Instituto de Química
Departamento de Química Orgânica
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
C
ARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA HIPOTÉTICAXACb0033
DA BACTÉRIAXanthomonas axonopodis pv. citri
Aluna: Paula Fernanda Lacarini Borin (RA: 011739)
Orientadora: Profa. Dra. Ljubica Tasic
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP
Borin, Paula Fernanda Lacarini.
B644c Caracterização estrutural da proteína hipotética XACb0033 da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri / Paula Fernanda Lacarini Borin. -- Campinas, SP: [s.n], 2010.
Orientadora: Ljubica Tasic.
Dissertação - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
1.Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac).
2. Sistema secretório do tipo IV. 3. Clonagem. 4. Caracterização estrutural. I. Tasic, Ljubica. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de
Química. III. Título.
Título em inglês: Structural characterization of an hypothetical protein XACb0033 from
Xanthomonas axonopis pv. citri (bacterium)
Palavras-chaves em inglês: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), Type four secretion system (T4SS), Cloning, Structural characterization
Área de concentração: Química Orgânica
Titulação: Mestre em Química na área de Química Orgânica
Banca examinadora: Profa. Dra. Ljubica Tasic (orientadora), Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos (IQ-UNICAMP), Profa. Dra. Giselle Zenker Justos (UNIFESP)
Agradecimentos
Gostaria de agradecer primeiramente e especialmente minha mãe Eufrazia, que
sempre me apoiou e me ajudou muito!
Agradeço a minha orientadora e amiga, Profa. Dra. Ljubica Tasic (Buba) pelos
ensinamentos, atenção, pela disponibilidade, prestatividade e pelas risadas que
demos juntas!
Ao Prof. Dr. Carlos Ramos, que além de ceder seu laboratório no LNLS para
realização dos experimentos, me ensinou e me ajudou desde o inicio da minha
iniciação científica em 2001 e me fez gostar ainda mais da Bioquímica!
A minha amiga de laboratório Thais, pela ajuda e companhia que sempre fez!
Aos alunos e funcionários do LNLS, em especial, a Veruska que me ajudou
desde o início da minha iniciação científica até redigir esta dissertação!
Aos professores com quais tive trabalho em colaboração, a Profa. Dra. Iris
Torriani, Profa. Dra. Anita Marsaioli, a Profa. Dra. Beatriz Guimarães.
Aos amigos Ricardo Marinho, Alexandre, Fábio, Adriana Martins, Adriana
Ramos, Ana Paula, Carla e Monteiro!
Ao meu marido André!
Aos membros que compõem esta banca!
Ao IQ-UNICAMP especialmente pela minha formação acadêmica!
Ao LNLS pela utilização de toda infra-estrutura, desde laboratórios, linhas de
luz e biblioteca!
A todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse
realizado!!!Muito Obrigada!!!
Curriculum vitae
Paula Fernanda Lacarini Borin Brasileira, casada, 27 anos
Rua José de Oliveira Campos, 80 Apto 504 Vila Francischini – Valinhos – SP
E-mail: paulaflb@yahoo.com.br
FORMAÇÃO
Graduada Bacharel em Química Tecnológica, UNICAMP, conclusão em 2005.
Técnica em Bioquímica, ETECAP, conclusão em 1999
ARTIGOS PÚBLICADOS E APRESENTAÇÕES EM CONGRESSOS Artigos Publicados
1. Khater, L.; Alegria, M.C.; Borin, P. F. L.; Santos, T.M. ; Docena, C. ; Tasic, L. ; Farah, C. S.; Ramos, C. H. I.; Identification of the flagellar chaperona FlgN in the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pathovar citri by its interaction with hook-associated FlgK. Archives of Microbiology 2007, 188(3), 243-250. 2. Tasic, L.; Borin, P. F. L.; Khater, L.; Ramos, C. H. I.; Cloning and
characterization of three hypothetical secretion chaperona proteins from
Xanthomonas axonopodis pv. citri, Protein expression and Purification 2007, 53, 363-369.
Participação em Reuniões Cienfíficas (Nacionais e Internacionais)
1. Marsaioli, A.; Lopes, T.; Borin, P.; Figueiredo, I.; Ramos, C.; Fujiwara, F.; Silva, J. C.; Torriani, I.; Tasic, L.; TYPE IV PROTEIN SECRETION PATHWAY: DOES Xac USE IT? 2nd IBEROAMERICAN NMR MEETING, Tarragona, Espanha, 2007. (painel)
2. Marsaioli, A.; Lopes, T.; Borin, P.; Figueiredo, I.; Ramos, C.; Fujiwara, F.; Silva, J. C.; Torriani, I.; Tasic, L.; TYPE IV PROTEIN SECRETION PATHWAY: DOES Xac USE IT? EUROMAR, Magnetic Resonance
4. Lopes, T. P.; Borin, P. F. L.; Ramos, C. H. I.; Figueiredo, I. M.; Marsaioli, A. J.; Tasic, L.; STD-NMR in Type IV Secretion System Proteins analyses, 11th NMR Users Meeting/Workshop NMR in South America, Angra dos Reis, RJ, Brasil, 2007. (painel)
5. Lopes, T. P.; Borin; P. F. L.; Aoki, P. S.; Ramos, C. H. I.; da Silva, J. C.; Torriani, I.; Tasic, L.; Comparative analysis of possible type IV secretion system chaperona (XACb0033) and its co-expressed and co-purified target protein (XACb0032) from Xanthomonas axonopodis pv. citri, 17a RAU, Resumos de trabalhos científicos, 66, Campinas, SP, Brasil, 2007. (painel) 6. Figueiredo, I. M.; Borin; P. F. L.; Lopes, T. P.; Ramos, C. H. I.; Marsaioli, A.
J.; Tasic, L.; A RMN como ferramenta primordial nas interações supramoleculares de chaperonas, IX Jornada de Ressonância Magnética Nuclear, Recife, PE, Brasil, 2006. (painel e apresentação oral)
EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL
Desde 2006 – Petrobras - Replan Cargo: Técnica de Operações Jr
Principais atividades: Controle e acompanhamento do processo de produção de Nafta e GLP do setor de Craqueamento Catalítico Fluído.
2004-2006 – UNICAMP Cargo: Técnica de Laboratório
Principais atividades: Preparação das aulas experimentais do laboratório de gradução de Química Orgânica.
2004 – EMS Sigma Pharma Cargo: Estagiária
Estágio da graduação na Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de novos medicamentos.
2001-2004 – Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) Iniciação Científica no Laboratório de Biofísica Molecular, atuando com clonagem e análise estrutural de proteínas.
2001-2001 – Livet Produtos Veterinários Cargo: Técnica de Laboratório
Pricipais atividades: Montagem do laboratório e análises de patógenos por técnicas de biologia molecular.
2000-2001 – Intituto Butantan Cargo: Estagiária
Estágio do ensino técnico no centro de Biotecnologia, trabalhando com Vacinas de DNA recombinantes
Resumo
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA HIPOTÉTICA XACb0033 DA BACTÉRIA
Xanthomonas axonopodis pv. citri
Palavras chave: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), Proteína XACb0033, Sistema
secretório do tipo IV (T4SS), Clonagem, Expressão, Caracterização Estrutural, Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS).
A Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa que parasita plantas cítricas e é responsável pela doença conhecida como cancro cítrico, que apresenta grande importância econômica em todo mundo. Acredita-se que a infecção da célula hospedeira ocorre com atuação dos sistemas de secreção, onde fatores macromoleculares de virulência, normalmente proteínas ou complexos de ácidos nucléicos com proteínas, são excretados para o citosol da célula no caso dos sistemas do tipo III e IV, onde irão interferir no processo celular do hospedeiro. O alvo do estudo é a proteína hipotética XACb0033, codificada pelo locus virB do plasmídio pXac64. Ela foi identificada como possível chaperona secretória do sistema de secreção tipo IV, por apresentar diversas características destas proteínas, como baixo peso molecular, pI ácido e propensão a formação de dímeros, entre outras. A XACb0033 foi clonada no vetor de expressão pET23a(+) e expressa na bactéria Escherichia coli utilizando técnicas de biologia molecular de clonagem e expressão. Os resultados da expressão foram satisfatórios, obtendo-se a proteína em quantidade suficiente para sua purificação seguida pela caracterização estrutural. A XACb0033 foi analisada por Espectrometria de Massas (MALDI-Tof MS), Dicroísmo Circular (CD), fluorescência de emissão estática e dinâmica, Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 (RMN de 1
Abstract
STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF AN HYPOTHETICAL PROTEIN XACb0033 FROM
Xanthomonas axonopis pv. citri (BACTERIUM)
Key words: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), XACb0033 protein, Type four
secretion system (T4SS), Cloning, Expression, Structural Characterization, Small angle X-ray scattering (SAXS).
Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a Gram-negative bacterium that
parasites citric plants all over the world and is responsible for causing the citrus canker with significant economic importance. It is believed that infection of the host cell occurs with activity of Xac’s secretion systems, where macromolecular virulence factors, usually proteins or nucleic acid complexes with proteins, are excreted into the cytosol of the host cells as in the case of type III and IV systems, where they will interfere with the key cell processes. The aim of our study was structural characterization of the XACb0033, Xac’s hypothetical protein, encoded by the locus virB of pXac64 plasmid. This protein was identified as a possible type IV secretion system chaperona because it presents many features of these proteins, such as low molecular weight, acidic pI, and propensity to form dimers, among others. The XACb0033 was cloned at expression vector pET23a (+) and expressed in Escherichia coli using molecular biology techniques for cloning and expression. The expression results were satisfactory, obtaining sufficient protein for its purification followed by structural characterization. The XACb0033 was analyzed by Mass Spectrometry (MALDI-Tof MS), Circular Dichroism (CD), static and dynamic Fluorescence, Nuclear Magnetic Resonance (1H NMR) and by Small Angle X-ray Scattering (SAXS). All collected data indicated that XACb0033 has folded structure, does not interact with nucleotides (ATP and ADP) and tends to act in dimeric form, following a model of a secretory chaperona, and, at last but not at least, its molecular envelope structure has been obtained.
Índice
Lista de Abreviaturas...xii
Lista de Tabelas...xv
Lista de Figuras...xvi
1. Introdução... 1
1.1. Xanthomonas axonopodis pv. citri - Xac e Cancro Cítrico ... 1
1.2. Sistemas de Secreção em bactérias Gram-negativas ... 3
1.3. Sistema Secretório Tipo III (T3SS) ... 4
1.4. Sistema Secretório Tipo IV (T4SS) ... 4
1.5. Chaperonas de Secreção (CS) ... 7
1.6. Genoma da Xac e a proteína em estudo XACb0033 ... 9
1.7. Clonagem ... 11
1.8. Expressão de proteínas em sistema bacteriano ... 12
1.8.1. Sistema pET de expressão ... 13
1.9. Análises espectroscópicas e espectrométricas ... 14
1.9.1. Dicroísmo circular (CD) ... 14
1.9.2. Fluorescência de emissão ... 16
1.9.3. Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 18
1.9.4. Espalhamento de Raios – X a Baixo Ângulo (SAXS) ... 20
1.9.5 Espectrometria de Massas (EM) ... 24
2. Objetivos ... 26
3. Materiais e Métodos ... 26
3.1. Clonagem ... 26
3.1.1. Seleção das enzimas de restrição ... 26
3.1.7. Sequênciamento de DNA ... 33
3.1.8. Extração de DNA plasmidial ... 34
3.2. Expressão de proteínas ... 35
3.2.1. Metodologia ... 35
3.2.2 Meio de cultura Luria Broth (LB)... 35
3.2.3. Cepas bacterianas utilizadas ... 35
3.2.4. Células competentes ... 36
3.2.5. Eletroporação ... 36
3.2.6. Expressão e preparação dos extratos proteícos ... 37
3.2.7. Lise bacteriana ... 37
3.2.8. Desenovelamento da proteína XACb0033 com uréia ... 38
3.2.9. Purificação da proteína de interesse (XACb0033) ... 38
3.2.10. Eletroforese de proteínas (SDS-PAGE, 15 %) ... 39
3.3. Diálises ... 40
3.4. Espectrometria de massas ... 40
3.5. Determinação da concentração da proteína XACb0033 ... 41
3.6. Dicroísmo Circular (CD) ... 41
3.7. Fluorescência de emissão estática e determinação de tempo de vida ... 42
3.8. Ressonância Magnética Nuclear ... 43
3.9. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) ... 43
4. Resultados e Discussões ... 45
4.1. Clonagem da ORF 10073.2 (gene que codifica XACb0033) ... 45
4.1.1. Subclonagem em pUC18 ... 45
4.1.2. Clonagem em pET23a (+) ... 46
4.1.3. Expressão de proteínas e preparação dos extratos protéicos ... 50
4.1.4. Purificação da XACb0033 ... 52
4.1.5. Determinação da concentração da proteína XACb0033 ... 53
4.1.6 Espectrometria de massas ... 53
4.1.7. Análise estrutural por dicroísmo circular ... 56
(RMN de 1H) ... 60
4.1.10. Tentativas de Cristalização ... 61
4.1.11. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) ... 62
5. Considerações Finais ... 65
6. Conclusões ... 68
Lista de Abreviaturas
ADT Adenosina difosfato
APS Persulfato de amônio do inglês amonium persulfate ATP Adenosina trifosfato
BSA Albumina de soro bovino do inglês Bovine serum albumine CD Dicroímo circular do inglês Circular Dichroism
ddNTP 2’,3’didesoxiribonucleotídeo 5’-trifosfato DDT Ditiotretiol
Dmáx Diâmetro máximo
DMSO Dimetilsulfoxido
DNA Ácido dexosiribonucléico do inglês DeoxyriboNucleic Acid dNTP 2’-Desoxinucleosídeo 5’-trifosfato
E. coli Escherichia coli
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético do inglês Ethylenediamine
tetraacetic acid
EM Espectrometria de massas FPLC
Cromatografia líquida de performance rápida do inglês Fast
Protein Liquid Chromatography
GST Glutathiona S-Transferase
Hsc Componentes de choque térmico do inglês Heat Shock Cognate Hsp Proteína de choque térmico do inglês Heat Shock Proteins IFGW Instituto de Física Gleb Wataghin
IPTG Isopropil -tiogalactopiranosideo
LB Luria Broth
LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncrotron
locus
Do latim, "lugar" é o local fixo num cromossomo onde está localizado
MALDI
Ionização a Laser assistida por Matriz do inglês Matrix Assisted
Laser Desorpion/Ionization
Mb Mioglobina
Mpf Formação do par conjugado do inglês Mating Pair Formation mRNA RNA mensageiro
NOE Efeito Overhauser Nuclear do inglês Nuclear Overhauser Effect
OGM Organismo geneticamente modificado
ORF Fase de leitura aberta do inglês Open Reading Frame
pb Pares de bases
qsp Quantidade suficiente para
Rg Raio de giração
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RNA Ácido ribonucleico do inglês Ribonucleic acid SAXS
Espalhamento de raios-X a baixo ângulo do inglês Small Angle
X-ray Scattering
SDS Dodecil sulfato de sódio do inglês Sodium Dodecyl Sulfate STD
Transferência de diferença de saturação, do inglês Saturation
Transfer Difference
T3SS Sistema secretório Tipo 3, do inglês Type 3 secretion System T4SS Sistema secretório Tipo 4 do inglês Type 4 secretion System T-DNA DNA transferido do inglês Transferred DNA
TEMED N,N,N´,N´- tetrametiletilenodiamino
Tof Tempo de vôo, do inglês Time-of-flight
Vir Virulência
WaterLOGSY
Espectroscopia de observação de ligação da água com gradiente, do inglês Water Ligand Observation with Gradient Spectroscopy
Xac Xanthomonas axonopodis pv. citri
Lista de Tabelas
Tabela 1.1.: Absorbâncias de luz circularmente polarizada (CD)
características para as estruturas secundárias de proteínas (-hélice e folha-)..15
Tabela 4.1: Atribuição das oligomerizações da XACb0033 em função da
relação m/z obtido pelo espectro de massas...54
Tabela 4.2.: Conteúdo de -hélice da XACb0033 calculado a partir de dados
de CD (25°C)...57
Lista de Figuras
Figura 1.1.: Xanthomonas e o cancro cítrico: Foto por microscopia
eletrônica de varredura de um estômato aberto de uma folha apresentando a X.
citri em seu canal (Graham e col., 2004). Características de lesões na folha (B),
fruto (C) e ramo (D), causadas pela infecção com X. citri
(http://www.fundecitrus.com.br/doencas/cancro.html)...2
Figura 1.2.: Sistemas secretórios bacterianos. Esquema dos tipos de
sistemas secretórios utilizados por bactérias Gram-negativas (retirado de Buttner e Bonas, 2002)...3
Figura 1.3.: Sistema secretório do tipo quatro (T4SS): Esquema dos
tipos de sistemas secretórios utilizados por bactérias Gram-negativas. Proteínas de B1 a B11 que constituem o T4SS e inserida na membrana interna, representada em laranja, a proteína D4 que se liga à uma molécula de ATP (em azul) sendo hidrolisada, liberando energia sufiente para secretar o substrato para a célula do hospedeiro, (retirado de Matxalen, 2009)...6
Figura 1.4.: Representação do plasmídeo pXAC64 da Xac: Genes que
codificam proteínas com funções desconhecidas estão indicados em branco, como é o caso da XACb0033, as setas escuras representam genes homólogos a genes com função conhecida. As setas indicam interações observadas em ensaio duplo-híbrido (isca presa, retirado da Alegria e col. 2005)...10
Figura 1.5.: Seqüência de nucleotídeos e de resíduos de aminoácidos da
XACb0033...10
Figura 1.7.: Diagrama de energia de Jablonski. A absorção de
determinada quantidade de energia faz com que um elétron passe do menor estado vibracional do estado fundamental (S0) para um estado vibracional superior do estado excitado S1 ou S2 (setas vermelhas). Após passar por processos não radiativos (setas azuis), que conduzem o elétron ao menor nível vibracional do primeiro estado excitado, pode ocorrer emissão de fluorescência (seta verde), que é a emissão de um fóton devido ao decaimento do estado S1 para o estado fundamental S0. A relaxação do elétron também pode ocorrer pela emissão de um fóton devido ao decaimento de um estado tripleto (T1) para o estado eletrônico fundamental (S0), processo chamado de fosforescência (seta vermelha)...17
Figura 1.8.: Representação esquemática da técnica STD, mostrando um
pulso seletivo na proteína, gerando o mapa do epítopo dos ligantes (Figueiredo e Marsaioli, 2007)...20
Figura 1.9.: Intensidade de espalhamento e função de distribuição de
distâncias para diferentes objetos geométricos (Svergun e Koch, 2003)...22
Figura 3.1.: Clivagem do DNA pelas enzimas de restrição: à esquerda
enzima Nde I e a direita Sal I...27
Figura 3.2.: Sequência dos iniciadores utilizados na clonagem da
XACb0033. Com indicações de sítios de clivagens pelas enzimas de restrição escolhidas (Nde I em vermelho e Sal I em azul) e indicação de codons de iniciação (Start) e de terminação (Stop)...27
Figura 4.2 : Identificação dos clones positivos. pUC18-10073.2 digeridos
com Nde I e Sal I. A direita padrão de peso molecular 1 kb plus , e banda circulada em vermelho referente a ORF 10073.2 com 219 pb...46
Figura 4.3.: Preparação do plasmídeo pET23a(+). Gel agarose 1%.
pET23a(+)-Mioglobina digerido com Nde I e Sal I, banda em 3666pb correspondente ao plasmídeo digerido...47
Figura 4.4.: Seqüenciamento de DNA, método de Sanger. Clone
pET23a-10073.2., sequência sem mutações. Na primeira linha sequência da enzima Nde I incluindo START CODON ATG, na última linha STOP CODON TGA seguindo da seqüência da enzima Sal I...49
Figura 4.5.: Indução com 1mM IPTG da proteína hipotética XACb0033.
Gel SDS-page 15%. Poço 1 – Amostra não induzida, poço 2 – Amostra com 1h de indução, poço 3 Amostra com 16hs de indução...50
Figura 4.6. : Desenovelamento com uréia. Gel SDS-page 15%. Poço 1 –
Fração solúvel da diálise da proteína em solução 8M uréia, poço 2 - Fração insolúvel da diálise da proteína em solução 8M uréia (amostra da fração insolúvel 10 vezes mais concentrada que fração solúvel)...51
Figura 4.7.: Purificação da XACb0033. Gel SDS-page 15%. Poços 1, 2, 3 e
4 – Eluatos da coluna de exclusão molecular...53
Figura 4.8.: Espectro de massas da proteína XACb0033. Presença de três
picos com relações m/z mais abundantes referentes ao monômero (m/z = 8294,17 u.a.), dímero (m/z = 16623,49 u.a.), tetrâmero (m/z = 33181,04 u.a.)...54
Figura 4.10.: Espectro de CD da proteína XACb0033. Em 4 M em tampão
fosfato de sódio (20 mM, pH=8,0), adquirido a 20°C com a velocidade de 20 nm/min de 200 a 260nm...57
Figura 4.11.: Desenovelamento térmico por CD da XACb0033. Em (a)
espectro de CD com aumento da temperatura, iniciando em 20°C e terminando em 65°C, em (b) espectro de CD a 20oC sem aquecimento (linha cheia vermelha), e espectro a 20oC após aquecimento até 65oC (linha pontilhada). Como visto, não houve a mudança da estrutura secundária após desenovelamento térmico, mostrando que o sistema é reversível...58
Figura 4.12.: Espectros de emissão de fluorescência da XACb0033.
Proteína em 4 M em tampão fosfato de sódio (20 mM, pH=8,0). O espectro (a) foi obtido com experimentos de emissão estática, com máximo de emissão em 345 nm e excitação em 295 nm, o espectro (b) representa tempo de vida dos triptofanos onde 1 = 1,2 ns e 2 = 4,9 ns...59
Figura 4.13.: Espectro de RMN da XACb0033 com ADP (1:100) na região de 4,0 a 9,0 ppm. Espectro (a) STD-controle (nenhum hidrogênio da XACb0033 irradiado) espectro (b) STD, não foi observado mapa do epítopo, ou seja, nenhuma interação significativa...61
Figura 4.14.: Curvas obtidas pelo espalhamento de raios-X a baixo
ângulo (SAXS) da XACb0033. (a) Curva de espalhamento e (b) função p(r) da proteína XACb0033...62
1. Introdução
1.1. Xanthomonas axonopodis pv. citri - Xac e Cancro Cítrico
Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa, que
parasita plantas cítricas. Possui como características respiração aeróbica, crescimento lento, formato de bacilococus e locomoção flagelar, fato importante para a sua adesão à célula hospedeira. Também, apresenta sistemas de secreção que permitem que fatores macromoleculares de virulência sejam secretados para o meio extracelular (Brunings e Gabriel, 2003). Este fitopatógeno é responsável pelo desenvolvimento do cancro cítrico, uma doença que no Brasil foi introduzida provavelmente por volta de 1954, sendo constatada pela primeira vez no ano de 1957, no município de Presidente Prudente, em material propagativo proveniente do Japão (Bitancourt, 1957).
A doença do cancro cítrico apresenta grande importância na economia brasileira e paulista, uma vez que o cinturão citrícola paulista é composto por mais de 200 milhões de pés de laranja, plantados em 628 mil hectares, responsáveis por 53% da produção mundial de suco e 80% do comércio internacional deste produto. Além disso, é o maior parque citrícola do mundo, empregando atualmente mais de 400 mil pessoas e gerando divisas ao redor de US$1,5 bilhões anuais. A receita com as exportações brasileiras de suco de laranja superou R$ 2 bilhões na safra 2006/07. Considerando-se apenas as exportações de suco de laranja concentrado e congelado (FCOJ), o faturamento da indústria cresceu 70,75% na safra passada, em comparação com a safra anterior (http://www.abecitrus.com.br/informativo/nota _receitajul07.html). Apesar do grande potencial produtivo, a citricultura brasileira é alvo constante de inúmeras pragas e doenças, que são capazes de causar danos irreversíveis na planta e na fruta, o que resulta em queda de produtividade e da qualidade dos frutos. O cancro cítrico é uma doença que causa lesões nos frutos, tornando-os
exceção da raiz, são susceptíveis a contaminação. Os tecidos mais jovens em crescimento ativo, porém, são alvos mais sensíveis. No inicio, as lesões são pequenas, circulares e de cor amarela, sendo que com o tempo as lesões tornam-se maiores, mais salientes e de cor castanha (Figura 1.1).
Figura 1.1.: Xanthomonas e o cancro cítrico: (A) Foto por microscopia eletrônica de varredura
de um estômato aberto de uma folha apresentando a X. citri em seu canal (Graham e col., 2004). Características de lesões na folha (B), fruto (C) e ramo (D), causadas pela infecção com X. citri (http://www.fundecitrus.com.br/doencas/cancro.html).
A Xac é de fácil disseminação, pois não necessita de um vetor específico de infecção, sendo transmitida através da ação do vento, da chuva e manuseio de ferramentas agrícolas. Apresenta alto índice de contágio, uma vez que o patógeno
para que haja um melhor entendimento da doença e dos mecanismos de virulência do patógeno, contribuindo para a melhoria da citricultura brasileira.
1.2. Sistemas de Secreção em bactérias Gram-negativas
Muitas bactérias Gram-negativas patogênicas são capazes de infectar e causar doenças nos seus hospedeiros, de modo que a infecção começa com a atuação dos sistemas de secreção, em que fatores macromoleculares de virulência, normalmente proteínas ou complexos de ácidos nucléicos com proteínas, são excretados para o citosol da célula hospedeira, onde irão interferir no processo celular do hospedeiro. Assim, desempenham um papel fundamental durante a infecção e, também, no desenvolvimento da doença, suprimindo os mecanismos de defesa do hospedeiro (Galán e Collmer, 1999; Cornelis e Van Gijsegem, 2000; Thanassi e Hultgren, 2000). Os sistemas de secreção são compostos por complexos multi-protéicos, e podem ser classificados em seis tipos diferentes, como mostrados na Figura 1.2, dependendo da forma como é realizada a translocação dos fatores de virulência para a célula hospedeira (Economou, 1999; Thanassi e Hultgren, 2000; Buttner e Bonas, 2002; Henderson e col., 2004)
Figura 1.2.: Sistemas secretórios bacterianos. Esquema dos tipos de sistemas
1.3. Sistema Secretório Tipo III (T3SS)
O sistema de secreção do tipo III (T3SS, “Type three Secretion System”) depende do contato com a célula hospedeira para ser montado. Acredita-se que o sistema que compõe o flagelo da Xac seja ancestral deste sistema de secreção, sendo que um terço das proteínas que compõem a estrutura macromolecular de T3SS são homólogas às proteínas que compõem a porção basal do flagelo (Hueck, 1998; Aizawa, 2001). A Xac possui um conjunto de genes que codifica o T3SS, e outro conjunto de genes, que codifica o flagelo polar, responsável pela locomoção da bactéria, ambos localizados no cromossomo (da Silva e col., 2002). A eficiência da motilidade é importante para a infecção, entretanto, a capacidade de secreção deste sistema derivado do flagelo é de fundamental importância para atacar a célula hospedeira. O T3SS é bem mais eficiente do que os sistemas secretórios tipo I e II (Figura 1.2.) na infecção do hospedeiro, devido à estrutura supramolecular formada pelo conjunto de proteínas que atravessam a membrana bacteriana (composta por três barreiras físicas: membrana interna, periplasma e membrana externa) e a parede da célula vegetal. Desta forma, além de secretar as proteínas de virulência para o meio externo, é capaz de injetá-las diretamente no citosol das células hospedeiras eucarióticas. O Sistema de Secreção do Tipo III desempenha papel fundamental no desenvolvimento de doenças causadas por patógenos de animais como a Yersinia ssp, Shigella flexneri e Salmonela
typhimurium, assim como por patógenos de plantas como Pseudomonas syringae, Erwinia ssp e Xanthomonas ssp (Hueck, 1998; Groisman, 2001).
entre populações bacterianas (Burns, 1999; Christie, 2001). O protótipo do T4SS é o sistema VirB/D4 da bactéria Agrobacterium tumefaciens, que exporta DNA simples fita, conhecido como T-DNA (“Transferred DNA”), através das membranas bacterianas para dentro da célula da planta, onde o T-DNA se integra ao seu genoma (Zambryski, 1988). O sistema é composto pelo locus virB, que consiste em 11 genes (VirB1 a VirB11), dez dos quais são essenciais para a transferência do DNA (VirB2 a VirB11). Já o sistema VirB1 atenua a virulência, e conseqüentemente a transferência de DNA (Berger e Christie, 1994), além de mais um gene que codifica o VirD4, o qual é o receptor do substrato (Christie, 1997). As proteínas VirB1 a VirB11 constituem as subunidades da estrutura supramolecular denominada formação do par conjugado (“Mating Pair Formation” - Mpf), e estas sozinhas formam a estrutura do canal. Quando associadas à proteína VirD4, formam o canal de secreção trans-envelope (Christie, 2001).
O sistema de secreção do tipo IV pode funcionar como sec-dependente e também como sec-independente (Burns, 1999) (T4SS, Figura 1.2), e é uma nanomáquina macromolecular, é utilizado como duto de transporte de proteínas ou complexos proteína/DNA para as células dos hospedeiros, tendo algumas similaridades com o sistema do tipo III, embora aparentemente estes não sejam relacionados (Fronzes e col., 2009; Matxalen e col., 2009). Estes dois sistemas possuem algumas características em comum, tais como, necessidade de contato físico com a célula hospedeira, exigência de que uma chaperone secretória se ligue à proteína a ser entregue (substrato) e espera-se que a exportação do substrato seja feita em somente uma etapa via canal de secreção. Entretanto, existe uma diferença fundamental entre os sistemas: o T4SS é derivado da maquinaria de conjugação de DNA, podendo exportar DNA simples fita e complexo DNA-proteína até a célula, e não há nenhuma evidência de que o T3SS possa fazer o mesmo. As proteínas mais conservadas do T4SS geralmente estão envolvidas com a ligação de ATP para transportar seu substrato para a célula hospedeira (Figura 1.3.), e já foram observados casos que proteínas do T4SS são capazes de hidrolisar ATP in vitro na ausência do seu substrato potencial ou
qualquer outro componente do T4SS (Christie e Vogel, 2000; Arechaga e col., 2008; Fronzes e col., 2009; Matxalen e col., 2009).
Para tal, postula-se que as ATPases VirB4 e VirB11 mediam a formação da maquinaria de secreção ou funcionam através de mudanças conformacionais dirigidas por ATP (Bruns, 2003). Isto é feito baseando-se na estrutura cristalográfica da H. pylori HP0525, uma ATPase homóloga de VirB11, onde foi sugerido que a sua estrutura hexamérica funciona como um poro, o qual fecha e abre de acordo com a mudança na conformação propiciada pela ligação ou hidrólise de ATP, respectivamente (Yeo e col., 2000)
Figura 1.3.: Sistema secretório do tipo quatro (T4SS). As proteínas B1-B11 constituem
o T4SS atravessando as duas membranas e, representado em laranja, parte externa deste sistema. A proteína D4 é uma ATPase e hidrólise de ATP (em azul), libera a energia necessária para secreção do substrato para a célula do hospedeiro (seta vermelha, retirado de Matxalen e col, 2009).
1.5. Chaperonas de Secreção (CS)
As chaperonas de sistemas de secreção, em geral, têm peso molecular menor que 20 kDa, pI ácido, interagem especificamente com uma proteína efetora, e uma ou duas proteínas translocadoras; atuam como dímero e se ligam a região amino-terminal da proteína cognata, possuem hélice anfipática no C-terminal e, diferentemente das chaperonas Hsp (“Heat Shock Proteins”), não possuem domínios de ligação de ATP (Wattiau e col., 1996; Bennett e Hughes, 2000; Feldman e Cornelis, 2003). Em geral, para microrganismos, as chaperonas de secreção são codificadas por genes localizados próximos àqueles que codificam as proteínas as quais estas irão se associar, auxiliando na sua identificação (Cornelis e Van Gijsegem, 2000). Esta família de proteínas não partilha similaridades significantes entre suas sequências primárias. Entretanto, a estrutura cristalográfica de algumas delas mostra que estas apresentam estruturas terciárias bem similares (Stebbins e Galán, 2003). Comumente, as chaperonas se ligam aos aminoácidos 50-100 de sua proteína cognata. Desse modo, seu sítio de ligação é logo abaixo da sequência sinal na extremidade amino-terminal (Schesser e col., 1996; Woestyn e col., 1996). As estruturas tridimensionais obtidas através da co-cristalização do chaperone com a sua proteína efetora fornecem informações sobre a função destas. Mostram que estas chaperonas mantêm o seu domínio de ligação na proteína cognata em um estado desenovelado, o que propicia com que a proteína efetora fique em uma conformação e tamanho compatíveis com o tamanho do canal de secreção (Stebbins e Galán, 2003). Outro papel proposto é prevenir a interação prematura da proteína a ser secretada com outras proteínas no citoplasma bacteriano (Woestyn e col., 1996). Outra função importante diz respeito ao encaminhamento do complexo chaperone/proteína efetora para a maquinaria de secreção, onde este processo é dirigido pelo chaperone, uma vez que a remoção do domínio de ligação do chaperone, em alguns dos complexos previne a secreção da proteína cognata (Lee e Galán, 2004). Portanto, a sequência sinal existente na proteína a ser secretada deve ser
um sinal geral para a secreção e as chaperonas devem conferir a especificidade necessária ao processo.
Além de reconhecer o complexo, a maquinaria de secreção tem de desfazê-lo, uma vez que a chaperone se mantém no citosol bacteriano após a proteína efetora se engajar no sistema (Galán e Collmer, 1999; Bennett e Hughes, 2000). Ao chegar à maquinaria de secreção, a proteína efetora encontra-se com o seu domínio efetor, que normalmente é localizado na extremidade amino-terminal, ainda enovelada (Luo e col., 2001). A limitação no tamanho do canal de secreção exige que este domínio se encontre desenovelado para que seja possível a secreção (Galán e Wolf-Watz, 2006). Tem sido demonstrado que as ATPases associadas à maquinaria de secreção atuam de forma a ajudar no recrutamento e no processo de desenovelamento da proteína a ser secretada, funções condizentes com a sua posição (membrana interna) na estrutura do sistema de secreção. Estudos in vitro mostraram que a ATPase se liga tanto ao chaperone sozinho, quanto ao complexo e os estudos in vivo demonstraram que na presença de ATPase ocorre a dissociação do complexo e o desenovelamento do domínio efetor da proteína a ser secretada (Akeda e Galán, 2005; Muller e col., 2006). Essa atividade de desenovelamento pode ser crítica no fornecimento de energia para o processo de secreção (Galán e Wolf-Watz, 2006).
1.6. Genoma da Xac e a proteína em estudo XACb0033
A Xac possui um cromossomo e dois plasmídeos, o pXAC33, com 33,7 Kb e o pXAC64, com 64,4 Kb. No seu genoma foram encontrados domínios que codificam sistemas secretórios tipo II, III e IV. O sistema do tipo II apresenta dois domínios diferentes, um geral ao gênero Xanthomonas (xps -Xanthomonas protein secretion), e outro específico para Xac, (xcs- Xanthomonas citri protein secretion). Já o T3SS está localizado no cromossomo, e é codificado por um grupo de 27 genes (da Silva e col., 2002). No seu genoma são codificados dois sistemas do tipo T4SS, que são distintos e independentes. Um no cromossomo, cuja função ainda não é conhecida e outro no plasmídeo pXAC64, que codifica a clássica maquinaria de conjugação (da Silva e col., 2002; Alegria e col., 2005).
Foram realizados ensaios de duplo-híbrido para estudar interações entre proteínas do T4SS, a fim de esclarecer os mecanismos pelos quais a Xac utiliza este sistema para interagir e modificar o metabolismo do hospedeiro. Estes ensaios foram realizados utilizando um número de proteínas de Xac como isca e a biblioteca genômica de Xac como presa, sendo encontradas várias interações entre os componentes do T4SS e proteínas hipotéticas. Uma destas interações foi atribuída às proteínas XACb0032 e XACb0033 (Alegria e col., 2005).
O gene da proteína hipotética XACb0033 encontra-se entre os genes trwC e virB1 do plasmídeo pXAC64 da Xac, como mostrado na Figura 1.4. (Alegria e col., 2005). A XACb0033, descrita como possível chaperone do T4SS, tem 72 aminoácidos (Kather e col., 2005) e possui ortologos encontrados em
Nitrosomonas europaea, Rhodospirillum e X. fastidiosa. O domínio mínimo
requerido na interação da XACb0033 com sua proteína parceira XACb0032 (possível proteína de virulência) corresponde aos resíduos 18 a 72 da sequência de resíduos de aminoácido da XACb0033, representada na Figura 1.5.
Figura 1.4.: Representação do plasmídeo pXAC64 da Xac: Genes que codificam proteínas com
funções desconhecidas estão indicados em branco, como é o caso da XACb0033, as setas escuras representam genes homólogos a genes com função conhecida. As setas indicam interações observadas em ensaio duplo-híbrido (isca presa, retirado da Alegria e col. 2005).
XACb0033 Sequência dos nucleotídeos 5’ATGGCACACGTCAATTCACGAGTTCAAAAGCACCGCGAC GCCCTGCGCATGGCAGGGCTGCGTCCGGTGCAAATTTGG GTGCCGGACACACGGCGGCCTGACTTCGCCGAGGAATGC CGCCGTCAGTGTCGTCTTGCTGCACAAGCGGACATGGCG GATACCGACATGCAGCGCTTCATGGATGAGGCGCTAGCA GACATGGATGGCTGGACGGAATGA3’ XACb0033 Sequência dos aminoácidos MAHVNSRVQKHRDALRMAGLRPVQIWVPDTRRPDFAEECR RQCRLAAQADMADTDMQRFMDEALADMDGWTE
Figura 1.5.: Sequência de nucleotídeos e de resíduos de aminoácidos da XACb0033. O entendimento das estruturas tridimensionais das proteínas envolvidas no mecanismo de translocação (proteínas efetoras e chaperonas) é essencial para que o mecanismo de virulência da Xac seja esclarecido, uma vez que proteínas de virulência com estrutura 3D específica e compatível com o tamanho do sistema de secreção são introduzidas na célula hospedeira (Galán e Collmer, 1999; Feldman e Cornelis, 2003; Alegria e col., 2004).
1.7. Clonagem
Uma variedade de técnicas referentes à tecnologia de DNA recombinante pode ser utilizada na clonagem de DNA, em que a preparação de grande número de moléculas de DNA idênticas é executada. A estratégia de clonagem utilizada é baseada em ampliação de um fragmento de DNA a partir do DNA extraído das células doadoras (Xac), o qual é então ligado a um plasmídeo de DNA, que pode se replicar na célula de um hospedeiro. A ligação do fragmento-plasmídeo gera o DNA recombinante que é inserido em células bacterianas (organismo geneticamente modificado, OGM) para síntese no novo clone (Lodish e col, 2004) O fragmento de DNA a ser ampliado representa um gene ou conjunto de genes que desejam ser clonados, e analogamente ao RNA, o DNA é sintetizado a partir de precursores de desoxinucleosídeos 5’-trifosfato (dNTPs). Também como a síntese de RNA, a síntese de DNA sempre ocorre na direção 5’ 3’ devido ao crescimento da cadeia resultar da formação da ligação fosfoéster entre o oxigênio 3’ da fita que está se formando e o fosfato 5’ do dNTP. A RNA polimerase pode achar um sítio de inicialização apropriado nas duplas fitas do DNA a iniciar a síntese do RNA complementar à fita molde de DNA Em contraste, DNA polimerase não consegue iniciar uma síntese de cadeia de novo, para isto requer uma fita pequena e pré-existente de RNA ou DNA, chamada de iniciador ou
primer, para iniciar o crescimento da cadeia. Com o primer emparelhado à fita
molde, a DNA polimerase adiciona um desoxinucleotídeo ao grupo hidróxido livre na posição 3’ do primer. (Lodish e col, 2004; Voet e Voet, 2006)
Os plasmídeos utilizados em tecnologia de DNA recombinante são moléculas de DNA dupla fita circulares que são separadas do DNA cromossomal da célula. Este DNA extra-cromossomal que ocorre naturalmente em bactérias e leveduras existindo uma relação parasítica com a célula do hospedeiro. Como o DNA cromossomal da célula hospedeira, o plasmídeo é duplicado antes de cada divisão celular. Durante a divisão celular, cópias dos plasmídeos são segregados para cada célula filha, assegurando a propagação do plasmídeo através das
tecnologia de DNA recombinante são aqueles que replicam em E. coli, apresentando entre 1,2 a 3 kb, e contém três regiões essenciais para clonagem de DNA: uma origem de replicação, um marcador que permite resistência, usualmente gene de resistência a drogas, e uma região onde DNA exógeno pode ser inserido (Lodish e col, 2004).
1.8. Expressão de proteínas em sistema bacteriano
A expressão de proteínas em bactéria é um importante método para a produção e estudo de proteínas (Voet e Voet, 2006, Lodish e col, 2004). Se, anteriormente, a quantidade de proteínas obtidas via manuseio da grande quantidade de tecidos processados e purificados representava um obstáculo, hoje esse tipo de desafio foi superado pela boa eficiência de expressão de proteínas em bactérias. As bactérias E. coli são comumente utilizadas para produção de proteínas e replicação de DNA plasmidial Devido sua fácil manipulação, rápido crescimento e por poderem carregar plasmídeos, constituem vetores importantes para as técnicas de biologia molecular (Lodish e col, 2004).
Utilizando-se plasmídeos de expressão fusionados a peptídeos, aminoácidos ou pequenas proteínas, como (HA, Hemagglutinin protein), histidinas e glutationa (GST,Glutathione S-Transferase), por exemplo, tem-se maior facilidade para purificação de proteínas através de técnicas cromatográficas. Atualmente, existem vários tipos de plasmídeos disponíveis para transformação de bactérias que sejam competentes para recepção deste material genético, por eletroporação, choque térmico ou quimio-transformação.
A partir da transformação do vetor bacteriano com o plasmídeo onde se encontra o gene de interesse, é preferível que a bactéria produza a proteína em
tornando-se mais abundantes diminuindo a eficiência da expressão ou produção da própria proteína. Desta forma, é preferível regular a produção da proteína, induzindo as células a expressá-la. Para indução, utiliza-se o composto isopropil -tiogalactopiranosideo (IPTG), que bloqueia o repressor da RNA polimerase compatível com o promotor do plasmídeo utilizado, permitindo que haja transcrição do gene e sua expressão.
1.8.1. Sistema pET de expressão
O sistema pET de expressão de proteínas heterólogas em E. coli vem sendo amplamente utilizado (Baneyx, 1999). Estes plasmídeos possuem o promotor T7, que é acessado pela T7 RNA polimerase, a qual possui uma alta processividade, possibilitando obter altas concentrações de mRNA do gene que estiver sob seu controle. O produto do gene lac I é um repressor que quando ligado ao operador O impede a expressão da T7 RNA polimerase impossibilitando a transcrição do DNA alvo. Entretanto, na presença de isopropil–-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), que é utilizado como indutor por ser análogo ao indutor natural, o repressor muda de conformação e se desliga do operador O e permite a expressão da T7 RNA polimerase e então permite a transcrição do DNA alvo. A T7 RNA polimerase passa a ser produzida em quantidade grande e devido a sua maior eficiência, que é cinco vezes maior do que da RNA polimerase da E.
coli, permite que a expressão do DNA alvo seja realizada em grande quantidade.
Também é possível controlar o momento exato em que o DNA alvo será expresso, pois a RNA polimerase da E. coli não o transcreve (Studier, Rosenberg e col., 1990).
O vetor de expressão utilizado foi o pET23a(+) (Novagen), apresenta resistência a ampicilina e é controlado pelo sistema T7 (Studier, Rosenberg e col., 1990). A expressão do DNA alvo (transcrição e tradução) é realizada somente na presença da RNA polimerase do vírus T7. Então foi utilizada a cepa de bactéria E.
coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene), pois esta possui no seu genoma o prófago do
promotor lacUV5 do operon lac, que está reprimido na presença da D-glicose e na ausência do seu indutor natural, lactose.
1.9. Análises espectroscópicas e espectrométricas
Existem várias técnicas que permitem a análise espectroscópica de proteínas em solução, sendo que neste trabalho foram utilizadas: Dicroísmo Circular (CD), Fluorescência de Emissão, Espectrometria de Massas (EM), Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS). Estas técnicas serão comentadas a seguir.
1.9.1. Dicroísmo circular (CD)
A espectroscopia de dicroísmo circular (CD), conduzida na região do UV (180 a 260 nm), é uma técnica utilizada principalmente em análises de estrutura secundária de proteínas em solução, devido à quiralidade destas moléculas (Kelly e Price, 1997). O sinal de CD representa a absorção diferencial da luz circularmente polarizada à esquerda e à direita após a sua passagem pela amostra sendo, em proteínas, a ligação peptídica [C(O)-NH] responsável por esta diferença na absorção. Os átomos da ligação peptídica podem interagir os de outras ligações peptídicas, originando a estrutura secundária da proteína. Isto permite que a proteína assuma arranjos helicoidais em determinados trechos de sua sequência de aminoácidos (Kelly e Price, 1997; Rodger, 1997). Estas formas regulares dos arranjos atômicos interagem de modo particular com a radiação polarizada, resultando na obtenção dos espectros de CD como função da
Tabela 1.1.: Absorbâncias de luz circularmente polarizada (CD) características para as
estruturas secundárias de proteínas (-hélice e folha-)
Transição eletrônica
*
n
*
-hélice 191-193/208-210 (nm) 222 (nm)
folha- 190-200 (nm) 210-225 (nm)
A estrutura secundária de uma proteína pode ser predominantemente -hélice; predominantemente folha ; + (regiões e separadas); / (região e misturadas); randômica (essencialmente desordenada), de modo que cada tipo apresenta um tipo de espectro de CD característico (Levitt e Chothia, 1976; Rodger, 1997). Através desta técnica, pode-se detectar se estão ocorrendo mudanças na conformação da proteína e, em caso positivo, correlacioná-las com as características do meio circundante. Pode-se saber, por exemplo, se mudanças de temperatura, ou de pH, ou a presença de outras moléculas no solvente são capazes de modificar a estrutura da proteína, e se essas modificações estruturais afetam a atividade biológica da macromolécula.
Figura 1.6.: Espectros de CD característicos
para proteínas com estrutura de -hélice,
1.9.2. Fluorescência de emissão
A fluorescência é um fenômeno eletrônico que ocorre após absorção de fótons, em que os elétrons da molécula assumem energias correspondentes aos estados quânticos excitados e menos estáveis. A molécula excitada atinge um estado energeticamente mais estável dissipando a energia absorvida por processos de decaimentos radiativos e/ou não-radiativos (Atkins, 2004). Os processos de decaimento não-radiativos envolvem vibrações, rotações e translações da biomolécula ou transferência de energia para as moléculas vizinhas por choques (Atkins, 2004). Os processos radiativos envolvem a emissão de fótons, em que a foto-emissão de estado quântico tripleto para o singleto é chamada de fosforescência, e a que envolve os estados singletos da molécula é chamada de fluorescência (Atkins, 2004). E este processo ocorre com maior probabilidade que a fosforescência.
Tipicamente as moléculas fluorescentes possuem elétrons deslocalizados em ligações duplas conjugadas, i.e., moléculas aromáticas e/ou em moléculas que apresentam conformações mais estáveis do que outras e, aparentemente, são rígidas. Em proteínas, alguns aminoácidos são susceptíveis ao processo de fluorescência: triptofano, tirosina, fenilalanina e cistinas. Porém é possível utilizar sondas fluorescentes ligadas aos determinados aminoácidos, amonoácidos modificados ou compostos que emitem fluorescência quando interagem com a proteína (Lakowicz, 1983). O triptofano é conhecido como resíduo protéico fluorescente e é sensível ao ambiente no qual se encontra, apresentando diferentes características de fluorescência de emissão dependentes do grau de exposição aos meios hidrofílicos e hidrofóbicos. Assim aliado ao seu alto rendimento quântico, quantidade relativamente pequena em proteínas e possibilidade de excitação específica, a técnica de fluorescência de emissão do
moléculas de água que o envolvem e emite fluorescência em comprimentos de onda menos energéticos, próximos a 355 nm (Lakowicz, 1983). Já quando o resíduo de triptofano se encontra em uma região no interior da proteína, geralmente hidrofóbico e com baixa acessibilidade a água, a emissão de fluorescência ocorrerá em comprimentos de ondas mais energéticos (310 nm a 335 nm) pois não haverá grande perda de energia com a reorganização de moléculas de água (Lakowicz, 1983).
Os principais comprimentos de onda de excitação para o triptofano, tirosina e fenilalanina estão no intervalo entre 260 nm e 295 nm. Porém, é possível separar bem as contribuições nos espectros de emissão entre o triptofano e a tirosina. A contribuição da fenilalanina é muito baixa quando comparada com os do triptofano e a tirosina. Utilizando comprimento de onda () de excitação próximos a 260 nm é possível excitar principalmente resíduos de tirosina e em 295 nm os resíduos de triptofano serão preferencialmente excitados (Lakowicz, 1983).
Figura 1.7.: Diagrama de energia de Jablonski. A absorção de determinada quantidade de
energia faz com que um elétron passe do menor estado vibracional do estado fundamental (S0) para um estado vibracional superior do estado excitado S1 ou S2 (setas azuis). Após passar por processos não radiativos (setas pretas), que conduzem o elétron ao menor nível vibracional do primeiro estado excitado, pode ocorrer emissão de fluorescência (seta verde), que é a emissão de um fóton devido ao decaimento do estado S1 para o estado fundamental S0. A relaxação do elétron também pode ocorrer pela emissão de um fóton devido ao decaimento de um estado tripleto (T1)
1.9.3. Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os fenômenos físico-químicos desencadeados pelas interações intermoleculares entre ligantes e receptores macromoleculares são a chave para o entendimento dos processos biológicos. Neste contexto, a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) tornou-se a priori, uma técnica poderosa no estudo de interações proteína-ligante, sendo capaz de detectar e quantificar as interações com alta sensibilidade, sem o conhecimento prévio da função da proteína (Figueiredo e Marsaioli, 2007). Entretanto, o monitoramento das interações através dos deslocamentos químicos das macromoléculas é difícil de ser analisado sem marcação isotópica. Isso faz com que o estudo das propriedades dos ligantes seja mais apreciado, pois fornece espectros de RMN mais simplificados e resolvidos que os espectros das macromoléculas (Figueiredo e Marsaioli, 2007). Existem muitos métodos espectroscópicos para a observação do epítopo dos ligantes, como métodos baseados na relaxação transversal (T2, spin-spin relaxação) e transferência de Efeito Overhauser Nuclear (NOE, “Nuclear Overhauser Effect”) (Figueiredo e Marsaioli, 2007, Mayer e Meyer, 2001). Entende-se por epítopo a superfície de contato macromolécula-ligante que pode ser mapeada através dos hidrogênios situados na interface. Os principais experimentos utilizados na obtenção do epítopo do ligante são o STD (“Saturation Transfer Difference”), WaterLOGSY (“Water Ligand Observation with Gradient Spectroscopy”) e NOE pumping (Figueiredo e Marsaioli, 2007, Mayer e Meyer, 2001). Já o experimento de DOSY-NOESY (“Diffusion-Ordered” NOE-SpectroscopY) permite a obtenção do epítopo da proteína. Portanto, estas técnicas fornecem informações complementares acerca das interações
Estes experimentos têm a característica de identificar acoplamentos dipolares que são espectralmente invisíveis nas amostras líquidas, mas fornecem informações relevantes sobre os movimentos moleculares e distâncias intra- e intermoleculares. Já os experimentos de STD consistem na diferença entre dois experimentos, em que no primeiro experimento (“on-resonance”), satura-se o receptor (proteína) via um trem de pulsos seletivos de rádio freqüência (rf). Esses pulsos são aplicados na freqüência de ressonância dos núcleos do receptor e não do ligante (Figueiredo e Marsaioli, 2007). A saturação propaga-se através dos hidrogênios do receptor via rede de interações dipolares intramoleculares entre hidrogênios (H-H); esse processo chamado “difusão de spin” é eficiente devido à grande massa molecular do receptor. A saturação é transferida aos compostos ligados via relaxação cruzada intermolecular para a interface receptor-ligante (Figueiredo e Marsaioli, 2007). As pequenas moléculas dissociam-se do receptor, mas permanecem em um estado “saturado” devido aos seus longos tempos de T1 quando livres. Logo, realiza-se um segundo experimento (“off-resonance”) no qual um trem de pulsos de radio freqüências (rf, radio frequences) idêntico ao primeiro é aplicado fora da faixa de ressonância dos núcleos (hidrogênios) dos ligantes e do receptor. A subtração dos experimentos fornece um espectro com os sinais dos ligantes. Nos experimentos “on-resonance” as proteínas são irradiadas em torno de -1,00 ppm, pois normalmente os ligantes não possuem sinais nessa região, enquanto as proteínas sim. Se os ligantes não possuem sinais na região aromática, esta se torna uma região passível de irradiação .Pulsos seletivos são empregados nas irradiações de saturação dos sinais da proteína, pois estes devem ter sua posição de irradiação exatamente selecionada (Figura 1.9). Os experimentos de STD apresentam-se como uma ótima escolha para determinação de epítopos, e das constantes de ligação dos ligantes, informações estas de suma importância no desenvolvimento de novas drogas (Mayer e Meyer, 2001,Figueiredo e col, 2007).
Figura 1.8.: Representação esquemática da técnica STD, mostrando um pulso seletivo na
proteína, gerando o mapa do epítopo dos ligantes (adaptado do Figueiredo e Marsaioli, 2007).
1.9.4. Espalhamento de Raios – X a Baixo Ângulo (SAXS)
A técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS- “Small Angle X-ray Scattering”; ângulos menores que 3-5) tem sido muito utilizada nos últimos anos no estudo de proteínas em solução (Svergun, 1996, Svergun e Koch, 2003). SAXS é um processo de espalhamento elástico que ocorre quando feixes de raios-X atravessam a amostra e interagem com os seus elétrons. A radiação reemitida pelos elétrons de cada átomo é espalhada isotropicamente, e estas ondas espalhadas atingem o detector onde são registradas. A partir das curvas de espalhamento obtidas e do tratamento matemático dos dados é, possível obter, com base no formato da curva, parâmetros dimensionais (Svergun e Koch, 2003). Estes, por consequência, permitem a construção de modelos do envelope molecular, em que podem ser obtidas informações sobre as estruturas terciárias e quaternárias da macromolécula, sem detalhes de nível atômico (Glatter e Kratky, 1982; Svergun,1999, 2007). A técnica de SAXS fornece informações estruturais sobre as inomogeneidades da partícula com dimensões características de dez a
densidade eletrônica. Se os centros espalhadores estão imersos em outro meio, como é o caso de partículas em suspensão em um dado solvente, o espalhamento surge do contraste de densidade eletrônica entre a partícula e o solvente (Glatter, 1982). Em proteínas, este contraste pode ser pequeno, resultando em um espalhamento muito fraco. o que exige maior tempo de coleta, ou a utilização de soluções protéicas mais concentradas (o que poderia prejudicar o padrão de espalhamento, uma vez que as proteínas poderiam se agregar) Desta forma, feixes de raios-X produzidos pela radiação síncrotron são empregados, pois o fluxo de fótons do feixe que incide sobre a amostra é muito mais intenso quando comparado aos raios-X obtidos de forma convencional. Isto propicia um melhor padrão de espalhamento em condições experimentais adequadas, tornando possível registrar esses casos de contraste fraco com maior eficiência (Zhang e col., 1994).
Para obtenção de uma curva de SAXS, uma solução de macromoléculas é exposta aos raios-X. A intensidade espalhada I(q) é função da transferência de momento q, obtendo-se a curva I(q) x q. Para análise da curva, é conveniente distinguir três regiões de espalhamento. Na região dos ângulos próximos a zero, pode-se determinar o raio de giração Rg, em que Rg é o raio correspondente à distância média quadrática dos elétrons da partícula até seu centro de gravidade, analogamente, o Rg pode ser visto como o raio de inércia da mecânica clássica, na região central; a razão I(0)/Q pode fornecer informação relativa ao volume, e na regiões de mais altos ângulos obtemos a relação superfície/volume da macromolécula (Feigin e Svergun, 1987)
O momento q é dado pela equação a seguir, em que é o ângulo de espalhamento e o comprimento de onda do raios-X:
q =4
sen
/
Uma análise mais completa para determinação da geometria da partícula pode ser feita através do cálculo, a partir dos dados experimentais, da função de
inversa da transformada de Fourier de I (q), a qual possui valor igual a 0 na máxima dimensão da partícula Dmáx (Svergun e Koch, 2003). A p(r) contém a mesma informação da intensidade de espalhamento I(q), mas a representação da
p(r) no espaço real é mais intuitiva. Além disto, informação sobre a forma da
partícula em solução pode ser deduzida visualmente da p(r). A Figura 1.9. apresenta padrões de espalhamento e p(r) característicos de objetos geométricos com mesmo valor de Dmáx(Svergun e Koch, 2003). Partículas globulares possuem uma p(r) na forma de uma função gaussiana centro-simétrica com máximo em
Dmáx/2. Partículas alongadas possuem uma p(r) com máximo em menores distâncias (linha verde, Figura 1.10). Partículas achatadas mostram um máximo mais alargado, também deslocando o máximo para distâncias menores que
Dmáx/2. A p(r) com um máximo deslocado para distâncias maiores que Dmáx/2 é indicativa de cascas esféricas. Partículas constituídas de subunidades separadas apresentam dois máximos, o primeiro correspondendo às distâncias intra-subunidade e outro a separação entre as intra-subunidades (Svergun e Koch, 2003).
1.9.4.1. Reconstrução ab initio da forma da proteína a partir de dados de SAXS
Um dos objetivos de SAXS aplicado ao estudo de proteínas em solução está em propor um modelo tridimensional a partir de uma curva uni ou bidimensional de espalhamento (Volkova, 2003). No passado, a determinação de objetos espalhadores foi realizada por julgamento de acerto e erro, computando modelos tridimensionais de objetos geométricos como esferas, cilindros, elipses, prismas, etc. e comparando-os com os dados experimentais. O primeiro modelo
ab initio para determinação de forma foi proposto por Stuhrmann (1970). Neste
método, a partícula é representada por uma função de envelope angular, que descreve as partículas em coordenadas esféricas. Contudo, a utilização de função de envelope angular se limita às formas relativamente simples.
Um modelo tridimensional de melhor qualidade, utilizando um modelo de átomo dummy (do inglês DAM – dummy atom model) pode ser construído ab initio utilizando método de Monte Carlo (Hromkovic, 2001). O método foi primeiramente implementado no programa DALAI_GA (Chacon, 1998, 2000). O volume, por exemplo, de uma esfera de diâmetro igual ao Dmáx, que é determinado a partir dos dados experimentais, e é definido e preenchido com empacotamento denso de esferas de raios menores em que as esferas correspondem às densidades eletrônicas intra-partícula. Também, na construção dos modelos ab initio são utilizados outros programas computacionais idealizados por Glatter, e o modelo final deve ajustar-se as curvas de espalhamento. Este modelo contém informação sobre as regiões de maior densidade eletrônica na molécula de proteína, sendo possível construir seu envelope molecular. Entre os programas disponíveis, encontra-se o DAMMIN que realiza a modelagem bead model (Svergun, 1999).
1.9.5 Espectrometria de Massas (EM)
A espectrometria de massas é aplicada nos estudos das proteínas quanto à determinação de pureza, massa molecular, afinidade em multimerização e a confirmação de sua sequência (Chapman, 2001). A ionização comumente utilizada é a Ionização a Laser assistida por Matriz (MALDI- “Matrix assisted Laser desorpion/ionization”) que possibilita a ionização de moléculas biológicas, tais como proteínas e peptídeos (Hoffman e col., 1996), sem fragmentá-las. A ionização das proteínas é acompanhada por um espectrômetro de massas. Por exemplo, uma das montagens experimentais dos equipamentos é MALDI-Tof (Tof- “Time-of-flight”), em que as proteínas ionizadas voam em tempos diferentes em função da diferenças de razão massa/carga (m/z) (Larsen e col., 1996). Durante a ionização assistida pela matriz, a maior parte da energia do laser é absorvida pela matriz utilizada, o que previne a fragmentação e/ou decomposição da amostra. As biomoléculas são então, ionizadas, e assim aceleradas em um campo elétrico dentro de um tubo sob vácuo. Durante o vôo neste tubo, as diferentes moléculas, no caso peptídeos, são separadas de acordo com suas respectivas razões m/z, e assim, atingem o detector em diferentes tempos, fazendo a ferramenta MALDI-Tof muito interessante para os estudos citados (Larsen e col., 1996). As amostras podem ser preparadas de várias maneiras, sendo mais utilizado o método de evaporação de solvente e tendo como a matriz um composto orgânico facilmente ionizável que permite a ionização suave do material biológico. Em espectros de massas de proteínas são observados íons [M+H]+, [M+2H]+ e [2M+H]+, com predominância do íon molecular [M+H]+, o que permite a obtenção da massa molecular da proteína analisada (Larsen e col., 1996).
redutores mais utilizados para realizar estes experimentos são 2-mercaptoetanol e DTT(Ditiotretiol).
A reação abaixo representa como o reagente 2-mercaptoetanol quebra as ligações de dissulfeto de uma moléluca de proteína genérica:
2. Objetivos
Os objetivos deste estudo foram clonar, expressar, purificar e executar as análises espectroscópicas e espectrométricas que possibilitarão a caracterização estrutural da proteína XACb0033, uma proteína hipotética e proveniente da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri.
3. Materiais e Métodos
A parte experimental consistiu de duas etapas, a primeira etapa foi realizada durante a iniciação científica executada no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron sob orientação do Prof. Dr. Carlos H. I. Ramos e a supervisão da Dra. Ljubica Tasic. O gene da proteína alvo (em estudo) foi clonado no vetor de expressão pET23a(+), a proteína foi expressa na bactéria Escherichia coli e o método para purificação da XACb0033 foi padronizado. Posteriormente estão apresentados os dados obtidos durante o período do mestrado. A purificação que havia sido padronizada durante o período de iniciação científica foi modificada, e os dados espectroscópicos e de espectrometria de massas foram obtidos com objetivo em caracterizar estruturalmente a proteína XACb0033.
3.1. Clonagem
Com o objetivo de clonar o gene correspondente a xacb0033 em pET23a(+) os seguintes passos foram realizados.
