Características morfofisiológicas e polimorfismo de DNA de isolados de Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae do Nordeste do Brasil

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(2) IZABEL RODRIGUES DE MIRANDA. CARACTERÍSTICAS MORFOFISIOLÓGICAS E POLIMORFISMO DE DNA DE ISOLADOS DE Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae DO NORDESTE DO BRASIL. RECIFE 2000.

(3) IZABEL RODRIGUES DE MIRANDA. CARACTERÍSTICAS MORFOFISIOLÓGICAS E POLIMORFISMO DO DNA DE ISOLADOS DE Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae DO NORDESTE DO BRASIL. Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Biologia de Fungos da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos à obtenção do grau de Mestre Fungos.. Orientadora: Profª. Dra. NEIVA TINTI DE OLIVEIRA. Recife 2000. em. Biologia. de.

(4) Miranda, Izabel Rodrigues de Características morfofisiológicas e polimorfismo de DNA de isolados de Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae do Nordeste do Brasil / Izabel Rodrigues de Miranda. – Recife : O Autor, 2000. 71 folhas : il., fig., tab., gráf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Biologia de Fungos, 2000. Inclui bibliografia e apêndice. 1. Biologia de fungos – Genética molecular. 2. Fungo fitopatológico – Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae – Variabilidade genética – Técnica RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) – Características morfofisiológicas. 3. Análise de polimorfismo – Dendrograma – Matriz de similaridade. I. Título. 577.21 : 581.2 572.8. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE BC2005-111.

(5) IZABEL RODRIGUES DE MIRANDA. CARACTERÍSTICAS MORFOFISIOLÓGICAS E POLIMORFISMO DE DNA DE ISOLADOS DE Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae DO NORDESTE DO BRASIL. Dissertação defendida e aprovada em 30/11/2000. COMISSÃO EXAMINADORA. Profº. Dr. Rildo Sartori Departamento de Agronomia / UFRPE. Profª. Dra. Neiva Tinti de Oliveira Coordenadora em exercício do Mestrado de Biologia de Fungos Centro de Ciências Biológicas / Departamento de Micologia / UFPE. Profª. Dra. Elza Áurea Luna Centro de Ciências Biológicas / Departamento de Micologia / UFPE.

(6) Ao meu sábio pai, MIRANDA, de sorriso largo, coração vasto e alma tão profunda, que há muito, há muito me faz falta.... DEDICO. Ao meu anjo terrestre, porto seguro de carinho e amor, que a tudo ilumina, minha mãe, D.TERINHA. Àquela que também só nos cercou de carinho e que acredito haver apenas uma palavra no mundo que possa defini-la. A dona do nosso jardim, minha tia RACHEL. As minhas estrelas guias e Sol astrais, meus filhos, XAVANA e XAENY. Que o meu Deus os abençoe, guie e proteja eternamente. Ao meu amor, HEITOR, cuja humanidade, tão grandiosa, não canso de admirar. As minhas pedras preciosas, a pequenina e querida ANNA (topázio) e a suave e confortadora EYA (rubi), minhas irmãs, que sempre me ensinam e me encantam. Aos “nossos anjinhos de luz,” verdadeiros confortadores de nossos corações e acendedores de nossas almas, meus sobrinhos YAGO e YASMIN. Minha verdadeira e preciosa família,. OFEREÇO..

(7) AGRADECIMENTOS Sobre todas as coisas, ao “meu” Deus, presente no Universo e em meu coração. Ao prof. Francisco Cordeiro, pelas palavras de apoio e encorajamento iniciais, neste novo caminho. Ao CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão do suporte financeiro para a realização deste trabalho. Ao Departamento de Micologia por viabilizar tamanha oportunidade. À prof. Dra. Neiva Tinti de Oliveira, por sua orientação. À prof. Marilene, pelo apoio espiritual e humano em todos os momentos que necessitei. Que os anjos lhe guiem e sua “fonte de luz” seja inesgotável. À prof. Dra. Uided Maaze pela gentileza de nos ceder as amostras para este estudo. À prof. Dra. Elza Áurea Luna pela sua atenção carinhosa em todos os momentos que a solicitei, por seus conselhos preciosos e pela eterna vontade de passar os seus conhecimentos, incondicionalmente. A todos os colegas de curso, pelos momentos de interação que vivenciamos e a certeza de nada ser por acaso. “Tudo vale a pena quando a alma não é pequena”. Aos queridos colegas e amigos, Ana Beatriz, Bartolomeu e Rita de Cássia, pelo incentivo, carinho e maravilhosos momentos passados juntos. Por tê-los conhecido, já valeu! A colega e amiga RITA DE CÁSSIA, um agradecimento muito mais que especial. Grande parte deste trabalho tornou-se melhor devido ao seu afetuoso e incansável apoio. A minha irmã Eya Miranda, um agradecimento também muito mais que especial, não só por sua devotada e carinhosa amizade em mais uma realização pessoal, como pelo desempenho profissional prestado em várias etapas deste trabalho. A minha irmã Anna Miranda, pelo seu jeito virginiano de sempre impulsionar-me para o alto e a constante participação em “nossas” vidas..

(8) A minha empregada Maria, pelo seu carinho e por possibilitar que minhas mãos fiquem “livres” do inevitável e necessário trabalho doméstico. Às primas Jeanne e Jackeline Rodrigues, que sempre nas nossas conversas a respeito deste trabalho, elevaram a minha capacidade, aflorando uma nova confiança e alegria em mim. A minha amiga Cristina Souza, especialmente, pela confiança, incentivo e força neste meu atual momento, e a todos os outros amigos (eles sabem quem são) pela certeza de sempre está em seus corações e vice-versa. Sem vocês a vida não teria o mesmo sentido. Mais uma vez, Deus cisma em me iluminar com a presença de um anjo. Palavras, querida colega Luciana Franco, são insuficientes para expressar minha gratidão. Aos meus amados pais, os melhores exemplos de amor, companheirismo, humanidade, virtuosidade e felicidade de que tenho conhecimento. Ao meu precioso filho Xaeny um agradecimento especialíssimo por sua engenhosidade e intimidade com a ciência da computação que me foram indispensáveis e a vontade sempre, de me ajudar não só neste aspecto.O seu orgulho por mim, também me ajuda a crescer. A minha preciosa filha Xavana. Basta o seu olhar para sentir todo o carinho, orgulho e admiração que emanas. Isto é TUDO para mim. Obrigada querida e especialmente neste momento, pela torcida, “conselhos” e compreensão em relação a minha ausência justo agora, num momento que tanto necessitas de mim. Ao meu amado esposo Heitor por, na nossa vida em comum e nas minhas escolhas, ser de um carinho e respeito tão raros e também, por sua total solicitude quando precisei de sua ajuda profissional para a realização deste trabalho. A vocês três, esposo e filhos queridos (sendo realmente redundante), cujo amor se manifesta de tantas maneiras, mas especialmente através de seu envolvimento, incentivo, paciência, compreensão e luminosidade. “7(1+23(16$0(172648( 6(38'(66(5(9(/É/26 ()$=È/269,9(5 $&5(6&(17$5,$0129$ /80,126,'$'($6(675(/$6 129$%(/(=$$2081'2 (0$,25$025 $2&25$d®2'26+20(16µ.

(9) . &$17$5(&$17$5(&$17$5 $%(/(=$'(6(580(7(512 $35(1',= Gonzaguinha.

(10) SUMÁRIO. LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... I. LISTA DE TABELAS.......................................................................................... V. LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................. VI. RESUMO............................................................................................................ VII. 1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 08. 2. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 2.1 O hospedeiro........................................................................................... 2.2 Fusariose ou murcha de Fusarium.......................................................... 2.3 O patógeno.............................................................................................. 2.4 Técnicas de Biologia molecular – PCR/RAPD.......................................... 10 10 12 14 16. 3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 22. 3.1 Material Biológico...................................................................................... 22. 3.2 Meios de Cultura e Soluções.................................................................... 24. 3.2.1 Meio Czapeck líquido (CZ)............................................................... 24. 3.2.2 Meio Czapeck Ágar (CZA)................................................................ 24. 3.2.3 Meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA.................................................... 24. 3.2.4 Solução de “Tween 80” 0,1% (v/v)................................................... 25. 3.2.5 Solução de Brometo de Etídio.......................................................... 25. 3.2.6 Tampão Fenol.................................................................................. 25. 3.2.7 Solução clorofane............................................................................. 25. 3.2.8 Solução clorofil................................................................................. 25. 3.2.9 NaCl 0,3M......................................................................................... 26. 3.2.10 Tris-HCL 1M pH 8,0....................................................................... 26. 3.2.11 EDTA 0,5M pH 8,0......................................................................... 26. 3.2.12 SDS 10%........................................................................................ 26. 3.2.13 Gel de agarose para eletroforese de DNA total (0,8%).................. 27. 3.2.14 Gel de agarose para RAPD (1,4%)................................................ 27.

(11) 3.2.15 Tampão TE..................................................................................... 27. 3.2.16 Tampão de extração de DNA de fungos filamentosos................... 27. 3.2.17 Tampão TEB 10X pH 8,0............................................................... 28. 3.2.18 Tampão de amostra....................................................................... 28. 3.2.19 Tampão de amplificação 10X, Enzima Taq polimerase, Mg++...... 28. 3.2.20 Primers........................................................................................... 29. 3.2.21 dNTP.............................................................................................. 29. 3.3 Características morfológicas (cor e aspecto da colônia)............................ 29. 3.4 Crescimento micelial de isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae..... 30. 3.5 Obtenção do micélio para extração do DNA genômico........................... 30. 3.6 Extração de DNA...................................................................................... 31. 3.7 Quantificação do DNA.............................................................................. 32. 3.8 Seleção de primers................................................................................... 32. 3.9 Amplificação do DNA................................................................................ 32. 3.10 Análise computacional dos dados.......................................................... 33. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 4.1 Morfologia da colônia................................................................................ 34 34. 4.1.1 Aspecto e coloração........................................................................ 34. 4.1.2 Crescimento micelial da colônia...................................................... 39. 4.1.3 Microcultivo...................................................................................... 44. 4.2 Extração e quantificação do DNA............................................................. 46. 4.3 Seleção de primers................................................................................... 47. 4.4 Análise do polimorfismo do DNA amplificado dos isolados de F. oxysporum f.sp. passiflorae pela técnica de RAPD............................ 50. 5. CONCLUSÕES.............................................................................................. 55. 6. ABSTRACT.................................................................................................... 56. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 57. APÊNDICE......................................................................................................... 66.

(12) Miranda, I.R.. Características Morfológicas e Polimorfismo de DNA.... I. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Aspecto macromorfológico de culturas de F.oxysporum f. sp. passiflorae com seis dias de incubação a 28° C. 1) Isolado 2695; 2) Isolado 4100; 3) Isolado 4101; 4) Isolado 4102; 5) Isolado 4103. As figuras indicadas pelas letras a (frente) e b (verso) referem-se ao crescimento em meio BDA e as indicadas por c (frente) e d (verso), ao crescimento em meio CZA.......................................................................... 36 Figura 2. Aspectos macromorfológicos de culturas de F.oxysporum f. sp. passiflorae com seis dias de incubação a 28° C. 1) Isolado 4104; 2) Isolado 4105; 3) Isolado 4106; 4) Isolado 4107; 5) Isolado 4108. As figuras indicadas pelas letras a (frente) e b (verso) referem-se ao crescimento em meio BDA e as indicadas por c (frente) e d (verso), ao crescimento em meio CZA.......................................................................... 37 Figura 3. Aspectos macromorfológicos de culturas de F.oxysporum f. sp. passiflorae com seis dias de incubação a 28° C. 1) Isolado 4109; 2) Isolado 4110; 3) Isolado 4111; 4) Isolado 4112; 5) Isolado 4113. As figuras indicadas pelas letras a (frente) e b (verso) referem-se ao crescimento em meio BDA e as indicadas por c (frente) e d (verso), ao crescimento em meio CZA.......................................................................... 38 Figura 4. Curvas de crescimento dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae em meio BDA a 28 ºC............................................................... 42 Figura 5. Curvas de crescimento dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae em meio CZA a 28 ºC................................................................ 42.

(13) Miranda, I.R.. Características Morfológicas e Polimorfismo de DNA.... II. Figura 6. Aspectos microscópicos de microcultivo do isolado 4102 em meio BDA a 28°C de F. oxysporum f. sp. passsiflorae a) microconídios b) macroconídios......................................................................................... 45 Figura 7. Aspectos microscópicos de microcultivo do isolado 4100 em meio BDA a 28°C de F. oxysporum f. sp. passsiflorae a) Clamidósporos b) microconidióforo...................................................................................... 45. Figura 8. Quantificação do DNA dos 15 isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae. A, B, C e D : marcador de peso molecular fago λ nas concentrações de 50, 100, 150 e 200ng/µl; 1) 4000; 2) 4001; 3) 2695; 4) 4002; 5) 4003; 6) 4004; 7) 4005; 8) 4006; 9) 4007; 10) 4008; 11) 4009; 12) 4010; 13) 4011; 14) 4012; 15) 4013...................................... 46. Figura 9. Seleção de primers com o DNA do isolado 4111 de F. oxysporum f. sp. passiflorae; M: marcador de peso molecular DNA de fago λ cortado com a enzima Hind III; Canaletas: 1) OPA 1; 2) OPA 2; 3) OPA 3; 4) OPA 4; 5) OPA 5; 6) OPA 6; 7) OPA 7; 8) OPA 8; 9) OPA 9; 10) OPA 10; 11) OPA 11; 12) OPA 12; 13) OPA 13; 14) OPA 14; 15) OPA 15; 16) OPA 16; 17) OPA 17; 18) OPA 18; 19) OPA 19; 20) OPA 20. A seta indica o. primer selecionado. para análise de. polimorfismo de DNA................................................................................... 48. Figura 10. Seleção de primers com o DNA do isolado 4111 de F. oxysporum f. sp. passiflorae; M: marcador de peso molecular DNA de fago λ cortado com a enzima Hind III; Canaletas: 1) OPW 1; 2) OPW 3; 3) OPW 5; 4) OPW 6; 5) OPW 7; 6) OPW 8; 7) OPW 9; 8) OPW 10; 9) OPW 11; 10) OPW 12; 11) OPW 13; 12) OPW 14; 13) OPW 15;. 14). OPW 16; 15) OPW 17; 16) OPW 18; 17) OPW 19; 18) OPW 20. As setas indicam os primers selecionados para análise de polimorfismo de DNA............................................................................................................. 49 Figura 11. Seleção de primers com o DNA do isolado 4111 de F. oxysporum f. sp. passiflorae: M: marcador de peso molecular DNA de λ.

(14) Miranda, I.R.. Características Morfológicas e Polimorfismo de DNA.... III. fago λ cortado com a enzima Hind III Canaletas: 1) OPX 1; 2) OPX 2; 3) OPX 3; 4) OPX 4; 5) OPX 5; 6) OPX 6; 7) OPX 7; 8) OPX 8; 9) OPX 9; 1O) OPX 11; 11) OPX 12; 12) OPX 13; 13) OPX 14; 14) OPX 15; 15) OPX 16; 16) OPX 17; 17) OPX 18; 18) OPX 19; 19) OPX 20. A seta indica o primer selecionado para análise de polimorfismo de DNA............. 49. Figura 12. Perfis de RAPD dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae obtidos com o primer OPA18. M: marcador de peso molecular DNA de fago λ cortado com a enzima Hind III; 1) 4100; 2) 4101; 3) 2695; 4) 4102; 5) 4103; 6) 4104; 7) 4105; 8) 4106; 9) 4107; 10) 4108; 11) 4109; 12) 4110; 13) 4111; 14) 4112; 15) 4113...................... 51. Figura 13. Perfis de RAPD dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae amplificados com o primer OPW06. M : marcador de peso molecular DNA de fago λ cortado com a enzima Hind III; 1) 4100;. 2). 4101; 3) 2695; 4) 4102; 5) 4103; 6) 4104; 7) 4105; 8) 4106; 9) 4107; 10) 4108; 11) 4109; 12) 4110; 13) 4111; 14) 4112; 15) 4113...................... 51. Figura 14. Perfis de RAPD dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae amplificados com o primer OPW11. M : marcador de peso molecular DNA de fago λ cortado com a enzima Hind III;. 1) 4100;. 2) 4001; 3) 2695; 4) 4102; 5) 4103; 6) 4104; 7) 4105; 8) 4106; 9) 4107; 10) 4108; 11) 4109; 12) 4110; 13) 4111; 14) 4112; 15) 4113...................... Figura 15. Perfis de RAPD dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae amplificados com o primer OPX03. M : marcador de peso molecular DNA de fago λ cortado com a enzima Hind III; 1) 4100; 2) 4101; 3) 2695; 4) 4102; 5) 4103; 6) 4104; 7) 4105; 8) 4106; 9) 4107;. 52.

(15) Miranda, I.R.. Características Morfológicas e Polimorfismo de DNA.... IV. 2) 4101; 3) 2695; 4) 4102; 5) 4103; 6) 4104; 7) 4105; 8) 4106; 9) 4107; 10) 4108; 11) 4109; 12) 4110; 13) 4111; 14) 4112; 15) 4113...................... 52. Figura 16. Dendrograma construído pelo método de agrupamento UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard a partir dos perfis de RAPD obtidos para os quinze isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae........... 53.

(16) Miranda, I.R.. Características Morfológicas e Polimorfismo de DNA.... V. LISTA DE TABELAS Tabela 1. Isolados de F.oxysporum f. sp. passiflorae; registro na URM-UFPE,. procedência,. substrato. e. registro. original........................................................................................................... 22. Tabela 2. Componentes da reação de amplificação do DNA de amostras de F. oxysporum f. sp. passiflorae e respectivas concetrações utilizadas em. uma. reação. de 33. RAPD.............................................................................. Tabela. 3.. Características. morfológicas. culturais. de. colônias. de. F.oxysporum f. sp. passiflorae quanto ao aspecto e coloração..................... 35. Tabela 4. Crescimento micelial de isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae em meio BDA a 28 ºC................................................................. 40 Tabela 5. Crescimento micelial de isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae em meio CZA a 28 ºC.................................................................. 41. Tabela 6. Taxa de crescimento micelial de isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae em meio BDA a 28°C.................................................................. 43 Tabela 7. Taxa de crescimento micelial de isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae em meio CZA a 28°C................................................................... 44. Tabela 8. Concentrações estimadas de DNA genômico dos isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae..................................................................... 47. Tabela 9. Primers selecionados para o RAPD e respectivas seqüências de nucleotídios............................................................................................... 48.

(17) Miranda, I.R.. Características Morfológicas e Polimorfismo de DNA.... LISTA DE ABREVIATURAS. PCR: Polimerase Chain Reaction RAPD: Ramdom Amplified Polymorfic DNA DNA: Desoxirribonucleic acid dATP: Trifosfato de Adenina dCTP: Trifosfato de Citosina dGTP: Trifosfato de Guanina dTTP: Trifosfato de Timina Mix.: Mistura BDA: Batata Dextrose Ágar CZA/CZ: Meio de Czapeck agar e líquido respectivamente EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária CPATSA: Centro de Pesquisa Agropecuária do Trópico do Semi-árido CNPMF: Centro Nacional de Pesquisa da Mandioca e Fruticultura UFPE: Universidade Federal de Pernambuco UME: University Recife Mycologia CCB:Centro de Ciências Biológicas URM: University Recife Mycologia. VI.

(18) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... RESUMO Quinze isolados de Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae provenientes do nordeste do Brasil foram analisados quanto a sua variabilidade genética utilizando a técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e em termos de características morfofisiológicas. Os isolados foram obtidos da Micoteca-URM do Departamento de Micologia/UFPE, Recife-PE. Na primeira etapa deste trabalho, foram observadas as características morfológicas (coloração e aspecto da colônia) e fisiológicas (crescimento e taxa de crescimento micelial dos isolados), utilizando-se dois meios de cultura, o BDA e o CZA. As características micromorfológicas também foram observadas, após microcultivos, utilizando o meio BDA. Os resultados obtidos, indicaram que houve maior variação no crescimento e também na expressão da coloração micelial dos isolados colonizados em meio BDA. As amostras apresentaram uma variação significativa em relação as taxas de crescimento entre os meios CZA e BDA. Para a investigação do polimorfismo de DNA dos isolados utilizando-se a técnica de RAPD, foram testados 57 primers dos quais quatro foram selecionados considerando-se a geração de bandas mais fortes, mais definidas e em maior número. Os primers selecionados geraram um total de 448 bandas, permitindo a construção de uma matriz de similaridade. Observou-se elevado polimorfismo genético, pois pelo menos uma banda não estava presente em todas as amostras não havendo presença de bandas monomórficas. O coeficiente médio de similaridade obtido para todas as amostras foi de 0.62 (62%). O dendrograma gerado a partir dos dados da matriz revelou uma alta variabilidade genética entre os isolados, pertencentes a mesma formae specialis. Aparentemente, não existe correlação entre a taxa de crescimento micelial e agrupamento dos isolados no dendrograma..

(19) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 8. 1. INTRODUÇÃO. Os fungos constituem um grande grupo de microorganismos cuja importância para a humanidade só foi reconhecida há pouco mais de um século e mesmo assim, ainda não se sabe, com certeza, quais as suas origens e quantas espécies ocorrem no mundo (Milanez, 1995). Estes importantes organismos interagem na natureza das mais variadas formas, tanto agindo de forma deletéria quanto de forma benéfica: atuam como agentes primários na decomposição no ciclo do carbono, nitrogênio e outros produtos; causam sérias doenças em plantas, animais e seres humanos; produzem muitos materiais importantes para a indústria alimentícia, farmacêutica e química. Portanto é de grande importância o conhecimento da atividade destes microorganismos, especialmente para que haja um maior controle de suas atividades deletérias. A medida que melhor compreende-se o papel dos fungos, maior o proveito que deles se pode obter para o benefício da sociedade (Griffin, 1994; Milanez, 1995). Os fungos fitopatogênicos são os causadores de uma série de doenças nas mais variadas espécies do reino vegetal. A maioria destes fungos ocorrem nas regiões tropicais (Shivas & Hyde, 1997) e são responsáveis por cerca de 90% de todas as doenças conhecidas (Hawksworth, 1993). O presente estudo aborda o fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum Schlchtend.:Fr. (Snyder & Hansen, 1940). Os representantes do gênero Fusarium figuram entre os mais importantes fitopatógenos (Booth, 1971; Domsch,1993; Nelson et al. 1983)..

(20) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 9. Fusarium oxysporum Schlchtend.:Fr. (Snyder & Hansen, 1940) é responsável pela “Murcha de Fusarium” (Assigbetse et al., 1994; Crowhurst et al. 1995; Silva-Hanlin et al., 1999; De Vay et al. 1997; O' Donnel et al. 1999; Voigt et al., 1995; Pegg et al., 1995), conhecida como a mais devastadora doença de planta do mundo ( Booth, 1971). F. oxysporum Schl f. sp. passiflorae Purss. Apud Gordon, (Yamashiro, 1987; Domsch et al., 1993) é o agente causal da “Murcha de Fusarium” em maracujazeiros (Passiflora spp), o que provoca substanciais problemas nesta cultura em diversas partes do mundo. Na região Nordeste do Brasil, a cultura do maracujá é uma alternativa de produção e de elevação da renda para pequenos e médios produtores. Portanto esta doença pode ser considerada como um dos fatores limitantes da produção, uma vez que até o momento as medidas de controle recomendadas não são eficientes. A identificação da diversidade genética presente em F. oxysporum f.sp. passiflorae constitui informação fundamental para programas de melhoramento, visando a obtenção de cultivares resistentes à murcha do maracujazeiro. Diversos trabalhos têm avaliado a variabiliade genética existente entre isolados de F. oxysporum de diferentes formae specialis utilizando a técnica de RAPD (Nelson et al., 1997; Assigbetse et al., 1994; Bentley et al., 1995; Manulis et al., 1994 ). Com a finalidade de contribuir para um maior conhecimento deste patógeno no sentido de auxiliar na construção de estratégias de controle da doença favorecendo os programas de melhoramento, este estudo teve como objetivo a caracterização de isolados de F.oxysporum f.sp. passiflorae, presentes na região Nordeste do Brasil, utilizando-se características morfofisiológicas e o polimorfismo de DNA gerado pela técnica de RAPD..

(21) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 10. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 2.1 O hospedeiro O Maracujazeiro é uma planta tropical do gênero Passiflora (Pio-Ribeiro & Mariano,1997), pertencente a ordem Passiflorales, família Passifloraceae. De origem sul-americana e brasileira, possui seu maior centro de distribuição geográfica no Brasil Centro-Norte (Leitão Fº & Aranha, 1974). No Brasil, o cultivo do maracujá em escala comercial, teve início no começo da década de 70, com P. edulis Sims f. flavicarpa Deg. (maracujá-amarelo). Espécie mais cultivada por apresentar frutos maiores, maior adaptabilidade ao clima quente, maior produtividade e maior resistência à fusariose ou "Murcha de Fusarium" (Salomão & Andrade, 1987; Lima et al., 1994; Manica, 1977). O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá, sendo cultivado principalmente nos estados de Sergipe, Pará, Rio de Janeiro, Ceará, Bahia, São Paulo, Piauí e Pernambuco. Os estados de Sergipe e Pernambuco destacam-se como os principais produtores (Anuário estatístico do Brasil, 1996; Susuki, 1987; Manica, 1981). A maior expressão econômica da industrialização do maracujazeiro é o suco (tanto o integral, quanto o concentrado), muitíssimo aceito nos mais variados mercados, o que proporcionou o desenvolvimento desta cultura em muitos países (Susuki, 1987). É utilizado na fabricação de sorvetes, licores e doces; na industria.

(22) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 11. famacológica, por suas propriedades medicinais (ação sedativa e tranquilizante); muito apreciado pelo valor decorativo de suas flores e qualidade gustativa de seus frutos (Susuki, 1987.; Medina et al., 1980.; Manica, 1981.; Pio-Ribeiro & Mariano,1997). Na alimentação, Balbach & Boarin (1992) exaltam sua importância pelo fato de seus frutos serem fonte de glicídios, vitaminas A, B2 (riboflavina) e C (ácido ascórbico)..

(23) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 12. 2.2 Fusariose ou Murcha do Fusarium As doenças que afetam os pomares podem ser classificadas de acordo com o tipo de agente causal: de origem bacteriana, fúngica ou virótica. Às fúngicas, a depender das partes atacadas da planta, podem ser divididas em dois grupos: doenças das partes aéreas, que se caracterizam por atacar os órgãos da parte aérea da planta, como folhas, ramos, inflorescências e frutos em qualquer estágio; sendo as principais doenças conhecidas a Antracnose e a Cladosporiose; e doenças das partes baixas, cuja sintomatologia encontra-se nas partes baixas da planta, atacando à altura do colo ou nas inserções das raízes superficiais. Neste último grupo as principais doenças conhecidas são a “Podridão do Pé” e especialmente a “Murcha de Fusarium ou Fusariose”, causada pelo fungo F. oxysporum f. sp. passiflorae. (Yamashiro, 1987). Esta doença afeta diversas culturas de interesse. econômico causando substanciais problemas no mundo inteiro, sendo responsável pelo insucesso das mesmas em várias regiões (Pio-Ribeiro & Mariano, 1997; Kimati, 1980). De acordo com Carvalho & Carvalho (1968), Masuda (1974) e Souza Filho et al. (1978), a ocorrência da "murcha" no Brasil, tem sido associada apenas ao Fusarium oxysporum. Segundo Pio-Ribeiro & Mariano (1997) a doença em culturas de maracujá foi descrita em Queensland (Austrália) em 1951, sendo relatadas no Brasil, pela primeira vez, na cidade de São Paulo em 1968 por Carvalho & Carvalho (1968). Logo após, foi relatada na cidade do Rio de Janeiro, e mais recentemente em 1993 e 1995 no Espírito Santo e Tocantins, respectivamente. A "Fusariose" pode ocorrer em qualquer fase do desenvolvimento da planta. O fungo. penetra. preferencialmente. pelas. raízes. primárias. ou. secundárias,. indiferentemente, e deteriora inicialmente a casca, penetrando depois nos tecidos lenhosos do câmbio, onde faz sua colonização maior através dos vasos. A doença causa uma impermeabilização dos vasos do xilema, o que impede o transporte da seiva para outros tecidos. Os sintomas mais facilmente visualizados são a mudança na coloração da folhagem, a murcha repentina, colapso e morte da planta. Uma vez.

(24) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 13. instalada na planta, esta doença ainda não comporta controle curativo a nível econômico até o momento (Pio-Ribeiro & Mariano, 1997; Yamashiro,1987). Para a prevenção, recomenda-se principalmente, evitar o plantio em áreas ricas em matéria orgânica e mal drenadas; plantar cultivares resistentes; tratar os solos das sementeiras, procurando impedir o desenvolvimento do fungo, e controlar os nematóides e ervas daninhas. Caso a doença já esteja instalada, recomenda-se a erradicação dos maracujazeiros afetados (Pio-Ribeiro & Mariano,1997)..

(25) Miranda, I.R.. 14. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 2.3 O Patógeno Os fungos têm importante papel ecológico, participando da decomposição de matéria orgânica, modificação da permeabilidade do solo, síntese de substâncias húmicas e de simbioses da produção de biomassa (alimentos ou rações) entre outros. Há os fungos que causam doenças nas plantas, animais e no próprio homem. Há outros fungos que deterioram matérias primas, alimentos e rações. Alguns desses fungos além de deteriorarem os grãos dos cereais, produzem micotoxinas, que são danosas ao ser humano e animais. A amplitude da atuação dos fungos no ecossistema é enorme e mesmo já se conhecendo algumas delas, abrange-las em sua totalidade ainda é um objetivo da comunidade científica, pois estes organismos poderiam ser mais facilmente controlados uma vez conhecidos os parâmetros físicos, químicos e biológicos que interferem na produção dessas substâncias ou no seu crescimento (Milanez, 1995). Os fungos fitopatógenos destroem plantações de várias culturas de interesse econômico, causando substanciais prejuízos para o setor agrícola. Shivas & Hyde (1997) acreditam que a grande maioria dos fungos fitopatógenos ocorrem nos trópicos, baseados nas suposições de que três-quartos de gêneros de plantas conhecidos ocorrem nas regiões tropicais; que os gêneros de plantas possuem em média cerca de 50 fungos patógenos; que a metade dos patógenos de um hospedeiro são específicos para o gênero do hospedeiro ou para um gênero mais próximo relatado e comparativamente, poucos fungos patógenos possuem uma larga variedade de hospedeiros distantes dos hospedeiros conhecidos. O gênero Fusarium, pertence à subdivisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, ordem Moniliales, família Tuberculariaceae (Ainsworth, 1973). Caracteriza-se por apresentar micélio extensivo e cotonoso, frequentemente produzindo coloração rósea, púrpura ou amarela no meio de cultura. Apresentam microconídios. abundantes,. geralmente. unicelulares,. ovóides,. formados. em. conidióforos simples ou ramificados; e macroconídios também abundantes, falcados e multiseptados; produzem clamidosporos e esclerócios (Booth, 1971; Lacaz,1991; Nelson, et al., 1983; Menezes & Oliveira, 1993; Domsch et al., 1993). As espécies do gênero são identificadas principalmente através dos caracteres morfológicos, e suas.

(26) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 15. formas fitopatogênicas, classificadas de acordo com a especificidade ao hospedeiro (Snyder & Hansen, 1940; Bentley et al., 1995; Edel et al., 1996; Kimati, 1980; Domsch et al., 1993). O gênero tem adquirido importância adicional, uma vez que foi detectada em algumas espécies a produção de micotoxinas e o ocasionamento de doenças em animais e humanos (Nelson et al., 1983; Domsch et al., 1993). F. oxysporum pertencente à Secção Elegans (Nelson et al., 1983) e é a espécie economicamente mais importante do gênero. Possuem mais de 120 formas especiais com diferentes raças capazes de causar "murchas" vasculares em diversas culturas comerciais de mais de 100 espécies de plantas. Conhecidas em todo o mundo, é provável que causem os maiores danos econômicos para colheitas agrícolas que qualquer outro patógeno de planta (Armstrong & Armstrong, 1981; Domsch et al., 1993).. Em sua maioria são de distribuição cosmopolita e ativos. decompositores da celulose em substratos vegetais (Edel et al., 1996; Edel et al., 1995; Nelson et al., 1997; De Vay et al., 1997; Assigbetse et al., 1994). Como ocorre em muitos outros fungos de solo, são dotados de abundantes meios de sobrevivência; um desses mecanismos é a rápida capacidade de mudança, tanto morfológica quanto fisiológica, podendo sobreviver assim em diversos tipos de substratos (Domsch et al., 1993). O agente causal da “murcha de fusarium” do maracujazeiro, é o fungo F. oxysporum f. sp. passiflorae, cuja disseminação se dá pelo contato direto entre raízes, água de superfície e subsuperfície e principalmente pelo transporte de sementes e mudas contaminadas. O patógeno penetra pelo sistema radicular, através de ferimentos naturais ou artificiais, em seguida atinge o xilema, através do qual se dissemina (Pio-Ribeiro & Mariano, 1997)..

(27) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 16. 2.4 Técnicas de Biologia molecular – PCR/RAPD A existência da variabilidade é o princípio básico para estudos genéticos, o que permite selecionar e estudar a herança de caracteres, visando a obtenção de novas combinações genéticas e informações sobre a variabilidade em plantas, animais e microorganismos (Ferreira & Grattapaglia, 1995). Com o desenvolvimento tecnológico e avanços na biologia molecular, modernas e poderosas técnicas moleculares surgiram. Entre estas, a PCR (Polimerase Chain Reaction) e a técnica de amplificação ao acaso de DNA polimórfico - RAPD, que muito tem contribuído para a detecção da variabilidade genética em diversos organismos. Desde a introdução da PCR, um crescente número de aplicações científicas foi realizada, incluindo clonagem direta, mutagênese e sequenciamento direto ou complemetar de DNA genômico (Foster, 1993),etc.. As técnicas baseadas em marcadores de DNA são altamente vantajosas, uma vez que representam diretamente a variabilidade genética, não estando sujeitas à influências do ambiente e nem sofrem variação em função do estágio de desenvolvimento do organismo e do tipo de tecido utilizado (Puterka et al., 1993). A reação em cadeia da polimerase (PCR), técnica descrita por Saiki et al. (1985), permite a amplificação de DNA pela ligação de oligonucleotídeos primers a regiões que delimitam determinada seqüência de DNA. Esta técnica causou grande impacto na biologia molecular, pois possibilitou a obtenção "in vitro" de várias cópias de um segmento específico de DNA. Para que ocorra esta amplificação, faz-se necessário seguir algumas etapas: a extração do DNA genômico, que é um DNA livre de outros constituintes celulares e que contêm o molde da região a ser amplificada, por isso chamado de DNA molde; reação de amplificação, etapa onde ocorre a duplicação de um determinado segmento de DNA, milhões de vezes. Para que esta duplicação aconteça são necessários o DNA molde (uma fita de DNA é utilizada como molde para a síntese dos novos segmentos complementares através da ação do DNA polimerase termoestável), os desoxinucleotídeos trifosfatados: dATP, dCTP,dGTP e dTTP (nucleotídeos que compõem a cadeia de DNA), o DNA.

(28) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 17. polimerase (DNA polimerase termoestável, a Taq DNA polimerase, que possui a capacidade de adicionar os nucleotídeos da reação de acordo com os da fita molde) e os oligonucleotídeos primers (oligonucleotídeos com seqüências complementares às extremidades 3' de cada uma das fitas simples, que servem de molde para a síntese). São os primers que definem a região do DNA genômico a ser sintetizada, uma vez que os se anelam especificamente àquelas seqüências homólogas na fita molde (Astolfi Filho et al., 1997; Fungaro, 1995). O processo de amplificação ocorre da seguinte forma: é feito um "mix" destes componentes em um tubo de ensaio, adicionado da solução tampão. O "mix" é submetido a os repetidos ciclos de amplificação (30 - 45), cada um envolvendo 3 etapas distintas de acordo com a temperatura: desnaturação (90 a 94°C - ocorre o rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias de DNA, provocando a desnaturação da molécula; anelamento (40 a 55C)- os primers se anelam às suas seqüências homólogas no DNA genômico e alongamento ou extensão (a 72°C por 2 a 5 min.) - ocorre a extensão da cadeia pela ação da enzima Taq polimerase. Toda essa variação de temperatura é feita em um termociclador programado. Após a finalização de 30 a 40 ciclos destes, são produzidas mais de 250 milhões de cópias de uma determinada seqüência específica do DNA em fita dupla, pois o número de cópias cresce de modo exponencial a cada ciclo (Astolfi Filho et al., 1997; Fungaro, 1995; Saiki et al., 1988). Finalmente, como última etapa da amplificação, é realizada a análise dos produtos amplificados em gel de agarose, corados com brometo de etídio, após eletroforese (Astolfi Filho, 1997; Fungaro, 1995). Williams. et al. (1990) e Welsh & McClelland (1990) descreveram. simultaneamente uma nova técnica de marcadores moleculares tendo como base os princípios da PCR, de enorme importância, especialmente quando objetiva-se a obtenção de marcadores genéticos distribuídos pelo genoma. Esta técnica chamada de RAPD tem como principal característica, a amplificação de fragmentos aleatórios de DNA, ou seja, são utilizados primers de seqüências arbitrárias de nucleotídeos. Não há, portanto, necessidade de conhecimento prévio das seqüências de nucleotídeos que serão amplificados. Esta característica é a principal diferença entre a técnica de PCR e a de RAPD. A amplificação através da técnica de RAPD.

(29) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 18. acontecerá quando a seqüência arbitrária do oligonucleotídeo utilizado, reconhecer sítios de homologia nas fitas do DNA molde, sendo uma delas com orientação invertida, dentro do intervalo limite da PCR - 4Kb (Williams et al., 1990). O tamanho dos primers utilizados para RAPD são menores do que os usados na PCR para que haja maior probabilidade de se encontrar seus homólogos. Devido ao alto grau de polimorfismo gerado, os marcadores RAPD permitem uma rápida avaliação da diversidade genética existente entre indivíduos. Esta técnica possui inúmeras vantagens, como proporcionar um número ilimitado de marcadores, evitar a interação direta com o ambiente, requerer pequenas quantidades de DNA, não necessariamente de alta pureza, não haver envolvimento de hibridização ou radioatividade, requerer pouco conhecimento da bioquímica ou da biologia molecular para interpretar os resultados obtidos (Megnegneau et al., 1993; Williams et al., 1990; Manulis et al., 1994; Michelmore et al., 1991; Welsh & McClelland, 1990). As aplicações da técnica de RAPD são bem diversificadas. Dentre elas estão o mapeamento genético, verificação de variabilidade ou polimorfismo genético, estudos de epidemiologia, taxonomia e evolução, identificação de raças e formas patogênicas, entre outras. Estudos genéticos, taxonômicos e ecológicos de muitos fungos têm sido realizados utilizando-se a técnica de RAPD ( Fungaro et al. 1996; Zinno et al., 1998; Abbasi et al., 1999; Paavanem – Huhtala et al., 2000; Machado et al., 1997; Wright et al., 1996; Yli-Mattila et al., 1996; Kistler et al., 1991; Bentley et al., 1995; Manulis et al., 1994; Nelson at al., 1997;. Assigbetse et al., 1994; Crowhurst et al., 1995;. Woo et al., 1996; Edel et al., 1995; Woudt et al., 1995; Edel et al., 1996; ). A técnica de RAPD tem sido freqüentemente utilizada para estudos da variabiliade genética de fungos filamentosos, uma vez que análises diretas de polimorfismos de DNA proporcionam informações úteis na variação dentro e entre espécies (Crowhurst et al., 1991). Crowhurst et al. (1995) avaliaram através da técnica de RAPD a variabilidade genética de 39 isolados de F. oxysporum coletados de angsana (Pterocarpus indicus Willd.), provenientes de diferentes regiões de Singapura, utilizando 17 primers. Os isolados apresentaram um alto grau de similaridade, apresentando poucas bandas.

(30) Miranda, I.R.. 19. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... polimórficas. As bandas polimórficas mais representativas possibilitaram distinguir quatro isolados obtidos de uma das regiões de Singapura, a Istana, dos isolados restantes. Manulis et al. (1994) examinaram através da técnica de RAPD, 58 isolados de F. oxysporum coletados de diversos cultivares de cravo provenientes de Israel, para identificação dos isolados patogênicos dos não patogênicos. Dos 58 isolados, 42 eram patogênicos da raça 2; 1(um) patogênico da raça 4 e 15, não eram patogênicos. Foram testados 30 primers arbitrários, dos quais 22 foram escolhidos para o RAPD. Os padrões de bandas gerados evidenciaram claramente os isolados patogênicos. dos. não. patogênicos.. Dezessete. dos. 22. primers. escolhidos. diferenciaram entre os isolados de F. oxysporum f.sp. dianthi (Prill. & Delacr.) W.C. Snyder & H. N. Hans. das raças 2 e 4 e comparados com outros métodos de identificação de F. oxysporum f.sp. dianthi, o RAPD é um método simples e rápido. Woo et al. (1996) trabalhando com 11 isolados de F. oxysporum f.sp phaseoli Kendrick & Snyder e a técnica de RAPD. Utilizaram quatro primers e constataram variabilidade genética dentro desta forma especial. Nelson et al. (1997) usaram a técnica de RAPD em isolados de F. oxysporum f. sp. erythroxyli, coletados de culturas de Erythroxylum coca Lam. var. coca., com o objetivo de elucidar a complexidade genética dos mesmos. Duzentos isolados de Fusarium foram coletados de culturas de coca em 10 diferentes locais da região central de Huallaga Valley, no Peru. Destes, confirmou-se que 187 eram F.oxysporum, dos quais 143 mostraram-se patogênicos a coca após testes de patogenicidade. Baseados na análise de RAPD, a variabilidade genética possibilitou agrupar os patógenos dentro de duas subpopulações e entre os isolados de cada subpopulação, observou-se uma alta similaridade genética. Os isolados patogênicos de F. oxysporum f. sp. erythroxyli. foram facilmente distinguidos dos não. patogênicos. Também observou-se distinção dos padrões de bandas de RAPD dos isolados de F. oxysporum f. sp. erythroxyli daqueles obtidos com as outras formas especiais de F. oxysporum e outras espécies de Fusarium. Machado et. al. (1997) caracterizaram dezesseis isolados de Cercospora sojina Hara através da técnica de RAPD. Os isolados foram coletados de diferentes áreas do estado de Minas Gerais, Brasil. Utilizaram-se 16 primers para as reações.

(31) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 20. de amplificação e foram geradas 89 bandas de DNA das quais 26 eram polimórficas. Os resultados mostraram uma extensa variabilidade genética, observando-se que isolados coletados de uma mesma área não foram incluídos necessariamente num mesmo grupo. Alzate-Marin et al. (1997) analisaram a diversidade genética de 22 isolados de Colletotrichum lindemuthianum, utilizando a metodologia do RAPD. Foram utilizados 21 primers , os quais geraram 102 bandas, sendo 56 polimórficas. Pela análise dos padões de bandas de RAPD, foi possível separar os isolados em três grupos distintos. Não se observou nenhuma relação entre os grupos e sua origem geográfica, e as raças previamente agrupadas por testes de virulência, não apresentaram correlação com a classificação obtida por marcadores RAPD. Crowhurst et al. (1991) utilizaram a técnica de RAPD para avaliar a variabilidade genética de 21 isolados de F. solani f. sp. cucurbitae das raças 1 e 2. Baseados nos padrões de RAPD, os isolados foram divididos em dois grupos distintos (MPI e MPV). Quatro isolados não puderam ser inseridos em nenhuma das subpopulações. Produtos de RAPD também foram usados para correlacionar os grupos MPI e MPV com regiões geográficas. Vilarinhos et al. (1995) objetivando caracterizar as raças Alfa-Brasil, Alfa-Brasil Widusa resistente/TU susceptível (patótipo 585), Zeta, Capa e Delta de Colletotrichum lindemuthianum, utilizaram marcadores moleculares RAPD. Foram geradas 105 bandas de DNA monomórficas e 48 polimórficas. Verificou-se alto polimorfismo entre o patótipo 585 as demais raças; e baixo polimorfismo entre as raças Alfa-Brasil, Zeta, Capa e Delta. Este resultado permitiu alocar as raças em grupos que diferem daqueles já definidos. Jungehülsing & Tudzynski, utilizando a técnica de RAPD, analisaram 29 isolados de Claviceps purpurea (Fr.) Tul., provenientes de vários hospedeiros e diferentes origens geográficas. Os resultados obtidos mostraram um alto grau de diversidade genética, incomum nestas espécies. Os isolados derivados do centeio apresentaram-se diversos dos derivados de outros hospedeiros. Bentley et al. (1995) avaliaram, utilizando a técnica de RAPD, a variabilidade genética de isolados de uma vasta coleção mundial de F. oxysporum f. sp. cubense (E.F.Sm.) W. C. Snyder & H. N. Hansen, representados pelas raças 1, 2 e 4 e 11.

(32) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA.... 21. diferentes grupos vegetativos (VCGs). Comparando padrões de bandas através de RAPD de ambos (raças e VCGs) foi possível dividir os isolados de F. oxysporum f. sp. cubense dentro de 2 grupos principais relacionando-os aos VCGs. Também foi possível determinar relacionamentos genéticos entre os diferentes VCGs e entre isolados de cada VCG. Em contraste, os resultados não mostraram correlações entre os padrões de bandas de RAPD e as raças. Assigbetse et al. (1994) analisaram pela técnica de RAPD a diversidade genética de 46 isolados de F. oxysporum f. sp. vasinfectum (Atk.) W.C. Snyder & H.N. Hansen, provenientes de várias regiões do mundo. Testes de patogenicidade em distintos cultivares de algodão diferenciaram os isolados em três raças (A, B e 4) restritos a áreas geográficas definidas. Os testes de RAPD foram realizados com 11 primers. O dendrograma gerado revelou polimorfismo entre os isolados. Os isolados formaram três grupos distintos mostrando correspondência com as suas reações patológicas..

(33) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 22. 3. MATERIAL E MÉTODOS. 3.1 Material Biológico Foram utilizados 15 isolados do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae, gentilmente cedidos pela prof. Dra. Uided Maaze, da UFRPE. Doze isolados foram obtidos da EMBRAPA/Petrolina-PE, dois do CNPMF-EMBRAPA/Cruz das Almas-BA e um da Micoteca do Departamento de Micologia, (registrada no Commonwealth Mycological Institute sob a sigla URM, Universidade do Recife Micologia), Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. A Tabela 1 representa o número de registro dos isolados na URM, a sua procedência, local da planta de onde foram isolados e número de registro original..

(34) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 23. Tabela 1. Isolados de F.oxysporum f.sp. passiflorae; registro na URM-UFPE, procedência, local de infecção e registro original.. Registro -URM. Procedência. Local de. Isolado. infecção 2695. URM-UFPE. Raiz. 26 95. 4100. CNPMF/ Cruz das Almas - BA. Colo. CN(MF)-12. 4101. CNPMF/ Cruz das Almas - BA. Ramos. CN(MF)-267. 4102. EMBRAPA/Petrolina-PE. Caule. CPATSA-8. 4103. EMBRAPA/Petrolina-PE. Colo. CPATSA-9. 4104. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-17. 4105. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-22. 4106. EMBRAPA/Petrolina-PE. Colo. CPATSA-23. 4107. EMBRAPA/Petrolina-PE. Colo. CPATSA-24. 4108. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-25. 4109. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA28b. 4110. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-30. 4111. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-32. 4112. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-34. 4113. EMBRAPA/Petrolina-PE. Raiz. CPATSA-37.

(35) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 3.2 Meios de Cultura e Soluções 3.2.1 Meio Czapeck líquido (CZ líquido) - Difco Nitrato de sódio.................................................... 3,0 g Fosfato de Potássio.............................................. 1,0 g Cloreto de Potássio.............................................. 0,5 g Sulfato de Ferro.................................................... 0,01 g Dextrose............................................................... 0,5 g Sulfato de magnésio............................................. 40 g Água destilada q.s.p. ........................................... 1000 ml. 3.2.2 Meio Czapeck Ágar (CZA) Nitrato de Sódio..................................................... 3,0 g Fosfato de Potássio............................................... 1,0 g Cloreto de Potássio............................................... 0,5 g Sulfato de Ferro..................................................... 0,01 g Dextrose................................................................ 0,5 g Sulfato de Magnésio.............................................. 40 g Agar-Ágar.............................................................. 16,0 g Água destilada q.s.p.............................................. 1000 ml. 3.2.3 Meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) - Oxoid Batata................................................................... 140,0 g Dextrose............................................................... 20,0 g Ágar...................................................................... 16,0 g Água destilada q.s.p............................................. 1000 ml. 24.

(36) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 25. 3.2.4 Solução de “Tween 80” 0,1% (v/v) Tween 80.............................................................. 0,1 ml Água destilada q.s.p............................................. 1000 ml A solução “Tween 80” foi distribuída em tubos de ensaios (2,5ml/tubo), autoclavada e mantida a 4ºC.. 3.2.5 Solução de Brometo de Etídio (Sambrook et al., 1989) Brometo de Etídio................................................. 0,01 g Água destilada q.s.p............................................. 10 ml Manipulou-se uma solução estoque de 10mg/ml pela adição de 1g de brometo de etídio a 100 ml de água destilada. Esta solução foi colocada em um agitador magnético por uma hora e posteriormente acondicionada em um frasco escuro sob refrigeração (4ºC). No momento de uso, 5µl dessa solução foram adicionados a 100ml de TEB-1X.. 3.2.6 Tampão Fenol Foi utilizado tampão fenol (GIBCO BRL). 3.2.7 Solução clorofane Obtida a partir da mistura de um volume de fenol com um volume de clorofil na proporção de 1:1. 3.2.8 Solução clorofil Obtida a partir da mistura de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção 24:1..

(37) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 26. 3.2.9 NaCl 0,3M NaCl...................................................................... 17,5 g Água deionizada q.s.p.......................................... 100 ml A solução foi autoclavada e mantida a 4ºC.. 3.2.10 Tris-HCL 1M pH 8,0 Trizma base.......................................................... 121,0 g Água deionizada q.s. p......................................... 1000 ml O pH foi ajustado para 8,0 com HCL concentrado. A solução foi autoclavada e mantida a 4ºC.. 3.2.11 EDTA 0,5M pH 8,0 EDTA.................................................................... 37,22 g Água deionizada q.s.p.......................................... 100 ml O pH foi ajustado para 8,0 adicionando pastilhas de NaOH. A solução foi autoclavada e mantida à 4ºC.. 3.2.12 SDS 10% SDS...................................................................... 20 g Água deionizada q.s.p.......................................... 200 ml.

(38) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 27. 3.2.13 Gel de agarose para eletroforese de DNA total (0,8%) Agarose.............................................................. 0,56 g TEB1X................................................................ 100 ml A agarose foi colocada em um Erlenmeyer e adicionou-se o TEB-1X. A suspensão foi levada ao microondas para aquecimento até a total diluição.. 3.2.14 Gel de agarose para RAPD (1,4%) Agarose................................................................ 1,26 g TEB....................................................................... 90 ml A agarose foi colocada em um Erlenmeyer e adicionou-se o TEB-1X. A suspensão foi levada ao microondas para aquecimento até a total diluição.. 3.2.15 Tampão TE Tris-HCL 1M pH 8,0.............................................. 1 ml EDTA 0,5M pH 8,0............................................... 1,2 ml O volume foi completado para 100 ml com água deionizada. O Tampão foi autoclavado e mantido a 4°C .. 3.2.16 Tampão de extração de DNA para fungos filamentosos (Raeder & Broda, 1985) Tris-HCL 1M......................................................... 2 ml EDTA 0,5M pH 8,0............................................... 0,5 ml SDS 10%.............................................................. 1 ml NACL 5M.............................................................. 0,5 ml Água deionizada q.s.p.......................................... 6 ml O tampão foi preparado somente no momento do uso..

(39) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 28. 3.2.17 Tampão TEB 10X pH 8,0 Trizma base.......................................................... 108 g Ácido bórico.......................................................... 55 g EDTA.................................................................... 20 ml O volume foi acertado para 100 ml com água deionizada e o pH para 8,0 com HCL concentrado. Depois de autoclavado foi mantido à 4ºC. Para uso, foi diluído com água deionizada para a concentração 1X.. 3.2.18 Tampão de amostra Azul de bromofenol............................................... 0,25 g Ficol (tipo 400 PHARMACIA)................................ 15,0 g Água deionizada q.s.p.......................................... 100 ml. A solução foi aquecida sem atingir o ponto de ebulição e estocada em alíquotas a 4ºC. 3.2.19 Tampão de amplificação 10X, Enzima Taq polimerase, Mg++ Tris-HCL pH 8,3.................................................... 100 mM MgCl2.................................................................... 15 mM KCL....................................................................... 500 mM. O tampão da reação de PCR vem 10X concentrado. A Taq polimerase é fornecida junto com o tampão e vem pronta para o uso, na concentração de 5 unidades por µl. O Mg é um cofator da Taq polimerase, vem na forma de MgCl², acompanhando a enzima, em uma concentração de 50mM.Neste trabalho utilizou-se uma concentração de 3,5 mM de Mg por reação..

(40) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 29. 3.2.20 Primers Os primers, utilizados para amplificar seqüências de DNA genômico, comercializados pela Operon Technologies,CA,USA, foram diluídos a uma concentração estoque de 50µM em tampão TE, usando o peso molecular do primer individual dado pelo fornecedor.A concentração final de trabalho foi de 2,5µM. Os Primers diluídos foram mantidos à – 20°C.. 3.2.21 dNTP Os dNTPs (desoxinucleotídeos trifosfatados) utilizados neste trabalho, foram fornecidos pela GIBCO BRL, separadamente, em concentrações de 100 mM. Para uso, misturou-se partes iguais de modo a obter uma diluição de concentração final de 2,5 mM. Os dNTPs diluídos foram mantidos à –20°C.. 3.3 Características morfofisiológicas (cor, crescimento e aspecto da colônia). A caracterização morfológica dos isolados de F. oxysporum f.sp. passiflorae foi realizada quanto ao aspecto, crescimento e coloração da colônia. Também foram feitos microcultivos para a observação das estruturas microscópicas das colônias. Para a observação do aspecto e coloração dos isolados, foram transferidos micélios de tubos de ensaio para o centro de placas de Petri, contendo os meios de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar) e CZA (Czapeck). Após sete dias de colonização, os dados observados foram registrados e as placas colonizadas foram fotografadas (verso e reverso). O cultivo foi realizado em meio BDA. Foram transferidos três inóculos para pontos diferentes do meio de cultura na placa de Petri e logo após, cobertos com lamínulas. Observou-se o crescimento dos mesmos aos 7, 11, e 15 dias de colonizados..

(41) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 30. 3.4 Crescimento micelial de isolados de F. oxysporum f.sp. passiflorae Foram transferidos discos de micélio-ágar, de 4mm de diâmetro, retirados da borda de colônias do fitopatógeno crescido em meio BDA, para o centro de placas de Petri contendo os meios de cultura BDA e CZA, com quatro repetições para cada meio. O crescimento foi avaliado a cada 24 horas, durante seis dias com o auxílio de uma régua milimetrada. A média do crescimento foi obtida através da soma das mensurações do diâmetro das colônias (realizadas em direções diametralmente opostas). Para o cálculo da taxa de crescimento radial da colônia, aplicou-se a fórmula adaptada de Lilly & Barnet (1951): Tc = (Clii - Cli) / (Tii - Ti), onde: Tc – Taxa de crescimento; Cli – Crescimento radial da colônia obtido no tempo i; Clii – Crescimento radial da colônia obtido no tempo ii; Ti – Tempo em que se realizou a primeira leitura; Tii – Tempo em que se realizou a segunda leitura.. 3.5 Obtenção do micélio para extração do DNA genômico Conídios dos isolados de F. oxysporum f.sp. passiflorae foram suspensos em 4ml de “Tween 80” 0,01% e transferidos para frascos de Erlenmeyer contendo 100ml de meio CZ líquido, mantidos sob agitação a 120 rpm a 28°C por 168h. Após este período, o micélio foi coletado por filtração a vácuo depois de lavado em água destilada e transferido para placas de Petri, onde foi determinado o seu peso úmido para extração de DNA. O micélio obtido foi estocado a –20°C..

(42) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 31. 3.6 Extração de DNA A extração do DNA foi realizada segundo a técnica de Raeder e Broda (1985), que consiste em triturar, no mínimo, 1g de micélio em nitrogênio líquido até a completa pulverização e logo após ser transferido para um tubo de microcentrífuga. Para cada grama de micélio, adicionou-se 1ml de tampão de extração. Após homogeneização, os tubos de microcentrífuga foram incubados por 15 minutos a 65°C. Posteriormente foi adicionado um volume da solução de fenol, misturando suavemente as fases e centrifugou-se a 12.000 rpm, por 15 minutos. A fase aquosa foi recuperada e transferida para um novo tubo de microcentrífuga adicionando-se um volume de clorofane. Foi efetuada nova homogenização e centrifugação nas mesmas condições anteriores recuperando-se a fase aquosa e outra vez, transferiuse para um novo tubo de microcentrífuga onde foi adicionado um volume de clorofil. Recuperou-se mais uma vez a fase aquosa e em outro tubo de microcentrífuga, adicionou-se o NaCl para uma concentração final de 0,3M. Em seguida foram adicionados dois volumes de etanol resfriado a –20°C, fase em que foi possível visualizar o DNA precipitado. As amostras foram submetidas novamente a uma centrifugação a 12.000 rpm por 15 minutos, para promover a fixação do DNA no fundo do tubo de microcentrífuga. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com etanol 70% em uma nova centrifugação. O sobrenadante outra vez foi descartado e os tubos invertidos para secagem completa do DNA. Este foi cuidadosamente ressuspendido em 200 µl de tampão TE pH 8,0 e guardado sob refrigeração à 4°C..

(43) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 32. 3.7 Quantificação do DNA A quantidade de DNA foi estimada por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8% a 3 V/cm de distância entre os eletrodos, juntamente com o marcador de peso molecular de fonte comercial com concentração conhecida (DNA de fago λ ). Após eletroforese, o gel foi mergulhado para ser corado em tampão TEB 1X. com 12 µl de brometo de etídio, por cerca de 30 minutos. Transcorrido este tempo, foi observado em transiluminador de luz ultravioleta e fotografado.. 3.8 Seleção de primers O DNA total de um dos isolados de F. oxysporum f.sp. passiflorae foi utilizado para a realização de uma seleção de primers, adequados para o material em estudo. Foram testados primers dos kits OPA, OPW e OPX da Operon Technologies, CA, USA.. 3.9 Amplificação do DNA A amplificação foi realizada em um termociclador da marca MJ Research, programado para realizar uma desnaturação inicial de 4 minutos a 92°C, quarenta ciclos de 90 segundos à 92°C, 90 segundos à 40°C, 120 segundos à 72°C e por fim 5 minutos a 72°C para a extensão final. Para a amplificação das amostras utilizou-se uma mistura de componentes conforme descrito na Tabela 2. Misturou-se as quantidades apropriadas de água Milli Q esterilizada, tampão de amplificação 10X, dNTPs, MgCl2, Taq polimerase e o primer em um único tubo de microcentrífuga. Desta mistura, transferiu-se 20µl ( para reações com volume final de 25 µL ) para cada microtubo do termociclador. Imediatamente após esta transferência, adicionou-se a cada reação 5 µl de DNA molde (previamente diluído em água Milli Q) de cada um dos isolados. Sobre cada.

(44) Miranda, I.R.. 33. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... reação foram adicionados 20 µl de óleo mineral esterilizado a fim de manter a temperatura e evitar evaporação. Em seguida os tubos foram colocados no termociclador para a realização da amplificação. Após este processo, os produtos de RAPD foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,4%, corados em brometo de etídio, visualizados em transiluminador de Luz UV e fotografado. Como marcador de peso molecular foi utilizado o DNA do fago λ clivado com enzima Hind III fornecido comercialmente. Tabela 2. Componentes da reação de amplificação do DNA de amostras de F. oxysporum f.sp. passiflorae e respectivas concentrações utilizadas em uma reação de RAPD.. Concentração. Volume na. Concentração. estoque. reação ( µL ). Final. Água Milli Q. -----. 3,6. Qsp. Tampão. 10 X. 2,5. 1X. dNTPs. 2,5 mM. 2,5. 0,25 mM. MgCl². 10 mM. 8,5. 3,4 mM. Taq polimerase. 5 U/µL. 0,4. 2 unidades. Primer. 4 µM. 2,5. 0,25 mM. DNA. 5 ng/µL. 5,0. 25 ng. Componente. Total. 25,0. 3.10 Análise computacional dos dados Os dados obtidos por amplificação ao acaso do DNA (RAPD) foram analisados. pelo. programa. de. microcomputador. NTSYS.PC. (Applied. Biobalestics,Inc.), introduzidos na forma de variáveis binárias, onde o número “1” (UM) significa presença de banda e o número “0” (ZERO), ausência. Desta forma, o programa construiu uma matriz de similaridade, utilizando-se o coeficiente de JACCARD (Sneath & Socal, 1973). A partir dos dados desta matriz foi construído um dendrograma pelo método UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetical averages)..

(45) Miranda, I.R.. Características Morfofisiológicas e Polimorfismo de DNA .... 34. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 4.1 Morfofisiologia da colônia 4.1.1 Aspecto e coloração Os dados dos aspectos e coloração das colônias foram registrados de acordo com a Tabela 3 e representados nas Figuras 1, 2 e 3 . Os isolados colonizados em meio BDA apresentaram uma grande variação no que se refere a sua coloração, revelando resultados semelhantes aos já observados na literatura (Nelson et al.,1993; Boot, 1971; Domsch et al., 1993). Essa variabilidade morfológica sugere uma possível expressão do polimorfismo genético, comprovado pelo RAPD no presente estudo. Em meio CZA não houve diferenças morfológicas expressivas. ..