Parâmetros citogenéticos de espécies comerciais de carangidae (perciformes), com vistas a sua empregabilidade na conservação biológica e piscicultura marinha

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(2) PARÂMETROS CITOGENÉTICOS DE ESPÉCIES COMERCIAIS DE CARANGIDAE (PERCIFORMES), COM VISTAS A SUA EMPREGABILIDADE NA CONSERVAÇÃO BIOLÓGICA E PISCICULTURA MARINHA. UEDSON PEREIRA JACOBINA. Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós Graduação – Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Orientador- Dr. Wagner Franco Molina. NATAL-RN 2012.

(3) Seção de Informação e Referência Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Jacobina, Uedson Pereira Parâmetros citogenéticos de espécies comerciais de carangidae (perciformes), com vistas a sua empregabilidade na conservação biológica / Uedson Pereira Jacobina. – Natal, RN, 2012. 150 f. : il. Orientador: Wagner Franco Molina. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Rede Nordeste de Biotecnologia. 1. Piscicultura Marinha – Tese. 2. Marcadores Cromossônicos – Tese. 3. Software Lekin – Tese. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BCZM. CDU 639.2.04.

(4) Dedico este trabalho a meu pai Lídio Jacobina Vieira Santos.

(5) “Nem tudo que se enfrenta pode ser. modificado,. mas. nada. pode. ser. modificado até que seja enfrentado. A tradição é a personalidade dos imbecis.”. Albert Einstein.

(6) AGRADECIMENTOS Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao programa Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) pela oportunidade de realizar este trabalho. Ao meu orientador Professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio e confiança depositada em mim, que foram fundamentais para a realização deste trabalho e oportunidade de trabalhar com grupo, objeto de estudo, “fantástico”, os Carangídeos. Aos professores Dr Luiz Antonio Carlos Bertollo, Marcelo de Bello Cioffi e Marcelo Vicari pela amizade, parceria e dicas na melhoria deste trabalho. Aos Professores Dr. Darlio Teixeira, Carlos Blaha e Paulo Sérgio Marinho pelas críticas e sugestões para a melhoria do trabalho. Aos Professores Dr. Orlando Moreira-Filho, Vitor de Oliveira Lunardi, Carlos Alfredo Galindo Blaha e Liliane de Lima Gurgel pelas críticas essenciais e fundamentais na melhoria desse trabalho. Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPQ) pela bolsa de pesquisa concebida em 2009. Ao Conselho de Aperfeiçoamento Superior pela bolsa REUNI concebida de 2010 a 2012, fundamental na minha permanência e continuidade deste trabalho em Natal. As Professoras Kattia Scortecci e Adriana Uchôa pelos ensinamentos, dicas e bate papos descontraídos nas aulas de Biologia Celular fundamentais para o meu aprendizado e amadurecimento como um futuro docente. A minha família, os irmãos Wilton, Wendell e José Welton e principalmente minha mãe Beatriz Alencar Jacobina por todo amor e carinho e confiança depositada em mim. Ao grande amigo Pablo Martinez pela convivência, parceria nos trabalhos e claro parceiro das melhores baladas em Natal, e por compartilhar os momentos difíceis. Aos grandes amigos Layse, Calado, Washington, Valdir, Silvio e Valério pelo apoio e por tornarem esta convivência mais descontraída e bem mais feliz em minha estadia de quatro anos em Natal..

(7) Aos amigos de Guamaré Layse, Kelly, Carol, Pedro, Calado, Acarilton, Érico, Iraê, Gustavo, Diogo, Felipe, Daniel, Aline, Lucas e Léo pela amizade, apoio, compreensão e por tornar a conviência mais fácil nos dias de labuta em Guamabeach. Ao amigo Garcia Júnior pelo apoio e suporte na identificação das espécies. Aos colegas do laboratório de Genética de Recursos Marinhos Gideão, Rodrigo Pantera, Eurico, Allysson, Amanda, George, Clóvis e Paulo por participarem direta ou indiretamente na realização deste trabalho. Em geral gostaria de agradecer a todas as pessoas que de certa forma contribuíram na realização deste trabalho..

(8) Resumo Entre os peixes marinhos, as famílias Carangidae e Rachycentridae se apresentam como grupos de grande importância comercial pela pesca e potencial para piscicultura marinha. Entretanto, bases genéticas que possam alicerçar o futuro cultivo destas espécies, sobretudo seus aspectos citogenéticos são incipientes. Os padrões cromossômicos têm fornecido dados básicos para a prospecção de processos biotecnológicos de manipulação cromossômica voltados ao melhoramento genético, como a indução a poliploidia, ginogênese e androgênese, assim como obtenção de estoques monossexo e hibridizações interespecíficas. Neste trabalho é apresentado um amplo levantamento citogenético em 10 espécies, sendo sete da família Carangidae e de Rachycentron canadum, espécie monotípica da família Rachycentridae. A caracterização citogenética clássica e mapeamento in situ de sequências multigênicas foram empregadas. Adicionalmente em espécies do gênero Selene e em morfótipos de Caranx lugubris foram realizadas comparações através de morfometria geométrica. Em geral, as espécies exibiram um marcante conservadorismo cromossômico numérico (2n=48). Apesar de apresentar, em grande parte, fórmulas cariotípicas diferenciadas, conservam diversas características cromossômicas típicas da Ordem Perciformes, como elevado número de elementos monobraquiais, sítios Ag-RONs/ DNAr 18S simples e heterocromatina reduzida, preferencialmente centromérica. Os principais mecanismos envolvidos na diversificação cariotípica são as inversões pericêntricas, com ação secundária de fusões cêntricas. Além do mapeamento físico e detalhamento cromossômico para as espécies são apresentados e discutidos padrões de variabilidade intra e diversificação interespecíficas, com identificação de marcadores citotaxonômicos. Este conjunto dos dados propicia um melhor conhecimento dos padrões carioevolutivos destes grupos e condições para o desenvolvimento de protocolos biotecnológicos baseados na manipulação cromossômica para estas espécies Atlânticas..

(9) Abstract Worldwide, families Carangidae and Rachycentridae represent one of the groups most important commercial fish, used for food, and great potential for marine aquaculture. However, the genetic bases that can underpin the future cultivation of these species, cytogenetic between these aspects are very weak. The chromosomal patterns have provided basic data for the exploration of biotechnological processes aimed at handling chromosomal genetic improvement, such as induction of polyploidy, androgenesis and ginogenesis, as well as obtaining monosex stocks and interspecific hybridizations. This paper presents a comprehensive cytogenetic survey in 10 species, seven of the family Carangidae and the monotypic family Rachycentridae. Classical cytogenetic analysis and in situ mapping of multigene sequences were employed, and additionally for the genus Selene and morphotypes of Caranx lugubris, comparisons were made using geometric morphometrics. In general, conservative species exhibit a marked chromosome number (2n=48). Although present in large part, different karyotypic form, retain many characteristics typical of chromosomal Order Perciformes, the high number of elements monobrachyal, Ag-NORs/18S rDNA sites and heterochromatin simply reduced, preferably centromeric. The main mechanisms involved in karyotypic diversification are the pericentric inversions, with secondary action of centric fusions. In addition to physical mapping and chromosome detail for the species are presented and discussed patterns of intra-and interspecific diversity, cytotaxonomic markers. This data set provides a better understanding of these patterns caryoevolutyonary groups and conditions for the development of protocols based on Biotechnology for chromosomal manipulation Atlantic these species..

(10) Lista de Figuras e Tabelas Introdução Figura-1. Relações filogenéticas baseadas em dados morfológicos (Gushiken, 1988) para Carangoidei (a) e de tribos da família Carangidae (adaptado de Reed et al., 2002) a partir de sequências Cit B (b). Pag-18 Tabela-1. Dados citogenéticos da família Carangidae. Pag-19 Capítulo 2 Figura 1. Cariótipos de Rachycentron canadum. Coloração convencional (a) destacando os sítios AgNORs no par cromossômico no. 2; (b) bandamento C, destacando as RONs como regiões heterocromáticas CMA3+/DAPI- ; (c) bandas de replicação, evidenciando os sítios de rDNA 18S (par 2) e 5S (pares 3 e 13) como de replicação inicial; (d) double-FISH com sondas de DNAr 18S (rosa) e 5S (verde), evidenciando a localização dos sítios de DNAr 18S no par no. 2 e dos sítios de DNAr 5S nos pares 3 e 13; (e) FISH com seqüências (TTAGGG)n evidenciando a localização de sítios teloméricos nos cromossomos (laranja). Barra = 5 µm. Pag-69 Figura 2. Idiograma representativo do complemento cromossômico de Rachycentron canadum, exibindo o mapeamento citogenético das sequências ribossomais, Ag-RONs, regiões heterocromáticas e bandas de replicação dos cromossomos. Pag-70 Capítulo 3 Figura 1. Cariótipos das espécies Trachinotus goodei (a, d, g), Trachinotus carolinus (b, e, h) e Trachinotus falcatus (c, f, i). Coloração convencional (a, b, c) destacando os pares portadores de sítios Ag-RONs; bandamento C (d, e, f); em destaque os pares organizadores nucleolares sob coloração por CMA3+/DAPI-. Dupla coloração em FISH com sondas de 18S DNAr (verde) e 5S DNAr (vermelho) (f, g, h). Barra = 5 µm. Pag-78 Figura 2. Árvore filogenética de parcimônia em algumas espécies da tribo Trachinotini (a), adaptado de Reed et al. (2002). As relações moleculares confrontam com uma fórmula cromossômica das espécies de Trachinotus analisadas. Abaixo, uma representação esquematica de uma nova possibilidade de “acrocentrização” (b) e condição derivada de sítios de DNAr múltiplos exclusivo em T. goodei (c). Em destque sítios DNAr 18 e 5S em T. Falcatus. Pag-80 Capítulo 4 Figura 1. Cariótipos das espécies Selene brownii, S setapinnis e S. vomer. (a) Coloração convencional destacando os sítios Ag-RONs no par cromossômico no. 1; (b) bandamento C destacando a região da RON com coloração CMA3+/DAPI-; (c) dupla-coloração em FISH com sondas de 18S DNAr (verde) e 5S (vermelho) evidenciando a localização dos sítios de 18S DNAr no primeiro par e 5S DNAr no 9° par nos cariótipos; (d) FISH com sondas (TTAGGG)n mostrando os sítios teloméricos nos cromossomos. Barra = 5 µm. Pag-90 Tabela 1. Distância de Mahalanobis entre as espécies de Carangidae (diagonal inferior) e valores de P com testes de permutação de (1000x) (diagonal superior).Pag-90 Figura 2. Variáveis canônicas e projeção da forma do corpo e mensurações de O. palometa (estrelas pretas), C. lugubris (círculos brancos) S. brownii (quadrados pretos), S. setapinnis (estrelas.

(11) brancas), S. vomer (círculos brancos). Abaixo, forma esquemática comparando entre espécies as formas. Pag.-91 Capítulo 5 Figura 1. Posição geográfica no Atlântico e detalhe do Arquipélago São Pedro e São Paulo, ponto de coleta dos morfótipos de C. lugubris. Pag-98 Figura 2. Representação esquemática dos pontos anatômicos dos 12 landmarks (a) definidos para as análises morfométricas em C. lugubris; (1) extremidade do focinho; (2) depressão do perfil frontal acima do focinho; (3) inserção da primeira nadadeira dorsal (4) inserção do segundo ponto de vista dorsal, (5) último raio dorsal, (6) fim da nadaeira anal, (7) inserção da anal, (8) inserção nadadeira anal; (9) base final da nadadeira pélvica, (10) inserção da nadadeira peitoral, (11 e 12) extremidades anterior e posterior do olho. Pag-105 Figura 3. Dendrograma de similaridade morfológica, obtido através de agrupamento UPGMA, para espécies de Caranx e Carangoides. Os morfótipos de C. lugubris apresentam-se similares entre si, mas discriminados de espécies morfologicamente mais próximas como C. hippos e C. latus. Um segundo cluster agrupa C. crysos e C. bartholomaei de corpo alongado. Pag-106 Figura 4. Cariótipos dos morfótipos I (esquerda) e II (direita) de C. lugubris presentes no ASPSP. Coloração por Giemsa, com destaque para o par no. 1 portador de sítios Ag-RON (a). Bandamento C (b). Coloração com DAPI/CMA3, exibindo sítios GC-ricos dispersos nas regiões centroméricas e teloméricas da maioria dos pares cromossômicos (c). Double-FISH evidenciando o mapeamento dos sítios 18S DNAr (vermelho) e 5S DNAr (verde). Pag-107 Tabela 1. Espécimes utilizados nas análises das sequências de DNA ribossomal 16S, número de acesso no GenBank e seus números de depósito na coleção ictiológica da UFRN. Pag-108 Tabela 2. Valores merísticos dos elementos seriais nos dois morfótipos de C. lugubris e em outras espécies de Carangidae dos gêneros Caranx e Carangoides, com ocorrência no Atlântico. a Honebrink (2000); b Smith-Vaniz & Carpenter (2007). Atlantico L. – Atlantico Leste; Atlantico O. – Atlantico Oriental. Pag-108 Capítulo 6 Figura1. Cariótipos de Carangoides bartholomaei (a), Caranx latus (b) e Caranx lugubris (c), sob coloração convencional. Abaixo respectivamente os padrões de distribuição da heterocromatina para cada espécie. Em destaque, os pares organizadores nucleolares (par 1). Sobreposição CMA/DAPI nas três espécies analisadas (g,h e i). Mapeamento cromossômico por dual-color FISH de sondas DNAr 18S (verde) e 5S (vermelho) em Carangoides bartholomaei (j), Caranx latus (k) e Caranx lugubris (l). Barra = 5µm. Pag-128.

(12) Sumário 1-Introdução 1.1- Aquicultura, aspectos citogenéticos e biodiversidade- Pag-14 1.2- Relações filogenéticas das famílias Carangidae e Rachycentridae com vistas à piscicultura marinha. Pag-16 2- Obj etivos 3-Mater ial e Méto dos 3.1-Material. Pag-21 3.2-Métodos. Pag-21 3.2.3- Preparações cromossômicas. Pag-21 3.2.4-Identificação de padrões heterocromáticos (bandamento C). Pag-22 3.2.5- Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RONs). Pag-22 3.2.6- Fluorocromos GC- e AT-específicos (CMA3 e DAPI). Pag-22 3.2.7- Hibridaç ão fluor esc ente in s itu (FISH)–Sondas 18S e 5S . Pag-23 3.2.8- Microfotografias e captura de imagens. Pag-24 3.2.9- Análises Morfométricas. Pag-25 4- Referências. Pag-26 Res ultado s e Discussão Capítulo 1 Protocolos citogenéticos e perspectivas biotecnológicas voltadas à piscicultura marinha. Pag- 31 Capítulo 2 Mapeamento cromossômico de seqüências repetitivas em Rachycentron canadum (Perciformes, Rachycentridae). Implicações para evolução cariotípica e perspectivas para fins biotecnológicos. Pag- 65 Capítulo 3 Perfil discriminatório de sitios de DNAr e possivel tendência de acrocentrização no gênero Trachinotus. Pag -74 Capítulo 4 Peixes-Galo do Atlântico: Independência dos padrões de diferenciação cariotípica e morfológica. Pag-86.

(13) Capítulo 5 Ocorrência de dois morfótipos de Caranx lugubris, (Carangidae) no Arquipélago São Pedro e São Paulo, meso Atlântico. Pag- 95 Capítulo 6 Mapeamento de genes 18S e 5S em espécies pelágicas dos gêneros Caranx e Carangoides (Carangidae).Pag-122 Considerações finais. Pag-137.

(14) 1- INTRODUÇÃO. 1.1- Aquicultura, aspectos citogenéticos e biodiversidade Entre as diferentes áreas da aquicultura, a piscicultura corresponde à atividade de maior volume em termos de produção mundial, sobretudo a desenvolvida em águas continentais. Por outro lado, embora a piscicultura marinha venha se desenvolvendo de forma crescente e em escala global, no geral ainda enfrenta algumas limitações ao seu pleno desenvolvimento, como questões sociais e ambientais e o baixo conhecimento da biodiversidade de algumas regiões, do ciclo de vida de espécies e dos seus aspectos genéticos podem ser elencados como empecilhos ao seu pleno desenvolvimento (Hutchings, 2001; Dulvy et al., 2003). No Brasil, a aquicultura tem se desenvolvido muito modestamente quando comparada com outros países do mundo, frente às expressivas potencialidades da biodiversidade e condições ambientais do país. Os grandes problemas enfrentados surgem da falta de organização do sistema de transferência de tecnologia, a carência de pesquisa aplicada, do ordenamento e desenvolvimento, bem como da distribuição dos produtos pesqueiros (Castagnolli, 1996). Embora em médio prazo, esta atividade venha a ser o setor que mais oferecerá possibilidades de aumento da produção de pescado, são necessários estudos que possibilitem a formulação de um programa de desenvolvimento para esta área, levando-se em conta as particularidades das diferentes regiões brasileiras (Camargo & Pouey, 2005). Um passo importante para o sucesso das atividades comerciais da piscicultura recai na exata compreensão, pelo setor produtivo, das diferenças e perspectivas genéticas que envolvem as populações naturais e estoques cativos de reprodutores. Populações naturais normalmente representam um repositório de ampla base genética da espécie, modelado sob a ação da seleção natural, sua manutenção é fonte permanente de germoplasma a ser utilizado para fins de melhoramento genético. Estoques cativos de reprodutores, por outro lado, constituem quase sempre uma amostra genética limitada, composto por pequeno número de exemplares comparado às populações naturais, nem sempre representativa do pool gênico das populações ou espécie e completamente dependente do manejo e dos cruzamentos envolvidos para a sua perpetuação. A genética aplicada à piscicultura abrange quatro principais áreas que estão intimamente interligadas, são elas: a manipulação genética; manejo genético, monitoramento genético e a conservação genética. Nas ultimas três décadas, estas. 1.

(15) abordagens começaram a contribuir nos programas de criação de peixes, das quais uma das mais utilizadas é a investigação e aplicações das informações cromossômicas (Hussain, 1996; Pandian & Koteeswaran, 1998; Arai, 2001). Dados cromossômicos relacionados ao melhoramento genético de peixes cultivados têm sido foco de discussões e revisões durante a última década (Hulata, 2001). Estudos cariotípicos têm fornecido informações básicas sobre o número, tamanho e morfologia dos cromossomos (Khan et al., 2000), que tem ajudado na compreensão dos mecanismos evolutivos dos grupos investigados. O conhecimento sobre padrões cromossômicas das espécies fornecem dados básicos para a padronização dos processos de manipulação cromossômica voltados ao melhoramento genético. Entre estes a indução da poliploidia, ginogênese e androgênese, assim como obtenção de estoques monossexo e hibridizações interespecíficas (Wu et al., 1988; Diter et al., 1993). Estas técnicas genéticas têm sido amplamente aplicadas em conjunção com o cultivo de espécies aquícolas no mundo (Arai, 2001; Beardmore et al., 2001; Jankun et al., 2007). Das 13.000 espécies de peixes marinhos descritos, apenas 2% dessas espécies foram estudadas sob o ponto de vista citogenético (Brum, 1996). A citogenética representa uma importante área dos estudos genéticos e o Brasil é um dos maiores expoentes. A caracterização citogenética de populações e espécies possibilita a identificação de polimorfismos, diferenças populacionais sutis e espécies crípticas (Mantovani et al., 2000; Porto-Foresti, 2006; Molina et al., 2008; Cioffi et al., 2009), que podem ser utilizadas para o manejo adequado, monitoramento, conservação e a exploração racional dos estoques pesqueiros. Os peixes marinhos, comparativamente aos de água doce apresentam, em geral uma pequena diversidade no número de cromossomos (Brum, 1996). Diferente dos ambientes continentais, os ambientes marinhos apresentam barreiras físicas em menor número ou efetividade, o que minimiza o isolamento geográfico (Lacson, 1992). Essa condição entre os Perciformes, maior grupo de peixes marinhos, poderia minimizar a diversificação cariotípica e favorecer um mais amplo compartilhamento entre os grupos do cariótipo basal composto por 48 cromossomos acrocêntricos (Ohno, 1970, White, 1973, Brum, 1996, entre outros). De fato, nesta Ordem, este cariótipo é encontrado freqüentemente em muitas famílias, tais como Carangidae (Murofushi & Yosida, 1979), Haemulidae (Aciolly, 2008), Pomacanthidae (Affonso et al., 2000), Pomacentridae (Molina & Galetti, 2002), dentre outros.. 2.

(16) Os estudos citogenéticos em peixes marinhos neotropicais têm crescido de forma expressiva, sobretudo em Perciformes (Araújo et al., 2010; Jacobina et al., 2011; MottaNeto et al., 2011; Aciolly et al., 2012; dentre outros), apesar de ainda reduzidos frente a dimensão deste grupo. Em função da costa brasileira (Atlântico Ocidental) apresentar uma vasta diversidade ictiofaunística, dados citogenéticos das espécies são ainda reduzidos, com ausência de informações sobre os padrões cromossômicos de diversas famílias. Neste aspecto, as análises citogenéticas em peixes tornam-se especialmente interessantes porque eles constituem um grupo particular dentre os vertebrados pelo número de espécies, diversidade de formas, comportamento e habitats e pela posição central que ocupam na evolução animal (Ohno, 1970). O aprimoramento de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares vem crescentemente permitindo acesso a regiões específicas dos cromossomos. O maior acesso à estrutura dos cromossomos aumenta o poder discriminatório, entre cariótipos aparentemente similares, e revelam mecanismos de rearranjos insuspeitos (Ozouf-Costaz et al., 1991), bem como são úteis na identificação de homeologias.. 1.2 -Relações filogenéticas das famílias Carangidae e Rachycentridae com vistas à piscicultura marinha No ambiente marinho, Perciformes constitui a ordem dominante, caracterizada como a maior e mais diversificada dentre os teleósteos. Neste grupo a subordem Percoidei é a mais representativa, com 79 famílias, 549 gêneros e 3.176 espécies (Nelson, 2006). Nesta Ordem, a superfamília Carangoidei representa um dos poucos grupos monofiléticos, constituído pelas famílias Nematistiidae, Coryphaenidae, Rachycentridae, Echeneidae e Carangidae (Johnson, 1993). Algumas características morfológicas sugerem que. Carangidae, Coryphaenidae, Rachycentridae e Echeneidae formam um grupo monofilético (Johnson, 1984), onde Rachycentridae e Echeneidae formam um grupo monofilético, tendo Coryphaenidae como grupo-irmão do clado de Nematistiidae e Carangidae (O'Toole, 2002). Em número de espécies Rachycentridae e Nemastiidae são formadas apenas por uma única espécie, Coryphaenidae por duas, Echeneidae por oito (Smith-Vaniz et al., 1999; O'Toole, 2002; Collette, 2003), enquanto que Carangidae, mais diversificada, abrange 32 gêneros e 140 espécies (Smith-Vaniz, 2002). Em todo o mundo, as famílias Carangidae e Rachycentridae representam um dos mais importantes grupos de peixes comerciais usados para fins alimentares (Smith-Vaniz 1999). Na família Rachycentridae, a espécie monotípica Rachycentron canadum (Cobia), é de ampla distribuição, vivendo em águas tropicais em todo o mundo, sendo importante. 3.

(17) economicamente e muito bem considerado como um candidato ideal para a aquicultura eno cenário mundial. Estes fatores têm estimulado a realização de pesquisas com esta espécie nos Estados Unidos, México, Porto Rico, Austrália, Vietnam, China e Taiwan (FAO, 2006). No Brasil, algumas regiões vêm tentando buscar soluções para o fortalecimento econômico com bases na aquicultura e vem incentivando políticas de desenvolvimento da piscicultura marinha através de diagnósticos e definições de organismos a serem cultivados. Atualmente, diversos órgãos públicos vêm estudando a implantação no país de cultivos desta espécie, Rachycentron canadum, o beijupirá, espécie que vem mostrando grande potencial para a piscicultura marinha devido à sua elevada taxa de crescimento – pode alcançar 6 kg em um ano de cultivo, ao alto valor comercial e a qualidade da carne (Carvalho Filho, 1999; Domingues et al., 2007). Já os membros da família Carangidae, representam cerca de 5% dos desembarques anuais de peixes ósseos marinhos em todo mundo. Entretanto, informações sobre a distribuição e abundância da maioria dos carangídeos é insuficiente para determinar a viabilidade de exploração ou maior exploração das espécies (Nakamura, 1980; Honebrink, 2000). Esta redução de estoques, alto valor econômico e características biológicas vem aumentando as pesquisas e o emprego de algumas destas espécies, constituintes desta familia na piscicultura marinha. Carangidae é um grupo diverso, constituído por espécies conhecidas popularmente como xaréus, pâmpanos, galos, entre outros. Suas relações taxonômicas são pouco claras e uma quantidade considerável de mudanças de nomenclatura vem ocorrendo (Laroche et al. 1984, Gunn 1990, Honebrink 2000). Dados morfológicos permitem definir quatro tribos, sendo elas Trachinotini, Scomberoidini, Naucratini e Carangini. Nestas tribos foram reconhecidas provisoriamente algumas subfamílias como Trachinotinae, formada pelos gêneros Lichia e Trachinotus, Scomberoidinae, composta por pelos gêneros Oligoplites, Parona e Scomberoides, Naucratinae composta pelos gêneros Compogramma, Elagatis, Naucrates, Seriola e Seriolina e Caranginae, a mais diversificada, formada por 96 espécies, distribuídas em 22 gêneros (Smith-Vaniz 1984). Outras filogenias baseadas em. características morfológicas foram também propostas para Carangidae (Gushiken, 1988). Hipóteses filogenéticas a partir de sequências do gene mitocondrial Citocromo b, revelam suporte para o monofiletismo das subfamílias Caranginae, Naucratinae e Trachinotinae (Figura, 1), embora a monofilia da tribo Scomberoidini tenha se mostrado questionável (Reed et al., 2002).. 4.

(18) a. b. Figura 1. Relações filogenéticas baseadas em dados morfológicos (Gushiken, 1988) para Carangoidei (a) e de tribos da família Carangidae (b) a partir de sequências Cit b (adaptado de Reed et al., 2002).. No que diz respeito aos representantes de Carangidae utilizadas na produção, várias espécies, como Pseudocaranx dentex e Trachinotus carolinus têm sido extensivamente cultivadas em tanques-rede no Japão (Heilman & Spieler, 1999; Ogawa, 1992;). Neste país a espécie Seriola quinqueradiata já vem sendo cultivada desde 1927, em gaiolas no mar, a partir da captura de juvenis selvagens (Nakada, 2002). Outras espécies de Seriola, como S. dumerili, também apresentam alto potencial para aquicultura, em virtude de seu crescimento rápido e alto valor comercial (Mazzola et al., 2000). Mais recentemente, o cultivo de S. lalandi tem sido implementado comercialmente na Austrália e Nova Zelândia, onde é dependente de juvenis criados (Poortenaar et al. 2001). No gênero Caranx, C. melampygus, espécie cujas populações tem sofrido os efeitos da pesca intensiva (Shomura, 1987; Friedlander & Dalzell 2004) tem atraído atenção para fins de cultivo. Do total das cerca de 140 espécies que compõem a família Carangidae, 25 espécies (17,8%), de 10 gêneros, já dispõe de alguma informação citogenética (Tabela 1). No entanto, a maioria destes estudos está relacionada às espécies do mar Mediterrâneo (Caputo et al., 1996; Sola et al., 2007; Chai et al., 2009). Um painel mais extenso de marcadores cromossômicos obtidos pela aplicação de métodos citogenéticos mais resolutivos torna-se necessário para representantes Atlânticos da família Carangidae. Estes dados possibilitarão analisar a evolução cromossômica, bem como a presença de marcadores populacionais ou interespecíficos, subsidiando seu emprego em práticas de manejo e exploração adequada dos estoques pesqueiros. Análises citogenéticas aprofundadas envolvendo um número maior de gêneros e espécies permitiria um primeiro cenário dos aspectos citogenéticos destas. 5.

(19) famílias Carangidae e Rachycentridae no litoral brasileiro e suporte para seu uso futuro no melhoramento genético e desenvolvimento da piscicultura marinha no Brasil. Tabela 1. Dados citogenéticos da família Carangidae. Espécies. 2n. NF. m/sm. st/a. Referências. Alectis ciliaris. 48. 48. -. 48. Atropus atropos. 48. -. -. -. Das et al., 1980. Carangoides armatus 48. -. -. -. Das et al., 1980. Murofushi & Yosida, 1979. Carangoides equula. 48. 48. -. 48. Murofushi & Yoshida, 1979. Caranx equula. 48. 48. -. 48. Murofushi & Yoshida, 1979. C. crysos. 46. 48. 2m/sm. 44. Netto, 1997. C. sansun. 48. 50. -. 46a/2st. C. sexfasciatus. 48. 48. -. 48. Murofushi & Yosida, 1979. Chloroscombrus chrysurus. 48. 48. -. 48. Pauls, 1993; Netto, 1997. Selene setapinnis. 46. 48. 2m/sm. 44. Netto, 1997. Selene vomer. 48. 50. -. 46a/2st. Seriola dumerili. 48. 50. 2sm. 46a. Vitturi et al., 1986. Seriola dumerili. 47. 50. 1m/2sm. 44a. Vitturi et al., 1986. Seriola dumerili. 48. 52. 2sm. 44a/2st. Sola et al., 1997. S. quinqueradiata. 48. 50. 2sm. 44a/2st4 6. Ida et al., 1978. Seriola nigrofasciata. 48. 48. -. 48. Tripathy & Das, 1988. Trachinotus carolinus 48. 56. 8m/sm. 40. Rodrigues et al., 2007. T. falcatus. 48. 58. 10m/sm. 38. Rodrigues et al., 2007. T. goodei. 48. 52. 4m/sm. 44a. Rodrigues et al., 2007. Trachurus japonicus. 48. 66. 18. 30. Murofushi & Yosida, 1979. T. mediterraneus. 48. 58. 10. 38. Vasil'ev, 1980. T. mediterraneus. 48. 70. 4m/4sm. 26a/14st. Caputo et al., 1996. T. trachurus. 48. 50. 2m. 46a. Caputo et al., 1996. Selar malam. 48. 50. 2sm. 46. Choudhury et al. (1993). Selar kalla. 56. 56. -. -. Choudhury et al. (1993). Patro & Prasad, 1979. Rodrigues et al., 2007. a – acrocêntrico; st – subtelocênrico; m– metacêntrico; sm – submetacêntrico, NF=Número Fundamental. 6.

(20) 2- OBJETIVOS 2.1- Objetivo Geral O presente trabalho objetivou estabelecer os padrões cromossômicos das espécies Atlânticas de importância comercial que compõe a família Carangidae, através de técnicas citogenéticas convencionais e hibridação in situ, que subsidiarão uma melhor compreensão da taxonomia do grupo, da distribuição espacial da variabilidade genética, dos aspectos evolutivos dos cromossomos da família, conservação da biodiversidade, manejo adequado dos recursos naturais e determinação de marcadores citotaxonômicos visando seu uso futuro no estabelecimento de plantéis reprodutores para cultivo. 2.2- Objetivos Específicos 1. Determinação da macroestrutura cariotípica das espécies que compõe a família Carangidae, no litoral brasileiro, definindo suas tendências evolutivas e mecanismos de mudança; 2. Estabelecimento dos padrões cromossômicos estruturais das espécies de Carangidae pelo uso de bandamentos cromossômicos para identificação das regiões organizadoras de nucléolos e da heterocromatina constitutiva e pelo emprego de fluorocromos base-específicos (DAPI / CMA3); 3. Mapeamento cromossômico dos genes ribossomais 18S e 5S por meio de hibridação in situ com sondas fluorescentes (FISH); 4. Caracterização dos padrões cromatínicos de Carangidae, revelados através do emprego de endonucleases de restrição e bandas de replicação pela incorporação in vivo e in vitro do análogo de base BrdU; 5. Diagnóstico citogenético das espécies de Carangidae propiciando sua utilização na manejo da pesca e consolidação da piscicultura marinha de espécies com potencial para cultivo.. 7.

(21) 3- MATERIAL E MÉTODOS 3.1-Material O material analisado foi coletado em diversos pontos ao longo da costa do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil, assim como no Arquipélago de São Pedro e São Paulo (00°55.1'N 029º20.7'W) e Atol das Rocas (3°51´36“ S, 33°49´5“ W) sobretudo em regiões reconhecidamente prioritárias em função da biodiversidade existente, variedade de habitats e exploração pesqueira. As coletas foram realizadas usando diferentes apetrechos de pesca, direcionados para o ambiente a ser estudado e/ou particularidades de cada grupo taxonômico a fim de obter maior variedade de espécies. Os espécimes coletados foram acondicionados em sacos plásticos com adição de oxigênio puro, até a sua chegada e acomodação em tanques, nas dependências do laboratório de Genética de Recursos Marinhos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para posterior desenvolvimento das práticas citogenéticas. Todos os espécimes utilizados foram fixados em formol por 5 dias e transferidos para álcool etílico 85% para futura identificação, armazenamento e depósito de exemplares testemunhos em coleções ictiológicas e museus na Universidade Federal do Rio Grande do Norte e em outras instituições de pesquisa qualificadas. Identificações das espécies foram obtidas através de consulta a um taxonomista de grupos marinhos. 3.2- Métodos 3.2.1-Preparações cromossômicas Após estimulação da divisão celular por meio da inoculação de agentes mitogênicos nos indivíduos por 24-48 horas (Molina, 2001), os animais foram sacrificados para retirada dos tecidos adequados às análises citogenéticas. Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim anterior, segundo a técnica direta de air-drying (Bertollo et al., 1978). Alternativamente, procedimentos in vitro, utilizando meio de cultura RPMI contendo fragmentos de tecido renal (Gold et al., 1996). A partir da suspensão celular obtida pelos procedimentos acima descritos, foi realizada a caracterização cariotípica dos espécimes com uso de coloração convencional. Após preparação de lâminas coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8), foram selecionadas as melhores metáfases para definição do número diplóide e confecção do cariótipo dos animais analisados. Os cromossomos foram classificados morfologicamente de acordo com Levan et al. (1964) e organizados no cariótipo em ordem decrescente de tamanho.. 8.

(22) 3.2.2-Identificação de padrões heterocromáticos (bandamento C) A heterocromatina constitutiva foi evidenciada pelo bandamento C (Sumner, 1972), com algumas adaptações de acordo com o material em estudo. As lâminas foram tratadas com uma solução de HCl 0,2 N, à temperatura ambiente, durante 13 minutos e, a seguir, submergidas numa solução de hidróxido de bário 5%, à temperatura ambiente, por 1 minuto. Logo após, as lâminas foram lavadas em solução de HCl 0,2N e incubadas numa solução salina 2xSSC, aquecida a 60°C, por 30 minutos. Os cromossomos foram corados com uma solução do Giemsa 5%, em tampão fosfato pH 6,8 durante 8 minutos. Após cada um dos passos acima, as lâminas forma lavadas com água destilada e secas ao ar. 3.2.3-Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RONs) Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) ativas, será utilizado o procedimento descrito por Howell & Black (1980), empregando nitrato de prata (AgNO3). As lâminas foram tratadas com uma mistura contendo 2 partes de uma solução aquosa de gelatina 2% (acrescida de ácido fórmico 1% na proporção de 1ml para cada 100ml de solução) e 4 partes de uma solução de nitrato de prata 50%. O material foi recoberto com lamínula e incubado em estufa a 60° C, por aproximadamente 5 minutos. A lamínula foi então retirada com um jato de água destilada e os cromossomos corados com Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8) por cerca de 30 segundos. Após esse período, as lâminas foram lavadas em água corrente e secas ao ar. 3.2.4-Coloração com Fluorocromos GC- e AT-específicos (CMA3 e DAPI) A dupla coloração por fluorocromos base-específicos (CMA3 e DAPI) seguiu a metodologia descrita por Barros-e-Silva & Guerra (2009). Preparações cromossômicas foram submetidas, a seguir, em formamida 70%/2xSSC a 70ºC por 2 minutos. Posteriormente, as lâminas foram banhadas por duas vezes em 2xSSC à temperatura ambiente por 2 minutos em cada banho. As lâminas foram então transferidas para uma bateria de álcool 70%, 85% e 100%, por 2 minutos em cada banho. Após secagem, foram adicionados 80µl de cromomicina A3 em cada lâmina, permanecendo 30 minutos em câmara escura na geladeira. Após este período, as lâminas foram banhadas em três vezes em PBS 1x, dois minutos em cada banho e imediatamente montadas com 80 µl de solução de DAPI/Antifading (0,2 µg/ml).. 9.

(23) 3.2.5-Hibridação fluorescente in situ (FISH) – Sondas 18S e 5S A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. As sondas foram marcadas por nick translation (BioNick Labeling System – Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A solução de hibridação consistiriu de 200 µl de formamida 50%, 80 µl de sulfato dextrano 50%, 40 µl de 20xSSC, 80 µl de água q.s.p., perfazendo um volume total de 400 µl, sendo adicionado 1,5 µg de sonda (DNA marcado com biotina). Em seguida, a solução de hibridação foi transferida para um banho fervente, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram lavadas com tampão PBS 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e posteriormente desidratadas em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foram colocadas em RNAse (100 µg/ml) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37° C. Após este período as lâminas foram lavadas em soluções salinas. O material foi desidratado em uma série alcoólica, 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2xSSC a 70° C, por 5 minutos, para desnaturação dos cromossomos. Uma nova desidratação em série alcoólica foi feita. Foram aplicados sobre a lâmina, 50 µl da solução de hibridação contendo a sonda desnaturada, permanecendo overnight a 37o C em câmara úmida. Transcorrido esse tempo, as lâmina foram lavadas em solução de formamida 50%/2xSSC a 42o C por 10 minutos, três vezes em 0,1xSSC a 60°C, 5 minutos em cada lavagem, e em solução Tween 20 (0,05%/2xSSC), sob agitação, por 5 minutos. Foi feito um tratamento com 90 µl de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4xSSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. A detecção da sonda foi feita, colocando-se sobre as lâminas, 70 µl de FITC (fluoresceína isotil cianato-avidina conjugada) a 0,25 µg/µl, por 30 minutos, em câmara úmida, com três lavagens sucessivas com Tween 20, durante 5 minutos em cada lavagem. O sinal de hibridação foi amplificado com cerca de 70 µl de antiavidina biotina-conjugada, por 30 minutos, com três lavagens adicionais com Tween 20, durante 5 minutos em cada lavagem. Este ciclo e o tratamento com FITC serão repetidos mais uma vez. Finalmente, a lâmina será desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%), durante 5 minutos em cada banho. Os sinais de hibridação serão detectados com avidina-FITC e os cromossomos contra-corados com iodeto de propídio (50 µg/ml) ou DAPI (0,2 µg/ml).. 10.

(24) 3.2.6-Microfotografias e captura de imagens As preparações cromossômicas convencionais foram analisadas e fotografadas em microscópio óptico. As preparações de FISH e de fluorocromos base-específicos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX50, equipado com sistema digital de captura de imagens.. 11.

(25) 3.3-Analises Morfométricas Para as analises morfométricas, fotografias sob escala foram obtidas do lado esquerdo de cada exemplar com uma câmera digital Sony H10 (8,1 megapixels) acoplada a um tripé. Todos os exemplares tiveram o sexo definido por exame macroscópico das gônadas. Utilizou-se e software TPSDig2 utilizado para localizar os landmarks e as coordenadas X e Y que foram sobrepostas através do software CoordGen, utilizando análises Procruster (Rohlf & Slice, 1990). Análises de componentes principais e variáveis canônicas também foram utilizadas para discernir diferenças na morfologia dentro e entre os grupos de estudo (populações, espécies, regiões de coleta), considerando-se análise de significância de MANOVA quando forem analisados mais de um grupo. Ambos os testes foram realizados com o software PCAGen e CVAGen respectivamente. A partir da média de distribuição das espécies no gráfico de variáveis canônicas, foram realizadas matrizes de deformações, para comparação de diferenças morfológicas (Rohlf & Slice, 1990). Todas as análises foram realizadas no software MorphoJ 1.02 (Klingenberg, 2008).. 12.

(26) 4- Referências Accioly, I.V., Bertollo, L.A.C., Costa G.W.W.F., Jacobina, U.P & Molina, W.F. 2012. Chromosomal population structuring in Carangids (Perciformes) between northeastern and southeastern of Brazil coast. African Journal of Marine Science. In press.. Accioly, I.V & Molina, W.F. 2008. Cytogenetic studies in Brazilian marine Sciaenidae and Sparidae fishes (Perciformes). Genetics and Molecular Research 7, 358-370. Affonso, P.R.A.M. 2000. Caracterização citogenética de peixes de recifes de corais da família Pomacanthidae (Perciformes). Master thesis. Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, Brazil, pp 143. Arai, K. 2001. Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan. Aquaculture 197, 205-228. Araújo, W. C., Martínez, P. A & Molina, W. F. 2010. Mapping of ribosomal DNA by FISH, EcoRI digestion and replication bands in the cardinalfish Apogon americanus (Perciformes). Cytologia 75, 109–117. Barros-e-Silva, A.E & Guerra M. 2010. The meaning of DAPI bands observed after Cbanding and FISH procedures. Biotechnic Histochemistry 85, 115-125. Beardmore, J. A., Mair, G.C & Lewis, R.I. 2001. Monosex male production in finfish as exampled by tilapia: applications, problems, and prospects. Aquaculture 197, 283-301. Bertollo, L.A.C. Estudos Citogenéticos no gênero Hoplias Gill, 1903 (Pisces, Erythrinidae). Tese (Doutorado na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto). Universidade de São Paulo, SP, 1978. Brum, M. J. I. 1996. Cytogenetic studies of Brazilian marine fish. Brazilian Journal of Genetics 19, 421-427. Camargo, S. G. O & Pouey, J.L.O.F. 2005. Aquicultura - um mercado em expansão. Revista Brasileira de Agrociência, Pelotas 11, 393-396. Caputo, V., Marchegiani, F & Olmo, E. 1996. Karyotype differentiation between two species of carangid fishes, genus Trachurus (Perciformes, Carangidae). Marine Biology 127, 193199. Carvalho Filho A. Peixes: Costa brasileira. 3.ed. São Paulo: Editora Melro, 1999. 320p. Castagnolli, N. Aqüicultura para o ano 2000. Brasília: 1996. 95 p. Chai, X., Lu, L.R & Clarke, S. 2009. Karyotype analysis of the yellowtail kingfish Seriola lalandi lalandi (Perciformes: Carangidae) from South Australia. Aquaculture Research 40, 1735-1741. Cioffi M. B., Martins, C., Centofante, L., Jacobina, U & Bertollo, L. A. C. 2009. Chromosomal variability among allopatric populations of erythrinidae fish Hoplias malabaricus: mapping of three classes of repetitive DNAs. Cytogenetic and Genome Research 125, 132–141.. 13.

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(31) Capitulo 1. PROTOCOLOS CITOGENÉTICOS E PERSPECTIVAS BIOTECNOLÓGICAS VOLTADAS À PISCICULTURA MARINHA. Molina, W.F & Jacobina, U.P.

(32) PROTOCOLOS CITOGENÉTICOS E PERSPECTIVAS BIOTECNOLÓGICAS VOLTADAS À PISCICULTURA MARINHA-UMA REVISÃO. Wagner Franco Molina & Uedson Pereira Jacobina. Introdução O conhecimento dos aspectos da biodiversidade nos ecossistemas marinhos é sensivelmente menor em relação ao ambiente terrestre. Apenas 10% da investigação sobre a biodiversidade global têm sido dedicado a estes ecossistemas (Hendriks et al., 2006). Isto é particularmente preocupante em face às mudanças globais decorrentes da sobreexploração de recursos naturais e as alterações climáticas. Estas alterações vêm causando efeitos impactantes em vários ecossistemas importantes ao ambiente marinho, incluindo regiões estuarinas e de recifes de corais (Pauly et al., 2002; Hughes et al., 2003) gerando efeitos variados sobre as populações de peixes (Hendriks, et al., 2006). Atrelado a questões ambientais a redução dos estoques pesqueiros naturais está intrinsecamente e perigosamente relacionada à segurança alimentar e ao bem estar social mundial (Camargo & Pouey, 2005; Jiang, 2010). Neste aspecto, a produção pesqueira alcançou seu potencial máximo de extração, sendo incapaz de atender a demanda mundial de forma sustentável. Um terço das reservas mundiais de peixes está esgotado ou em fase de recuperação e necessitam de ser reconstituídas (FAO, 2006). Estima-se caso o ritmo de exploração da pesca extrativa marinha se mantenha, que haja um colapso global das atividades de pesca comercial até 2048 (Geraque, 2006). Os setores da pesca e aquacultura representam meio de subsistência para 540 milhões de pessoas. Além disto, dependência deste insumo é constatada pelo consumo histórico alcançado em 2010, contabilizando em média de 17 quilos de pescado por pessoa, ou 15% da dieta média de proteínas de origem animal para três bilhões de pessoas (FAO, 2010). Assim, é senso comum que a aquacultura representa a única alternativa futura viável à manutenção do consumo de proteína animal de origem aquática.. 1.

(33) Atualmente, a produção da piscicultura marinha está concentrada principalmente no salmão do Atlântico (Salmo salar) a espécie cuja produção teve a maior expansão nos últimos anos. Outras espécies que também tiveram aumento significativo de produção foram o robalo europeu (Dicentrarchus labrax) e o pargo (Sparus aurata) (Alarcon & Alvares, 1999; Zanuy, 2001). Um passo importante para o sucesso desta atividade recai na exata compreensão, pelo setor produtivo, das diferenças e perspectivas genéticas que envolvem as populações naturais e estoques cativos de reprodutores. Populações naturais normalmente representam um repositório de ampla base genética da espécie, modelado sob ação da seleção natural, sua manutenção é fonte permanente de germoplasma a ser utilizado para fins de melhoramento genético. Estoques cativos de reprodutores, por outro lado, constituem quase sempre uma amostra genética limitada nem sempre representativo do pool gênico das populações ou espécies e completamente dependente do manejo e dos cruzamentos envolvidos para a sua perpetuação. Desde meados da década de 80, abordagens genéticas passaram a contribuir nos programas de criação de peixes com o emprego de técnicas clássicas e modernas, levando a um crescimento vertiginoso entre outras abordagens, da investigação e aplicações das informações cromossômicas (Hussain, 1996; Arai, 1997a,b; Pandian & Koteeswaran, 1998; Jacobina et al., 2011). De fato, os conhecimentos sobre o cromossomo e marcadores de DNA estão cada vez mais incorporados à aquicultura de forma prática eficiente. Neste sentido, o desenvolvimento de tecnologias de manipulação cromossômica, identificação de sexo cromossômico, criopreservação de gametas, transgênicos e o mapeamento genético, abordagens apoiadas no melhor conhecimento dos cromossomos das espécies e relacionadas ao melhoramento genético de peixes cultivados, têm sido foco de discussões e revisões durante a última década (Hulata, 2001). A piscicultura marinha vem se desenvolvendo de forma crescente em escala global,. contudo. em. geral. enfrenta. algumas. limitações. ao. seu. pleno. desenvolvimento, fatores como baixo conhecimento sobre a biodiversidade de algumas regiões, conhecimento limitado sobre o ciclo de vida de espécies, questões sociais e ambientais e reduzido conhecimento sobre aspectos genéticos das. 2.

(34) espécies podem se colocar como empecilhos ao seu pleno desenvolvimento (Hutchings, 2001; Dulvy et al., 2003). Diante da importância da aplicação das informações e protocolos genéticos na aquicultura marinha, aqui é apresentada uma breve revisão sobre os principais empregos e perspectivas do estudo dos cromossomos relacionados à piscicultura marinha. Identificação da biodiversidade de espécies e estoques A citogenética representa o ramo da genética relativo ao estudo dos cromossomos quanto a seus aspectos morfológicos e funcionais, sua variação e evolução. Nas últimas décadas, a citogenética vem se destacando por uma abordagem eficiente na caracterização de grupos naturais, utilizando dados cariotípicos para identificação de espécies (citotaxonomia) e na elaboração de padrões de relacionamento e ou filogenias (citossistemática). A grande maioria das espécies é cariotipicamente única, diferindo de outras em relação ao número e a morfologia cromossômica e/ou em relação a características estruturais dos seus cromossomos (Dias & Giuliano-Caetano, 2002). Cerca de 3.425 espécies e sub-espécies já têm algum nível de informação cromossômica conhecida (Arai, 2011). Estes dados têm se mostrado uma ferramenta auxiliar na taxonomia, uma vez que os métodos tradicionais de classificação de espécies com a utilização de análises de caracteres morfológicos estão sujeitos a uma maior variação geográfica ou ambiental (Bertollo et al., 1978). Caracteres cromossômicos vêm sendo progressivamente utilizados com sucesso na identificação de espécies crípticas (Bertollo et al., 1978; Moreira-Filho et al., 1991), assim como nas relações entre espécies (Brum & Galetti, 1997). No que diz respeito aos estudos em peixes, ela têm fornecido importantes subsídios para o melhor entendimento das relações evolutivas entre espécies e populações. A identificação da biodiversidade é uma etapa fundamental para medidas de conservação dos recursos pesqueiros ameaçados além de contribuir para seu uso sustentável e manejo. Características cromossômicas têm sido relacionadas entre os mais poderosos marcadores genéticos na identificação taxonômica de unidades evolutivas significativas (Moritz et al., 1996).. 3.

(35) Estudos citogenéticos na região Neotropical têm mostrado algumas unidades taxonomicas evolutivas como no caso da espécie nominal Hoplias malabaricus que possui sete citótipos em diverge quanto ao número diploide de 2n=39 a 42 cromossmos, com ocorrêcia de sistema de cromossomos sexuais simples ou múltiplo, assim como, ausência destes (Bertollo, et al., 2000). Alguns citótipos mostram ampla distribuição geográfica, enquanto outros parecem ser endêmicos a determinadas bacias hidrográficas. Situações de simpatria e sintopia entre citótipos, sem a detecção de espécimes com fórmulas cromossômicas híbridas, já foram constatadas em várias localidades, o que reforça a diferenciação existente nesse grupo, sugerindo a inexistência de fluxo gênico entre os citótipos (Ferreira et al., 1989; Scavone et al., 1994; Lemos et al., 2002; Pazza & Júlio Jr., 2003; Born & Bertollo, 2006). Diferenças quanto ao número diplóide também foram detectadas em Synbranchus marmoratus em que o número diplóide varia de 2n=42 a 2n=46, assim como a presença de tipos diferenciais de hemoglobina tipo I (2n=44 a 46) e tipo II (2n=42) (Nakamoto et al., 1986; Torres, 2000). Uma alta variabilidade na fórmula cariotípica tem sido identificada na espécie Astyanax scabripinnis, que também mostra marcada diferenciação relacionada à quantidade e variabilidade de blocos heterocromáticos e sítios Ag-RONs (Moreira-Filho & Bertollo, 1991; Mizoguchi et al., 1998; Mantovani et al., 2000). Neste sentido, estudos citogenéticos se mostram úteis a diferentes propósitos na caracterização de populações e espécies, seja na identificação de polimorfismos (Mantovani et al., 2000; Porto-Foresti, 2007; Molina & Galetti, 2008), diferenças populacionais sutis (Cioffi et al., 2009), na detecção de espécies crípticas (Moreira-Filho et al., 1991; Aguilar & Galetti, 2008; Vicari et al., 2008). De forma aplicada, estes dados possibilitam o monitoramento e manejo adequado, visando à conservação e a exploração racional dos estoques pesqueiros. As informações cariotípicas ainda são incipientes em espécies de peixes marinhos, que representam uma das grandes fronteiras a serem ultrapassadas para expansão da piscicultura comercial em alguns países. Grande parte dos estudos disponíveis tem focado na determinação dos aspectos da macroestrutura cariotípica de variados grupos, entre eles alguns de grande importância para a aquicultura (e.g. Jacobina et al., 2011). Desta forma, têm sido identificados marcadores citotaxonômicos, sistemas de cromossomos sexuais, cromossomos Bs 4.

(36) (supranumerários) e os mecanismos evolutivos envolvidos na sua diferenciação (Brum, 199; Molina, 2007; Martinez et al., 2009, entre outros). Técnicas clássicas de caracterização cromossômica (coloração convencional, Ag-RONs, bandamento C) vem sendo empregadas na maior parte dos estudos citogenéticos em vertebrados, assim como em peixes. Estes conhecimentos, embora apresentem limitações, tem disponibilizado um conhecimento aplicável a vários fins biotecnológicos, destacando-se a manipulação cromossômica e a obtenção de linhagens poliplóides, ginogenéticas, androgenéticas e detecção de híbridos interespecíficos (Komen & Thogard, 2007; Piferrer et al., 2011). Devido à possibilidade de variação mesmo entre espécies próximas, as regiões. organizadoras. nucleolares. (RONs). estão. entre. os. marcadores. citotaxonômicos mais empregados. As RONs são regiões do DNA responsáveis pela transcrição do RNA ribossômico, frequentemente exibem padrões particulares aos diferentes grupos de peixes, podendo variar no número, localização, intensidade de coloração e tamanho, com diferenças inter-individuais dentro de uma mesma espécie ou mesmo em mosaico, entre células de um mesmo indivíduo (Morelli, 1998). Variações numéricas inter ou intra-individuais no tamanho, localização e no número já foram descritas em vários gêneros. Em alguns grupos, a presença destes sítios em apenas um par de cromossomos é a condição mais frequente. Este padrão já foi observado tanto em famílias dulcícolas como Prochilodontidae (Pauls & Bertollo, 1990), Anostomidae (Galetti et al., 1984), Parodontidae (Moreira-Filho et al., 1985), assim como em espécies marinhas das famílias Carangidae (Caputo, 1996), Mugilidae (Sola, 2007), Lutjanidae (Rocha & Molina, 2008), Apogonidae (Araújo et al., 2009), entre outras. Em outros peixes ocorrem NORs múltiplas ou simples, como Astyanax (Morelli, 1981; Moreira-Filho, 1989; Paganelli, 1990), Hoplias (Born & Bertollo 2000; Vicari et al., 2003), ou preferencialmente múltiplas como em Salmo (Martínez et al., 2009). Um padrão muitas vezes distintivo entre os cariótipos dos peixes reside na distribuição e qualificação da heterocromatina. Regiões heterocromáticas compreendem DNA repetitivo, identificados preliminarmente pelo bandamento C ou por fluorocromos base-específicos. Os cariótipos de muitas espécies de Perciformes tem mostrado uma distribuição da heterocromatina principalmente nas regiões centroméricas e terminal (Molina, 2007). Contudo, outros grupos 5.

(37) filogenéticos como Characiformes, podem apresentar grandes segmentos heterocromáticos em posição intersticial como em Astyanax (Mantovani et al., 2000). Fluorocromos base-específicos vêm sendo empregadas acessoriamente para qualificar as regiões cromossômicas heterocromáticas em peixes. Em peixes, as RONs com poucas exceções, apresentam-se como regiões de intensa fluorescência quando submetidos à fluorocromos GC-específicos (Schweizer, 1980). Por outro lado, o DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole) forma complexos fluorescentes com o DNA, mostrando especificidade por regiões ricas em bases AT. Segmentos heterocromáticos ricos em bases AT são menos frequentes em peixes podendo, contudo, serem encontrados em algumas espécies (Amemiya & Gold, 1986). Estes e outros métodos vêm permitindo a identificação da estrutura, organização molecular, o mapeamento de genes específicos, até o comportamento dos cromossomos nas diferentes fases do ciclo celular. Mapeamento cromossômico - Hibridação in situ Detecção de seqüências repetitivas e teloméricas Os DNAs satélites representam uma importante porção do genoma eucarioto composta por diferentes classes de DNA repetitivos, não codificadora e organizada em tandem, com unidades de cerca de 100-300 pares de bases (Sumner, 1990; Epplen & Epplen-Haupt, 2002), que podem estar dispersas no genoma, ou organizadas em matrizes em tandem (Charlesworth et al., 1994; Koehler et al., 1997). Unidades de DNAs satélites podem estar presentes de centenas a milhares de cópias em um genoma. Diferentes famílias de DNA satélite têm sido isoladas, caracterizadas e localizadas em cromossomos de diversas espécies, evidenciando uma grande correlação com regiões de heterocromatina constitutiva (John, 1988; Lohe et al., 1993; Lohe & Hilliker, 1995). Unidades monoméricas repetidas são comumente detectadas nas regiões centroméricas e teloméricas de alguns ou de vários cromossomos de um determinado organismo, associadas a blocos de heterocromatina constitutiva (Tyler-Smith & Willard, 1993). Além da quantidade e da localização de sequências específicas de DNA satélite variarem grandemente entre espécies distintas, estas muitas vezes mostram-se espécie-específicas, o que 6.