UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
TIAGO LEITE MARTINS
ESTUDO DE LESÕES CUTÂNEAS INDUZIDAS
POR VENENO DE SERPENTES
NITERÓI 2014
TIAGO LEITE MARTINS
ESTUDO DE LESÕES CUTÂNEAS INDUZIDAS
POR VENENO DE SERPENTES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Universidade Federal Fluminense, como um dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Interdisciplinar.
Orientadora: Prof. Drª SABRINA CALIL-ELIAS
NITERÓI 2014
TIAGO LEITE MARTINS
ESTUDO DE LESÕES CUTÂNEAS INDUZIDAS
POR VENENO DE SERPENTES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Universidade Federal Fluminense, como um dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Interdisciplinar.
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Sabrina Calil-Elias (UFF) Orientadora
Prof. Dr. Paulo de Assis Melo (UFRJ)
Prof. Dr. Felipe Leite de Oliveira (UFRJ)
NITERÓI 2014
AGRADECIMENTOS:
Deus.
À minha família pelo apoio, principalmente minha mãe Telma, meu irmão Gabriel e o Sr. Padula que me deram suporte sempre que necessário.
À minha orientadora Prof. Dra. Sabrina Calil-Elias pela confiança, paciência e direcionamentos fundamentais nos momentos de dificuldade.
Ao Prof. Dr. Paulo de Assis Melo pela colaboração e ensinamentos imprescindíveis para a realização deste trabalho.
À Prof. Dra. Carla Valéria Vieira Guilarducci-Ferraz pela contribuição essencial em diversas etapas (Obrigado tia Dalva!), inclusive com várias revisões desta dissertação.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia da Faculdade de Farmácia da UFF pelo companherismo, apoio e incentivo.
“Se você quer ser bem sucedido precisa ter dedicação total, buscar o seu último limite e dar o melhor de si.”
RESUMO
Os venenos de serpente são complexa mistura de toxinas, que são principalmente enzimas e peptídeos com diversas atividades biológicas. Os venenos botrópicos podem induzir hemorragia, edema, necrose e diversas doenças da pele, tais como a formação de bolhas e dermonecrose. Embora existam progressos consideráveis no estudo da patogênese da hemorragia e mionecrose em Viperidae peçonhentas, existem poucas referências das anormalidades de pele derivadas destes venenos, independentemente da sua relevância clínica. O nosso objetivo é avaliar os efeitos dos venenos de Bothrops leucurus e Bothrops
jararaca na indução de lesões da pele, bem como no processo de regeneração. Foram
utilizados camundongos swiss albinos adultos com 25 ± 3 g (n = 4/grupo, do sexo masculino), que durante todo o experimento receberam comida e água "ad libitum" e foram mantidos em ciclo de luz natural. A manipulação e os procedimentos com os animais seguiram os princípios do Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa (CEUA-UFF n º 219). As lesões cutâneas foram induzidas no abdome por injeção intradérmica de 3 mg / kg de veneno de B. leucurus ou B. jararaca. O grupo controle recebeu injeção de solução salina fisiológica. Os animais foram sacrificados 1, 3, 7, 14, 21, 45 e 60 dias após a injeção de veneno, sob anestesia geral, a fim de remover a pele para processamento histológico. O passo seguinte foi corar com hematoxilina e eosina as amostras de pele e análise por microscopia óptica. Depois de 24 h a epiderme das amostras injetadas com os venenos estava desorganizada e apresentava maior espessura, em comparação com o controle. Após 21 e 45 dias foi possível identificar diferenças na análise imuno-histoquímica de citoqueratina 14 com padrão de marcação suprabasal das camadas epidérmicas, observado apenas em áreas de hiperproliferação nas amostras de pele injetadas com veneno. As amostras de pele de 60 dias do grupo de B. leucurus apresentaram células com núcleos picnóticos e as amostras de pele injetadas com as peçonhas de ambas espécies tinham fibra muscular em fase de recuperação, com núcleos centralizados, indicando processo de regeneração. Ainda nesta fase crônica foi possível identificar angiogênese com base na marcação de endotélio na derme através da imuno-histoquímica com o anticorpo CD34. Os resultados indicam que as lesões cutâneas induzidas por B. leucurus diferem de B. jararaca, sendo que as primeiras produziram intenso infiltrado inflamatório com padrão proliferativo diferenciado de reparação de feridas. Além disso, as peçonhas estudadas apresentaram-se como ferramentas úteis para o estudo de modelos de regeneração cutânea, porém a confirmação da tumorigênese depende de uma análise mais complexa, com destaque para fatores determinantes como o tempo e a intensidade de exposição ao veneno.
ABSTRACT
Snake venoms are complex mixture of toxins, which are mostly enzymes and peptides with diverse biological activities. The bothropic venoms can induce hemorrhage, edema, necrosis and various skin conditions such as blister formation and dermonecrosis. Although there are significant advances in the study of the pathogenesis of hemorrhage and myonecrosis in venomous Viperidae, there are few references to the skin abnormalities derived from these venoms, regardless of its clinical relevance. Our goal is to evaluate the effects of B. leucurus and B. jararaca venoms in the induction of skin lesions as well as in the process of regeneration. The animals used were adult albino Swiss mice with 25 ± 3 g (n = 4/group, male), which throughout the experiment received food and water "ad libitum" and were maintained in natural light cycle. Manipulation and procedures with animals followed the principles of Evaluation Committee on the Use of Animals in Research (CEUA-UFF nº 219). The skin lesions were induced in the abdomen by intradermal injection of 3 mg/kg B. leucurus or B. jararaca venom. The control group received injection of physiological saline solution. The animals were sacrificed 1, 3, 7, 14, 21, 45 and 60 days after venom injection under general anesthesia in order to remove the skin for histological processing. The next step was the hematoxylin and eosin staining of the skin samples and analysis by optical microscopy. After 24 h the epidermis of the samples injected with venoms was disorganized and had greater thickness, compared with the control. After 21 and 45 days it was possible to identify differences in immunohistochemical analysis of cytokeratin 14 with suprabasal epidermal layers staining, observed only in areas of hyperproliferation in samples of skin injected with venom. Skin samples of B. leucurus 60 days group cells had pyknotic nuclei and skin samples injected with venoms of both species had muscle fiber in recovery phase, with centered nuclei , indicating regeneration process. Still in chronic phase, we found angiogenesis based on marking endothelium in the dermis by immunohistochemistry with CD34 antibody. The results indicate that the cutaneous lesions induced by B. leucurus differs from B. jararaca, with the first resulting in intense inflammatory infiltrate with different proliferative pattern of wound repair. In addition, the venoms studied were presented as useful tools to study models of skin regeneration , although confirmation of tumorigenesis depends on a more complex analysis with emphasis on determining factors such as the time and intensity of exposure to the venoms.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADP Adenosina disfosfato Asp Aspartato
CCE Carcinoma de células escamosas CD34 Cluster of Differentiation 34
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CK Citoqueratina
INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
LAAOs L-Aminoácido oxidases
LtC Lectina tipo C Lys Lisina
MP Metaloproteinases NT Nucleotidase
PBS Tampão fosfato salino
PLA2 Fosfolipase A2
PSS Solução salina fisiológica
SINAN Sistema de informação de agravos e notificação SMS Secretaria Municipal de Saúde
SP Serinoproteinase
SVS Secretaria de Vigilância em Saúde UFF Universidade Federal Fluminense UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro UV Ultravioleta
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - Estimativas de óbitos por acidente ofídico, f. 12 FIGURA 2 - Acidentes por animais peçonhentos no Brasil, f. 13
TABELA 1 - Principais toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, f. 16
FIGURA 3 - Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (24h), f. 32 FIGURA 4 - Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (3d), f. 34 FIGURA 5- Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (7d), f. 36 FIGURA 6 - Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (14d), f. 38 FIGURA 7 - Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (21d), f. 40 FIGURA 8 - Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (45d), f. 42 FIGURA 9 - Análise histológica dos efeitos da injeção dos venenos botrópicos (60d), f. 44 FIGURA 10 - Análise histomorfométrica da epiderme após a injeção dos venenos, f. 45 TABELA 2 - Análise histomorfométrica da epiderme após a injeção dos venenos, f. 46 FIGURA 11 - Análise histomorfométrica da derme após a injeção dos venenos, f. 47 TABELA 3 - Análise histomorfométrica da derme após a injeção dos venenos, f. 47 FIGURA 12 - Análise histomorfométrica da hipoderme após a injeção dos venenos, f. 48 TABELA 4 - Análise histomorfométrica da hipoderme após a injeção dos venenos, f. 48 FIGURA 13 - Distribuição do colágeno total após a injeção dos venenos, f. 49
FIGURA 14 - Quantificação de colágeno total após a injeção dos venenos, f. 50 FIGURA 15 - Análise imuno-histoquímica dos efeitos dos venenos (CK14 - 21d), f. 51 FIGURA 16 - Análise imuno-histoquímica dos efeitos dos venenos (CK14 - 45d), f. 52 FIGURA 17 - Análise imuno-histoquímica dos efeitos dos venenos (CK14 - 60d), f. 52 FIGURA 18 - Análise imuno-histoquímica dos efeitos dos venenos (CD34 - 21d), f. 53 FIGURA 19 - Análise imuno-histoquímica dos efeitos dos venenos (CD34 - 45d), f. 54 FIGURA 20 - Análise imuno-histoquímica dos efeitos dos venenos (CD34 - 60d), f. 54
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO, p. 11
1.1 Histórico do ofidismo, p. 11
1.2 Dados epidemiológicos do acidente ofídico, p. 12 1.3 Aspectos clínicos do acidente ofídico, p. 13
1.4 Composição e principais características do veneno de serpentes do gênero Bothrops, p. 14 1.4.1 A peçonha de Bothrops jararaca, p. 15
1.4.2 A peçonha de Bothrops leucurus, p. 17 1.5 Lesão cutânea induzida pelo veneno, p. 18 1.6 Epidemiologia do câncer de pele, p. 19
1.7 Modelos experimentais de indução da carcinogênese em murinos, p. 21 1.8 Marcadores de diferenciação epitelial, p. 23
1.8.1 Citoqueratina 14, p. 24 1.8.2 Antígeno CD34, p. 24 2 OBJETIVOS, p. 26 2.1 Objetivo geral, p. 26 2.2 Objetivos específicos, p. 26 3 MATERIAL E MÉTODOS, p. 27 3.1 Material, p. 27
3.2 Indução das lesões, p. 27 3.3 Análise histológica, p. 28
3.4 Avaliação histomorfométrica, p. 28
3.4.1 Espessura da epiderme, derme e hipoderme, p. 28 3.4.2 Análise do conteúdo de colágeno total, p. 28 3.5 Análise imuno-histoquímica, p. 29
3.6 Análise estatística, p. 30
4 RESULTADOS, p. 31
4.1 Análise histopatológica, p. 31
4.1.2 Três dias após a injeção do veneno, p. 33 4.1.3 Sete dias após a injeção do veneno, p. 35 4.1.4 Catorze dias após a injeção do veneno, p. 37 4.1.5 Vinte e um dias após a injeção do veneno, p. 39 4.1.6 Quarenta e cinco dias após a injeção do veneno, p. 41 4.1.7 Sessenta dias após a injeção do veneno, p. 43
4.2 Análise histomorfométrica, p. 45
4.2.1 Análise da espessura da epiderme, p. 45 4.2.2 Análise da espessura da derme, p. 46 4.2.3 Análise da espessura da hipoderme, p. 47 4.2.4 Análise de colágeno, p. 49
4.3 Análise imuno-histoquímica, p. 51
4.3.1 Anticorpo monoclonal anti - Citoqueratina 14, p. 51 4.3.2 Anticorpo monoclonal anti - CD34, p. 53
5 DISCUSSÃO, p. 55
6 CONCLUSÃO, p. 61
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 62
1 INTRODUÇÃO
A peçonha possui um importante papel fisiológico para as serpentes, pois constitui um mecanismo de defesa contra predadores, além de auxiliar na captura de presas (MACKESSY, 1993). Dessa forma, os venenos contém componentes capazes de provocar distúrbios nos processos vitais de maneira sinérgica, podendo causar efeitos locais e/ou sistêmicos (LAING et al., 2003).
As lesões cutâneas podem ser reproduzidas por processos secundários à inflamação e cicatrização, além dos processos físicos e químicos que são executados com protocolos consolidados (FREIRE et al., 2013). A peçonha ofídica dentre as quais destaca-se o veneno das serpentes do gênero Bothrops, o mais incidente no Brasil, apresenta uma alternativa de modelo biológico de lesão tissular com desenvolvimento tardio de neoplasia localizada no local de ocorrência do acidente. Mello e colaboradores (2000) demonstraram que lesões cutâneas decorrentes de acidente botrópico podem evoluir para neoplasia, podendo desta forma o veneno ser uma ferramenta para o estudo histopatológico específico das alterações crônicas observadas.
1.1 Histórico do Ofidismo
Alguns registros que datam do período colonial determinavam uma média de mais de mil óbitos relacionados à picada de serpentes no ano de 1838, a maioria notificados pela Santa Casa do Rio de Janeiro. Desde aquela época a questão da subnotificação era tema recorrente, foi Vital Brazil, pioneiro na produção de soros antiofídicos no Brasil, um dos primeiros a introduzir boletins para observação de acidentes ofídicos que eram enviados junto com as ampolas de soro e deveriam ser preenchidos e retornados ao laboratório produtor (ROZENFELD, 1972). Os dados obtidos por esse tipo de estratégia de notificação foram base para publicações durante várias décadas, entre 1950 e 1980, fontes adicionais eram obtidas por estudos pontuais sobre ofidismo, principalmente nos Estados de São Paulo e Rio de Janeiro (LAGUARDIA et al., 2004)
A partir de 1986 com a dificuldade crescente na produção de soros antiofídicos o Ministério da Saúde tomou medidas emergenciais para o controle de acidentes ofídicos no território nacional. A notificação passou a ser obrigatória no País, estabelecendo-se um sistema de troca de informações epidemiológicas entre as esferas estaduais e federais. O resultado mais importante dessas medidas foi a considerável redução nas taxa de letalidade que passaram de 250 óbitos/ano para cerca de 110 casos letais/ano que representam valor próximo da estimativa atual (BRASIL, 2012).
1.2 Dados epidemiológicos do acidente ofídico
Os acidentes ofídicos são classificados como doença negligenciada de âmbito mundial, principalmente nos países tropicais onde se tem o maior número de casos. Em diversas situações estes acidentes não são fatais, porém, podem causar lesão incapacitante, devido ao intenso dano tecidual, muitas vezes com amputação do membro atingido (MELLO, et al., 2000; GUTIÉRREZ et al., 2006). Atualmente, em todo o mundo, estima-se que ocorra anualmente cerca de 1.8 milhões de casos de envenenamento dos quais 421 mil são notificados (Figura 1), destes, 20.000 têm como desfecho a morte da vítima (KASTURIRATNE et al., 2008).
Figura 1: Estimativas de óbitos por acidente ofídico por região geográfica (Fonte: KATSURIRATNE et al., 2008).
Os principais gêneros de serpentes presentes no Brasil são representativos do contingente encontrado na América do Sul sejam eles: Bothrops, Crotalus, Lachesis e
Micrurus (MELGAREJO, 1998). A última estimativa aponta que no Brasil ocorrem,
anualmente, cerca de 30.000 casos de acidentes ofídicos, segundo o Ministério da Saúde (BRASIL, 2012) (figura 2). De acordo com os quatros gêneros de serpentes de importância em saúde pública, são notificados em ordem de frequência: botrópico (87%) Crotálico (9%), laquético (3%) e elapídico (1%) (BRASIL, 2012).
Figura 2: Acidentes por animais peçonhentos no Brasil (Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
1.3 Aspectos clínicos do acidente ofídico
O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops provoca alterações locais importantes tais como hemorragia, edema, erupções cutâneas e necrose do tecido conjuntivo. Além disso, existe uma complexa cascata de eventos sistêmicos que induzem a distúrbios hemodinâmicos que podem levar até mesmo ao choque cardiovascular (GUTIÉRREZ et al., 2008).
A peçonha botrópica, após a sua inoculação, permanece na pele (mais de 50% do volume total), sendo este o primeiro órgão acometido, agindo posteriormente em outros tecidos como músculo esquelético e vasos sanguíneos, e em alguns casos alcançando outros tecidos como o coração e os rins. A alta concentração na pele é condizente com os efeitos clínicos causados pelo veneno, incluindo inchaço, dor, pústulas, equimoses e necrose local, podendo causar hemorragia (SANTOS, 2011). Outros efeitos do veneno observados em algumas espécies do genéro botrópico, incluem choque cardiovascular, mioglobinúria, e mais especificamente nos rins glomerulonefrite e necrose cortical (SANTORO et al., 2009).
O veneno botrópico, em concentração não letal, pode causar alterações funcionais dos rins, como diminuição da filtração glomerular, da diurese e do fluxo plasmático renal em ratos. A diminuição dos níveis de fibrinogênio e hematócrito e a presença de hemólise intravascular são fatores bem característicos. O aumento da hemoglobina livre também foi observado, ficando evidenciado a participação da hemólise intravascular e da deposição de fibrina nos capilares glomerulares como os fatores mais importantes na etiopatogenia da insuficiência renal aguda observada como consequência do acidente ofídico (ALBUQUERQUE et al., 2013).
1.4 Composição e principais características do veneno de serpentes do gênero Bothrops
Os venenos de serpentes são mistura complexa de toxinas, que em sua maioria são enzimas e peptídeos com atividades biológicas diversas. Suas composições variam entre as diferentes famílias, gêneros, espécies, idade e distribuição geográfica (CHIPPAUX, 1998). Os venenos de serpentes contêm peptídeos e proteínas que atuam em diversos mecanismos fisiológicos.
Algumas destas proteínas são sítio-específicas em suas ações, o que as torna importantes ferramentas para avanços terapêuticos e biológicos, sendo o exemplo mais conhecido o desenvolvimento dos inibidores da enzima conversora de angiotensina (FERREIRA & ROCHA e SILVA, 1965).
Muitas destas toxinas são metaloenzimas usualmente chamadas metaloproteinases. Elas estão envolvidas em etapas importantes do processo de lesão celular envolvendo tecido
conjuntivo e as células vasculares, sendo as integrinas um de seus principais alvos (OWNBY, 1990; BJARNASON e FOX, 1994; LÓPEZ-LOZANO, 2002). O veneno botrópico é constituído de diferentes toxinas de natureza protéica, algumas com atividade enzimática, que podem produzir os efeitos sistêmicos e locais observados após o acidente ofídico. Algumas destas proteínas estão associadas a elementos inorgânicos como Na+, K+, Fe+2, Mg+2, Mn+2 e Zn+2 para a manutenção da sua estrutura e ação biológica. Vários componentes foram isolados dos venenos de serpentes do gênero Bothrops dentre os quais pode-se destacar: fosfolipases A2, enzimas proteolíticas, fatores hemorrágicos e pró-coagulantes (GUTIÉRREZ e LOMONTE, 1989; SGRIGNOLLI, 2011).
1.4.1 A peçonha de Bothrops jararaca
O veneno de B. jararaca é capaz de induzir alterações patológicas complexas que podem ser caracterizadas tanto por efeitos locais como sistêmicos, a saber: edema, hemorragia, mionecrose, desfibrogenação e choque (ZELANIS, 2010).
O número de toxinas isoladas da peçonha desta espécie (Tabela 1) é superior ao de qualquer outra espécie do mesmo gênero, atuando principalmente sobre componentes responsáveis pela manutenção da homeostasia (KAMIGUTI, 1988; ZELANIS, 2010). Essa característica do veneno direcionou pesquisas com foco no isolamento e caracterização destas toxinas, com o objetivo de buscar soluções para fisiopatologia dos acidentes botrópicos, assim como identificar os principais alvos moleculares (GARCIA et al., 2004).
Tabela 1: Principais toxinas isoladas do veneno de B. jararaca. com ação sobre a hemostasia.
Toxina Classe Atividade biológica Referência
PA-BJ SP Indução da agregação
plaquetária
Santos et al, 2000.
Bothrombina SP Coagulante Watanabe et al, 2002
KN - BJ SP Liberação bradicinina Serrano et al, 1998
Bothrops protease A SP Fibrinogenolítica Murayama et al, 2003
Bothropasina MP (PIIIb) Hemorrágica Mandelbaum et al, 1982
Jararagina MP (PIIIb) Hemorrágica Lopes et al, 2012
Jararafibrase I MP (PIIIb) Hemorrágica Kawano et al, 2002
Bothrostatina MP (PII) Inibição da agregação
plaquetária induzida por colágeno
Fernandez et al, 2005
Bothrocetina LtC Indução da agregação
plaquetária por interação com VW
Suzuki et al, 2012
Bothrojaracina LtC Bloqueio da atividade
da trombina sobre o fibrinogênio
Monteiro, 2005
BJ-PLA 2 PLA2 Indução da agregação
plaquetária
Serrano et al, 1999
NPP-BJ NT Inibição da agregação
plaquetária induzida por ADP
Santoro, 2009
Legenda: LtC - Lectina tipo C; MP - Metaloproteinase; PLA2 – Fosfolipase A2; SP - Serinoproteinase;
P(II) – Metaloproteinase - PII; P(III) Metaloproteinase - PIII; NT - Nucleotidase; ADP - Adenosina difosfato; VWF - Fator de Von Willebrand.
Um dos principais componentes deste veneno são as metaloproteinases. A jararagina é a principal responsável pela intensa hemorragia local e inibição da agregação plaquetária in
vitro causadas pelo veneno de Bothrops jararaca. A jararagina é uma zinco-metaloproteinase
hemorrágica que possui 421 resíduos de aminoácidos em uma estrutura de alta massa molecular (47kDa), possuindo um domínio tipo desintegrina e outro domínio rico em cisteína. Foi classificada como a hemorragina mais potente (classe P-III), pertencente à subfamília reprolisina, bloqueando a ação do colágeno α2β1 e com atividade catalítica hidrolase do tipo endopeptidase dependente do zinco (MOURA-DA-SILVA & BALDO, 2012).
Os mecanismos propostos para a interferência da jararagina na agregação plaquetária referem degradação dos receptores plaquetários e protéinas adesivas envolvidas na hemostasia. A jararagina provoca hemorragia sistêmica porque não perde a sua eficácia mesmo na presença de inibidores de protease plasmáticos como a α2-macroglobulina e porque tem atividade proteolítica sobre o Fator de Von Willebrand (VW) e o receptor plasmático de colágeno (RAMOS & SELISTRE-de-ARAÚJO, 2006).
1.4.2 A peçonha de Bothrops leucurus
O veneno de Bothrops leucurus possui metaloproteinases não hemorrágicas como a leucurolisina-a (BELLO, et al., 2006) e a leucurolisina-b (SANCHEZ et al., 1992; SANCHEZ et al., 2007). A metaloproteinase BleucMP, foi recentemente descrita por Gomes e colaboradores (2011), como uma enzima capaz de provocar a redução significativa do fibrinogênio plasmático, porém sem determinar alterações hematológicas nocivas em camundongos. Além deste, outro exemplo de grande importância para a fisiopatologia do veneno das serpentes é a função exercida pelas fosfolipases A2 ácidas (Bl-PLA2) da espécie
Bothrops leucurus, que após a sua separação por cromatografia líquida de alta eficiência e
posterior liofilização para isolamento e identificação bioquímica, induziram o edema e a secreção de citocinas pró-inflamatórias (NUNES et al., 2011).
As fosfolipases A2 representam uma superfamília de enzimas lipolíticas que catalizam especificamente a hidrólise da ligação éster de glicerofosfolipídios, resultando na geração de ácidos graxos e lisofosfolipídios. As fosfolipases são geralmente divididas em quatro grandes grupos, as PLA2 extracelulares, não pancreáticas ou secretadas (sPLA2) de baixo peso molecular as PLA2 intracelulares de origem citosólica e alto peso molecular (cPLA2), as PLA2 independentes de Ca+2 (iPLA2) e as associadas à lipoproteínas (Lp PLA2) (KANG et al., 2011).
Cecilio e colaboradores (2013) isolaram e caracterizaram as fosfolipases A2 Lys 49 e Asp 49 a partir do veneno de Bothrops leucurus, a principal aplicação, testada com sucesso neste trabalho, foi o potencial de atividade contra o vírus da dengue.
Outra toxina presente na peçonha de B. leucurus é a leucurobina, que de acordo com Magalhães e colaboradores (2007) é uma glicoproteína monomérica, capaz de hidrolisar rapidamente a cadeia α do fibrinogênio.
De acordo com os resultados de Torres e colaboradores (2010) uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno de B. leucurus a BleuLAAO não apresentou atividade antimicrobiana para Staphylococcus aureus mas o veneno total foi capaz de impedir o crescimento desta bactéria e, além disso, suprimiu o crescimento de formas epimastigotas de
Tripanossoma cruzi. Estes indícios sugerem que o veneno possui frações ainda não isoladas
de compostos com potencial clínico relevante.
1.5 Lesão cutânea induzida pelo veneno
As alterações patológicas decorrentes do ataque de serpentes do gênero Bothrops abrangem uma sequência complexa de eventos, que compreendem os seguintes aspectos: edema local, formação de bolhas, dermonecrose e até mesmo necrose do tecido muscular esquelético (CALIL-ELIAS, 2004; WARREL, 2010).
Algumas evidências, como a degeneração muscular decorrente do acidente botrópico, foram alcançadas através do estudo da patogênese da mionecrose e hemorragia como demonstrado por Gutiérrez & Ownby (2003). Entretanto existe ainda uma grande demanda para estudos mais específicos com foco nas alterações patológicas de origem cutânea, que apesar da sua importância, apresentam déficit de resultados comprobatórios consistentes (JIMÉNEZ et al, 2008).
A injeção intradérmica de diversos venenos de serpente induz dermonecrose local (THEAKSTON & REID, 1983; JIMÉNEZ et al, 2008 ). De acordo com essa informação, a análise destes efeitos provocados pelo veneno de serpente pode ser relevante a partir de uma perspectiva de desenvolvimento de um modelo que possibilite entender o processo de formação das erupções cutâneas e dermonecrose (JIMÉNEZ et al, 2008).
Grande variedade de doenças, incluindo as autoimunes (SCHIMIDT & ZILIKENS, 2011) e também aquelas derivadas de deficiências proteicas e intoxicação por agentes naturais ou sintéticos (TAMBOURGI et al, 2005) provocam feridas dérmicas vesicantes, formação de
bolhas e necrose tecidual. A inoculação do veneno de serpente provoca alterações cutâneas, como por exemplo necrose tecidual, que pode ser ferramenta útil para investigação destas afecções cutâneas.
A partir dos dados de Mello e colaboradores (2000), Araújo (2005) mostrou que o veneno da serpente Bothrops jararaca quando injetado intradérmico na cauda de camundongo suíço induziu sinais de dano tecidual local agudo. Sete dias após a injeção do veneno, houve extensa necrose, comprometendo inclusive os anexos. Sessenta dias após a lesão foi evidenciada proliferação fibrosa da derme e a recuperação parcial dos anexos. Sobre a área reepitelizada ocorreu angiogênese, com acentuada congestão no plano subdérmico. Foi sugerido que o veneno de B. jararaca possa ser um possível agente promotor tumoral, uma vez que, o veneno induziu intensa resposta inflamatória local, com hiperplasia e alterações citológicas displásicas transitórias na epiderme.
1.6 Epidemiologia do câncer de pele
O câncer de pele é o de maior incidência no Brasil, a última estimativa realizada em 2013 pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA) orienta para a existência de cerca de 576 mil novos casos de câncer dos quais 182 mil correspondem ao câncer de pele. O câncer de pele não melanoma é o câncer mais comum no mundo e, embora, na maioria dos casos não seja metastático, sua incidência continua a aumentar. Contudo, se não for corretamente diagnosticado, pode produzir destruição local da pele, dos tecidos moles, ossos e cartilagem. O câncer de pele não melanoma possui dois tipos histológicos mais comuns: carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, sendo que o primeiro alcança entre 75% a 80% dos cânceres de pele não melanoma (INCA, 2013).
No Brasil, o câncer de pele é o mais incidente em ambos os sexos. Apesar de apresentar baixa letalidade, a demora no diagnóstico pode levar a deformidades físicas e piora na qualidade de vida. As campanhas de prevenção do câncer de pele, ao proporcionar o diagnóstico precoce, resultam em tratamento rápido, diminuição da morbidade e aumento da sobrevida do paciente. O fator de risco mais importante para o desenvolvimento do câncer de pele não melanoma é a exposição à radiação ultravioleta (UV) (recebida nas fases iniciais da vida) em conjunto com o tipo de pele do paciente. Indivíduos de pele clara que se queimam e
nunca se bronzeiam possuem risco aumentado de desenvolver esse tipo de câncer (LEITER & GARBE, 2008). A susceptibilidade genética para desenvolvê-lo é relacionada à quantidade de melanina e à resposta da pele à radiação UV. Logo, a incidência é maior em caucasianos. A exposição aos raios UV também pode ocorrer por meio de câmaras de bronzeamento artificial ou em terapias de luzes. A radiação ionizante também mostrou aumentar o risco de desenvolver essa neoplasia, assim como a infecção pelo HPV. A reincidência da neoplasia também aumenta o risco de desenvolver novos cânceres de pele não melanoma (SONG, 2013).
O câncer cutâneo do tipo não melanoma ocupa o primeiro lugar no grupo das neoplasias malignas. Vários tipos de lesões dermatológicas, quando mal tratadas, podem evoluir para câncer cutâneo, do tipo carcinoma espinocelular (CE). Os precursores do câncer cutâneo são chamados de lesões pré-malignas e constituem dermatoses com evolução em freqüência acima da simples casualidade para carcinoma (KANE et al., 2004).
O uso de animais de laboratório tem se mostrado eficaz na elucidação de eventos moleculares responsáveis por vários estágios do desenvolvimento tumoral. Uma das maiores vantagens dos animais para a carcinogênese está em fornecer as provas da relação causa-efeito entre a exposição ao carcinógeno, alterações genéticas e eventos biológicos que conduzem ou não a neoplasia. Além desta vantagem, pode-se destacar que o modelo experimental de câncer de pele é útil para o teste de medicamentos (DLUGOSZ e YUSPA, 1999).
Os modelos usualmente empregados para formação do câncer de pele são através da lesão celular e apoptose. Estas lesões podem ser reproduzidas por processos físicos, químicos ou secundários à inflamação e cicatrização (BROWN e BALMAIN, 1995). Atualmente, os estudos em camundongos transgênicos oferecem novo caminho, permitindo refinamento da investigação experimental, com detalhamento dos eventos in vivo (BROWN e BALMAIN, 1995). As informações mais precisas, considerando-se a contribuição de genes específicos a estágios particulares da tumorigênese, são desenvolvidas pelos testes de protocolos de carcinogênese na pele de camundongos transgênicos ou geneticamente modificados (DLUGOSZ e YUSPA, 1999).
Mello e colaboradores (2000) relataram o caso de um homem picado por serpente que após completa recuperação da lesão ulcerada apresentou persistência no local de área descamativa, assintomática, de cerca de 5 mm. Decorridos 23 anos, evoluiu para carcinoma espinocelular bem diferenciado. Caso semelhante foi relatado em menino na Arábia Saudita (MELLO, et al., 2000). Embora os venenos de serpente não pareçam estar envolvidos na promoção de neoplasia, esses dados despertaram o interesse em avaliar experimentalmente as alterações induzidas pelas toxinas.
1.7 Modelos experimentais de indução da carcinogênese em murinos
A quimiocarcinogênese induzida experimentalmente baseia-se no acúmulo de alterações genéticas em uma única célula e a sua expansão clonal. Além disso, é essencial a relativa rapidez com que os tumores cutâneos se desenvolvem nos animais, permitindo observar resultados após exposição única ou múltipla aos carcinógenos, sendo possível diferenciar os estágios do câncer e estabelecer uma relação temporal entre a exposição e a evolução da neoplasia (OWENS, 1999; FEI SU et al., 2012). O bioensaio iniciação-promoção está bem estabelecido para a pesquisa em pele de camundongos. A atividade cancerígena do composto testado pode ser previamente comprovada pela hiperplasia e displasia epidérmicas, porque estas são precursoras de carcinomas de células escamosas e papilomas (WILLIAMS, 1999).
Os protocolos de estudo da tumorigênese com animais evidenciam a ocorrência de diversas alterações genéticas que contribuem para o desenvolvimento da neoplasia. A sequência de estágios de iniciação, promoção e progressão depende de fatores moleculares qualitativamente relacionados. A iniciação tumoral corresponde à reação entre o agente químico e o DNA da célula alvo resultando em mudanças irreversíveis na capacidade de regulação da diferenciação genética. A ativação destes compostos ocorre através de enzimas que catalisam o metabolismo de xenobióticos, disponíveis em grande quantidade tanto na pele de humanos quanto nos animais de experimentação utilizados (MERK et al., 2004).
A indução da quimiocarcinogênese cutânea em dois estágios, através da administração tópica de compostos químicos, permite avaliar a influência de fatores sistêmicos, locais ou mesmo elementos do ambiente, na susceptibilidade, crescimento e progressão tumorais (SCHIOPPA et al., 2011).
A iniciação é seguida pela promoção, que determina a seleção e a expansão das células iniciadas podendo levar ao desenvolvimento de um tumor. Exemplo de agente químico indutor tumoral é o 7, 12-dimetilbenz[α]antraceno (DMBA) que induz a transição do tipo A-T no códon 61 (segundo nucleotídeo) do protoncogene Harvey-ras (HA-ras). Após a iniciação, ocorre a aplicação de um promotor tumoral que pode ser o acetato de forbol miristato (PMA), que pode propagar o desenvolvimento de células fagocíticas ou o 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA) (LOUREIRO et al., 2002).
De acordo com essa estratégia poderiam ser utilizados animais produzidos por biotecnologia no desenvolvimento de bioensaios alternativos de carcinogênese cutânea. As linhagens Tg. AC e RasH2, que carregam o transgene HA-ras ativado são as principais escolhas para realizar esse tipo de análise, sendo indicadas para a identificação de carcinógenos genotóxicos e não-genotóxicos (LYNCH et al., 2007).
A radiação ultravioleta é outra forma de promoção do câncer de pele, principalmente a radiação UVB (290-320 nm) representa um dos fatores de risco mais importantes no desenvolvimento deste tipo de câncer. A depleção do sistema imunitário cutâneo induzida pelo UVB tem sido amplamente descrita através de evidências epidemiológicas e moleculares substanciais que relacionam a exposição solar à ocorrência do melanoma maligno (CAINI et al., 2009).
As pirimidinas adjacentes na fita de DNA são extremamente vulneráveis à dimerização por radiação UVB, sendo as principais lesões observadas a ciclobutano pirimidina (CPD) e a 6-4 pirimidina pirimidona (6-4 PP). O espectro de ação máxima da CPD ocorre em torno de 290 nm, onde sua eficácia para indução do carcinoma de células escamosas (CCE) está comprovada. A radiação UVB foi capaz de induzir mutações características (transição C-T) em sítios di-pirimidínicos, que são alvos típicos para a dimerização por UVB. Esse padrão foi reconhecido no gene p53 de CCE, confirmando a influência da radiação solar como fator decisivo na oncogênese cutânea (GRUIJL & REBEL, 2008).
Schwarz e colaboradores (2004) desenvolveram modelo padrão de hipersensibilidade de contato para estudar os efeitos da radiação UVB na imunidade local e sistêmica de
humanos e ratos. Através da aplicação de haptenos, como o difenciprone, em local previamente irradiado na pele foi possível deprimir a resposta imunitária dos indivíduos UVB-suscetíveis o que é de grande interesse, visto que, a fase efetora da reação de hipersensibilidade é inibida pela ação das células T reguladoras. Além disso, foi observada indução de uma reação de hipersensibilidade em indivíduos UVB-resistentes após a exposição controlada por 4 dias consecutivos à radiação UVB.
1.8 Marcadores de diferenciação epitelial
As citoqueratinas são uma família complexa de proteínas. São constituintes protéicos das células epiteliais, identificados principalmente como filamentos de dimensão intermediária de importância crucial para a caracterização e avaliação da diferenciação epidérmica, também estão relacionadas com a origem dos tumores epiteliais (WATANABE et al., 1995).
As citoqueratinas são componentes essenciais do citoesqueleto das células epiteliais e sua expressão é frequentemente orgão ou tecido-específica (GARCIA et al, 2009). A especificidade das citoqueratinas está sendo cada vez mais usada como um marcador confiável para a diferenciação epitelial (SCHWEIZER et al, 2006). A visualização das citoqueratinas proporciona a localização do epitélio nos diferentes tipos de lesões, permitindo a distinção entre cistos e granulomas epiteliais, assim como a determinação do prognóstico e do tipo histológico (NOGUEIRA-CASTAÑON et al., 2004).
As citoqueratinas epiteliais são as mais estudadas e conhecidas. São designadas pelo seu peso molecular ou por um número (de acordo com catálogo de MOLL et al, 1982). As citoqueratinas são divididas em duas subfamílias, a primeira agrupa as citoqueratinas básicas de alto peso molecular (CK 1-8), a segunda subfamília inclui as citoqueratinas 9-19 que são de baixo peso molecular (MOLL et al, 1982). As citoqueratinas de baixo peso molecular são mais frequentes no epitélio simples e glandular, enquanto que as de alto peso molecular são expressas em epitélios escamosos queratinizados estratificados (GARCIA et al., 2009; SCHWEIZER et al., 2006).
De acordo com o resultado de análises imunohistoquímicas utilizando anticorpos monoclonais específicos pode-se afirmar que existe um padrão único de distribuição das citoqueratinas em cada uma das camadas epidérmicas (MATHER et al., 2013). Características semelhantes foram encontradas através de estudos de progressão tumoral em roedores utilizando citoqueratinas para elucidação de alterações tissulares específicas (CASTIGLIONI et al., 2013).
O movimento celular entre as diferentes camadas do epitélio normal provoca alteração da expressão das citoqueratinas (KUROKAWA et al., 2006). O camundongo apresenta ao nível basal a síntese primária do par citoqueratina 5 de 58 quilodaltons (KD) e citoqueratina 14 (CK14 – 50 KD). A nível suprabasal pode ocorrer supressão celular da expressão destas citoqueratinas (CK5/CK14) e início da síntese de citoqueratinas específicas de diferenciação como a citoqueratina 1 (CK 1 – 68 KD) e citoqueratina 10 (CK10 – 56.6 KD) (MATHER et al., 2013).
1.8.1 Citoqueratina 14
A citoqueratina 14 é uma proteína ácida de 50 KD, que em conjunto com a citoqueratina 5 (58 KD), atua como marcador para diferenciar o epitélio estratificado do epitélio simples. A citoqueratina 14 é expressa em epitélios estratificados queratinizados como, por exemplo o tecido esofágico (MOLL et al., 1982; ALMEIDA, 2004). A citoqueratina 14 apresenta expressão positiva em diversas regiões da pele, com maior presença nos queratinócitos das células basais. As células das glândulas sebáceas também são positivas para esta protéina (ALTEMANI, 2008).
De acordo com o estudo de WAGNER e colaboradores (2013) a interação do par de citoqueratinas CK5/CK14 com componentes celulares basais pode ser importante para a resistência epitelial ao estresse físico.
1.8.2 Antígeno CD34
O antígeno CD34 é uma glicoproteína presente em células progenitoras endoteliais e hematopoiéticas, tendo sido estudado como marcador de tumores vasculares (LEEK, 2001). É um eficiente marcador da diferenciação das células endoteliais, corando mais fortemente o endotélio neoplásico que o endotélio normal (REKHI et al., 2012).
O CD34, com peso molecular de 116 KD, é um marcador de células tronco hematopoiéticas e de progenitores mais diferenciados das diversas linhagens, incluindo a eritróide, que se liga à proteína de adesão CD62L (Selectina L), perdendo gradualmente a sua expressão com a maturação (LIU et al., 2007; TSIFTSOGLOU et al., 2009). Desta forma, à medida que as células se tornam comprometidas para com a linhagem eritróide, a expressão de CD34 decresce substancialmente até desaparecer (BOEHM et al., 2009).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito dos venenos de Bothrops jararaca e Bothrops leucurus na pele.
2.2 Objetivos específicos
Analisar as alterações morfológicas cutâneas induzidas pelos venenos de Bothrops
jararaca e Bothrops leucurus.
Determinar as possíveis diferenças entre o percentual de colágeno total entre os grupos estudados.
Avaliar as alterações imuno-histoquímicas demonstradas pela expressão de citoqueratina 14.
Determinar a localização de vasos sanguíneos após o processo de cicatrização pela análise imuno-histoquímica com anticorpo CD34.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Foram utilizados camundongos adultos suíços albinos machos (±25 g), que receberam água e ração “ad libitum” e foram mantidos no Biotério da Faculdade de Farmácia da UFF com controle de luminosidade (12 h claro / 12 h escuro) em ciclo de luz natural. A manipulação e os procedimentos com os animais obedeceram aos princípios da CEUA (Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa – Protocolo nº 219/2012 – Anexo 1) da Universidade Federal Fluminense (UFF). Os venenos brutos de Bothrops jararaca e Bothrops
leucurus foram doados pelo Professor Doutor Paulo de Assis Melo do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Os sais e reagentes utilizados foram todos de grau analítico. Foram utilizados na análise imuno-histoquímica o anticorpo monoclonal citoqueratina 14 clone SP53 (diluição 1 : 250) da marca CELL MARQUE cód 314R-14, e, o anticorpo monoclonal CD34 clone QBEnd 10 (pronto pra uso) da fabricante Dako cód IR632.
3.2 Indução das lesões
Os animais foram divididos em três grupos onde cada um continha pelo menos quatro animais, a saber:
Grupo 1 – Controle
Grupo 2 – B. jararaca 3 mg/Kg Grupo 3 – B. leucurus 3 mg/Kg
Os animais do grupo controle receberam injeção intradérmica de 100 μL de solução fisiológica salina (PSS) composta por: (mM) NaCl, (135,0); KCl, (5,0); MgCl2, (1,0). Os venenos de Bothrops jararaca ou Bothrops leucurus foram administrados por via intradérmica (100 μL), no abdome, na dose de 3 mg/Kg. Os animais foram sacrificados 1, 3, 7, 14, 21, 45 e 60 dias após a injeção do veneno, sob “overdose” de enflurano.
3.3 Análise histológica
Após a eutanásia nos dias determinados foi retirada a pele da área de lesão para o processamento histológico. O material foi colocado em solução de paraformaldeído tamponado 10% e mantido de 24 – 48 h. Após esse período o material foi conservado em álcool 70% e desidratado em concentrações crescentes de álcool (70% - 100%), posteriormente foram realizados três banhos de xilol. Foram feitos blocos de parafina e cortes de 5 μm de espessura, obtidos através do micrótomo Spencer 820 (American Optical®). Os cortes foram corados com Hematoxilina & Eosina (H&E). Para a análise histopatológica do material as lâminas foram observadas e fotografadas em microscópio óptico de luz convencional da marca Olympus (BX43).
3.4 Avaliação Histomorfométrica
3.4.1 Espessura da epiderme, derme e hipoderme
Foi realizada a avaliação histomorfométrica da espessura das camadas da pele, isto é, da epiderme, derme e hipoderme. Para isto foram realizados os cortes corados com Hematoxilina & Eosina. As fotomicrografias foram importadas para o software IMAGE PRO PLUS v. 6.0. A partir do arquivo com aumento de 10 X procedeu-se com a calibração da imagem a partir da linha de referência presente na foto, na sequência foi efetuada a inserção do padrão requerido em micrômetros e foi realizada a avaliação em cinco pontos equidistantes. Dos valores obtidos foi realizado o cálculo da média e do desvio padrão.
3.4.2 Análise do conteúdo de colágeno total
A análise do colágeno total foi feita a partir de cortes de 5 μm obtidos dos blocos de parafina preparados como descrito anteriormente. Depois da desparafinização em xilol e hidratação os cortes foram lavados em água destilada (3 minutos), imersos em e corados com Picrosírius (90 minutos). Em seguida procedeu-se com a desidratação, clarificação e montagem das lâminas.
A avaliação do percentual de colágeno foi efetuada através da coloração especial picrosírius porque esta marca em vermelho o colágeno total, permitindo quantificar a área preenchida por colágeno em relação ao total do corte observado. Foi utilizado o microscópio com câmera modelo OLYMPUS BX43 para a captura das fotos. A imagem digital foi importada para o software IMAGE PRO PLUS (v. 6.0) a partir do arquivo com aumento de 20 X procedeu-se com a calibração da imagem, inserção do tamanho da linha de referência em micrômetros e mensuração da área total do corte analisado pelo contraste a partir do padrão determinado, neste caso as regiões marcadas com a cor vermelha. Os resultados foram expressos em percentual de colágeno relativo ao controle.
3.5 Análise imuno-histoquímica
A análise imuno-histoquímica foi realizada com o objetivo de determinar possíveis alterações crônicas observadas na comparação entre as amostras dos grupos estudados e identificar as possíveis influências da injeção intradérmica das peçonhas botrópicas no processo de regeneração tecidual. Foram utilizados dois marcadores teciduais com perfis distintos, o anticorpo monoclonal para citoqueratina 14 (CK14 – SP53) e o anticorpo monoclonal para CD34 (QBEnd10). O anticorpo específico para citoqueratina 14 (diluição 1 : 250) é capaz de identificar este polipeptídeo de 50 kD encontrado principalmente nas células basais do epitélio escamoso. O anticorpo CK 14 é um marcador útil para diferenciar carcinoma de células escamosas de outros tumores epiteliais, além disso tem aplicação como marcador basal específico de subtipos de carcinomas de mama. O anticorpo monoclonal para CD34 (pronto para uso) é específico para marcação desta proteína transmembrana de 116 kDa, expressa em células tronco hematopoiéticas, células dos capilares endoteliais e fibroblastos. O anticorpo CD34 tem utilidade na identificação de tumores vasculares e na subclassificação de leucemias.
Foram realizados cortes histológicos de 4 micra de espessura, colocados em lâminas previamente microfilmadas com SILANO [(3- aminopropyltriethoxy) Sigma Company], que após serem desparafinizados e hidratados em três banhos de xilol durante 15 minutos e três banhos de álcool durante 3 minutos, foram lavados em água corrente e água destilada. A peroxidase endógena foi inibida com o peróxido de hidrogênio (H2O2 a 3% meio a meio em
metanol, três banhos sucessivos de 10 minutos) e lavados posteriormente em solução salina tamponada (PBS), composta de 85 g de NaCl, 15,5g de Na2HPO4. 2H2O e 2,3g de NaH2PO4 diluídos em um litro de água destilada, o pH desta solução foi ajustado para 7.2. em temperatura ambiente. Após lavagem em água corrente e água destilada, foi realizado Para a recuperação antigênica foi realizado banho em solução de tampão citrato 0.05% constituída de 2,94 g de citrato de sódio, diluídos em um litro de água destilada, o pH desta solução foi ajustado com solução de HCl 1N. Após o acerto para pH = 6.0, as lâminas foram colocadas em estufa, na temperatura de 90ºC durante 30 minutos, seguido de resfriamento e banho de albumina bovina a 3% (BSA) durante 30 minutos. A adição da albumina nesta etapa tem por função bloquear a ligação inespecífica, principalmente, de conjugados de peroxidase que são capazes de estabelecer ligações com sítios aniônicos teciduais, interferindo no resultado da reação com os anticorpos.
Depois de retirar a albumina, a região em torno do corte foi secada e, então, aplicado o anticorpo primário por 60 minutos. Seguiram-se duas lavagens sucessivas em tampão PBS tween 0,25% por 5 minutos. A incubação com anticorpo secundário durou 60 minutos, seguida de mais dois banhos sucessivos com tampão PBS tween 0,25% por 5 minutos. Após procedeu-se com a revelação com DAB (diamino benzidino), com controle de cada lâmina através de microscopia óptica. Após lavagem com água corrente e água destilada, os cortes foram contracorados com hematoxilina de Harris durante 2 minutos e lavados em água corrente por 5 minutos. Finalmente foram hidratados, clarificados e montados em óleo de cedro.
A quantificação do endotélio vascular dos cortes marcados com anticorpo monoclonal anti-CD34 foi realizada por contagem manual dos vasos sanguíneos através da observação das lâminas no microscópio e posterior padronização do resultado a partir do cálculo da área total do corte efetuado através do software IMAGE PRO PLUS v. 6.0.
3.6 Análise estatística
A significância dos experimentos foi obtida pelo teste t de Student, aplicado para avaliação estatística da análise histomorfométrica, com o intuito de avaliar a diferença da espessura da epiderme entre as amostras injetadas com veneno e os seus respectivos grupos controle, e, para análise do percentual de colágeno total; ambas as análises foram efetuadas para amostras não pareadas, sendo considerado estatisticamente significante quando p < 0,05.
4 RESULTADOS
4.1 Análise histopatológica
4.1.1 Vinte e quatro horas após a injeção do veneno
Os animais injetados com PSS apresentaram constituição característica de pele normal, sem alterações. A epiderme estava com a camada basal organizada, a derme possuía constituição normal, assim como a hipoderme que também não apresentou modificações (Figura 3A). Após 24 horas da injeção intradérmica das toxinas ofídicas, foi possível observar que todos os animais apresentaram intensa necrose tecidual no sítio de aplicação.
Em cortes de pele injetados com veneno de B. jararaca foi possível visualizar a epiderme mais espessa do que o controle com hiperceratose (Figura 3B), além disso, observou-se vários focos hemorrágicos (Figura 3E), situados principalmente abaixo da camada hipodérmica com trechos de congestão vascular. Foi observada proliferação celular intensa com permeação difusa de hemácias na derme e no tecido adiposo (Figura 3B). Em nível hipodérmico foi identificado o processo de sobreposição de células adiposas, saponificação.
As amostras de pele injetadas com veneno de B. leucurus apresentaram epiderme bastante irregular com pontos de inserção transversal de folículos pilosos. Na derme foi possível identificar focos de tecido adiposo, e intenso infiltrado inflamatório em área próxima à derme e hipoderme. A camada muscular estava em processo de lesão e foi possível observar miofibroblastos. Foram verificados vários grupos de células inflamatórias (Figura 3I).
Figura 3: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 24 h após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 24 h e corado com H&E. As imagens retratam as três
principais camadas da pele {1 - epiderme; 2 - derme; 3 – hipoderme}. A análise microscópica apresentou os seguintes elementos (setas): folículos pilosos (P), hemorragia (H), infiltrado leucocitário (L). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente.
1 2 3 P H L A B C D , E F G H I
4.1.2 Três dias após a injeção do veneno
Em todos os animais injetados com veneno foi observado o processo de proliferação celular semelhante ao grupo de 24h após a injeção dos venenos. À microscopia, os animais que receberam injeção de PSS apresentaram constituição característica de pele normal, sem alterações e com a camada basal organizada, a derme apresentava constituição normal, assim como a hipoderme que também não apresentava alterações (Figura 4A).
Em amostras de pele injetadas com veneno de B. jararaca foi possível observar a epiderme consideravelmente mais espessa do que o controle, com células dispostas em várias camadas (Figura 4B), diferente da pele normal. A derme apresentou características de proliferação celular persistente e também folículos pilosos em todo o campo. A camada hipodérmica apresentou distribuição variada, ou seja, foi possível observar fragmentos do tecido adiposo na derme, além disso foram localizados alguns vasos sanguíneos nessa área (Figura 4E).
Os cortes de pele injetada com veneno de B. leucurus apresentaram epiderme bastante espessa. Na derme foi possível identificar alguns folículos pilosos em diferentes conformações e também grande quantidade de infiltrado inflamatório. O tecido adiposo apresentou distribuição irregular com vários adipócitos na derme e também abaixo do músculo. Camada muscular degenerada com intenso infiltrado inflamatório (Figura 4F).
Figura 4: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 3 dias após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 72 h da injeção do veneno e corado com H&E. As imagens
retratam o corte histológico. A análise microscópica apresentou os seguintes elementos (setas): folículos pilosos (P), vasos sanguíneos (V) e infiltrado leucocitário (L). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente.
P V L A B C D , E F G H I
4.1.3 Sete dias após a injeção do veneno
Após 7 dias da injeção, análise microscópica das amostras de PSS demonstrava epiderme com camada celular fina com características de pele normal e com a camada basal organizada, a derme apresentou distribuição normal, assim como a hipoderme que não estava alterada (Figura 5A).
As amostras de pele que receberam o veneno de B. jararaca apresentavam epiderme mais espessa do que o controle, sendo possível visualizar nesta camada áreas com hiperceratose (Figura 5E). A derme apresentou características de proliferação. A camada hipodérmica estava em processo de saponificação, foram observados vasos sanguíneos, principalmente em região próxima ao músculo. Camada muscular em processo de lesão.
Em amostra de pele injetada com a peçonha de B. leucurus foi possível observar epiderme bastante espessa. Na derme foi possível identificar folículos pilosos em diferentes conformações e também áreas de proliferação celular. Foram identificados fibroblastos e infiltrado inflamatório na derme (figura 5F).
Figura 5: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 7 dias após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 7 dias e corado por H&E. As imagens retratam o corte
histológico. A análise microscópica apresentou os seguintes elementos (setas): folículos pilosos (P), vasos sanguíneos (V) e hemorragia (H). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente. P V P H A B C D , E F G H I
4.1.4 Catorze dias após a injeção do veneno
Após 14 dias da injeção a análise microscópica das amostras de salina demonstrava epiderme com camada celular fina com características de pele normal e com a camada basal organizada, a derme apresentou distribuição normal, assim como a hipoderme que não estava alterada (Figura 6A).
Observou-se na pele injetada com veneno de B. jararaca, que a epiderme não estava mais espessa do que o controle, mas foi possível visualizar áreas com hiperceratose (Figura 6E). A derme apresentava maior espessura do que a tratada com PSS e foi possível identificar proliferação celular persistente. A camada hipodérmica estava concentrada entre a derme e o músculo, como esperado. Na hipoderme foi observada presença de septo espessado com cicatriz intra adiposa, fibrose septal com ruptura alveolar e formação de eritema nodoso (Figura 6H).
A pele injetada com veneno de B. leucurus apresentou epiderme menos espessa e irregular. Na derme, também pouco espessa, foi possível identificar infiltrado leucocitário (Figura 6F). Além disso, foram observados septos de tecido conjuntivo na hipoderme, o que indica presença de inflamação persistente.
Figura 6: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 14 dias após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 14 dias e corado com H&E. As imagens retratam o corte
histológico. A análise microscópica apresentou os seguintes elementos (setas): folículos pilosos (P), vasos sanguíneos (V), septo de tecido conjuntivo (S) e infiltrado leucocitário (L). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente.
P V P L S A B C D , E F G H I
4.1.5 Vinte e um dias após a injeção do veneno
Após 21 dias da injeção a análise microscópica das amostras de pele que receberam solução salina demonstrava epiderme com camada celular fina com características de pele normal, sem alterações e a derme apresentou distribuição normal, assim como a hipoderme que também não estava alterada (Figura 7A).
As amostras de pele injetadas com veneno de B. jararaca apresentaram epiderme mais espessa do que o controle, sendo possível visualizar áreas com hiperceratose (figura 7E). A derme também apresentava maior espessura do que o grupo controle e foi possível identificar fibroblastos (Figura 7E) e folículos pilosos. A camada hipodérmica estava posicionada entre a derme e o músculo.
A pele injetada com veneno de B. leucurus apresentou epiderme menos espessa neste período. Na derme, foi possível identificar vasos sanguíneos logo abaixo da epiderme (Figura 7C), além disso, também foram observados fibroblastos localizados na derme (Figura 7I).
Figura 7: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 21 dias após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 21 dias e corado com H&E. As imagens retratam o corte
histológico. A análise microscópica apresentou os seguintes elementos (setas): Folículos pilosos (P), vasos sanguíneos (V) e fibroblastos (F). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente. P F V A B C D , E F G H I F
4.1.6 Quarenta e cinco dias após a injeção do veneno
Após 45 dias da injeção a análise microscópica das amostras de pele injetadas com PSS apresentava epiderme com camada celular fina com características de pele normal, sem alterações a derme possuía constituição normal, assim como a hipoderme que também não apresentou modificações (Figura 8A).
As amostras de B. jararaca apresentaram epiderme mais espessa do que o controle sendo possível visualizar hiperceratose (Figura 8E). A derme também apresentava maior espessura do que o controle. A camada hipodérmica estava situada em espaço entre a derme e o músculo, além disso foi possível identificar células inflamatórias.
Em amostra de B. leucurus foi possível observar epiderme com superfície irregular. Na derme, foi possível identificar folículos pilosos e cicatrizes que indicam a área de injeção intradérmica da peçonha. A hipoderme estava disposta em forma descontínua. A camada muscular apresentava células com núcleo centralizado, o que indica processo de regeneração (Figura 8F).
Figura 8: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 45 dias após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 45 dias e corado com H&E. As imagens retratam o corte
histológico. A análise das imagens obtidas apresentou os seguintes elementos (sinalizados com as setas): folículos pilosos (P), vasos sanguíneos (V) e fibroblastos (F). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente.
P F V A B C D , E F G H I
4.1.7 Sessenta dias após a injeção do veneno
Após 60 dias da injeção a análise microscópica das amostras de pele injetadas com PSS apresentava epiderme com características de pele normal, sem alterações, (Figura 9A).
As amostras de B. jararaca apresentaram epiderme menos espessa do que o controle (Figura 9E). A derme também apresentava menor espessura do que o controle e foi possível identificar fragmentos de tecido adiposo dispersos nessa área. A camada hipodérmica, bastante espessa, estava situada em espaço entre a derme e o músculo, além disso foi observado acúmulo de células inflamatórias em torno das células adiposas, que estavam sobrepostas.
Na amostra de pele injetada com veneno de B. leucurus foi possível observar epiderme espessa e irregular. Na derme, foi possível identificar vasos sanguíneos, fibroblastos e células com núcleos picnóticos (Figura 9F). A células da camada muscular possuiam núcleo centralizado, o que indica processo de regeneração. Na análise desta lâmina também foi possível observar alta concentração de células inflamatórias entre a hipoderme e a camada muscular.
Figura 9: Análise histológica dos efeitos dos venenos botrópicos 60 dias após a injeção intradérmica. O tecido foi retirado após 60 dias e corado com H&E. As imagens retratam o corte
histológico. A análise microscópica a partir das imagens obtidas apresentou os seguintes elementos (sinalizados com as setas): Folículos pilosos (P), adipócitos (A) e fibroblastos (F). As barras representam 100 µm (A-C), 50 µm (D-F) e 20 µm (G-I), respectivamente.
P A F A B C D , E F G H I
4.2 Análise histomorfométrica
Com o objetivo de analisar as possíveis alterações causadas na pele após a injeção intradérmica das peçonhas botrópicas procedeu-se a avaliação da espessura da derme, epiderme e hipoderme de cada grupo. Além disso, procedeu-se à análise do conteudo total de colágeno.
4.2.1 Análise da espessura da epiderme
A análise da espessura da epiderme revelou uma tendência de aumento da espessura desta camada nos grupos injetados com os venenos de B. jararaca e B. leucurus, onde de acordo com a análise estatística obteve-se resultados significantes na maioria dos períodos avaliados (Tabela 2) com a maior diferença (aumento de 127%) observada entre PSS e B.
jararaca no grupo de 3 dias. No intervalo de sessenta dias, observou-se uma aproximação
dos valores de espessura da epiderme , não existindo diferença estatisticamente significante na comparação entre os animais injetados com PSS e os grupo injetados com o venenos de B.
jararaca e B. leucurus (Figura 10).
Figura 10: Análise histomorfométrica após a administração dos venenos botrópicos em diferentes períodos após a injeção intradérmica dos venenos. Análise da espessura da epiderme.
(*p<0,05 comparação entre os grupos PSS e B. jararaca; #p <0,05 comparação entre os grupos PSS e
Tabela 2: Análise histomorfométrica da epiderme. Os resultados são expressos de acordo com o parâmetro de significância determinado para o teste t de Student.
Epiderme PSS X B. jararaca PSS X B. leucurus
24 h *p <0,05 #p <0,05 3 dias *p <0,05 #p <0,05 7 dias *p <0,05 #p <0,05 14 dias *p <0,05 #p <0,05 21 dias *p <0,05 #p <0,05 45 dias *p <0,05 #p <0,05 60 dias p = 0,35 p= 0,16
4.2.2 Análise da espessura da derme
A análise da espessura da derme apresentou maior variabilidade na comparação entre o grupo controle e os grupos injetados com venenos de B. jararaca e B. leucurus. Em relação a análise estatística obteve-se resultados significantes na maioria dos períodos avaliados (Tabela 3) com a maior diferença (aumento de 186%) observada entre PSS e B. jararaca no grupo de 14 dias. Neste intervalo o grupo injetado com veneno de B. leucurus apresentou resultado inverso, com espessura da derme menor do que o grupo controle, tendência que foi mantida e estatisticamente significante na comparação entre os grupos de 21 dias. Ao final do período de análise, no grupo de sessenta dias, observou-se maior espessura da derme dos animais injetados com PSS do que com os grupos injetados com veneno de B. jararaca e B.
