Validação Analítica Quantitativa: Comparação entre os parâmetros de desempenho da ANVISA e do INMETRO

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Texto

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VIGILÂNCIA SANITÁRIA

Validação Analítica Quantitativa: Comparação entre os parâmetros de

desempenho da ANVISA e do INMETRO

Luiz Geraldo Araújo Neto¹ Kleber Vânio Gomes Barros² ¹ Farmacêutico. Aluno da Pós-Graduação em Vigilância Sanitária, pela Universidade Católica de Goiás/IFAR. ² Orientador: Farmacêutico pela Universidade Federal da Paraíba e Mestre em Engenharia Química pela Unicamp-SP; klebervanio_gomesbarros@yahoo.com.br.

Resumo

A Gestão de Qualidade busca garantir a qualidade do produto e do serviço. No caso dos laboratórios, os principais sistemas de gerenciamento são a ISO/IEC 17025:2005 e a BPL (Boas Práticas de Laboratório). Uma parte fundamental da gestão de qualidade em laboratórios é o processo de validação que garante que determinado método seja cientificamente coerente sob as condições que ele é aplicado. Este processo é base para o procedimento chamado de acreditação, que é feito por diversos organismos de acreditação, entre eles, a ANVISA e o INMETRO. O objetivo desse trabalho é analisar, por meio de uma revisão bibliográfica, o processo de validação analítica quantitativa, evidenciando os parâmetros de desempenho fundamentais de acordo com os dois principais órgãos credenciadores do Brasil: ANVISA e INMETRO. Os principais parâmetros utilizados são: faixa de trabalho, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, precisão, robustez, seletividade e sensibilidade.

Palavras-Chaves: Validação, Parâmetros de Desempenho, Gestão de Qualidade em Laboratórios.

Quantitative Analytical Validation: Comparison between the performance

parameters of the ANVISA and INMETRO

Abstract

The Quality Management attempts to guarantee the quality of product and service. In the case of laboratories, the main management systems are ISO / IEC 17025:2005 and GLP (Good Laboratory Practice). A key part of quality management in laboratories is the validation process that ensures the scientific method is consistent under the conditions that it is applied. This process is the basis for the accreditation procedure that is done by various accreditation organisms, including the ANVISA and INMETRO. The aim of this paper is to analyze, through a literature review, quantitative analytical validation process highlighting the key performance parameters, according as the two main acquirers of Brazil: ANVISA and INMETRO. The main parameters used are: working range, accuracy, detection limit, quantification limit, linearity, accuracy, robustness, selectivity and sensitivity.

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1. INTRODUÇÃO

A Gestão de Qualidade é um sistema de gerenciamento que atua em todos os níveis de um empreendimento, buscando a garantia da qualidade do produto e do serviço. Para laboratórios, em decorrência das particularidades de seu ramo de trabalho e importância, foram criados sistemas de gestão, como a ISO/IEC 17025:2005 e as Boas Práticas de Laboratório (BPL) (OLIVARES, 2009).

A norma ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005 dispõe de requisitos necessários para que laboratórios de ensaio e calibração possam demonstrar a competência técnica, a capacidade de produção de resultados tecnicamente confiáveis e a presença de um sistema de gestão efetivo. Ela foi elaborada pelo Comitê Brasileiro de Qualidade (ABNT/CB-25), pela Comissão de Estudos de Avaliação de Conformidade (CE-25:000.04) e foi a Consulta Nacional de acordo com o edital nº 8, de 31/08/2005. A publicação desta norma cancela e substitui a edição anterior (ABNT NBR ISO/IEC 17025:2001) (VALLE; BICHO, 2001; ABNT, 2005). A norma é dividida em 6 partes: Objetivo, Referência Normativa, Termos e Definições, Requisitos de Direção, Requisitos Técnicos e os Anexos Normativos (ABNT, 2005).

Os principais objetivos desta norma é fixar um padrão internacional para demonstrar as competências dos laboratórios em realizar os ensaios e facilitar a aplicação dos requisitos de forma a evitar ambiguidade e ideias conflitantes na hora da interpretação (VALLE; BICHO, 2001).

A ABNT NBR ISO/IEC 17025 apresenta uma abrangência tanto na área técnica quanto na área administrativa, sendo assim muito flexível para atender a qualquer área do laboratório, com intuito de demonstrar a competência técnica para gerar resultados válidos. Os quesitos específicos à ABNT NBR ISO/IEC 17025 contemplam o processamento de denúncia, o cálculo da incerteza, rastreabilidade e a participação na comparação interlaboratorial como o ensaio de proficiência (ENGELHARD et al., 2003; FOX, 2003).

A BPL é uma norma criada pela OECD (Organization for Economic Co-operation and

Development) que compreende um sistema de qualidade que compreende tanto o processo

organizacional quanto as condições nas quais os estudos são planejados, desenvolvidos, monitorados, registrados, arquivados e relatados. Ela tem como objetivo testar substâncias para determinar suas propriedades e com isso obter um perfil de segurança com relação à saúde humana e ao meio ambiente. A partir da determinação deste perfil pode-se obter o registro ou licença para produtos farmacêuticos, agrotóxicos, cosméticos, veterinários,

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aditivos de alimentos e rações e produtos químicos industriais (OECD, 1997; INMETRO, 2009a). Ela é composta por 10 partes: Organização e Pessoal da Instalação Teste; Programa de Garantia de Qualidade; Instalações; Equipamentos, Materiais e Reagentes; Sistema de Teste; Substância Teste e Substância Referência; Procedimentos Operacionais Padrão; Execução de Estudo; Relatando os Resultados de Estudos; Armazenamento e Retenção de Registro e Materiais (INMETRO, 2009A).

A BPL não foi feita para as operações gerais do laboratório e sim especificamente para o estudo feito por ele. Ela é uma garantia de qualidade, integralidade e segurança dos dados apresentados pelo estudo. Alguns pontos que são exclusivos para a BPL: cuidados com os animais, o monitoramento das instalações e dos estudos, a obrigatoriedade de um plano de estudos para todos os estudos a serem realizados (ENGELHARD et al., 2003; FOX, 2003).

Há princípios que são comuns tanto para a ISO/IEC 17025:2005 e a BPL, principalmente no que diz respeitos à gestão e organização. Ambas definem responsabilidades, necessidade de procedimentos padrões para calibração e manutenção de equipamentos, além de apontar a necessidade de treinamento do pessoal e o uso de testes de validação de métodos e relatórios de teste e estudo. Não é possível comparar e dizer qual é a melhor, pois cada uma apresenta características próprias. Além disso, não se pode afirmar que um sistema engloba o outro e sim um complementa o outro (ENGELHARD et al., 2003).

O processo de validação mostra-se como elemento integral da gestão de qualidade em laboratórios, da garantia de qualidade e da acreditação. O termo validação é definido como a confirmação por meio de estudos sistemáticos que garante que o método seja cientificamente coerente sob as condições que ele é aplicado. Esta confirmação se dá pelo fornecimento de provas objetivas que demonstram o cumprimento de critérios que levam a aceitação e assim provar a aplicabilidade do método para um determinado fim (BRASIL, 2003; ANVISA, 2004; PETERS et al., 2007; STÖCKL et al., 2009; INMETRO, 2009B).

A validação demonstra objetivamente a qualidade inerente de um método analítico, pois inclui os possíveis fatores que influenciam o resultado final e possibilita o julgamento quanto à consistência e qualidade dos resultados analíticos (PETERS et al., 2007; TAVANIERS et al., 2004; HUBER, 2007).

O termo verificação é visto muitas vezes como sinônimo de validação. Porém há diferença entre eles. A verificação é o fornecimento de evidências que mostram a adequação de um dado item a um requisito específico. Enquanto que um processo de validação é verificar se os requisitos específicos são adequados para o uso pretendido (HUBER, 2007; INMETRO, 2009B).

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Há dois subtipos de validação:

Validação de metodologia quantitativa: determina a quantidade de analito tanto de forma direta (gravimetria, volumetria, entre outras) quanto indireta (método cromatográfico, espectroscopia, entre outras) em uma determinada quantidade de amostra. Este tipo de ensaio pode determinar tanto analitos de maior teor quanto de menor teor (traços) (FELDSINE et al.,2002; INMETRO, 2010B); Validação de metodologia qualitativa: pauta-se na presença ou na ausência do

analito de interesse na amostra analisada. Referenciado em guias como teste de identificação, também é objeto do processo de validação (ICH, 1995; FELDSINE et al., 2002; BRASIL, 2003).

A acreditação seria uma forma reconhecimento formal por um organismo de acreditação em que se atesta que o estabelecimento é competente para realizar suas atividades com confiança. Este reconhecimento deve transmitir confiança para o comprador e para a autoridade regulamentadora, além de facilitar o comércio através das fronteiras (INMETRO, 2011).

O INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial), autarquia executiva do Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior (MDIC), com sede em Brasília (DF), criado pela Lei Nº 5.966, de 11 de dezembro de 1973, é o órgão executivo central do Sistema Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (Sinmetro). Uma das principais atividades do INMETRO é a de acreditar laboratórios que voluntariamente optem pela decisão (INMETRO, 2012).

Na organização interna do INMETRO, a Coordenação Geral de Acreditação do Inmetro (CGCRE/INMETRO), criada pelo decreto nº 6.275 de 28 de novembro de 2007, é a unidade responsável por todos os aspectos referentes à acreditação, incluindo as decisões de acreditação, atuando assim como organismo de acreditação e avaliação de conformidade. Dentro da CGCRE/INMETRO, a DICLA (Divisão de Acreditação de Laboratórios) é a responsável pela coordenação, gerenciamento e execução das atividades relacionadas ao monitoramento e reconhecimento de instalações de teste segundo os princípios da BPL (INMETRO, 2012).

Este organismo concede acreditação com base na ISO/IEC 17025 e BPL. E qualquer laboratório pode participar do processo, sendo ele público ou privado, nacional ou estrangeiro e sendo de qualquer porte ou área de atuação (INMETRO, 2011). O laboratório já acreditado passa automaticamente a fazer parte da RBC (Rede Brasileira de Calibração) para os laboratórios de calibração, e da RBLES (Rede Brasileira de Laboratórios de Ensaios) para os

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laboratórios de ensaio. Ambas as redes apresentam uma relação dos laboratórios credenciados com as respectivas áreas de atuação. Estas listas podem ser consultadas no site do INMETRO (RBC, 2012; RBLES, 2012).

As orientações sobre o processo de acreditação estão dispostas no documento DOQ-CGCRE-001. A acreditação tem varias modalidades que se encaixa para cada perfil de atuação do laboratório. As modalidades são (INMETRO, 2010A):

Laboratórios Clínicos: segue a NIT-DICLA 083 (Critérios Gerais para Competência de Laboratórios Clínicos).

Ensaio de Campo: segue a BPL segundo a NIT-DICLA 034 (existem documentos complementares: NIT-DICLA 036 a 041 e 043 a 045).

Ensaio de Laboratório: segue a BPL segundo a NIT-DICLA 035 (existem documentos complementares: NIT-DICLA 036 a 041 e 043 a 045).

Laboratório de Calibração e Ensaio: segue a NBR ISO/IEC 17025.

Para iniciar o processo de acreditação deve ser enviada uma série de documentos: Formulário de Participação em Atividade de Proficiência, Formulário de Proposta de Escopo, Termo de Compromisso de Acreditação, Manual da Qualidade, Certificados de Calibração dos Equipamentos, entre outros. Estes documentos serão avaliados pela DICLA e encaminhados para um gestor de acreditação que será responsável por todo o processo (INMETRO, 2012).

Finalizada a entrega de todos os documentos, uma equipe de avaliação composta por especialistas escolhidos pela CGCRE é formada. Então a DICLA agenda a vistoria das instalações e se houver alguma não conformidade, o laboratório terá um prazo de 90 dias para saná-la e ter outra reavaliação. Sendo que uma avaliação pode durar de 3 a 5 dias (INMETRO, 2012).

Ao final da avaliação é feita uma reunião de encerramento podendo acarretar em uma acreditação imediata (quando não se detectou conformidades), acreditação após implementação de ações corretivas para as não conformidades vistas, ou não conceder a acreditação. A manutenção da acreditação é feita em 12 meses e as seguintes podem ser feitas em até dois anos (INMETRO, 2012).

Mudanças significativas no laboratório devem ser encaminhadas ao INMETRO, como a mudança da razão social, representação legal, novas instalações no laboratório, novo gerente de qualidade, mudança na estrutura organizacional, entre outras (INMETRO, 2012).

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Outro organismo que realiza o processo de acreditação é a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Ela é uma autarquia sob regime especial vinculada ao Ministério da Saúde. Foi criada pela lei 9782 de 26 de janeiro de 1999 devido a exigências sociais e políticas. A missão da instituição é promover a proteção da saúde da população por meio do controle sanitário tanto da produção quanto da comercialização de produtos e serviços (ANVISA, 2012).

Na ANVISA, o setor que é responsável pelo credenciamento de laboratórios é a Gerência-Geral de Laboratórios de Saúde Pública (GGLAS/ANVISA). Ela verifica a competência técnica para realizar estudos e análises. Esta habilitação demonstra a boa qualidade dos serviços prestados pelas entidades habilitadas (ANVISA, 2012).

Os laboratórios credenciados fazem parte da REBLAS (Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde), que prestam serviços relativos a análises prévias de controle fiscal e de orientação de produtos sujeitos ao regime da vigilância sanitária. Para fazer parte desta rede, além do credenciamento da ANVISA, é aceito, também o feito pelo INMETRO. Estes quesitos demonstram a alta confiabilidade dos resultados analíticos (ANVISA, 2012).

Os critérios usados para a habilitação são estabelecidos pela ISO/IEC 17025, BPL, BPLC (Boas Práticas em Laboratórios Clínicos) e a ISO/Guia 43 (Ensaios de Proficiência por Comparação Interlaboratorial) (INMETRO, 2001; ANVISA, 2012).

O objetivo desse trabalho é elucidar, por meio de uma revisão bibliográfica, como é feito o processo de validação analítica quantitativa analisando seus parâmetros de desempenho de acordo como os dois principais credenciadores do Brasil: ANVISA e INMETRO.

2. METODOLOGIA

A elaboração desse trabalho foi feita a partir de uma revisão bibliográfica pautada em artigos científicos, legislações e guias técnicos produzidos pela ANVISA e INMETRO.

3. DISCUSSÃO

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Durante o processo de validação, um passo bastante importante e imprescindível é a escolha dos parâmetros a serem analisados. A escolha está diretamente ligada ao tipo de ensaio, ou seja, se tem caráter quantitativo ou qualitativo, e, principalmente, aos requisitos pedidos pelo cliente ou mesmo pelo órgão regulador (HUBER, 2007; INMETRO, 2010B).

O método de análise quantitativo pode ser dividido em dois tipos, aquelas análises que determinam elementos que estão em maior teor (1 a 100%), e aquelas análises que determinam os elementos que estão tanto em menor teor (0,01% a 1%) quanto para aqueles que apresentam somente traços (<0,01%). Para cada tipo de análise há um conjunto de parâmetros que são designados para o processo de validação, como visto a seguir. (INMETRO, 2010B).

Ensaio de determinação de elementos de maior teor: Precisão, Seletividade, Exatidão (Tendência), Robustez, Sensibilidade, Linearidade e Faixa de Trabalho.

Ensaio de determinação de elementos menor teor e traços: Precisão, Seletividade, Exatidão (Tendência), Robustez, Sensibilidade, Linearidade, Faixa de Trabalho, Limite de Detecção e Limite de Quantificação.

Os parâmetros de desempenho são atribuições que qualificam o método de ensaio quanto as suas qualidades funcionais (EC, 2002). Com intuito de harmonizar as definições dos parâmetros de desempenho que fazem parte do processo de validação e com isso melhorar seu entendimento, a Tabela 1 compara as definições adotadas tanto pelo INMETRO, dispostas na norma DOQ-CGCRE-008, quanto pela ANVISA, referenciadas na RE nº 899/2003 (BRASIL, 2003; INMETRO, 2009B; INMETRO, 2010B).

Tabela 1- Harmonização entre as definições dos parâmetros de desempenho dispostos no INMETRO e na ANVISA

INMETRO ANVISA

Exatidão (Tendência)

Grau de concordância entre um valor medido e um valor verdadeiro de um analito.

É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro.

Faixa de Trabalho/Intervalo

Faixa de concentrações do analito no qual o método pode ser aplicado.

É a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico.

Limite de Detecção

É a concentração mínima de um analito medido, com 95% ou 99% de confiança, que mostra ser maior que zero.

É a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.

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Limite de Quantificação

Menor concentração do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de precisão e exatidão.

É a menor quantidade do analito que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

Linearidade

É a capacidade de produzir resultados que sejam diretamente proporcionais à concentração de analito, em uma dada faixa de concentração.

É a capacidade de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito, dentro de um intervalo especificado.

Precisão

Grau de concordância entre os valores medidos, obtidos por medições repetidas, no mesmo objeto ou em objetos similares, sob condições especificadas.

É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra

Precisão intermediária

Precisão sob um conjunto de condições específicas, que compreendem o mesmo procedimento de medição, o mesmo local e medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares, ao longo de um período extenso de tempo, mas pode incluir outras condições que envolvam mudanças.

Concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

Repetitividade (Repetibilidade)

Precisão sob um conjunto de condições específicas que compreendem o mesmo procedimento de medição, os mesmos operadores, o mesmo sistema de medição, as mesmas condições de operação e o mesmo local, assim como medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares durante um curto período de tempo.

Concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação

Reprodutibilidade

Precisão sob um conjunto de condições específicas que compreendem diferentes locais, diferentes operadores, diferentes sistemas de medição e medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares.

Concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes.

Robustez

Mede a sensibilidade que o método apresenta em face de pequenas variações

É a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos.

Seletividade

Está relacionado com o evento de detecção, em que um método produz resposta para apenas um analito. Um método seletivo é aquele de distingui a resposta de um analito dos outros.

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.

Sensibilidade

Demonstra a variação da resposta em função da concentração do analito. É expresso pela inclinação da curva analítica,

Mesma definição que Limite de Detecção

3.2 Procedimentos referentes a cada parâmetro de desempenho apresentados pelo INMETRO e ANVISA

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3.2.1 Precisão

Tanto para o INMETRO quanto para a ANVISA, a precisão é expressa por meio do desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (C.V) da serie de medidas. Ela é calculada pela razão entre o desvio padrão (DP) e a concentração média determinada (CMD), como mostrado na fórmula 1 (INMETRO, 2010B; BRASIL, 2003).

(Fórmula 1)

A seguir, na Tabela 2, são colocadas as diferenças de procedimentos para análise dos tipos de precisão de acordo com o INMETRO e ANVISA (BRASIL, 2003; INMETRO, 2010B).

Tabela 2: Procedimentos para análise, seguindo os critérios do INMETRO e da ANVISA, levando em conta cada tipo de precisão.

INMETRO ANVISA

Repetitividade (Repetitibilidade)

Determinada por meio de análises de materiais de referência ou adição de branco nas várias concentrações dentro da faixa de trabalho. Devem-se analisar sete ou mais repetições. Seu cálculo se dá por meio do limite de repetitividade (r), descrito pela fórmula 2, para as diferentes condições que são realizadas o experimento e com isso decidir se a diferença entre as análises duplicadas de uma amostra é significante sob um nível de confiança de 95%.

(Fórmula 2), onde t(n-1, 1-α) é distribuição de Student; S é o desvio padrão amostral associado aos resultados considerados para cada nível de concentração.

A repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do teste.

Precisão Intermediaria

Dependendo do estado a ser aplicado este parâmetro, pode ser determinado por meio de gráfico de controle do desvio padrão, que poderá ser aplicado para replicatas de amostras e para padrões estáveis ao longo do tempo, ou por meio da fórmula 3.

Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.

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(Fór mula 03), onde t é o total de amostras ensaiadas; n é o total de ensaios efetuados por amostra; j é o número da amostra em que j=1, t; k é o número do ensaio da amostra j em que k=1,n; yjk é o valor de k para a amostra j e yj representa a média aritimética dos resultados da amostra j.

Reprodutibilidade

É um parâmetro de validação que não pode ser executado por um único laboratório. O cálculo pode ser feito por meio do limite de reprodutibilidade (R), descrito pela fórmula 04, que possibilita o analista decidir a diferença entre os valores das duplicatas de uma amostra, nas condições específicas deste parâmetro, são significantes.

(Fórmula 4), onde t(n-1, 1-α) é distribuição de Student; Sr é o desvio padrão associado aos resultados de todos os laboratórios que é calculado por Sr = Slab2 + Sr2. Em que Slab é a média das variâncias dos resultados de cada laboratório e Sr é a variância das médias dos laboratórios.

Não dispõe sobre o procedimento

3.2.2 Seletividade

Na literatura há uma confusão entre os termos seletividade e especificidade. De acordo com a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a especificidade seria quando não há interferência ocorrendo demonstrando o máximo de seletividade. Já a seletividade reflete a influência de outras substâncias presentes na matriz durante a determinação analítica (VESSMAN et al., 2001).

Para poder avaliar este parâmetro primeiramente é necessário encontrar os componentes que precisam ser analisados, por meio de uma pesquisa cuidadosa na área de aplicação do método. Além disso, devem-se expor os componentes e a matriz sob condições extremas como calor, radiação UV/visível, luz florescente, entre outros para determinar produtos de degradação (BRUCE et al., 1998).

De acordo com o INMETRO, estão descritos dois tipos de ensaios para verificação da seletividade. O primeiro compara a amostra com o material padrão pelo método a ser validado

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e por outro já validado. Com isso observa-se o quão capaz é o método a ser validado em identificar o analito em presença dos interferentes. O segundo ensaio analisa a amostra com vários interferentes junto ao analito de interesse. Esta estratégia é usada para avaliar o efeito dos interferentes durante o processo de identificação (INMETRO, 2010B).

O tratamento estatístico da seletividade pode ser usado tanto o teste F (Snedecor) que avalia a homogeneidade da variância e o teste t (Student) que faz comparação entre médias. Primeiramente, devem-se dividir as amostras em dois grupos com concentrações de analitos iguais, porém um deve conter a matriz e outro não. O número de amostras deve ser maior ou igual a sete para que possa se adequar ao modelo estatístico. Para o teste F, deve-se comparar o valor F calculado com o tabelado. Quando menor o valor calculado, a matriz não exerce efeito significativo. O mesmo ocorre para o teste t, se o teste t calculado for menor que o t tabelado a matriz não interfere na detecção do método (EURACHEM, 2002).

Já para ANVISA, os ensaios de seletividade são descritos de duas formas, uma delas descritas para os testes de identificação (análise qualitativa) e outra para os de quantificação de analitos, seja de alto teor ou de baixo (análise quantitativa) (BRASIL, 2003).

Análise Qualitativa: O método deve ser capaz de selecionar o analito dentre interferentes com estruturas semelhantes em uma amostra. Sua confirmação se dará pelo resultado positivo em amostras que contém o analito e negativo para as amostras que não conterem o analito de interesse.

Análise Quantitativa: É feito por meio de analises de amostras com quantidades apropriadas de impurezas e de amostras não contaminadas, podendo assim comparar os dois resultados.

Se a seletividade não for assegurada, poderá comprometer a linearidade, exatidão e a precisão do método (BRASIL, 2003; ICH, 1994; INMETRO, 2010B).

3.2.3 Exatidão (Tendência)

Para o INMETRO, a exatidão é avaliada numericamente por meio da tendência. Quanto menor a tendência maior o rigor da análise. Sua determinação pode ser alcançada por meio de três procedimentos (INMETRO, 2010B; EURACHEM, 2002):

Uso de Material de Referência Certificado: Devido a sua importância no processo de validação, em avaliar o desempenho do laboratório, seu fornecimento é feito por organismos reconhecidos e confiáveis como o NIST (National Institute of Standards and Technology) e LGC (LGC Standards). Para avaliar a exatidão, a comparação entre os valores certificados e os

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experimentais é feitos por meio do erro relativo, teste hipótese, índice z e erro normalizado.

Comparação Interlaboratorial: Avalia o desempenho de um método nas condições de normais de trabalho em vários laboratórios por meio de amostras homogêneas. Este ensaio visa estabelecer a comparabilidade de novos métodos com relação aos de referência.

Comparação de Método: Avalia o grau de proximidade dos resultados obtidos pelos diferentes métodos, de forma que um deles é o método de referência e o outro é o que deve ser validado.

Na falta do material de referência, a tendência pode ser investigada por meio do ensaio de recuperação descrita pela fórmula 5 (INMETRO, 2010B).

(Fórmula 5)

Este ensaio consiste em comparar amostras fortificadas com diferentes concentrações de analito (alta, média e baixa) sempre dentro da faixa de trabalho do método. O fator limitante deste método é a forma do analito adicionado na amostra, no qual pode ocasionar uma avaliação otimista da recuperação por consequência do viés (THOMPSON et al., 2002).

No caso da ANVISA, ela dispõe de várias metodologias para determinação da exatidão. Entre elas estão descritas (BRASIL, 2003):

Fármacos: em que se aplica o método analítico para uma substância de pureza conhecida (padrão de referência) e então compara com resultados de um segundo método já validado.

Forma Farmacêutica: Usa um placebo contaminado, em que é adicionado uma quantidade conhecida de fármacos em uma mistura de componentes do medicamento.

Impurezas: Usa-se o método de adição de padrão, em que se adiciona uma quantidade conhecida de impureza ao fármaco.

Seu cálculo se dá com uma porcentagem da recuperação da quantidade conhecida de analito adicionada a amostra e é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente como mostrado na fórmula 6 (BRASIL, 2003).

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(Fórmula 6)

A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, da faixa de trabalho e da seletividade, sendo verificada a partir de, no mínimo, nove determinações contemplando a faixa de trabalho do procedimento, ou seja, três concentrações, baixa, média e alta, com três réplicas cada (BRASIL, 2003).

3.2.4 Robustez

A robustez pode ser testada ao introduzir pequenas alterações durante o processo de análise e então examinar o efeito resultante (HUBER, 2007). O INMETRO propõe a análise da robustez utilizando o teste de Youden (INMETRO, 2010B). Este teste se baseia nos delineamentos fatoriais, permitindo, assim ordenar a influência que cada um dos aspectos analisados tem na variação do resultado final (THOMPSON et al., 2002). Logo, quanto maior for a robustez de um método, maior será a confiança nos resultados, principalmente quanto à precisão (ICH, 1994; THOMPSON et al., 2002; BRASIL, 2003; INMETRO, 2010B;;;).

Se forem comprovadas suscetíveis variações nas condições analíticas do experimento, estas condições devem ser controladas e uma declaração de precaução deve ser anexada aos procedimentos (ICH, 1994).

A ANVISA não atribui nenhum procedimento para a análise da robustez, somente conceitua e aponta os principais fatores que podem influenciar em métodos analíticos como espectrofotometria, cromatografia líquida, cromatografia gasosa, além do processo de preparo das amostras (BRASIL, 2003).

3.2.5 Linearidade

O INMETRO defende a necessidade de no mínimo cinco concentrações para a produção da curva analítica. Esta obedece à equação linear y = a + bx, em que y é a resposta medida, x é a concentração, a é a interseção com o eixo y quando x = 0 e b é a inclinação da curva analítica (representa a sensibilidade). O gráfico resultante desta função matemática demonstra os resultados do ensaio em função da concentração do analito. Se for vista uma relação linear, se faz necessário avaliar esta relação por meio de métodos estatísticos adequados como o modelo de regressão linear, de coeficiente de correlação linear e de resíduo, que é a diferença entre o valor observado e o valor calculado pela equação da reta de regressão. Sendo necessária, antes do uso dos modelos estatísticos, a verificação da ausência de valores discrepantes para cada nível de concentração e a homogeneidade dos dados, ou

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seja, mais homogêneos e menos dispersos em torno em torno da reta de regressão (INMETRO, 2010B).

Assim como no INMETRO, a ANVISA recomenda a análise de no mínimo cinco concentrações diferentes para a determinação da linearidade. Se for visto uma relação linear aparente após exame visual do gráfico, os resultados dos testes deverão ser tratados por métodos estatísticos como determinação do coeficiente de correlação (critério mínimo para aceitação é de 0,99), intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo (BRASIL, 2003).

A linearidade é necessária para a avaliação da exatidão, mas uma relação linear entre as concentrações não garante a exatidão do processo analítico (HUBERT et al., 2007).

3.2.6 Faixa de Trabalho

Em um método quantitativo existe uma faixa para se trabalhar, em que as concentrações do analito são aplicáveis ao método, ou seja, que forneçam um grau aceitável de exatidão, precisão e linearidade. Seus limites de quantificação superior e inferior são derivados do estudo de linearidade, em que o limite inferior coincide com o limite de quantificação e o limite superior varia de acordo com o equipamento (INMETRO, 2010B; ICH, 1994).

Para o cálculo da faixa de trabalho, o INMETRO divide o método em três etapas (INMETRO, 2010B):

1ª etapa: Tem por objetivo identificar, por observação visual, a faixa linear aproximada e os limites superior e inferior da faixa de trabalho. A matriz utilizada é o branco com adição de concentrações variadas de analitos. Para a plotagem do gráfico devem-se colocar no eixo das abscissas as concentrações e as medições no eixo das ordenadas.

2ª etapa: Tem como objetivo determinar a faixa de trabalho e confirmar a faixa de linearidade. A matriz usada, normalmente, é o material de referência com diferentes concentrações dentro da faixa linear. Nesta etapa são calculados o coeficiente da reta de regressão e os valores de resíduo. Além de verificar, visualmente, a existência de dispersos que possam interferir na análise.

3ª etapa: Tem como objetivo determinar o limite de quantificação que é o limite inferior da faixa de trabalho. A matriz usada é o branco com adição de concentrações de analito próxima ao limite de detecção.

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A ANVISA não aborda seu procedimento, mas sim sua definição e aponta os limites percentuais de teor de analito que devem estar na faixa de trabalho, relacionando com cada tipo de ensaio como a determinação quantitativa de analito em matérias primas ou em formas farmacêuticas, determinação de impurezas e uniformidade de conteúdo e ensaios de dissolução (BRASIL, 2003).

A faixa de trabalho não necessariamente é idêntica à faixa de calibração. Embora esta abranja uma ampla faixa de concentração, a faixa de trabalho se relaciona a um intervalo mais restrito. Durante um processo de validação são determinadas duas concentrações, que por meio de uma extrapolação razoável determina-se a faixa de trabalho do procedimento analítico (THOMPSON et al., 2002).

3.2.7 Sensibilidade

A sensibilidade, pelo INMETRO, é descrita junto ao parâmetro da linearidade, em que pela equação linear da curva analítica se pode pressupor a sensibilidade do método. No caso, quanto mais sensível o método for, maior a inclinação da reta demonstrando então que pequenas variações de concentração resultam em maior variação da resposta (INMETRO, 2010B). Já a ANVISA relaciona a sensibilidade com o limite de detecção, colocando-os como o mesmo parâmetro (BRASIL, 2003).

Em termos práticos, a sensibilidade está ligada a calibração do equipamento. Como normalmente é arbitrário, de forma que varia de equipamento para equipamento, não é muito útil na validação. Porém pode ser usado nos procedimentos de garantia de qualidade (HUBER, 2007; THOMPSON et al., 2002).

3.2.8 Limite de Detecção

Para o procedimento de determinação do limite de detecção, o INMETRO defende um mínimo de sete replicatas. São descritos dois métodos para alcançar este parâmetro (INMETRO, 2010B):

1º método: Usa-se como matriz o branco da amostra. O cálculo do limite de detecção é descrito pela fórmula 7. Este método é válido somente quando os valores dos brancos apresentam um desvio padrão diferente de zero.

LD= X + t(n-1, 1-α) x s (Fórmula 7), em que LD é o limite de detecção, X é a média dos valores dos brancos da amostra, t é a

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abscissa de distribuição de Student e s é o desvio padrão amostral dos brancos da amostra.

2º método: Usa-se como matriz o branco da amostra com adição de analito em menor concentração aceitável. Esta concentração seria aquela que poderia ser alcançada com grau aceitável de incerteza. Seu cálculo é feito pela fórmula 08.

LD= 0 + t(n-1, 1-α) x s (Fórmula 08), em que LD é o limite de detecção, t é a abscissa de distribuição de Student e s é o desvio padrão amostral dos brancos da amostra.

O método adotado pela ANVISA para o cálculo do limite de detecção é por meio da análise de soluções com concentrações conhecidas e decrescentes de analito até o menor valor detectável (ANVISA, 2004) e deve ser feita ao longo de vários dias sempre comparando com brancos padrões (ICH, 1994; STÖCKL et al., 2009). O parâmetro pode ser avaliado de forma visual no caso dos métodos não instrumentais (cromatografia de camada delgada, titulação, comparações de cor, entre outras), objetivando relacionar a menor concentração do analito com algum efeito esperado. No caso dos métodos instrumentais (cromatografia em coluna, cromatografia gasosa, espectroscopia) o limite de detecção pode ser calculado pela fórmula 9, em que DPα é o desvio padrão quando interceptado com o eixo das ordenadas e IC é a inclinação da curva de calibração (BRASIL, 2003).

(Fórmula 9)

O limite de detecção não é um parâmetro robusto, logo pode ser afetado por pequenas alterações como temperatura, pureza dos reagentes, condição dos instrumentos, pH e outros. Portanto, é importante que estes fatores sempre sejam verificados antes de iniciar a validação deste parâmetro (UNODC, 2009).

3.2.9 Limite de Quantificação

O INMETRO adota duas formas de calcular as concentrações (INMETRO, 2010B): 1° método: Usa-se como matriz o branco da amostra e o cálculo do limite

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(Fórmula 10), em que X é a média dos valores em branco e s é o desvio padrão amostral dos brancos.

2° método: Usa-se como matriz o branco com adição de concentrações variadas de analitos, próximos ao limite de detecção. Devem-se medir cada replicata, independentemente, a cada nível de concentração. Além disso, deve-se calcular o desvio padrão amostral para cada concentração e por fim plotar o gráfico em que relaciona concentração e desvio padrão para com isso atribuir um valor do limite de quantificação.

A ANVISA estabelece o limite de quantificação por meio de analises de soluções contendo concentrações decrescentes de analito que possam ser determinadas com precisão e exatidão aceitáveis. Ele pode ser calculado pela fórmula 11, em que DPα é o desvio padrão quando interceptado com o eixo das ordenadas e IC é a inclinação da curva de calibração (BRASIL, 2003).

(Fórmula 11)

O limite de quantificação inferior é usado em ensaios quantitativos para analisar traços de analitos, sendo utilizado normalmente para determinação de impurezas ou produtos de degradação (ANVISA, 2004; INMETRO, 2010B; THOMPSON et al., 2002). Quantificação abaixo do limite de quantificação inferior não é aceitável para análises de caráter quantitativo, porém se for obtido os dados vão ter somente caráter qualitativo (PETERS et al., 2007).

No caso do limite de quantificação superior, que é a concentração máxima de substância que pode ser quantificada, geralmente é idêntico à concentração do padrão mais alto de calibração (PETERS et al., 2007).

4. CONCLUSÃO

Como dito, o objetivo desse artigo foi de elucidar o processo de validação analítica quantitativa por meio da análise dos parâmetros de desempenho de acordo com a ANVISA e o INMETRO. A partir disso observa-se que o processo de validação, mesmo sendo oneroso e caro, é um elemento integral dentro do sistema de gestão de laboratório, da garantia de qualidade e do processo de acreditação.

(18)

Mesmo com algumas diferenças entre as definições e os procedimentos que envolvem o processo de validação, tanto a ANVISA quanto o INMETRO trabalham para que os dados gerados pelo método validado tenham maior confiabilidade, melhor aceitação e proporciona maior credibilidade ao método.

No meio técnico-científico, por meio dos diversos trabalhos pesquisados, na maioria das vezes, há uma falta de conhecimento sobre o tema validação e uma confusão entre os termos validação e verificação, Tal fato, foi evidenciado pela inexistência ou discordância da aplicação dos requisitos de validação no desenvolvimento dos trabalhos.

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