DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA-PPGB
ANTÔNIA MOÊMIA LÚCIA RODRIGUES PORTELA
APLICAÇÕES DE TÉCNICAS MOLECULARES DE NOVA GERAÇÃO (NGS) PARA O ESTUDO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE TOUROS E VACAS
LEITEIRAS
FORTALEZA 2018
APLICAÇÕES DE TÉCNICAS MOLECULARES DE NOVA GERAÇÃO (NGS) PARA O ESTUDO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE TOUROS E VACAS LEITEIRAS
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia em Agropecuária.
Orientador: Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura
Coorientador: Prof. Dr. Jorge André Matias Martins
FORTALEZA 2018
P877a Portela, Antonia Moemia Lucia Rodrigues.
Aplicações de técnicas moleculares de nova geração (NGS) para o estudo do desempenho reprodutivo de touros e vacas leiteiras / Antonia Moemia Lucia Rodrigues Portela. – 2018.
138 f. : il. color.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (Rede Nordeste de Biotecnologia), Fortaleza, 2018.
Orientação: Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura. Coorientação: Prof. Dr. Jorge André Matias Martins.
1. Metilação. 2. Epigenética. 3. RNA sequencing. 4. Pós-parto. 5. Gene. I. Título.
APLICAÇÕES DE TÉCNICAS MOLECULARES DE NOVA GERAÇÃO (NGS) PARA O ESTUDO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE TOUROS E VACAS LEITEIRAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutora em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia em Agropecuária.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________ Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________________ Prof. Dr. Fábio Roger de Vasconcelos
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________________ Prof. Dra. Lays Debora Silva Mariz
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________________ Prof. Dr. Stefano Biffani
Italian National Research Council (CNR)
_______________________________________________________ Prof. Dr. Vicente José de Figueiredo Freitas
A Deus, pela minha existência, força, coragem e determinação que me foi dada para alcançar mais esse objetivo, porque nada nos é possível se não for de Sua vontade.
A Deus, pelo seu amor e pela sua infinita misericórdia manifestados a cada dia em minha vida. Pela proteção, força e coragem para enfrentar todas as dificuldades da vida pessoal e profissional. Senhor, a minha confiança descansa nas Tuas mãos. Sempre espero e confio em ti. Obrigado por mais essa vitória.
Aos meus pais Maria Lia Neta Portela e Manoel Raimundo Portela, por terem me dado a vida e por todo amor e dedicação fundamentais em todos os momentos da minha vida. Às minhas irmãs Luana Portela e Nalda Portela e ao meu irmão Fábio Portela, com os quais dividi momentos de alegrias e tristezas, e que sempre estarão me incentivando e torcendo pelo meu sucesso.
À família Marques de Oliveira (minha segunda família), em especial à dona Maria das Graças, Sr. Francisco e Jorge Luis, por fazerem me sentir parte da família, dividindo comigo momentos de tristezas, mas principalmente momentos de muitas alegrias. Vocês moram no meu coração.
Ao orientador Prof. Dr. Arlindo Moura, pela orientação deste trabalho, paciência, pela dedicação dispensada, confiança e profissionalismo demonstrado no decorrer de nossa convivência. Agradeço pela contribuição decisiva na minha formação e pelo muito que aprendi durante os anos de doutorado.
Ao Co-orientador Prof. Dr. Jorge Martins, pela dedicação constante e por sempre estar disposto a ajudar em todos os momentos.
Aos queridos amigos integrantes do grupo de pesquisa de Fisiologia Animal, obrigada pelo apoio de todos.
À querida amiga e irmã Jordania Freire e toda a família Freire, Clayrtiano Freire, Dona Celina, Sr. Raimundo e Rafael Freire, em especial meu afilhado João Arthur, agradeço pela amizade, companheirismo, apoio e incentivo desde o início e por me tratarem sempre com muito carinho, como se eu fosse uma irmã, obrigada pelo apoio e pelas palavras de carinho nos momentos mais difíceis.
Aos amigos Anderson Weiny Silva, Regislane Pinto Ribeiro, Juliane Passos, Amélia Soares e Jackson Costa agradeço pela amizade, pelos conselhos, pelos momentos de trabalho e pelos momentos de descontração. Admiro a competência de vocês.
Ao meu amigo Rony Barroso pelo apoio incondicional e por ser meu companheiro de momentos bons e ruins durante essa fase.
uma das melhores pessoas que conheci e que quero para a vida... Amo tu e serei sempre grata por seu grande apoio.
À Danuza Leão e Denise Azevedo, obrigada pelo apoio, companheirismo, risadas, por sempre se preocuparem comigo e fazer eu me sentir tão especial para vocês, nos encontramos, um achado que deu certo.
Ao meu amigo Aderson Viana, que apesar de sermos muito diferentes é alguém em quem confio, e que me passa confiança. Obrigada, nobre amigo.
Aos meus amigos Taciane Alves, Mayra Vetorazzi, Antônio Carlos, Mónica Ramirez, Arabela Guedes, Nielyson Batista por todo o apoio nos momentos de desânimo, obrigada a todos e amo muito vocês.
À Kamila Sousa e Renato Passos, pelo apoio e por terem sido presentes nessa caminhada, por toda ajuda, agradeço.
A minha amiga Gisvani Lopes, por toda vibração positiva, pela força e apoio nos momentos difícies, te amo amiga.
Aos integrantes do grupo de pesquisa do Consiglio Nazionale della Ricerche: Dra. Flavia Pizzi, Emanuele Capra, Dra. Stefania Chessa, Dra. Paola cremonesi e em especial ao Dr. Stefano Biffani por ter sido muito presente nos meus trabalhos desenvovlvidos, pela paciência e por ter sido um amigo.
À Elisabety Mendes, por ter me recebido como membro da família, pelas conversas e conselhos, por ter sido meu apoio durante o ano do meu doutorado sanduíche, muita gratidão por você.
Aos integrantes da banca examinadora, Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura (Orientador), Prof. Dr. Stefano Biffani, Profa. Dra. Lays Débora Silva Mariz, Dr. Fábio Vasconcelos, Prof. Dr. José Roberto Viana Silva e Prof. Dr. Vicente José de Figueiredo Freitas, por terem gentilmente aceito o convite para participar da banca de defesa desta tese, e pela solicitude em contribuir no engrandecimento deste trabalho.
Aos funcionários da Universidade Federal do Ceará pela convivência, atenção e disponibilidade durante todos esses anos de convívio.
A todos que de alguma forma me deram força e incentivo na realização do meu doutoramento, seja profissionalmente ou sentimentalmente e por participarem da minha vida.
coração, o meu
“Porquanto, ainda que a figueira não floresça, nem haja fruto na vide; o produto da oliveira minta, e os campos não produzam mantimento; Todavia eu me alegrarei no Senhor, exultarei no Deus da minha salvação. O Senhor é minha força e me fará andar sobre as minhas alturas.”
identificar assinaturas epigenéticas diferenciais entre espermatozoides de alta motilidade (AM) e baixa motilidade (BM). O estudo 2 teve como objetivo caracterizar as vias metabólicas associadas ao início da lactação em vacas Holandesas utilizando dados de RNA-seq obtidos de amostras de tecido adiposo subcutâneo coletadas em três momentos: em 2 (T0), 30 (T1) e 90 (T3) dias após o parto. No estudo 1 foi explorado a metilação de dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs) em populações de espermatozoides de AM e BM de
Bos taurus separados por Percoll. Padrões de metilação de espermatozoides de alta e baixa
motilidade foram investigados por sequenciamento de bissulfito. A comparação entre as populações desses espermatozoides revelou que a variação da metilação afeta os genes envolvidos na organização da cromatina, no qual houve metilação em genes associados à remodelação da estrutura do DNA, bem como em um elemento repetitivo BTSAT4 em regiões pericentroméricas. Desta forma, sugere-se que a manutenção da estrutura cromossômica através da regulação epigenética seja crucial para a funcionalidade correta do espermatozoide. Para o estudo 2, o RNA total foi extraído a partir do tecido adiposo subcutâneo no dia do parto (T0), 30 dias após o parto (T1) e noventa dias após o parto (T3), e comparações foram feitas entre os grupos mencionados. Um total de 12.294 genomas foram identificados e submetidos a uma filtragem, identificando um total de 405.435.505 genes, nos quais os genes diferencialmente expressos foram analisados através do False Discovery Rate (FDR = 0,05). As vias metabólicas associadas ao início da lactação em vacas holandesas foram caracterizadas utilizando dados de RNA-seq obtidos de amostras de tecido adiposo subcutâneo coletadas em três momentos: aos 2 (T0), 30 (T1) e 90 (T3) dias pós-parto. A análise de enriquecimento identificou 142 vias metabólicas. Os mais significativos foram: secreção de insulina, sinalização da ocitocina, glicólise / gliconeogênese, metabolismo do piruvato, resistência à insulina, sinalização de cálcio, GnRH (hormônio liberador de gonadotropina), MAPK (proteína quinase mitogênica), sinalização de adipocitocinas e o sistema renina-angiotensina. Todas essas vias representam importantes rotas metabólicas em bovinos leiteiros em lactação.
differential epigenetic signatures between high motility (HM) and low motility (LM) sperm. Study 2 aimed to characterize the metabolic pathways associated to early lactation in Holstein cows using RNA-seq data obtained from subcutaneous fat tissue samples collected at three time points: at 2 (T0), 30 (T1) and 90 (T3) days postpartum. In study 1, we explored the methylation of cytosine-guanine dinucleotides (CpGs) in HM and LM sperm populations in
Bos taurus separated by Percoll. Methylation patterns of high and low motility sperm were
investigated by bisulphite sequencing. The comparison between the populations of HM and LM sperm revealed that the variation of methylation affects the genes involved in the organization of chromatin and that methylation occurred in genes associated with the remodeling of the DNA structure, as well as in a repetitive element BTSAT4 in pericentromeric regions. Thus, it is suggested that the maintenance of chromosome structure through epigenetic regulation is crucial for the correct functionality of sperm. For study 2, total RNA was extracted from subcutaneous adipose tissue on the day of birth (D0), 30 days postpartum (D30) and ninety days postpartum (D90) and comparisons were made between the groups mentioned. A total of 12.294 genomes were identified and subjected to a filtering, identifying a total of 405.435.505 genes, in which differentially expressed genes were analyzed using the False Discovery Rate (FDR = 0.05). Metabolic pathways associated to the early lactation in Holstein cows were characterized using RNA-seq data obtained from subcutaneous fat tissue samples collected at three time points: at 2 (T0), 30 (T1) and 90 (T3) days postpartum. The enrichment analysis identified 142 metabolic pathways. The most significative were insulin secretion, oxytocin signaling, glycolysis/gluconeogenesis, pyruvate metabolism, insulin resistance, calcium signalling, GnRH (Gonadotropin releasing hormone), MAPK (mitogen-activated protein kinase), adipocytokine signaling, and the renin−angiotensin system. All these pathways are important metabolic routes in lactating dairy cattle.
Figura 1 – Controle da expressão gênica por mecanismos epigenéticos
... 22
Figura 2 – Condensação e compactação da cromatina do espermatozoide
... 26
Figure 3 – Distribution of CpG methylation levels across the gene bodies, 5’UTR,
3’UTR and CGI ……….……… 63
Figure 4 – Hierarchical clustering for DMRs present in CGIs, gene bodies, 5’ UTRs
and 3’ UTRs
…………...……… 64
Figure 5 – Distribution of CGIs length in HM and LM (20-60 CpG methylated) and
HM and LM (80-100 CpG methylated)
... 65
Figure 6 – CpG methylation levels in MRs and DMRs of HM and LM sperm
populations
... 66
Figure 7 – Top metabolic pathways (from KEGG) enriched in the genes associated
with the lactation period. These pathways were detected from genes
identified in subcutaneous adipose tissue
Table 1 – GO terms identified for the differentially methylated genes (DMGs) found
to differ between high motile (HM) and low motile (LM) sperm populations in gene bodies (GENE), 5’ untranslated regions (5’UTRs), 3’ untranslated
regions (3’UTRs) and CpG islands (CGIs)
……… 54
Table 2 – Frequency of occurrence for Repetitive Elements (REs) overlapping CGIs with different methylation levels (20-60 % methylation and 80-100% methylation) in high motile (HM) and low motile (LM) sperm populations. Frequency of occurrence for REs is also reported for Bos taurus genome
……. 56
Table 3 – Top 5 pathways associated at different time points comparison (at calving (T0), at 30 days post-calving (T1) and at 90 days post-calving (T3)
3’UTRs Regiões 3’ não traduzidas 3’ untranslated regions 5’UTR Regiões 5’ não traduzidas 5’ untranslated regions ALH Amplitude do deslocamento lateral da
cabeça
Amplitude of lateral head displacement
BCF Frequência de batimentos Frequency of head displacement BTLTR1 Fragmentos de repetições
interrompidas Registrado por RepeatMasker ID
Fragments of Interrupted Repeats Joined by RepeatMasker ID BTSAT3 Satélite/Centromérico Satellite/Centromeric BTSAT4 Satélite/Centromérico Satellite/Centromeric CASA Sistemas automáticos de análise de
sêmen
Computer-Assisted Semen Analysis CATSPER1 Canal catiônico 1 do espermatozoide Cation Channel Sperm Associated 1
CGIs Ilhas CpGs CpG islands
CH3 Radical metil Methyl radical
CpGs Dinucleotídeos citosina-guanina Cytosine-guanine dinucleotides DMGs Genes dierencialmente expressos Differentially methylated genes DNA Ácido desoxirribonucleico Deoxyribonucleic acid
Dnmt3b DNA (citosina-5-)-metiltransferase 3 beta
DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta
DNMTs DNA metiltransferases Deoxyribonucleic acid methyltransferases
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática Enzyme-linked immunosorbent assay
GO Ontologia gênica Gene ontology
HDM Histona demetilase histone demethylase
HM Alta motilidade High motile
HMT Histona metiltransferase Histone methyltransferase HMTases Histona metiltransferases Histone methyltransferases ICR1 Região 1 controladora de imprinting imprinting control region 1 IGF2 Fator de crescimento semelhante à
insulina-2
KDMs Lysine (K)-specific demethylase
KMT2A Histone lysine methyltransferases 2A
KMTs Histone lysine methyltransferases
LIN Linearidade Linearity
LINE Long interspersed elements
LM Baixa motilidade Low motile
LSD1 Lysine-specific histone demethylase 1
LSM Least squares means
MBD Methyl-binding domain
MEST Mesoderm-specific transcript
miRNAs micro RNAs MicroRNAs
MLL1 Mixed-lineage leukemia 1
MLL2 Mixed-lineage leukemia 2
MMSET Multiple myeloma SET domain
MRs Methylated regions
NCBI National center for biotechnology
information
NSD1 Nuclear receptor-binding SET
Domain 1
NSD2 Nuclear receptor-binding SET
Domain 2
NSD3 Nuclear receptor-binding SET
Domain 3 OSSAT2 Fragmentos de repetições
interrompidas Registrado por RepeatMasker ID
Fragments of Interrupted Repeats Joined by RepeatMasker ID PCR Reação em cadeia da polimerase Polymerase chain reaction Res Elementos repetidos Repetitive elements
RNA Ácido ribonucléico Ribonucleic acid
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro Messenger ribonucleic acid
somáticas
SRA Sequence Reads Archive
STR Retilinearidade Straightness
Suv39h Suppressor of variegation 3-9
homolog
TALP Tyrode’s albumine lactate pyruvate
VAP Velocidade de Trajeto Average path velocity VCL Velocidade Curvilinear Curvilinear velocity VSL Velocidade Progressiva Straight line velocity
WHSC1 Wolf-Hirschhorn syndrome
% Percentagem Percentage
~ Aproximadamente Aproximately
± SEM Erro padrão da média Standard error of the mean
°C Graus Celsius Degrees Celsius
µg Micrograma Microgram
µL Microlitro Microliter
µm Micrômetro Micrometer
µM Micromolar Micromolar
CO2 Dióxido de carbono Carbon dioxide
H Hora Hour
IU/mL Unidades internacionais por mL International units per mL
Min Minuto Minute
Mg Miligrama Milligram mL Mililitro Milliliter mM Milimolar Millimolar Mm Milímetro Millimeter Ng Nanograma Nanogram Nm Nanômetro Nanometer
P < 0,05 Probabilidade de erro menor do que 5% Error probabilities is less than 5% P > 0,05 Probabilidade de erro maior do que 5% Error probabilities is more than 5%
1 INTRODUÇÃO... 19
2 REVISÃO DE LITERATURA... 21
2.1 Tecnologias ômicas na reprodução animal... 21
2.1.1 Genômica... 21
2.1.2 Epigenética... 26
2.1.2.1 Epigenética e fertilidade... 24
2.1.2.2 Estrutura do DNA espermático... 25
2.1.2.3 Motilidade espermática... 27 2.1.3 Transcriptômica... 29 2.1.4 Proteômica... 32 2.1.5 Metabolômica... 33 3 PROBLEMA... 35 4 JUSTIFICATIVA... 36 5 HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 38 6 OBJETIVOS... 39 6.1 Objetivos gerais... 39 6.2 Objetivos específicos... 39
7 EPIGENETIC VARIATION IN PERICENTROMERIC REGIONS BETWEEN HIGH AND LOW MOTILE SPERM POPULATIONS IN BOS TAURUS …………... 40 8 DYNAMIC PROFILE OF ACTIVE METABOLIC PATHWAYS IN THE SUBCUTANEOUS FAT TISSUE OF HOLSTEIN COWS DURING EARLY LACTATION …...……… 88 9 CONCLUSÕES………. 122
10 PERSPECTIVAS……….. 123
1 INTRODUÇÃO
A maioria dos estudos reprodutivos em bovinos está voltada para a fertilidade da vaca, enquanto a fertilidade do macho recebeu menos importância. No entanto, estudos relataram que um percentual significativo de falhas reprodutivas em bovinos de leite é atribuído à subfertilidade dos machos (DEJARNETTE et al., 2004). Consequentemente, a fertilidade de touros não deve ser considerada menos importante em esquemas de reprodução destinados a melhorar o desempenho reprodutivo do gado leiteiro (BRAUNDMEIER; MILLER, 2001).
A avaliação da fertilidade de touros consiste na avaliação seminal. Assim, os parâmetros tais como concentração, motilidade e morfologia espermática podem não ser suficientes para uma análise completa do potencial de fertilidade do sêmen. A análise do sêmen não informa como o espermatozoide, particularmente o DNA espermático ajudará e influenciará o desenvolvimento do embrião. Em termos de função espermática, a análise do sêmen não informa realmente sobre eventos como a quimiotaxia, que é o processo no qual o espermatozoide poderá encontrar o oócito, além de também não informar sobre a penetração, o processo de obter o espermatozoide e seu DNA no oócito para que o embrião possa começar a se formar. Dessa forma, o surgimento das tecnologias ômicas, como a genômica, transcriptômica, proteômica, e metabolômica tornaram-se ferramentas valiosas para o estudo do sêmen, fornecendo a detecção de possíveis biomarcadores da fertilidade (THUNDATHIL
et al., 2016).
Estudos recentes no campo da genômica comparativa e análise de expressão gênica forneceram novas ferramentas de detecção molecular que permitem que vários parâmetros sejam efetivamente integrados na avaliação do potencial fertilizante do sêmen (BISSONNETTE et al., 2009). Recentemente, estudos baseados na expressão gênica e epigenética foram usados para analisar características de fertilidade. Em humanos foi demonstrado que os padrões de metilação do DNA de espermatozoides diferem significativamente entre homens inférteis e férteis. Além disso, o padrão de metilação do DNA pode ser preditivo da qualidade do embrião durante a fertilização in vitro (ASTON et
al., 2015). A metilação desordenada em genes em “loci” promotores e impressos está
fortemente associada a várias formas de infertilidade e defeitos de espermatozoides em homens (WU et al., 2010). Da mesma forma, a hipometilação global do DNA espermático foi relacionada a resultados insatisfatórios da gestação em pacientes através de fertilização in vitro (BENCHAIB et al., 2005). Há muitos candidatos prováveis que podem causar alterações
epigenéticas nos espermatozoides e podem levar à embriogênese anormal (STUPPIA et al., 2015). Assim, o epigenoma espermatico oferece interessantes oportunidades de estudo e grandes esforços têm sido empregados para entender o papel dos padrões epigenéticos do espermatozoide no seu desenvolvimento e funcionalidade, bem como no desenvolvimento embrionário e na prole.
Em vacas leiteiras no momento de transição do período seco para o início da lactação, o risco de doenças metabólicas é particularmente alta (HAMMON et al., 2006; McART et al., 2013). Após o parto, o gado leiteiro requer um aumento acentuado dos requisitos de nutrientes para propiciar produção de leite (DRACKLEY, 1999). Desta forma, impedir ou contornar o balanço energético no período pós-parto pode reduzir a incidência de doenças e diminuir a mobilização de reservas corporais (DUFFIELD et al., 2009).
O melhoramento genético no âmbito da produção de leite requer uma visão abrangente da biologia do processo de lactação, desde um único estágio até a curva total da lactação (CUI et al., 2014). Além de dados genéticos, perfis de expressão gênica e análise de alterações em vias metabólicas oferecem novas oportunidades para elucidar os mecanismos subjacentes de traços complexos em humanos e animais de produção, e atualmente ocorre o rápido desenvolvimento e redução de custos do sequenciamento de próxima geração (NGS) (REINERT et al., 2015). Assim, as novas tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS), agora avaliado como uma ferramenta abrangente e precisa para analisar complexos sistemas ômicos subjacentes a processos biológicos, oferecendo grandes oportunidades para elucidar os mecanismos subjacentes de características complexas, como o processo de lactação e da fertilidade em touros. Desta forma, ensaios baseados em sequências de transcriptomas e sequenciamento de RNA e DNA (RNA-seq; DNA-seq), tornou-se uma abrangente e precisa ferramenta para análise de padrões de expressão gênica.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1TECNOLOGIAS ÔMICAS NA REPRODUÇÃO ANIMAL
As tecnologias “ômicas” adotam uma visão geral das moléculas que compõem uma célula, tecido ou organismo. Elas são voltadas principalmente para a detecção universal de genes (genômica), RNAm (transcriptômica), proteínas (proteômica) e metabólitos (metabolômica) em meio biológico específico. As abordagens “ômicas” propõem uma caracterização global de classes específicas de biomoléculas-alvo em sistemas uni ou multicelulares como uma estratégia para alcançar uma compreensão abrangente das funções biológicas (ALEXANDRI et al., 2010). As tecnologias genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica podem ser aplicadas não apenas para a maior compreensão dos processos fisiológicos normais, mas também nos processos de doença, que desempenham um papel na triagem, diagnóstico e prognóstico, bem como auxiliam na compreensão da etiologia das doenças. Estratégias exclusivas se prestam à descoberta de biomarcadores à medida que investigam múltiplas moléculas simultaneamente (HORGAN; KENNY, 2011).
Nos últimos anos, tem havido um notável desenvolvimento nestes campos. O grande desafio, no entanto, é integrar várias formas de dados “ômicos” para fornecer informações sobre os complexos sistemas biológicos dentro dos organismos vivos (SURAVAJHALA et
al., 2016). A maioria das características biológicas é controlada por um grande número de
genes que, além de seus efeitos aditivos, podem interagir entre si e sua expressão pode ser alterada com base em uma variedade de efeitos ambientais. Desta forma, o rápido desenvolvimento em tecnologias “omics” fornece oportunidades de investigar o genoma e o epigenoma, bem como, a possibilidade de sua posterior implementação em métodos de melhoramento.
2.1.1 Genômica
O efeito gênico nas características de produção e na fisiologia animal tem sido estudado principalmente ao vincular esses parâmetros de resultado à variação em sequências genéticas. A maioria das pesquisas em animais de produçãoé feita via observação de um grande número de Polimorfismos de nucleotídeo Único (SNPs – mutações únicas em posições específicas no genoma) ou sequenciando genes-alvo que devem estar envolvidos no resultado
de interesse. Porém recentemente, o sequenciamento do genoma inteiro tornou-se mais popular (CROUCHER et al., 2010).
Embora alguns genes isolados com efeito sobre características econômicas ocorram, a maior parte da variação genética no ganho econômico se deve a características complexas controladas por muitos genes. De fato, evidências recentes indicam que a maioria das características quantitativas é controlada por milhares de polimorfismos (BOYLE et al., 2017). Os primeiros estudos de reprodução na produção de gado leiteiro foram baseados em observações fenotípicas e na habilidade de alguns criadores. Com o tempo, a pecuária leiteira evoluiu para uma ciência com melhor compreensão e apreciação da herança de vários traços importantes e assim, o desenvolvimento de conjuntos de dados para estimativa de mérito e melhoria genética de raças leiteiras. Desta forma, ganhos genéticos significativos foram obtidos usando essas estratégias de melhoramento em muitas áreas, incluindo características de produção de leite. Embora a combinação de extensos dados genealógicos e fenótipos tenha melhorado os programas de seleção, as características de baixa herdabilidade, como fertilidade e saúde, e outras características difíceis de fenotipar, obteve a exploração de novas metodologias para alcançar um aumento dos ganhos genéticos (FLEMING et al., 2018).
Assim, a genômica realiza o sequenciamento genético dos organismos, sendo essencial para a compreensão dos complexos eventos que orquestram a função de todos os organismos ou os defeitos que levam a doenças (SHULDINER; POLLIN, 2010). Portanto, o desenvolvimento de técnicas como o sequenciamento de DNA tornou-se uma ferramenta essencial para decifrar genes completos e, mais adiante, genomas inteiros.
Assim, diante do importante papel do macho na determinação da fertilidade do rebanho bovino e o ganho genético possível com o advento da seleção genômica, múltiplas abordagens são necessárias para desvendar a complexidade da fertilidade de touros. Apesar do pequeno tamanho efetivo da população na maioria das raças bovinas e da natureza altamente selecionada de touros para a inseminação artificial, Whiston et al. (2017) demonstraram o primeiro catálogo abrangente de variação genética em genes de β-defensina em bovino e o primeiro sequenciamento de todo exoma de touros divergentes de fertilidade. Essa abordagem identificou novas variantes nos genes β-defensina e FOXJ3, potencialmente regulando a função reprodutiva, e esses biomarcadores podem contribuir para futuras estratégias de reprodução a fim de melhorar a fertilidade em machos
2.1.2 Epigenética
A epigenética é usada para descrever as mudanças herdáveis que controlam a expressão gênica, sem que a sequência original do DNA seja alterada (RUSSO et al., 1996). Entre os mecanismos epigenéticos conhecidos, destacam-se as modificações covalentes nas histonas, tais como: acetilação, metilação, ubiquitinação e fosforilação, que ocorrem nas caudas N-terminais de proteínas histonas, as quais o DNA se enrola formando o nucleossomo, estrutura fundamental da cromatina. O processo da metilação do DNA é descrito como a introdução de radical metil (CH3) no carbono 5 de citosinas, seguidas de guaninas (ilhas GpGs), na moléculas de DNA e RNAs não codificantes considerados pequenos ou micro RNAs (miRNAs) espalhados ao longo do genoma com função regulatória de controle da expressão gênica (JONES; TAKAI, 2001) conforme demonstrado na figura 1.
Figura 1. Controle da expressão gênica por mecanismos epigenéticos. Fonte: Adaptado de
Hagood (2014).
A acetilação de lisinas é altamente dinâmica regulada pela ação oposta de duas famílias de enzimas: histonas acetiltransferases e histonas deacetilases. Na acetilação há a transferência de um grupo acetil ao grupo Ɛ-amino de cadeias laterais de lisina, levando a neutralização da carga positiva da lisina e assim, enfraquecendo as interações entre histonas e DNA. Há dois grupos de acetilases: A e B. O grupo A é uma família de enzimas mais diversificada, e de modo geral modificam múltiplos sítios dentro das caudas N-terminais das
histonas, devido à sua capacidade de interromper a estabilidade de interações eletrostáticas, onde essas enzimas funcionam como coativadores transcricionais (YANG; SETO, 2008). O grupo B é predominantemente citoplasmático [acetilando histonas livres, mas não aquelas que já se depositaram na cromatina] (PARTHUN, 2007). No entanto, não são apenas as caudas das histonas que estão envolvidas neste regulamento, sítios adicionais de acetilação presentes dentro do núcleo globular da histona também são encontrados.
A metilação do DNA em ilhas GpGs é a única modificação epigenética que afeta diretamente o DNA. Na mesma, um grupo metil é adicionado a uma base de citosina, onde essa alteração não afeta a forma como a citosina é transcrita em RNA mensageiro, porém promove localmente a compactação da cromatina, afetando o fator de ligação de transcrição (BIRD, 2002). No processo de metilação do DNA, a introdução do radical metil é catalisada e mantida por enzimas denominadas DNA metiltransferases (DNMTs), que obtêm e transferem o radical metil a partir do composto S-adenosyl-L-metionina, que é o doador de metil, para o carbono 5 da citosina (FERNANDES et al., 2007).
As ilhas CpGs estão em grande parte das regiões promotoras dos genes, sendo essa região pelo menos 10 vezes mais metilada do que outras regiões do genoma com CpGs (RODRIGUEZ et al., 2016). Porém, a atuação da metilação do DNA no controle da expressão gênica em regiões promotoras é considerada um processo simples, visto que este evento pode afetar a função gênica quando ocorre em regiões diferentes, como o que acontece em regiões intrônicas, ilhas CpGs distantes da região promotora (shore CpG island) ou em elementos de repetição em tandem (FERNANDES et al., 2007). Desta forma, o importante papel exercido pela metilação do DNA, assim como pelas modificações de histonas, no controle da função gênica assume-se que o epigenoma, ou seja, a programação epigenética total do DNA seja um fenômeno dinâmico e diferente entre os tipos celulares (BOYES; BIRD, 1992).
2.1.2.1 Epigenética e fertilidade
Durante as últimas décadas, numerosos testes de avaliação da capacidade fertilizante dos espermatozoides foram desenvolvidos, destacando-se as análises morfológicas (BONDE
et al., 1998), de motilidade (BUDWORTH et al., 1998), de penetração do muco cervical
(AITKEN et al., 1985), análise das membranas plasmática e acrossomal e a interação espermatozoide-zona pelúcida em testes de fertilização in vitro com oócitos homólogos (GUIENNE et al., 1990). Entretanto, é necessário um método preciso e amplamente aplicável
para a avaliação de sêmen no diagnóstico de infertilidade do macho que permita melhorar os padrões de avaliação seminal. Estudos genômicos e/ou proteômicos sistematizados das características seminais, assim como, chips de microarranjos poderiam contribuir na identificação de novas e melhores técnicas de avaliação (CORNER et al., 2006).
A metilação do DNA tem sido intimamente associada à infertilidade masculina, onde o padrão de metilação em espermatozoides maduros reflete mudanças no padrão de expressão gênica que ocorre durante a espermatogênese. A metilação do DNA controla a atividade transcricional dos genes e está envolvida no estabelecimento de uma estrutura de cromatina de ordem superior. Um padrão normal de metilação nas células germinativas contribui para a progressão da meiose, culminando na produção de espermatozoides funcionais. Assim, anormalidades na metilação do DNA podem afetar a produção de espermatozoides e explicar alguns casos de infertilidade masculina (ROUSSEAUX et al., 2008).
A aplicação de tecnologias da genômica para estudo da célula espermática, em conjunto com uma avaliação detalhada da competência funcional deve fornecer perspectivas para as bases bioquímica, fisiológica e genética da qualidade do sêmen de baixo potencial fertilizante (SAKKAS et al., 2004). Pesquisas têm investigado o papel da integridade do DNA espermático na infertilidade masculina, e sugere-se que a integridade do DNA do espermatozoide possa ser um bom preditor da fertilidade masculina, pois, evidências demonstram que espermatozoides de homens inférteis apresentam mais danos no DNA em comparação com homens férteis, e esse dano pode ter um efeito negativo no potencial da fertilidade masculina (ZINI et al., 2001).
Vale ressaltar que os touros são capazes de gerar mais descendentes do que as vacas; consequentemente, a seleção do macho é mais eficaz do que a seleção da fêmea para melhorar qualquer característica (McDANIELD; KUEHN, 2014). Diante disso, quando se utilizam touros com valores genético e reprodutivo superiores em um rebanho, pode-se reduzir o número de reprodutores em serviço e acelerar o ganho genético (FORDYCE et al., 2002). Entretanto, existem diferenças na capacidade fertilizante entre os touros (DEJARNETTE et
al., 1992). A estimativa da fertilidade do reprodutor é uma ferramenta importante na escolha
do macho, não só porque reflete o estado individual do reprodutor, mas também porque dito resultado influencia o futuro do rebanho.
O espermatozoide possui uma natureza inerente quiescente. Contudo, existem vários vestígios epigenéticas importantes que criam uma paisagem especializada e única, como a composição da proteína nuclear, metilação do DNA e RNAs dos espermatozoides (CARRELL, 2012). Desta forma, estudos desenvolvidos na investigação de sinais
epigenéticos do espermatozoide entre touros de alta e baixa fertilidade demonstraram que 76 regiões são diferencialmente metiladas entre touros de diferentes estados de fertilidade (KROPP et al., 2017). Verma et al. (2014) relataram análise de metilação por microarray de espermatozoides de búfalo considerado alto e subfértil, dos quais 73 genes em alta fertilidade e 78 genes em espermatozoides subférteis foram hipermetilados, logo após a análise da via caracterizaram esses genes por desempenharem papeis na transcrição regulação e proliferação celular.
2.1.2.2 Estrutura do DNA espermático
A cromatina espermática se destaca por ser extremamente condensada. Nas células somáticas o DNA é enrolado ao redor de proteínas denominadas histonas e organizados em estruturas solenoides (McGHEE et al., 1983). No entanto, o núcleo espermático não possui volume suficiente para este tipo de organização (WARD, 2011), consequentemente a cromatina do espermatozoide deve ser organizada de maneira única, altamente condensada e compactada (SHARMA; AGARWAL, 2011) (FIGURA 2). A compactação da cromatina espermática ocorre durante a espermatogênese, onde a célula germinativa, geneticamente ativa, se transforma em um espermatozoide inativo ou quiescente até a fertilização do oócito. Estas mudanças são induzidas pela modificação de proteínas que se ligam e compactam o DNA, promovendo a desprogramação temporária do genoma paterno (BALHORN, 2011).
Figura 2. Condensação e compactação da cromatina do espermatozoide. Fonte: Adaptado de Seli et al. (2004).
Antes da meiose, a cromatina dos espermatócitos é estruturalmente semelhante à das células somáticas, onde as proteínas predominantes são as histonas. Com o progresso da meiose e nos primeiros estágios da espermiogênese uma série de proteínas variantes das histonas são sintetizadas; algumas dessas proteínas irão ser mantidas em pequenas proporções no espermatozoide maduro, e o restante delas é substituída por proteínas de transição (BALHORN, 2011). Com o aparecimento dessas proteínas de transição nas espermátides, é iniciada a condensação da cromatina, que acontece no sentido da região apical para a caudal (OKO et al., 1996). Então, as proteínas de transição são substituídas por proteínas de carga positiva, denominadas protaminas (BALHORN, 2011).
A integridade do DNA de espermatozoides de mamíferos é de importância vital para a contribuição paterna de um descendente normal, uma vez que danos de DNA podem resultar em morte celular e na indução de mutações que podem ser transportadas para a próxima geração ou resultar em infertilidade do macho(ANDRABI, 2007; SHIBAHARA et al., 2003). Assim, a integridade do DNA tornou-se importante indicativo da qualidade do espermatozoide (HUGHES et al., 1999). Consequentemente, os distúrbios na integridade da cromatina são caracterizados pela presença de fraturas na banda simples ou dupla da molécula de DNA que leva à formação de segmentos desnaturados (RYBAR et al., 2004). Uma elevada suscetibilidade à desnaturação demonstra heterogeneidade da estrutura da cromatina e tem sido relacionada a distúrbios na espermatogênese, morfologia anormal (ENCISO et al., 2011), concentração e motilidade espermática diminuídas (BENCHAIB et al., 2003), danos ao desenvolvimento embrionário e consequente fertilidade reduzida (HALLAP, 2005). Os espermatozoides afetados possuem a capacidade de fertilizar oócitos, porém o consequente desenvolvimento embrionário depende do grau de alteração do DNA (AHMADI; NG, 1999).
2.1.2.3 Motilidade espermática
A motilidade é um importante fator a ser considerado na análise da qualidade espermática. Durante o processo de maturação dos espermatozoides no epidídimo ocorre modificação da membrana plasmática, mitocôndrias, fibras e componentes microtubulares da peça intermediária, resultando em motilidade progressiva (AMANN et al., 1993). A motilidade espermática é o parâmetro mais comumente utilizado a fim de analisar o potencial de fertilidade do sêmen, uma vez que a célula espermática necessita estar móvel para migrar
ao longo do trato reprodutivo feminino e promover a fertilização do oócito (TALWAR, 2015). Portanto, a motilidade apresenta correlação significativa (0,34) com a fertilidade, sendo utilizada em centros de processamento de sêmen como parâmetro limitante para definir a viabilidade de uma amostra de sêmen (SEVERO, 2009).
A motilidade é classificada de acordo com a porcentagem de células espermáticas com movimento progressivo e qualidade do movimento, que envolve a velocidade de movimento linear, distância total e progressão (JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002). Usualmente, a motilidade espermática é estimada em analisar o sêmen entre lâmina e lamínula, assim, determinando subjetivamente o percentual de células móveis em uma amostra com uso da microscopia óptica. Esse método é uma forma indireta de avaliação simples e de baixo custo, no entanto, demonstra grande variabilidade (VERSTEGEN et al., 2002). Esta variável, ocorre em função a experiência do avaliador, ocasionando diferenças nos valores para um mesmo parâmetro. Assim, a avaliação pelo CASA mostra maior padronização, precisão, confiabilidade e velocidade na obtenção de resultados nas análises (COX et al., 2006). Esse tipo de análise permite uma avaliação mais exata e objetiva da motilidade, fornecendo informações precisas e significativas da cinética celular espermática, determinando não somente a percentagem de células móveis na amostra, mas também quantifica características específicas do movimento espermático (GARNER, 1997).
Diferenças significativas foram observadas nos parâmetros de motilidade entre os espermatozoides que resultaram em uma alta taxa de fertilização e àqueles que não fertilizaram oócitos in vitro (HIRANO et al., 2001). Em bovinos, estudos demonstraram que ejaculados com maior frequência de espermatozoides, gota citoplasmática proximal e problemas de motilidade progressiva, não desenvolveram na fertilização in vitro em embriões além da clivagem (THUNDATHIL et al., 2001a). Nagy et al., (2015) analisando a motilidade de espermatozoides bovinos através de sistemas automáticos de análise de sêmen (CASA) detectaram que o parâmetro velocidade de trajeto é algo característico de motilidade do sêmen, útil e que possui relevância clínica na predição de fertilidade. Assim, o exame e determinação da motilidade espermática é parte significativa da avaliação da qualidade do sêmen.
De acordo com Verstegen et al. (2002) os parâmetros gerados da motilidade espermática pelo CASA são: Total (%), que é a soma de todas as células contadas móveis e não móveis; Motilidade (%),população de células que estão se movendo com uma velocidade mínima determinada no “setup”, proporção de células móveis do total; Motilidade Progressiva (%),porcentagem de células movendo-se progressivamente; Velocidade de
Trajeto (VAP, µm/s), velocidade média ininterrupta do trajeto da célula; Velocidade Progressiva (VSL, µm/s), velocidade média percorrida em linha reta entre os pontos inicial e final do trajeto; Velocidade Curvilinear (VCL, µm/s), a velocidade média mensurada de ponto a ponto do trajeto percorrido pela célula; Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH, µm), largura média da oscilação da cabeça conforme a célula se move; Frequência de Batimentos (BCF, Hz), frequência com que a cabeça do espermatozóide move-se para trás e para frente durante um trajeto percorrido; Retilinearidade (STR, %), valor médio da proporção entre VSL/VAP; Linearidade (LIN, %), valor médio da proporção entre VSL/VCL; e Velocidade Rápida (%). No entanto, estes parâmetros podem não ser suficientes para uma avaliação completa do potencial da fertilidade.
O desenvolvimento das tecnologias ômicas tem fornecido novas ferramentas de detecção molecular que permitem que vários parâmetros estejam efetivamente integrados na avaliação do potencial fertilizante do sêmen. Por meio da abordagem proteômica, Zhao et al. (2006) identificaram várias proteínas expressas diferencialmente em amostras de espermatozoides de baixa motilidade, em comparação com amostras de espermatozoides que apresentavam motilidade normal. Bissonnette et al. (2009) demonstram que alguns transcritos previamente identificados em associação com a fertilidade também estão associados com motilidade in vitro de espermatozoides bovinos. Hering et al. (2014) identificaram genes associados à baixa motilidade espermática de touros, dentre eles o gene da proteína associada ao canal catiônico 1 do espermatozoide (CATSPER1) que contribui para a patogênese da astenozoospermia. Tais informações, podem contribuir para elucidar mecanismos moleculares subjacentes à motilidade espermática.
2.1.3 Transcriptômica
Os estudos transcriptômicos analisam a transcrição de genes a partir RNAm. Antes da formação de proteínas/enzimas, a transcrição dos genes é o primeiro passo para a expressão da atividade dos genes (WANG et al., 2009). A transcriptômica tem como objetivo realizar o estudo de todos os conjuntos de moléculas de RNA (RNAm, RNAr, RNAt e RNA não-codificante) em uma única célula ou organismo. Como a transcriptômica reflete os genes que estão ativos expressos em qualquer momento da célula, também é referida como perfil de expressão. A principal técnica usada para abordar essa abordagem “omica” é o microarranjo de RNA e o DNA (BLOW, 2009c).
Estudos transcriptômicos frequentemente demonstram a abundância de RNAms e de suas proteínas correspondentes e se as mesmas estão bem correlacionadas. O destino de um RNAm é rigidamente regulado por uma interação complexa de modificação, processamento, armazenamento, decaimento e tradução, todos envolvendo interações proteína-RNA através de complexos de ribonucleoproteína mensageiro (RNPm). Alguns desses complexos montados são conduzidos diretamente para a tradução, enquanto outros são desviados para a repressão de armazenamento e translacional (MUELLER-MCNICOLL; NEUGEBAUER, 2013).
A transcriptômica é amplamente utilizada em estudos com animais de produção. Diferenças transcriptômicas em embriões derivados de touros de diferente status de fertilidade no estágio de pré-implantação do desenvolvimento, demonstrando que o gameta masculino contribui não apenas com DNA, mas também com RNA e fatores de sinalização para o oócito na fertilização (KROPP et al. 2017).
O RNA-seq é a atual tecnologia usada para a análise de alto rendimento dos perfis de transcriptoma, o que é essencial para entender a base molecular dos fenótipos. Além disso, tem a capacidade de sequenciar diretamente toda a população de transcritos através da amplificação de cDNA curto e, em seguida, marcação fluorescente de uma única base de cada vez gerando dezenas de milhões de leituras curtas, em torno de 30-400 pb de comprimento (WANG et al. 2009). Este método foi aplicado para mapear o transcriptoma de diversas espécies e tecidos, incluindo espermatozoides de humanos (SENDLER et al., 2013), camundongos (FANG et al., 2014), bovinos (CARD et al., 2013; SELVARAJU et al., 2017) e cavalo (DAS et al., 2013). Embora essas células sejam consideradas transcricionalmente e translacionalmente inativas, as quais contêm uma ampla população de moléculas de RNA codificadoras e não-codificadoras (JODAR et al. 2013), com funções que têm sido relacionadas à espermatogênese (OSTERMEIER et al., 2002), reorganização da cromatina espermática (HAMATANI, 2012), potencial de fertilidade (JODAR et al., 2015), desenvolvimento embrionário precoce (SENDLER et al., 2013) e herança epigenética transgeracional (RANDO, 2016). Assim, o estudo do transcriptoma do espermatozoide é fundamental para entender sua biologia e seu papel na fertilidade. Contudo, um dos principais desafios para o estudo do transcriptoma dos espermatozoides é o baixo rendimento de RNA e a alta fragmentação dos transcritos tipicamente presente nestas células, visto que a química padrão de RNA-seq normalmente requer uma grande quantidade (1 mg) de RNA de boa qualidade.
A técnica de RNA-Seq tem a capacidade de detectar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), bem como os limites de exon-exon para todas as transcrições expressas na amostra (COSTA et al., 2010). Na reprodução de mamíferos, o RNA-Seq tem sido usado recentemente para revelar a função e importância dos transcritos em vários estágios reprodutivos com foco principal na aquisição da função reprodutiva em adultos e na qualidade do embrião, demonstrando a importância desta técnica para reprodução de um modo geral. Em bovinos, a análise de RNA-Seq do sêmen sequenciou o transcriptoma do espermatozoide bovino, consistindo de 6.166 transcritos, incluindo várias transcrições previamente identificadas e novas para posteriores estudos funcionais (SELVARAJU et al., 2017). O sequenciamento direto é uma vantagem sobre a sequência curta de sondas de cDNA usadas para chips de microarray que não cobrem transcritos inteiros potencialmente resultando em deturpação de transcritos truncados e isoformas transcritas. Huang et al. (2012) utilizaram o RNA-seq para caracterizar e comparar os padrões de splicing alternativo em blastocistos em desenvolvimento ou em degeração usando embriões de bovinos fertilizados in vitro, detectando novos genes que podem desempenhar importantes papéis no início do desenvolvimento embrionário, demonstrando claramente o poder de RNA-seq e forneceu novos conhecimentos sobre desenvolvimento embrionário inicial de bovinos, fornecendo uma compreensão sistemática adicional desenvolvimento embrionário de mamíferos em grande escala.
Em vacas leiteiras a análise da expressão gênica foi realizada pelo sequenciamento de RNA da Illumina® e obtiveram um total de 16.892 genes expressos no período de transição, 19.094 genes foram expressos no pico de lactação e 18.070 genes foram expressos no final da lactação. Independentemente do estágio de lactação, aproximadamente 9.000 genes mostraram expressão em todos os períodos. A maioria dos genes na via do metabolismo da gordura apresentou alta expressão no leite no período de transição e no pico de lactação. Este foi o primeiro estudo a descrever o transcriptoma de forma abrangente do leite bovino em vacas Holandesas (WICKRAMASINGHE et al., 2011).
Estudo analisando perfis de expressão de genes em amostras de tecido adiposo subcutâneo em diferentes idades e sexos, identificou um total de 12.233 genes expressos, que foram detectados pelo método RNA-Seq para mostrar os genes diferencialmente expressos fornecendo uma nova compreensão do tecido adiposo a um nível molecular (ZHOU et al., 2014).
A tecnologia RNA-seq foi também empregada em estudo para detectar a genes diferencialmente expresos em glóbulo de gordura do leite com 10 dias e 70 dias após o parto
entre dois grupos de vacas com produção alta e baixa de leite após 305 dias, análise do rendimento de gordura e rendimento de proteína do leite. No total, 1232, 81, 429 e 178 estes resultados demonstraram alguns genes considerados promissores para características de produção de leite em bovinos leiteiros (YANG et al., 2016).
2.1.4 Proteômica
O próximo passo após a transcrição de genes em RNAm é a tradução do RNAm resultante em proteínas. Este processo pode ser influenciado por fatores como o RNAmi. Nesta etapa, proteínas altamente abundantes podem ser produzidas, bem como proteínas de baixa abundância que possuem uma ampla gama de funções em toda a fisiologia do animal de produção. Assim, a proteômica é considerada uma das mais conhecidas abordagem “ômica” (CRAVATT et al., 2007). A proteômica, consiste na identificação, quantificação e no estudo das modificações pós-traducionais do proteoma, ou seja, o conjunto de proteínas expressas em um genoma ou tecido; e no estudo das interações proteicas e mecanismos regulatórios (BLACKSTOCK; WEIR, 1999).
Assim, a proteômica baseia-se em princípios bioquímicos, biofísicos e de bioinformática para quantificar e identificar as proteínas expressas, pois se modificam de acordo com o desenvolvimento de um organismo bem como em resposta aos fatores ambientais (ANDERSON; ANDERSON, 1996; WILKINS et al., 1996). A proteômica surgiu na década de 1970 quando pesquisadores começaram a criar as bases de dados de proteínas utilizando a técnica de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (O’FARREL, 1975). A pesquisa proteômica permite identificar e caracterizar marcadores biológicos, ou seja, moléculas endógenas ou exógenas específicas de um determinado estado patológico. Assim, a capacidade de identificação dessas moléculas é útil no diagnóstico precoce de doenças e no acompanhamento da evolução do tratamento (CASH, 2002).
No que concerne à reprodução animal, essa técnica tem sido empregada principalmente para a detecção de marcadores bioquímicos da fertilidade, como também da congelabilidade do sêmen. A análise proteômica dos espermatozoides proporciona maior entendimento das interações proteicas do plasma seminal com estas células. Portanto, a proteômica do sêmen é imprescindível para identificação de propriedades e funções das proteínas envolvidas nos mecanismos de regulação das funções do trato reprodutivo masculino (STRZEZK et al., 2005).
A abordagem proteômica clássica é baseada especialmente, na separação das proteínas por eletroforese em gel bidimensional (2D), que separa as proteínas por dois parâmetros independentes: na primeira dimensão pelo ponto isoelétrico e na segunda dimensão pela massa molecular. A eletroforese bidimensional é um método fundamental, pois possibilita a visualização de um grande número de proteínas simultaneamente e suas distintas isoformas (HAYNES et al., 2000; LOW et al., 2002). No entanto, o método mais utilizado para identificação das proteínas é a espectrometria de massas que consiste na mensuração do peso molecular de átomos e moléculas. Primeiramente, as proteínas de interesse são recortadas do gel, fragmentadas (obtenção dos peptídeos), geralmente por digestão tríptica, e os fragmentos são analisados no espectrômetro de massa que, por sua vez, determina a massa da molécula mesurando a razão massa/carga do íon da molécula (SIUZDAK, 2006).
2.1.5 Metabolômica
Os componentes do proteoma (proteínas/enzimas) são envolvidos no metabolismo do animal. Além de analisar as enzimas utilizando a tecnologia proteômica, a pesquisa também podese concentrar nos metabólitos produzidos pelas enzimas de interesse. Metabólitos são produtos intermediários ou finais do metabolismo em uma amostra biológica. O conjunto de todos os metabólitos de baixa massa molecular (até 1500 Da), presentes ou alterados em um sistema biológico, é chamado de metaboloma (do inglês, metabolome) (WITTENBURG et
al., 2013). Existem muitas categorias diferentes de metabólitos que podem ser estudadas,
incluindo lípidos, metabólitos solúveis em água e metabólitos voláteis. Essas diferentes categorias de metabólitos requerem a sua própria abordagem analítica para detecção (WANG
et al., 2009).
O desenvolvimento da metabolômica tem como principal objetivo avaliar as mudanças do maior número possível de diferentes metabólitos de pequenas moléculas em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Assim, diferentemente da transcriptômica e proteômica, o perfil metabolômico pode dar um panorama da fisiologia da célula e tem sido amplamente utilizado (CARROLL et al., 2010; ZHAO et al., 2014). A metabolômica é um método promissor para identificar possíveis biomarcadores de fertilidade e infertilidade masculina (DEEPINDER et al., 2007; KOVAC et al., 2013). A presença, ausência e/ou alterações de metabólitos específicos podem estar relacionadas à fisiologia dos espermatozoides, e tais informações podem permitir um diagnóstico precoce associado a um
melhor tratamento da infertilidade (AITKEN, 2010). No estudo de Bender et al., 2010, análises do perfil metabolômico de fluidos foliculares de vacas e novilhas em lactação, por cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa (CG-EM), identificaram níveis mais elevados de ácidos graxos saturados no fluido de vacas em comparação ao fluido das novilhas. Os autores desse estudo sugerem que elevados níveis de ácidos graxos no fluido folicular podem ter efeitos negativos sobre a fertilidade de vacas (BENDER et al., 2010).
Velho et al. (2018) determinaram o perfil metabólico do plasma seminal de touros de alta e baixa fertilidade e identificaram potenciais biomarcadores de fertilidade. Além disso, foi utilizado ferramentas de bioinformática para revelar as redes e reações nas quais os metabólitos do plasma seminal do touro podem estar envolvidos. Neste estudo foi demonstrado que frutose, ácido cítrico, ácido lático, uréia e ácido fosfórico são os metabólitos predominantes no plasma seminal de touros, ralatando uma clara separação dos perfis metabólicos entre os touros de alta e baixa fertilidade, sendo a frutose e o ácido 2-oxoglutárico potenciais candidatos a biomarcadores de fertilidade de touros. Os resultados do deste estudo ajudarão a avançar nosso entendimento atual dos processos multifatoriais e complexos relacionadas com a fisiologia da fertilidade em machos.
3 PROBLEMA
Conforme descrito na revisão de literatura, vários estudos têm demonstrado os avanços das tecnologias “ômicas” na reprodução, bem como a importância de apronfundar os conhecimentos relacionados a expressão de genes ligados a fertilidade de bovinos. Diante disto, levantou-se os seguintes questionamentos:
1. Será que o padrão de metilação do DNA espermático pode ser um parâmetro importante para a análise da fertilidade do sêmen de reprodutores?
2. Será que vacas leiteiras holandesas durantre o período da lactação apresentam alterações na expressão gênica e consequentemente nas vias metabólicas?
4 JUSTIFICATIVA
O uso das tecnologias ômicas proporcionam o entendimento do funcionamento celular dos organismos e suas alterações biológicas. Estas tecnologias tornaram-se de uso corrente em estudo com animais de produção para melhor entender a fisiologia do animal e a qualidade dos produtos produzidos. Objetivando descobrir potenciais biomarcadores, inúmeros estudos têm sido realizados empregando as abordagens “ômicas”, incluindo proteômica, metabolômica e lipidômica. Sabe-se que um biomarcador ou marcador biológico é uma característica quantificável e/ou mensurável, que pode representar um fenótipo funcional ou uma determinada patologia em um organismo vivo. Esses biomarcadores se estabelecem de acordo com as mudanças nos níveis de genes, microRNAs, proteínas, metabólitos ou outras moléculas que possam influenciar um determinado processo biológico. Um aspecto importante de se fazer tais estudos “ômicos” é o entendimento da variação. Por exemplo, em relação à paridade, lactação, estado alimentar e saúde animal, a variação pode ocorrer em transcritos, proteínas ou metabólitos encontrados em animais de produção e nos produtos produzidos. Essa variação pode ajudar a entender melhor a fisiologia do animal (HETTINGA; ZHANG 2018).
As tecnologias ômicas fornecem informações sobre os benefícios da combinação de conjunto de dados coletados em diferentes períodos. Isso pode ser ainda mais estendido para maiores perspectivas, como compreender que os genes não funcionam isoladamente, mas sim em conjuntos de genes que codificam, através de conjuntos de transcritos, conjuntos de proteínas que estão envolvidas em processos metabólicos específicos. Uma vez que o genoma de um animal é sequenciado e anotado, esta informação pode ser utilizada para construir vias metabólicas, que descrevem o quadro integrado de como diferentes processos em uma espécie funcionam juntos. Além disso, a construção de visões gerais das vias metabólicas é um primeiro passo necessário para a pesquisa visando uma melhor compreensão do metabolismo de um animal. Esta construção de vias metabólicas pode ser feita usando conhecimento de reações enzimáticas conhecidas e caminhos para os quais os genes podem ser ligados. Como exemplo, as redes de genes envolvidos na síntese de lipídeos (BIONAZ; LOOR 2008) e proteínas (BIONAZ; LOOR 2011) de vacas leiteiras.
Portanto, estudar animais de produção em diversos períodos usando simultaneamente tecnologias “ômicas” pode ser muito útil para entender melhor a fisiologia subjacente, bem
como as modificações que ocorrem. Uma vez identificadas tais vias metabólicas, novas linhas de pesquisas serão propostas no sentido de melhor compreender seus mecanismos de ação. As funções de alguns genes ainda são desconhecidos e, portanto, ainda precisam ser melhor elucidados, especialmente aqueles associados à lactação de vacas de alto rendimento. Desta forma, uma melhor compreensão desses mecanismos auxiliará a entender e identificar mais precocemente animais com problemas metabólicos, aumentando dessa forma a eficiência na seleção de animais de alta produção.
5 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
1) O enriquecimento de sequências metil-CpG altera o padrão de metilação do DNA e estão associadas à motilidade dos espermatozoides.
2) A variação de metilação pode afetar os genes envolvidos na organização da cromatina espermática.
3) Durante o período da lactação em vacas ocorre mudança na expressão de genes. 4) Com o uso das tecnologias ômicas é possível identificar os genes diferencialmente expressos e revelar variações de sequência nas regiões transcritas.
6 OBJETIVOS
6.1OBJETIVOS GERAIS
Elaborar um perfil de metilação em todo o genoma nas duas populações de espermatozoides e identificar assinaturas epigenéticas diferenciais entre espermatozóides de alta (HM) e baixa motilidade (LM).
Identificar o padrão de expressão de genes do tecido adiposo subcutâneo de vacas no parto e com 30 e 90 dias pós-parto.
6.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a metilação de dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs) em populações de espermatozoides de Bos taurus de alta (HM) e baixa mobilidade (LM) separadas por gradiente de Percoll.
Identificar os padrões de metilação em espermatozoides HM e LM investigados por sequenciamento de bissulfito.
Comparar o perfil de expressão gênica no tecido adiposo subcutâneo de vacas leiteiras no dia do parto (D2), 30 dias e 90 dias pós-parto utilizando o método RNAseq.
7 ARTIGO I:
Epigenetic variation in pericentromeric regions between high and low motile sperm populations in Bos taurus
(Variação epigenética em regiões pericentroméricas entre populações de espermatozoides de alta e baixa motilidade em Bos taurus)
Artigo aceito para publicação no periódico Scientific Reports (Qualis A1 – Biotecnologia)
Epigenetic variation in pericentromeric regions between high and low motile sperm populations in Bos taurus.
Capra E.1, Lazzari B. 1-2, Turri F.1, Cremonesi P.1, Portela AMLR.3, Ajmone-Marsan P.4,5 Stella A. 1-2, Pizzi F.
1Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Lodi, Italy. 2Parco Tecnologico Padano, Lodi, Italy.
3Department of Animal Science, Federal University of Ceará, Fortaleza, Brazil 4Istituto di Zootecnica, Università Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza, Italy
5Centro di Ricerca Nutrigenomica e Proteomica – PRONUTRIGEN, Università Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza, Italy
Corresponding Author:
aIstituto di Biologia e Biotecnologia Agraria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, via Einstein, 26900 Lodi, Italy
Tel.: +39 0371 4662505; fax: +39 0371 4662501. E-mail address: pizzi@ibba.cnr.it (F. Pizzi). Email addresses: EC: e.capra@ibba.cnr.it BL: barbara.lazzari@ptp.it FT: turri@ibba.cnr.it PC: cremonesi@ibba.cnr.it AMLRP: moemmia@hotmail.com PAM: paolo.ajmone@unicatt.it AS: alessandra.stella@ptp.it FP: pizzi@ibba.cnr.it
Abstract: Sperm epigenetics is an emerging area of study supported by observations
reporting that abnormal sperm DNA methylation patterns are associated with infertility. Here, we explore cytosine-guanine dinucleotides (CpGs) methylation in high (HM) and low motile (LM) Bos taurus sperm populations separated by Percoll gradient. HM and LM methylation patterns were investigated by bisulfite sequencing. The average level of methylated cytosine was about 94%. Comparison between HM and LM sperm populations revealed that methylation variation affects genes involved in chromatin organization. CpG Islands (CGIs), were highly remodelled. A high proportion of CGIs was found to be methylated at low-intermediated level (20-60%) and associated to the repetitive element BTSAT4 satellite. The low-intermediate level of methylation in BTSAT4 was stably maintained in pericentromeric regions of chromosomes. BTSAT4 was hypomethylated in HM sperm populations. The characterization of the epigenome in HM and LM Bos taurus sperm populations provides a
first step towards the understanding of the effect of methylation on sperm fertility. Methylation variation observed in HM and LM populations in genes associated to DNA structure remodelling as well as in a repetitive element in pericentromeric regions suggests that maintenance of chromosome structure through epigenetic regulation is probably crucial for correct sperm functionality.
Keywords: sperm, motility, methylation, epigenetic, satellite
Introduction
Male infertility is a complex disorder affecting humans as well as other animals. Infertility is partially explained by physiological and biochemical factors, such as low sperm counts and poor sperm quality. The genetic basis of male infertility accounts for about 15% of infertile cases [1, 2]. The etiology of this disorder remains unclear both in human and other species. For example, bulls considered of high-merit based on different sperm traits such as spermatozoa motility and morphology, are sometimes unable to produce successful full-term pregnancies [3, 4]. Different molecular parameters related to sperm nuclear and mitochondrial DNA, plasma membrane and lipid composition affect the ability of spermatozoa to fertilize oocytes and contribute to normal embryo development [5-7]. Therefore, much remains to be understood and novel molecular approaches may help to unravel the molecular basis of infertility.
Among the known epigenetic processes in mammalian cells, DNA methylation has been identified as an important regulatory mechanism of genome function in normal embryonic development, X-chromosome inactivation and genomic imprinting [8, 9]. DNA methylation of the 5-carbon position in cytosine residues was reported to be predominantly present at cytosine-guanine dinucleotides (CpG) and especially in GC rich regions called CpG islands (CGIs) [10]. CGIs methylation in different genomic features impacts gene expression i.e. promoter hypomethylation is associated with gene expression, while methylation in gene bodies influences splicing [11]. Methylation is also observed in Repetitive Elements (RE) of adult cells playing a role in the maintenance of chromosome structure and genome integrity [12].
Sperm epigenetic marks are unique, thus the factors that determine the patterns of DNA methylation differ between male germ cells and somatic cells. Although RE are highly methylated in both germ and somatic cells, elements from several subfamilies show different
