expediente, pelos conselhos, pelas caronas, por serem os ombros amigos nas horas difíceis e por ficarem tão ou mais felizes que eu por uma conquista minha. Espero levá-los para sempre comigo, vocês fazem valer a pena!
Aos visitantes colaboradores do nosso laboratório, tão carinhosamente
amigos, novas risadas, novas e boas lembranças.
As minhas tutoras no Programa de Bolsas REUNI, na disciplina Fisiologia Humana I, Professoras Maria Regina Freitas, Rachel Linka Gouveia e Rita de Cássia Sá, por me guiarem no árduo caminho que é Ensinar. Obrigada por me
aceitarem enquanto “intrusa” nas suas salas de aula e por partilharem essa experiência comigo.
Aos alunos queridos do curso de Educação Física da Universidade Federal da Paraíba do primeiro período nos semestres letivos 2011.1; 2011.2; 2012.1 e 2012.2 com os quais tive a oportunidade de conviver e passar um pouco do conhecimento adquirido, por ocasião do Programa de Bolsas REUNI. Obrigada por fazerem parte dessa experiência comigo, por se disporem a me ouvir, por me questionar, por me ajudar a crescer e por me fazer ter a certeza de que profissão mais bonita que Educador não há.
Aos amigos que fiz na graduação em Farmácia, por acreditarem que eu conseguiria vencer mais essa batalha, por sempre darem um jeito de nos revermos, por se fazerem presente nos melhores momentos da minha vida, pelo aprendizado ao longo de quatro anos juntos. Vocês fizeram a melhor turma que alguém poderia ter!
A todos os amigos e colegas da turma de Mestrado 2011 por dividirem o aperreio e a felicidade que é fazer parte disso tudo, pelas vezes que nos cruzamos nos corredores e vimos o olhar aflito do outro e ainda assim sorrimos, com a certeza de que tudo terminaria bem.
À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos em nome dos Professores Dra. Maria de Fátima Agra e Dr. Josean Tavares pela competência pela qual coordenam este Programa.
Às secretárias da Pós-graduação Tânia M. A. Araújo e Caroline Mangueira, por toda dedicação, eficiência e cuidado com que fazem seu trabalho.
Ao José Crispim Duarte, pela sua amizade, competência e auxílio técnico nos mais variados problemas no laboratório e no biotério.
Ao Luís C. Silva e Adriano S. Cordeiro por trabalharem tão arduamente para que possamos realizar nossos experimentos, por sua dedicação e cuidado no trato dos animais no Biotério e no laboratório, por serem exemplos de brasileiros batalhadores.
À Mônica por fazer do seu trabalho a nossa terapia, tendo sempre uma palavra de incentivo, por entender nossos estresses e ser sempre uma mãezona para todos.
Aos meus amigos queridos que deixei na minha cidade natal, mas que levo sempre no meu coração, Júlia Aragão, Karla Rafaela Galindo e Luann Souza. Obrigada pelo apoio incondicional, por sempre acreditarem que essa aventura daria certo, pela compreensão quanto ao nosso tempo longe, pelas horas vividas na internet, por me deixarem fazer parte das vossas vidas. O lugar de vocês é especial em minha vida.
mesmo sem entender direito sempre me apoiaram. Obrigada Maria Helena, Niedja Carla, Suêdja Bruna, Vanessa Pereira, Suzana Maria e Josilene Pontes.
Aos tantos Professores que fizeram parte da minha formação desde o Pré-escolar, pois foram eles que deram o pontapé inicial para que tudo isso acontecesse, quando incentivavam a leitura, as feiras de Ciência, as aulas de Química, a História acontecendo ali diante dos meus olhos em cada aula, as poesias ganhando vida na aula de Português, todos tão importantes que não poderia citar um único nome sem ser injusta com os demais.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pela bolsa concedida e pelo suporte técnico científico através do Portal Periódicos.
À Universidade Federal da Paraíba, instituição responsável pela minha formação profissional, onde aprendi a ser adulta e vivi alguns dos melhores anos da minha vida dos quais vou lembrar sempre com uma pontada de saudade.
A todos que de maneira direta ou indireta contribuíram para a produção desta dissertação de mestrado.
Muitíssimo obrigada!
A educação é um processo social, é desenvolvimento.
Não é a preparação para a vida, é a própria vida.
RESUMO
O óleo essencial extraído das partes aéreas de Lippia microphylla Cham.
(Verbenaceae) (LM-OE) apresenta como componentes majoritários o timol e o carvacrol. O objetivo deste trabalho foi investigar e caracterizar o efeito espasmolítico do óleo LM-OE em íleo de cobaia, bem como verificar se este efeito era devido aos seus constituintes majoritários. Foram realizadas medidas de contrações isotônicas e isométricas e do cálcio citosólico. O óleo LM-OE inibiu as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina ou de carbacol (CCh) (CI50 = 15,8 ± 2,3 e 24,4 ± 2,9 µg/mL, respectivamente). Da mesma forma, o timol, o carvacrol e a mistura timol/carvacrol antagonizaram as contrações fásicas induzidas por histamina (CI50 = 14,2 ± 1,6; 13,6 ± 1,3 e 13,0 ± 2,1 µg/mL, respectivamente) ou por CCh (CI50 = 21,3 ± 3,8; 16,0 ± 2,6 e 27,9 ± 4,8 µg/mL, respectivamente). Quando comparado com o óleo, não houve diferença em nenhum dos casos. Do mesmo modo, o óleo LM-OE relaxou, de maneira equipotente, o órgão pré-contraído com 40 mM de KCl, com 10-5 M de CCh ou com 10-6 M de histamina (CE50 = 7,6 ± 0,8; 7,2 ± 1,3 e 6,8 ± 0,6 µg/mL, respectivamente). Como o passo comum na via de sinalização destes agentes contráteis são os canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV), hipotetizou-se que de alguma forma o óleo estaria impedindo o influxo de Ca2+ através destes canais. Visto que provavelmente os componentes majoritários são os marcadores biológicos para esta espécie, avaliou-se o efeito dos mesmos sobre a contração tônica induzida por 40 mM de KCl. Observou-se que o timol, o carvacrol e a mistura timol/carvacrol relaxaram o órgão de maneira significante e dependente de concentração (CE50 = 5,1 ± 1,1; 11,5 ± 1 e 5,1 ± 1,1 µg/mL, respectivamente), sendo o carvacrol o menos potente entre os três, os quais se mostraram equipotentes ao óleo LM-OE. Para confirmar a hipótese da participação dos CaV no mecanismo espasmolítico do óleo LM-OE, foram feitas curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) e na presença do óleo LM-OE, o qual antagonizou essas contrações, além de relaxar o órgão pré-contraído com S-(-)-Bay K 8644 (CE50 = 8,5 ± 1,5 µg/mL), agonista seletivo dos CaV1, confirmando assim que o subtipo de CaV envolvido é o CaV1. O fato do CsCl, um bloqueador não seletivo dos canais de K+, não ter alterado a potência relaxante do óleo LM-OE no íleo pré-contraído com 10-5 M de CCh, descarta a hipótese da modulação positiva desses canais, o que levaria a um bloqueio indireto dos CaV. Em experimentos utilizando a camada circular do íleo de cobaia, o óleo antagonizou as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de CCh (CI50 = 30,1 ± 1,5 µg/mL), o que sugere uma possível inibição da sinalização intracelular de Ca2+ para exercer seu efeito espasmolítico. A viabilidade das células musculares lisas da camada longitudinal foi avaliada na ausência e na presença de 81 µg/mL do óleo LM-OE, não havendo morte celular no período 2 h de contato das células com o óleo LM-OE. Na presença do óleo LM-OE, a intensidade de fluorescência em miócitos intestinais de cobaia estimulados por histamina foi reduzida em consequência da redução da [Ca2+]
c. Em conclusão, o óleo LM-OE age por impedir o influxo de cálcio através dos CaV1, por possivelmente inibir a sinalização intracelular de Ca2+ e redução da concentração citosólica desse íon, para promover seu efeito espasmolítico em íleo isolado de cobaia.
Palavras-chave:Lippia microphylla, timol, carvacrol, ação espasmolítica, cálcio. Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
ABSTRACT
The essential oil extracted from aerial parts of Lippia microphylla Cham.
(Verbenaceae) (LM-OE) presents as major compounds thymol and carvacrol. The aim of this study was to investigate and to characterize oil LM-OE spasmolytic effect on guinea pig ileum, as well to verify if this effect is due its major compunds, thymol and carvacrol. Were performed measures of isometric and isotonic contractions and cytosolic calcium. LM-OE inhibited phasic contractions induced by 10-6 M of histamine or carbachol (CCh) (IC50 = 15.8 ± 2.3 e 24.4 ± 2.9 µg/mL, respectively). In a similar manner, thymol, carvacrol and thymol/carvacrol mixture antagonized histamine- (IC50 = 14.2 ± 1.6; 13.6 ± 1.3 e 13 ± 2.1 µg/mL, respectively) ou CCh- (IC50 = 21.3 ± 3.8; 16 ± 2.6 e 27.9 ± 4.8 µg/mL, respectively) induced phasic contractions. Compared with LM-OE, in neither case was difference. In the same way, LM-OE relaxed pre-contracted organ by 40 mM of KCl, 10-5 M of CCh or 10-6 M of histamine (EC
50 = 7.6 ± 0.8; 7.2 ± 1.3 e 6.8 ± 0.6 µg/mL, respectively), being equipotent in the three situations. As CaV are common step on pathway of these three contractile agents, we hypothesized that somehow LM-OE would blocking Ca2+ influx by these channels. Once probably the major compounds are biological markers for this specie, we evaluated their effect upon tonic contraction induced by 40 mM of KCl. We found that thymol, carvacrol and thymol/carvacrol mixture relaxed the ileum in a significant and concentration-dependent manner (EC50 = 5.1 ± 1.1; 11.5 ± 1 e 5.1 ± 1.1 µg/mL, respectively), being carvacrol the least potent among the three, they did not showed statistic difference when compared with LM-OE. To confirm the hypothesis of CaV participation on LM-OE spasmolytic action, were performed cumulative concentration-response curves to CaCl2 in a nominal without Ca2+ depolarizing medium in absence (control) and LM-OE presence, witch one antagonize these contractions besides to relaxes the organ when it was pre-contracted by S-(-)-Bay K 8644 (EC50 = 8.5 ± 1.5 µg/mL), a selective CaV 1, agonist confirming that the CaV subtype involved is CaV 1. The fact of CsCl, a K+ channels nonselective blocker, has not changed the relaxing potency of LM-OE oil on ileum pre-contracted with 10-5 M CCh, discard the hypothesis of positive modulation of these channels, which would lead to an indirect blockade of CaV. In experiments with ileum circular layer, LM-OE antagonized phasic contractions induced by 10-6 M of CCh (IC50 = 30.1 ± 1.5 µg/mL), that suggests a negative modulation of the Ca2+ intracellular signaling by LM-OE oil to exert its spasmolytic effect. Viability of layer longitudinal smooth muscle cells was evaluated in the absence and presence of 81 µg/mL LM-OE oil, and no cell death was verify during 2 h of contact with cells LM-OE oil. In the presence of LM-OE oil, the intensity of fluorescence in intestinal guinea pig myocytes stimulated by histamine was reduced as a result of the reduction of calcium cytosolic concentration ([Ca2+]
c). In conclusion, the LM-OE oil act by blocking calcium influx through CaV1, possibly by inhibiting intracellular Ca2+ signaling and reducing [Ca2+]c, to promote its spasmolytic effect in guinea pig ileum.
Keywords:Lippia microphylla, thymol, carvacrol, spasmolytic action, calcium. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Figura 1 –Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae) ... 33
Figura 2 – Estrutura química do timol (A) e do carvacrol (B) ... 34 Figura 3 – Esquema da via de ativação da fosfolipase C na contração do músculo liso ... 38
Figura 4 – Registros originais representativos do efeito do óleo LM-OE sobre o íleo de cobaia pré-contraído com 40 mM de KCl (A), com 10-5 M de carbacol (CCh) (B) ou com 10-6 M de histamina (C).. ... 65 Figura 5 – Registros originais representativos do efeito do timol (A), do carvacrol (B) ou da mistura timol/carvacrol (C) sobre o íleo de cobaia pré-contraído por 40 mM de KCl ... 68
Figura 6 – Registros originais representativos do efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644 em íleo de cobaia parcialmente despolarizado ... 73
Figura 7 – Registros originais representativos do efeito do óleo LM-OE sobre o íleo de cobaia pré-contraído com 10-5 M de CCh na ausência (A) e na presença de 5 mM de CsCl (B). ... 75
Gráfico 1 – Efeito do óleo LM-OE frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina (A) e de CCh (B) em íleo isolado de cobaia ... 61
Gráfico 2 – Efeito do timol frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina (A) e por 10-6 M de CCh (B) em íleo isolado de cobaia. ... 61
Gráfico 3 – Efeito do carvacrol frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M
de histamina(A) e de CCh (B) em íleo isolado de cobaia. ... 62
Gráfico 4 – Efeito da mistura timol/carvacrol frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina (A) e de CCh (B) em íleo isolado de cobaia .... 62
Gráfico 5 – Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl(), por 10-5 M de CCh () ou por 10-6 M de histamina ()... 66
Gráfico 6 –Efeito do timol (), do carvacrol () ou da mistura timol/carvacrol () sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl ... 69
Gráfico 7 – Curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+ na ausência () e na presença do óleo LM-OE nas concentrações de 3 (), 9 (), 27 () e 81 µg/mL (), em íleo isolado de cobaia ... 71
Gráfico 8 – Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (n = 5) () ou por 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644 (n = 3) () em
íleo de cobaia parcialmente despolarizado ... 73
Gráfico 9 –Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas 10-5 M de CCh na ausência () ou na presença () de 5 mM de CsCl ... 76
Tabela 1 – Valores de Emax e CI50 para as drogas testadas frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina em íleo isolado de cobaia ... 63
Tabela 2 – Valores de Emax e CI50 para as drogas testadas frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de CCh em íleo isolado de cobaia ... 63
Tabela 3 – Valores de Emax e CE50 para as drogas testadas sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl em íleo isolado de cobaia ... 69
Tabela 4 – Valores de CE50 e Emax para o CaCl2 na ausência (controle) e na presença de várias concentrações do óleo essencial de Lippia microphylla
[Ca2+] concentração de Ca2+ [Ca2+]
c concentração de Ca2+ citosólico
[Ca2+]i concentração de Ca2+ intracelular
ACh acetilcolina
AMPc monosfofato cíclico de adenosina ANOVA análise de variância
ATP trifosfato de adenosina
CaM calmodulina
CaV canais de cálcio dependentes de voltagem
CaV1 canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo 1
CaVL canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L
CCh carbacol
CEUA Conselho de Ética em Uso Animal
CE50 concentração de uma substância que produz 50% de seu
efeito máximo
CI50 concentração de uma substância que inibe 50% do efeito
máximo produzido por um agonista
CsCl Cloreto de césio
DAG diacilglicerol
e.p.m. erro padrão da média
Emax efeito máximo
Gq/11 proteína Gq ou proteína G11
GPCRs receptores acoplados à proteína G
GTP trifosfato de guanosina
IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol
LM-OE óleo essencial de Lippia microphylla Cham.
M concentração molar (mol/L)
MLC cadeia leve da miosina
MLCK cinase da cadeia leve da miosina
PgPNSB Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
PIP2 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol
PKA proteína cinase A
PKG proteína cinase G
PLC fosfolipase C
RS retículo sarcoplasmático
S-(-)-Bay K 8644 1,4-diidro-2,6-dimetil-5-nitro-4-[2-(trifluorometil)fenil]3-piridina carboxílico ácido metil éster
UFPB Universidade Federal da Paraíba
1 INTRODUÇÃO ... 25 1.1 Produtos Naturais e a Fitoterapia no Brasil ... 26
1.2 Óleos Essenciais: Uma Visão Geral ... 29
1.3 A Família Verbenaceae, o Gênero Lippia e a Espécie Lippia microphylla
Cham. . ... 31
1.4 Fisiologia da contração e relaxamento do músculo liso ... 35
2 OBJETIVOS ... 41 2.1 Gerais ... 42
2.2 Específicos ... 42
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 43 3.1 Material ... 44 3.1.1 Produtos-teste ... 44
3.1.2 Animais ... 44
3.1.3 Drogas e Reagentes... 45
3.1.4 Soluções Nutritivas ... 46
3.1.5 Preparação das soluções dos produtos em estudo ... 47
3.1.5.1 Preparo da solução do óleo essencial das folhas de Lippia microphylla
Cham. (LM-OE) ... 47
3.1.5.2 Preparo da solução estoque do timol e do carvacrol ... 47
3.1.5.3 Preparo da solução estoque da mistura timol/carvacrol ... 48
3.1.6 Aparelhos ... 48
3.2 Métodos ... 50 3.2.1 Investigação do efeito do óleo essencial de Lippia microphylla ou de seus
3.2.1.2 Efeito do óleo LM-OE, do timol, do carvacrol ou da mistura timol/carvacrol sobre a fase tônica das contrações induzidas por KCl, por carbacol ou por histamina ... 51
3.2.2 Avaliação da participação dos canais de cálcio no efeito relaxante produzido pelo óleo essencial de Lippia microphylla em íleo isolado de cobaia ... 51
3.2.3.1 Efeito do óleo LM-OE frente às contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+... 51
3.2.3.2 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por S-(-)-Bay K8644 ... 52
3.2.2 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante produzido pelo óleo essencial de Lippia microphylla em íleo isolado de cobaia ... 52
3.2.2.1 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por carbacol, na ausência e na presença de cloreto de césio (CsCl) ... 52
3.2.4 Avaliação do efeito do óleo LM-OE sobre a camada muscular circular de íleo isolado de cobaia ... 53
3.2.5 Avaliação da citotoxicidade do óleo essencial de Lippia microphylla em
miócitos da camada longitudinal do íleo isolado de cobaia ... 54
3.2.5.1 Cultura de miócitos da camada longitudinal do íleo isolado de cobaia ... 54
3.2.5.2 Efeito do óleo LM-OE sobre a viabilidade celular de miócitos da camada longitudinal do íleo isolado de cobaia ... 55
3.2.5.3 Avaliação do efeito do óleo LM-OE sobre a [Ca2+]
c de miócitos intestinais da camada longitudinal de íleo de cobaia ... 56
3.3 Análise estatística ... 57 4 RESULTADOS ... 58 4.1 Efeito do óleo essencial de Lippia microphylla ou de seus constituintes
4.1.2 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por KCl, por CCh ou por histamina ... 64
4.1.3 Efeito do timol, do carvacrol ou da mistura timol/carvacrol sobre as contrações tônicas induzidas por KCl ... 67
4.1.5 Avaliação da participação dos canais de cálcio no efeito relaxante produzido pelo óleo essencial de Lippia microphylla ... 70
4.1.5.1 Efeito do óleo LM-OE frente às contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+... 70
4.1.5.2 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por S-(-)-Bay K8644 ... 72
4.1.4 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante produzido pelo óleo essencial de Lippia microphylla ... 74
4.1.4.1 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por carbacol, na ausência e na presença de cloreto de césio (CsCl) ... 74
4.1.6 Efeito do óleo LM-OE sobre a camada muscular circular de íleo isolado de cobaia ... 77
4.2 Efeito do óleo essencial de Lippia microphylla (LM-OE) sobre a viabilidade
celular de miócitos da camada longitudinal do íleo isolado de cobaia ... 78
4.3 Avaliação do efeito do óleo essencial de Lippia microphylla (LM-OE) sobre a
[Ca2+]
c em miócitos da camada longitudinal do íleo isolado de cobaia ... 79
1 INTRODUÇÃO
1.1 Produtos Naturais e a Fitoterapia no Brasil
A relevância da medicina tradicional para a humanidade é atestada por números da Organização Mundial de Saúde (OMS), que estima que entre 75 e 80% da população mundial utiliza essa modalidade de medicina (ALVES; ROSA, 2005).
Agra e colaboradores (2007) destacaram a importância do uso da medicina tradicional em todas as partes do mundo, onde esta apresenta crescente importância econômica, principalmente através da utilização de plantas medicinais que têm uma posição respeitável hoje em dia, especialmente nos países em desenvolvimento, onde o serviço de saúde moderno é limitado e representam a única forma de tratamento acessível.
Além de serem usados pela população como fonte de remédios, os produtos naturais têm servido como fonte e inspiração para uma grande fração da atual farmacopeia (KINGSTON, 2011), fornecendo um vasto arsenal terapêutico contra inúmeras enfermidades, compreendendo assim, uma fonte de inestimável valor às necessidades medicinais da humanidade.
Diversas razões foram apresentadas para explicar o sucesso de produtos naturais na descoberta de drogas: alta diversidade química, criação de moléculas biologicamente ativas através da evolução e a semelhança estrutural com alvos proteicos em muitas espécies (HENKEL et al., 1999; FEHER; SCHMIDT, 2003).
Nas florestas tropicais concentram-se mais de 50% das espécies de plantas do mundo, mas a Floresta Amazônica não é a única região de vasta biodiversidade na América do Sul. A Floresta Atlântica e o Cerrado são também considerados hotspots de biodiversidade, ou seja, estão incluídos entre os mais
ricos e mais ameaçados reservatórios de vida animal e vegetal do planeta (CONSERVATION INTERNATIONAL, 2010). Além disto, a Caatinga e o Pantanal abrangem quase 15% do território brasileiro e também contêm vasta diversidade biológica. Diferentes ecossistemas produzem uma variedade enorme de substâncias com estruturas químicas diferentes, que podem ser úteis para diversos fins. Dentro deste contexto, a flora brasileira representa uma das mais ricas fontes de novas substâncias bioativas (BRANDÃO et al., 2010).
Nota-se nos últimos anos que o interesse em trabalhar com fitoterapia tem ressurgido. Na última década, registrou-se um aumento expressivo no interesse em substâncias derivadas de espécies vegetais, o que incentivou a pesquisa científica para a comprovação dos efeitos observados empiricamente. Outro fator que incentiva esses estudos com espécies vegetais é a complexidade na descoberta de novas drogas; alguns estudos mostram que são necessários de sete a dez anos para o desenvolvimento completo de um novo medicamento (FLISCHER; MONTARI, 1995; CALIXTO, 2000; SIXEL; PECINALLI, 2005). Com tamanha biodiversidade o Brasil tem condições de ser um dos principais países a adotar a Fitoterapia como uma alternativa segura e eficaz no tratamento de várias patologias, nesse sentido algumas medidas foram adotadas pelo Governo Federal.
Dessa forma, o Governo Federal aprovou em junho 2006 o Decreto 5.813 que cria a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, a qual estabelece diretrizes e linhas prioritárias para o desenvolvimento de ações voltadas à garantia do acesso seguro e uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos em nosso país, ao desenvolvimento de tecnologias e inovações, assim como ao fortalecimento das cadeias e dos arranjos produtivos, ao uso sustentável da biodiversidade brasileira e ao desenvolvimento do Complexo Produtivo da Saúde (BRASIL, 2006).
Fazendo um breve histórico da evolução da Fitoterapia no Brasil, temos que em 2008, havia 432 fitoterápicos simples e 80 compostos registrados na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), sendo as principais espécies com medicamentos registrados o Ginkgo (Ginkgo biloba) e a Castanha da Índia
(Aesculus hippocastanum), com 33 e 29 registros, respectivamente (CARVALHO
et al., 2008). Já dados apresentados por Perfeito (2012) mostram que no período de março de 2005 até março de 2010 são apresentados 382 medicamentos fitoterápicos com registro válido no Brasil, sendo estes 357 classificados como simples e outros 25 compostos ou em associação, obtidos de 98 espécies vegetais. As espécies com maior número de registro permanecem Ginkgo biloba,
Aesculus hippocastanum, sendo acrescentada a esse grupo a Mikania glomerata
(Guaco).
O passo seguinte dado pelo Governo Federal em relação ao uso de plantas medicinais no Brasil foi a criação da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS) em 2008. Criada com a finalidade de auxiliar o desenvolvimento de toda cadeia produtiva e orientar estudos e pesquisas que possam subsidiar a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (RENAFITO), a RENISUS é composta por uma lista de 71 espécies vegetais já utilizadas nos serviços de saúde estaduais e municipais, considerando o conhecimento tradicional e popular e os estudos químicos e farmacológicos disponíveis (BRASIL, 2012). Estão presentes na RENISUS espécies vegetais, nativas ou exóticas adaptadas, listadas pelo seu nome científico (BRASIL, 2009).
produção de fitoterápicos no país. Dessa forma, faz-se necessário maior incentivo por parte do governo federal e real esforço por parte dos cientistas brasileiros em comprovar as indicações das plantas medicinais utilizadas pela população e/ou pesquisar drogas complexas que possam vir a se tornarem fitoterápicos.
1.2 Óleos Essenciais: Uma Visão Geral
Dentro do grupo dos produtos naturais, encontram-se os óleos essenciais, os quais são produzidos por plantas aromáticas como metabólitos secundários caracterizados por sua volatilidade, complexidade de componentes e forte odor. Em geral, são obtidos por meio de hidrodestilação ou destilação a vapor, técnicas conhecidas desde a Idade Média, pelos povos árabes (BAKKALI et al., 2008).
Cabe salientar que há variações na composição quanti e qualitativa destes produtos naturais a depender da composição química do solo (SANTOS et al., 2012); fase de crescimento e maturação da planta (TAVARES et al., 2005); sazonalidade da coleta (CERQUEIRA et al., 2009); temperatura do ar de secagem do material vegetal (RADÜNZ et al., 2002), entre outras variáveis.
Os óleos essenciais são compostos basicamente por dois grupos de origem biossintética distintas: o principal grupo constituído de terpenos e o outro por componentes alifáticos e aromáticos, ambos os grupos caracterizados por moléculas com baixo peso molecular. Geralmente, o componente majoritário é o responsável pela atividade biológica apresentada pelo óleo essencial, porém o complexo não pode ser desprezado, uma vez que pode haver o sinergismo entre as substâncias constituintes do óleo inteiro (BAKKALI et al., 2008).
Atualmente, cerca de 3000 óleos essenciais são conhecidos, dos quais 300 são comercialmente importantes, especialmente nas indústrias farmacêutica, agronômica, alimentícia, sanitária, cosmética e de perfumaria. Alguns dos componentes isolados dos óleos essenciais são usados em perfumes, produtos de maquiagem, produtos sanitários, odontológicos, agrícolas, conservantes e aditivos alimentícios, bem como em remédios naturais (BAKKALI et al., 2008).
essenciais vem adquirindo no desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Além das várias atividades biológicas descritas, já existe resultados promissores quanto ao uso de produtos a base de óleos essenciais com indicação terapêutica. Um exemplo de produto recentemente lançado no mercado é Acheflan® produzido com extratos de erva baleeira Cordia verbenacea DC., contendo α-humuleno, cuja
indicação é como anti-inflamatório de uso tópico para o tratamento de tendinite crônica e dores miofasciais. O Rowachol®, indicado para cálculos biliares e como
colérico e colagogo, contendo borneol, α-pineno, cafeno, 1,8-cineol, mentona e mentol (HENRIQUE et al., 2009).
Algumas atividades biológicas já foram descritas para essa classe de produtos naturais. Dentre estas, pode-se destacar: Syzigium aromaticum (L.)
Merr. & Perry, Lippia sidoides Cham. e Hyptis martiusii Benth. apresentaram
atividade larvicida contra as espécies de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus,
mosquitos transmissores da dengue e filariose, respectivamente (COSTA et al., 2005); Houttuynia cordata Thunb. se mostrou inibitória contra o vírus da herpes
simples tipo I (HSV-1), vírus influenza e vírus da imunodeficiência adquirida tipo I (HIV-1) (HAYASHI; KAMIYA; HAYASHI, 1995); atividade bactericida frente à
Salmonella enterica apresentada pelos óleos essenciais de Origanum vulgare,
Thymus vulgaris e Cinnamomum zeylanicum (SANTURIO et al., 2007); o óleo
essencial de Satureja obovata apresentou atividade espasmolítica em duodeno de
rato (CRUZ et al., 1990), assim como os óleos essenciais de espécies do gênero
Pelargoniums (Geraniaceae). demonstraram tal atividade em íleo de cobaia
(LIS-BALCHIN; HART; ROTH, 1997).
1.3 A Família Verbenaceae, o Gênero Lippia e a Espécie Lippia microphylla Cham.
Inserida na grande diversidade das plantas medicinais, cabe destacar a família Verbenaceae, a qual reúne aproximadamente 36 gêneros e 1000 espécies (SOUZA; LORENZI, 2005 apud SAMPAIO, 2009), as quais medram em regiões tropicais, subtropicais e temperadas da América, África e Índia, sendo um dos centros de mais alta diversidade as regiões subtropicais da América do Sul (SANDERS, 2001 apud SAMPAIO, 2009). No Brasil ocorrem aproximadamente 17 gêneros e 250 espécies (SOUZA; LORENZI, 2005 apud SANTOS et al., 2009).
As espécies de Verbenaceae têm seu potencial econômico amplamente explorado, tanto como ornamentais (LORENZI; SOUZA 2001, apud SANTOS et al., 2009), quanto terapêuticas, neste último caso devido a presença de óleos essenciais (SANTOS et al., 2009). São exemplos de atividades farmacológicas descritas: repelente de mosquito do gênero Aedes para a espécie Lantana
camara L. (DUA et al., 2003); antinociceptiva e hipnótica para a espécie Premna
tomentosa L. (DEVI et al., 2003); leishmanicida para formas promastigotas de
várias espécies de Leishmania, para a espécie Stachytarpheta cayennensis (Rich)
Vahl. (MOREIRA et al., 2007) e relaxante de corpos cavernosos de coelhos para a espécie Clerodendron capitatum (Willd) (ABDELWAHAB et al., 2012).
Segundo revisão feita por Pascual et al., (2001) o gênero Lippia é
constituído de cerca de 200 espécies de ervas, subarbustos e árvores de pequeno porte. Espécies desse gênero podem ser encontradas principalmente em países das Américas Central e Sul, e territórios da África tropical. O Brasil detém sozinho cerca de 70-75% das espécies conhecidas desse gênero, sendo a maioria delas concentrada na Cordilheira do Espinhaço, nos estados de Minas Gerais e Goiás, onde há ocorrência de pedras, sendo comum o crescimento das espécies de Lippia neste solo (VICCINI et al., 2005).
A maioria das espécies deste gênero é utilizada na medicina popular como remédios no tratamento de doenças dos sistemas respiratório e gastrintestinal (MORTON, 1981 apud PASCUAL et al., 2001).
et al., 1995 apud PASCUAL et al., 2001) e citostática (SLOWING BARILLAS, 1992; KLUEGER et al., 1997 apud PASCUAL et al., 2001).
Nesse gênero, algumas espécies já tem se destacado no cenário da fitoterapia no Brasil, como por exemplo, L. sidoides, que consta na RENISUS
(BRASIL, 2009), sendo também listada na Farmacopeia Brasileira e indicada como anti-inflamatório, antisséptico da cavidade oral, contra afecções de pele e couro cabeludo; além desta espécie, o infuso das partes aéreas de L. alba é
indicado como ansiolítico, sedativo leve, antidispéptico e antiespasmódico (BRASIL, 2011).
Radicada no gênero Lippia está a espécie Lippia microphylla Cham.
(Verbenaceae) (Figura 1), a qual é encontrada apenas na Guiana e no Brasil (LEMOS et al., 1992 apud PASCUAL et al., 2001), sendo popularmente conhecida
como “alecrim-do-mato”, “alecrim-de-tabuleiro” e “alecrim-pimenta”, e utilizada
Figura 1 –Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae)
Fonte: Tavares, 2007
Esta espécie caracteriza-se por ser um arbusto medicinal e aromático, muito ramificado e quebradiço, que mede 2-3 m de altura. Apresenta folhas de forte cheiro picante e as flores são pequenas e esbranquiçadas (MATOS, 2000; MATOS, 2002; LORENZI; MATOS, 2002, apud ARAÚJO, 2011).
Desta espécie, extraiu-se o óleo essencial para o qual algumas atividades farmacológicas já foram descritas: antifúngica contra Rhizoctonia solani (SCHURT
et al., 2012); bactericida contra Shigella flexneri, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus, onde o componente majoritário encontrado
foi o 1,8-cineol (RODRIGUES et al., 2011); vasorrelaxante em artérias mesentérica e aorta de rato (ARAÚJO, 2011).
De acordo com a revisão realizada por Pascual et al., (2001), os principais componentes do óleo essencial de Lippia microphylla são os monoterpenos
1,8-cineol, α-terpineol, terpinen-4-ol, metiltimol, sabineno, -terpineno e timol; e os
para o carvacrol, tomados em conjunto somam quase 80% do total do óleo (Anexo A).
Estes dois componentes são isômeros de posição. O timol é conhecido quimicamente como 5-metil-2-(1-metiletil)-fenol e o carvacrol como 5-isopropil-2-metilfenol, possuem fórmula molecular C10H14O e peso de 150,2 g/mol (Figura 2) (www.sigmaaldrich.com).
Figura 2 –Estrutura química do timol (A) e do carvacrol (B)
Várias atividades biológicas já foram descritas para o timol, como por exemplo, atividade antimicrobiana de amplo espectro (DORMAN; DEANS, 2000; LAMBERT et al., 2001 apud ARAÚJO, 2011); redução da atividade contrátil do tônus espontâneo de músculo liso estomacal e de veia porta de cobaias (BEER;
LUKANOV; SAGORCHEV, 2007); espasmolítico em íleo e traqueia de ratos e
aumento do transporte mucociliar em camundongos (BEGROW et al., 2010) e vasorrelaxante em artérias aorta e mesentérica de ratos por bloqueio do influxo de cálcio através da membrana (PEIXOTO-NEVES et al., 2010; ARAÚJO, 2011).
Do mesmo modo, o carvacrol já apresentou algumas atividades biológicas: inseticida contra moscas domésticas através do antagonismo dos receptores nicotínicos da acetilcolina (TONG et al., 2012); anti-inflamatória por redução de mediadores da inflamação e possível indução de mediadores anti-inflamatórios (LIMA et al., 2013); antinociceptiva (CAVALCANTE MELO et al., 2012); redução da excitabilidade neuronal por bloqueio dos canais de sódio dependentes de voltagem (JOCA et al., 2012) e vasorrelaxante em aorta torácica de rato (PEIXOTO-NEVES et al., 2010).
Uma vez que estes dois monoterpenos apresentam atividade vasorrelaxante, assim como o próprio óleo essencial de Lippia microphylla, e
A
B
tendo em vista as indicações populares deste óleo, torna-se interessante avaliar suas atividades sobre outros modelos de musculatura lisa.
1.4 Fisiologia da contração e relaxamento do músculo liso
Sabendo-se da importância dos produtos naturais como fonte de substâncias potencialmente terapêuticas, há um grande interesse em se investigar drogas obtidas diretamente de plantas ou seus derivados que atuem na musculatura lisa, visto que esse músculo é o principal responsável pelo controle da maioria dos órgãos ocos dos sistemas do corpo. As células da musculatura lisa estão presentes nas paredes de vários órgãos, incluindo os vasos sanguíneos, estômago, intestinos, bexiga e vias aéreas (WEBB, 2003).
A regulação da contração do músculo liso apresenta um papel importante em muitos processos fisiopatológicos autonômicos. Por exemplo, a contração anormal do músculo liso é importante em condições, como a hipertensão arterial, vasoespasmos cerebrais e coronarianos, asma brônquica, disfunção erétil e possíveis complicações no trabalho de parto (WEBB, 2003).
No músculo liso um aumento na concentração citosólica de cálcio livre ([Ca2+]c) é a causa primária para a produção da contração. Esta elevação no conteúdo citosólico de Ca2+ também está envolvida na proliferação celular do músculo liso (VAN BREEMEN; SAIDA, 1989).
O cálcio é um importante segundo mensageiro que desempenha um papel essencial a uma grande variedade de processos biológicos, incluindo a regulação enzimática, expressão gênica, tráfego de proteína, proliferação celular, apoptose e a coordenação do acoplamento excitação-contração do músculo (CARAFOLI, 2002). Em geral, existem duas fontes deste íon sinalizador na célula: uma extracelular, que permite o influxo de Ca2+ para o citoplasma através dos canais na membrana plasmática, e outra intracelular, representada pelos estoques internos, principalmente o retículo sarcoplasmático (RS), que liberam Ca2+ para o citosol (PAN; MA, 2003).
(ALEXANDER; MATHIE; PETERS, 2007). A entrada de cálcio em músculo liso visceral é controlada pelo potencial de membrana, uma vez que este determina a abertura de CaV (SHMIGOL; EISNER; WRAY, 1998; WRAY et al., 2001). Os CaV1 (ativados por alta voltagem e sensíveis às di-hidropiridinas) são os principais e muitas vezes o único tipo de canal de Ca2+ expresso em muitos músculos lisos (THORNELOE; NELSON, 2005; WRAY; BURDYGA; NOBLE, 2005).
O fluxo dos íons K+ através de canais localizados na membrana regulam o influxo de Ca2+ através dos Ca
V (THORNELOE; NELSON, 2005). Os canais de potássio desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e na excitabilidade celular, sendo a contração no músculo liso dependente do balanço entre o aumento da condutância ao íon K+, levando a uma hiperpolarização, e a diminuição da condutância ao K+, levando a uma despolarização (KNOT et al., 1996).
No músculo liso, o tônus basal pode ser regulado por vários subtipos de canais de K+, entre eles: canais de K+ sensíveis à voltagem (KV); canais de potássio ativados por cálcio e voltagem de grande condutância (BKCa); canais de K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa); canais de K+ retificadores de entrada (Kir); canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP), entre outros (THORNELOE; NELSON, 2005). Sendo que, a repolarização ou hiperpolarização de membrana ocorre devido, principalmente, à ativação dos BKCa, que são ativados quando a [Ca2+]
c se eleva na ordem de M, e à ativação dos KV, em
decorrência à despolarização de membrana (LEDOUX et al., 2006). Tal ativação leva a uma redução no influxo de Ca2+ através dos CaV por sua inibição e, consequentemente, a uma redução da [Ca2+]c (LEDOUX et al., 2006; LIN et al., 2006).
Diante do exposto, compostos como os ativadores de canais de K+ podem hiperpolarizar a membrana e, indiretamente, bloquear os CaV1, inibir o influxo de Ca2+, e consequentemente, diminuírem a [Ca2+]
c (WESTON; EDWARDS, 1992; LEDOUX et al., 2006; LIN et al., 2006).
alcançada quer através da despolarização da membrana (acoplamento eletromecânico), levando a um aumento da [Ca2+]c e contração muscular, ou induzida por um agonista (acoplamento fármaco-mecânico) que pode ser independente do potencial de membrana (SOMLYO; SOMLYO, 2003). Os agonistas tais como ocitocina, serotonina, carbacol e histamina se ligam a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e ativam a cascata do 4,5-bisfosfato de fostatidilinositol (PIP2), geralmente através da proteína Gq/11, mediando a produção de 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3), que estimulam a liberação de Ca2+ do RS (FUKATA; AMANO; KAIBUCHI, 2001). Os agonistas contráteis podem também elevar a [Ca2+]
Figura 3– Esquema da via de ativação da fosfolipase C na contração do músculo liso
O relaxamento no músculo liso ocorre como resultado da remoção do estímulo contrátil ou pela ação direta de uma substância que estimula a inibição do mecanismo contrátil (MORGAN, 1990). Independentemente, o processo requer uma diminuição da [Ca2+]c e aumento da atividade da fosfatase da cadeia leve da miosina (MLCP) (SOMLYO et al., 1999).
Há ainda os agonistas que induzem relaxamento, onde a ligação aos seus receptores ativa diretamente uma ciclase de guanilil ou de adenilil, resultando na formação do monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), respectivamente (REMBOLD, 1996). O aumento na [GMPc] ativa a proteína cinase G (PKG), enquanto que o aumento na [AMPc] ativa tanto uma proteína cinase dependente de AMPc (PKA) como a PKG. Os mecanismos que explicam a redução do Ca2+ pela PKG incluem: ativação da captação de Ca2+ pelos estoques intracelulares; aumento do efluxo de Ca2+; inibição da liberação de Ca2+ do R.S.; hiperpolarização de membrana via ativação direta e/ou indireta de canais para K+; inibição direta de Cav (ORALLO, 1996; VAANDRAGER; DE JONGE, 1996) ou indireta por ativação de canais para K+ (KUME et al., 1989; WHITE et al., 1993). A PKA que tem ações semelhantes às das PKGs como por exemplo a ativação dos canais para K+ (REMBOLD, 1992; MINAMI; FUKUZAWA; NAKAYA, 1993) e fosforilação da MLCK e assim diminuição de sua afinidade pelo complexo [4Ca2+-CaM] (REMBOLD, 1992).
Além disso, a hiperpolarização da membrana das células musculares lisas pode ser produzida por substâncias que abrem canais de K+, como por exemplo, cromacalina, levocromacalina e nicorandil, que consequentemente, aumentam o efluxo de K+ da célula (EDWARDS; WESTON, 1990; GURNEY, 1994). Dessa maneira, a hiperpolarização reduz o influxo de Ca2+ através dos canais Ca
V 1,
diminuindo, portanto, a [Ca2+]
c, a fosforilação da miosina e a contração (REMBOLD, 1996).
Os mecanismos de relaxamento do músculo liso envolvidos no acoplamento fármaco-mecânico incluem: (1) aumento na atividade da Ca2+ -ATPase tanto do RS (SERCA) como da membrana plasmática (PMCA) através da PKG/PKA, levando a um aumento do sequestro e da saída de Ca2+, respectivamente, diminuindo assim a [Ca2+]
c; (2) diminuição da formação do IP3,
redução da [Ca2+]c pelo AMPc-PKA por diminuir o influxo de Ca2+ indiretamente por hiperpolarização ou por ação direta nos CaV1, e, finalmente, (4) diminuição da [Ca2+]c por estimulação do trocador Na+/Ca2+ (BLAUSTEIN, 1989).
2 OBJETIVOS
2.1 Gerais
Contribuir para o estudo farmacológico da família Verbenaceae, em particular da espécie Lippia microphylla Cham. com a finalidade de descobrir
drogas potencialmente terapêuticas ou que atuem como ferramentas farmacológicas.
Investigar e caracterizar o efeito espasmolítico do óleo essencial das partes aéreas de L. microphylla (LM-OE), bem como verificar se este efeito é devido aos
seus constituintes majoritários, o timol e o carvacrol, ou da mistura timol/carvacrol.
2.2 Específicos
Investigar:
a. O efeito do óleo LM-OE, do timol, do carvacrol ou da mistura timol/carvacrol em íleo de cobaia;
b. A participação dos canais de cálcio sensíveis à voltagem (CaV); c. A participação dos canais de potássio no efeito do óleo LM-OE;
d. O efeito do óleo LM-OE frente às contrações desencadeadas pelo cálcio intracelular em músculo liso da camada circular de íleo de cobaia;
e. A viabilidade de miócitos intestinais da camada longitudinal do íleo de cobaia na presença do óleo LM-OE;
Material e
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
3.1.1 Produtos-teste
A espécie Lippia microphylla Cham. foi coletada no município de Serra
Branca, no estado da Paraíba. O material botânico foi identificado pela Profa. Dra. Maria de Fátima Agra, do Setor de Botânica do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PgPNSB), do Centro de Ciências da Saúde (CCS), da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). Uma exsicata da planta está depositada no Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB), da UFPB sob código de identificação AGRA et al., 6118.
O timol e o carvacrol foram obtidos da Sigma-Aldrich (EUA) com pureza superior ou igual a 99,5%.
3.1.2 Animais
Foram utilizados cobaias (Cavia porcellus) de ambos os sexos, pesando
entre 300-500 g, provenientes do Biotério Prof. Thomas George do Centro de Biotecnologia (CBiotec)/UFPB.
Antes dos experimentos os animais eram mantidos sob rigoroso controle alimentar com uma dieta balanceada à base de ração tipo pellets (Purina®) com
acesso à água ad libitum, com ventilação e temperatura (21 ± 1 ºC) controladas e
3.1.3 Drogas e Reagentes
O cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O) e o sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O) foram adquiridos da Vetec (Brasil). O bicarbonato de sódio (NaHCO3), o cloreto de sódio (NaCl) e o cloreto de potássio (KCl) foram adquiridos da Fmaia (Brasil). O fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), a glicose e o fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4) foram adquiridos da Nuclear (Brasil). Estas substâncias, exceto a glicose e o bicarbonato de sódio, eram dissolvidas e diluídas em água destilada para obtenção de cada solução estoque que eram mantidas sob refrigeração.
O cloridrato de carbamilcolina (CCh) e o di-hidrocloridrato de histamina foram adquiridos da Merck (Brasil). Estas substâncias eram dissolvidas e diluídas em água destilada para obtenção de cada solução estoque (10-2 M) que eram mantidas a -β0 °C em “freezer”, essas soluções estoques eram diluídas em água destilada para obtenção de concentrações apropriadas a cada protocolo experimental.
O S-(-)-Bay K8644 (1,4-diidro-2,6-dimetil-5-nitro-4-[2-(trifluorometil)fenil]3-piridina carboxílico ácido metil éster), cloreto de césio (CsCl), óleo de castor (Cremofor), penicilina-estreptomicina, o ácido [etilenodinitrilo]tetracético (EDTA), o ácido (N-[2-hidroxietilpiperazina-N‟-[2-etanosulfônico]) (HEPES) e o dimetilsufóxido (DMSO), foram obtidos da Sigma-Aldrich (EUA).
Estas substâncias eram mantidas em um “freezer” à temperatura de -20 °C. O CsCl era dissolvido e diluído em água destilada, e o S-(-)-Bay K8644 em etanol absoluto.
O Dulbecco‟s Modified Eagle Médium (DMEM), soro fetal bovino, glutamina
e a solução de tripsina/ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (1:250) foram obtidos da Cultilab (Brasil).
3.1.4 Soluções Nutritivas
As soluções nutritivas tiveram seu pH ajustado com HCl ou NaOH 1 N para 7,4, sendo as suas composições descritas abaixo:
Krebs modificado por Sun e Benishin (1994), (mM): NaCl (117,0), KCl (4,7), MgSO4 (1,3), NaH2PO4 (1,2), CaCl2 (2,5), glicose (11,0) e NaHCO3 (25,0).
Krebs modificado despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+, (mM): NaCl (51,7), KCl (70), MgSO
4 (1,3), NaH2PO4 (1,2), glicose (11,0) e NaHCO3 (25,0).
PSS sem Ca2+(“Calcium-free Physiological Salt Solution”) (mM) – NaCl (132,4); KCl (5,9); MgCl2 (1,2); Glicose (11,5).
PBS (“Physiological Buffer Solution”) (mM): NaCl (140,0); Na2HPO4
(3,9); NaHPO4 (1,7); NaHCO3 (4,2); EDTA (0,2).
Composição do meio de cultura dos miócitos intestinais (mM): O DMEM foi suplementado com soro fetal bovino (10%), glutamina (0,02 M) e penicilina-estreptomicina (100 U/mL - 10 µg/mL), ajustado ao pH 7,2. (mM): NaHCO3 (25,0); HEPES (11,0).
HBSS (“Hank's Balanced Salt Solution”) (mM): NaCl (137,9); KCl (5,33);
MgCl2 (0,49); KH2PO4 (0,44); MgSO4 (0,41); Na2HPO4 (0,34); CaCl2 (1,3); NaHCO3 (4,2); Glicose (5,6); HEPES (10,0).
3.1.5 Preparação das soluções dos produtos em estudo
3.1.5.1 Preparo da solução do óleo essencial das folhas de Lippia microphylla Cham. (LM-OE)
O óleo essencial de Lippia microphylla Cham. foi extraído das suas partes
aéreas e era solubilizado em Cremofor® (3% v/v) e diluído em água destilada para obtenção da solução de partida (10 mg/mL). Esta solução era feita diariamente, uma vez que óleos essenciais caracterizam-se pela presença de compostos voláteis. De acordo com a necessidade de cada protocolo experimental a solução era novamente diluída em água destilada. A concentração final de Cremofor® nas cubas nunca excedeu 0,01% (v/v). Nesta concentração o Cremofor® é desprovido de efeito contrátil ou relaxante significante no órgão estudado, de acordo com dados obtidos em experimentos anteriores. Para avaliar o efeito das drogas-teste, eram utilizadas concentrações submáxima e máxima (243 e 729 µg/mL para drogas complexas; 3 x 10-5 e 10-4 M para substâncias isoladas). Se na concentração submáxima o efeito relaxante fosse maior que 70% e na concentração máxima este efeito atingisse mais que 90%, uma curva cumulativa com o produto-teste era realizada a fim de encontrar as concentrações que produzissem de 0 a 100% de efeito. As concentrações do óleo essencial LM-OE eram utilizadas em múltiplos de 3, a fim de obtermos as concentrações que produzissem de 0 a 100% do seu efeito.
3.1.5.2 Preparo da solução estoque do timol e do carvacrol
3.1.5.3 Preparo da solução estoque da mistura timol/carvacrol
A mistura timol/carvacrol era preparada de acordo com as concentrações que o timol e o carvacrol se encontravam no óleo essencial de Lippia microphylla.
O cálculo foi feito a partir de uma regra de três simples, onde a soma das percentagens individuais dos constituintes no óleo era considerada 100% e a
percentagem de cada um “x”. Dessa forma, para a preparação de 1 mL da solução estoque da mistura timol/carvacrol 10-2 M eram utilizados 405 µL da solução de carvacrol 10-2 M e 595 µL da solução de timol 10-2 M. De acordo com a necessidade de cada protocolo experimental a solução era novamente diluída em água destilada. A escolha e o incremento das concentrações seguiu o mesmo padrão dos itens anteriores.
3.1.6 Aparelhos
Para o registro das contrações isotônicas, os órgãos eram suspensos em cubas de 5 mL aerados com carbogênio e conectados a uma alavanca isotônica de inscrição frontal em cilindros esfumaçados de um quimógrafo (DTF, Brasil).
Para registrar as contrações isométricas, os órgãos eram suspensos em cubas de banho para órgãos isolados de 6 mL modelo BOI-04 e conectados a transdutores de força isométricos modelo TIM 05 acoplados a um amplificador modelo AECAD04F. Este, por sua vez, estava conectado a um sistema de aquisição digital com o software AQCAD versão 2.1.6 para aquisição dos dados e ANCAD para análise. O sistema contém uma bomba termostática modelo BT-60 que controla a temperatura das cubas. Todos os aparelhos foram adquiridos da AVS Projetos (São Paulo, SP, Brasil).
As células em cultura eram observadas em microscópio óptico de luz invertida (Nikon, Japão).
As medidas de fluorescência eram realizadas em um aparelho de medidas de cálcio, Flex Station 3, Molecular Devices (Califórnia, EUA) e analisadas no programa Soft Max Pro.
As culturas de células eram mantidas em estufa úmida de CO2 à 37 °C (Forma Scientific, EUA).
Os valores de pH eram aferidos através de um pHmetro digital modelo PG2000 (GEHAKA, São Paulo, SP, Brasil).
3.2 Métodos
3.2.1 Investigação do efeito do óleo essencial de Lippia microphylla ou de seus constituintes majoritários em íleo isolado de cobaia
3.2.1.1 Efeito do óleo LM-OE, do timol, do carvacrol ou da mistura timol/carvacrol frente às contrações fásicas induzidas por histamina ou por carbacol
Os cobaias eram mantidos em jejum por um período de 18 horas, tendo acesso à água ad libitum antes do início dos experimentos. Após este período eram eutanasiados por deslocamento cervical seguido de secção dos vasos cervicais. O abdômen era aberto e um segmento do íleo de aproximadamente 15 cm de comprimento era retirado e colocado em uma placa de Petri contendo solução nutritiva de Krebs modificado a 37 ºC sob aeração com carbogênio.
Após cuidadosa dissecação, o segmento do íleo era seccionado em fragmentos de 2 - 3 cm de comprimento, suspensos individualmente em cubas de vidro e deixados em repouso por 30 min, tempo necessário para perfeita estabilização da preparação, durante este período a solução nutritiva era trocada a cada 10 min. Após o período de estabilização, duas contrações fásicas de magnitudes similares, com intervalo de 15 min entre ambas, eram obtidas com 10-6 M de carbacol ou de histamina, concentração submáxima que produz cerca de 80% da resposta máxima induzida pelos agonistas e registradas através de uma alavanca isotônica de inscrição frontal em um cilindro esfumaçado de um quimógrafo. O óleo essencial de Lippia microphylla (LM-OE), o timol, o carvacrol
ou a mistura timol/carvacrol, era incubado em várias concentrações individuais por 15 min em preparações diferentes e na presença destas era induzida uma terceira contração por um dos agonistas acima citados.
3.2.1.2 Efeito do óleo LM-OE, do timol, do carvacrol ou da mistura timol/carvacrol sobre a fase tônica das contrações induzidas por KCl, por carbacol ou por histamina
O íleo era montado como descrito anteriormente. Porém, após o período de estabilização, uma contração submáxima para KCl (40 mM), histamina (10 -6 M) ou carbacol (10-5 M) eram obtidas. Durante a fase tônica sustentada (8 – 10 min) da segunda resposta, as drogas testadas eram adicionadas de maneira cumulativa à cuba, em diferentes preparações e em concentrações crescentes. O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração inicial produzida pelos agentes contráteis. Os valores da concentração dos produtos-teste que produzem 50% do seu efeito máximo (CE50) foram obtidos por regressão não linear a partir das curvas concentrações-resposta obtidas.
3.2.2 Avaliação da participação dos canais de cálcio no efeito relaxante produzido pelo óleo essencial de Lippia microphylla em íleo isolado de cobaia
3.2.2.1 Efeito do óleo LM-OE frente às contrações induzidas por CaCl2 em
meio despolarizante nominalmente sem Ca2+
O íleo era montado como descrito no item 3.2.1.1. Após o período de estabilização de 30 min a solução de Krebs modificado era substituída pela solução despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+, por um período de 45 min. Eram induzidas duas curvas similares de maneira concentrações-resposta cumulativa ao CaCl2, em seguida o óleo LM-OE era incubado na ausência de CaCl2 por 15 min e após esse período uma terceira curva cumulativa ao CaCl2 era obtida na presença do óleo.
3.2.2.2 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por S-(-)-Bay K8644
Após a estabilização por 30 min em solução de Krebs modificado, o íleo era parcialmente despolarizado pela adição de 15 mM de KCl (WEI et al., 1986; CONTE-CAMERINO et al., 1987; ZHENG et al., 1991; USOWICZ et al., 1995) por 10 min e em sua presença era induzida uma contração com 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644, um agonista seletivo dos CaV do tipo L ou CaV1 (FERRANTE et al., 1989). Durante a estabilização da fase tônica dessa contração o óleo LM-OE era adicionado de maneira cumulativa. O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração inicial produzida pelo S-(-)-Bay K8644. A CE50 foi obtida por análise de regressão não linear.
3.2.3 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante produzido pelo óleo essencial de Lippia microphylla em íleo isolado de cobaia
3.2.3.1 Efeito do óleo LM-OE sobre as contrações tônicas induzidas por carbacol, na ausência e na presença de cloreto de césio (CsCl)
O íleo era montado como descrito no item 3.2.1.1. Após o período de estabilização, era induzida uma contração com 40 mM de KCl para verificar a funcionalidade do órgão. A preparação era lavada e após 15 min, era induzida uma contração com 10-5 M de carbacol, e sob o componente tônico dessa contração era adicionado o óleo LM-OE de maneira cumulativa para obtenção da curva controle. Em outro experimento era adicionada à cuba 5 mM de CsCl, que nessa concentração é um bloqueador não seletivo dos canais de potássio (CECCHI et al., 1987), e após 20 min na presença do bloqueador era induzida uma contração com 10-5 M de carbacol e sob o componente tônico dessa contração era adicionado o LM-OE de forma cumulativa.
LM-OE foram calculados a partir das curvas concentrações-resposta, na ausência e na presença do bloqueador.
3.2.4 Avaliação do efeito do óleo LM-OE sobre a camada muscular circular de íleo isolado de cobaia
O íleo era retirado com descrito no item 3.2.1.1. Para obtenção da camada circular a camada mucosa era removida mecanicamente através do atrito com algodão embebido em solução de Krebs modificado, na parede interna do órgão. Um segmento em forma de anel com cerca de 5 mm era então isolado, suspenso com a ajuda de hastes de aço inoxidável em cubas de banho para órgão isolado contendo solução fisiológica de Krebs modificado, sendo aerados com mistura carbogênica, mantidos a uma temperatura de 37 °C, e sob tensão de repouso de 0,5 g. A solução do banho era trocada a cada 15 min, permanecendo o órgão em repouso por 60 min para completa estabilização da preparação (adaptado de CHENG, SHINOKUZA, 1987). Após o período de estabilização, duas contrações fásicas de magnitudes similares, com intervalo de 15 min entre ambas, eram obtidas com 10-6 M de carbacol, concentração submáxima que produz cerca de 80% da resposta máxima e registradas através de um sistema de aquisição digital. O óleo essencial de Lippia microphylla (LM-OE) foi incubado em
várias concentrações, individualmente por 15 min em preparações diferentes e na presença deste era induzida uma terceira contração pelo carbacol.
