UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECIOSAS
PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE
REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA
ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA
MANAUS 2017
ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA
PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA
AMAZÔNIA BRASILEIRA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Profº Drº Marcelo Cordeiro dos Santos Co-orientador (a): Profª Dra. Maria Lucia Rosa Rossetti
MANAUS 2017
Ficha catalográfica
D278p de Lima, Ana Carolina de Oliveira
Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira: Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira / Ana Carolina de Oliveira de Lima. Manaus: [s.n], 2017.
114 f.: il.; 297 cm.
Dissertação - PGSS - Doenças Tropicais e Infecciosas (Mestrado) - Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, 2017.
Inclui bibliografia
Orientador: Marcelo Cordeiro dos Santos Coorientador: Maria Lúcia Rosa Rossetti
1. Prevalência. 2. Micobacterias não tuberculosas.
1. 3. Técnicas moleculares. 4. HIV/AIDS. 5. Região Norte. I. Marcelo Cordeiro dos Santos (Orient.). II. Maria Lúcia Rosa Rossetti (Coorient.). III. Universidade do Estado do Amazonas. IV. Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Sistema Integrado de Bibliotecas da Universidade do Estado do Amazonas.
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM
PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE
REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA
ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora: ______________________________________ Presidente ______________________________________ Membro ______________________________________ Membro
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus familiares e amigos que me apoiaram nos momentos difíceis, ao meu pai Miquéias Oliveira de Lima e irmãos Marcos e Miquéias Júnior, com todo meu amor e gratidão pela força e incentivo, por tudo que fizeram por mim nessa trajetória. Em memória de Anira de Lima, mãe e amiga, dedico este trabalho fruto de um sonho nosso e com imensa saudade, por todo exemplo de superação e amor que me foi passado.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela força e sabedoria concedida para que eu pudesse alcançar essa conquista.
À minha família por terem sido alicerce inabalável na trajetória até aqui.
À querida Ms. Rossicléia Lins Monte pelo carinho e pelas instruções dadas para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao professor Drº Marcelo Cordeiro dos Santos, meu orientador, pelos ensinamentos e pela oportunidade de crescimento profissional.
À professora Drª Maria Lúcia Rossetti, minha co-orientadora, que me possibilitou aprendizagens únicas, sempre me incentivando. Muito obrigada pela confiança e por acreditar em meu potencial.
Ao professor Drº Afrânio Kritski, pela contribuição na construção deste trabalho, incentivo e ensinamentos incansáveis
À equipe do laboratório do Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CDCT da Fundação de Produção e Pesquisa em Saúde – FEPPS, pelo apoio e ensinamentos oferecidos.
À equipe do laboratório da Gerência de Bacteriologia pelos anos que me acolheram me disponinilizando conhecimento e maturidade profissional o que me fez chegar até aqui.
À equipe do laboratório da Gerência de Tuberculose e Virologia pelo apoio no desenvimento das técnicas laboratoriais necessárias nesse trabalho.
A todos os professores Universidade do Estado do Amazonas/Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, por todo aprendizado e atenção dispensado no repasse dos conhecimentos durante as aulas.
À Fundação de Amparo à pesquisa do Amazonas (FAPEAM) pelo apoio e bolsa de estudo. Aos membros da secretaria acadêmica da Pós-graduação em Medicina Tropical e a todos os funcionários da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, pelo incentivo e cordialidade.
Aos colegas da turma de Mestrado ano 2015, por todos os momentos maravilhosos juntos, pela sincera amizade durante esta jornada e por todo apoio, em especial às colegas Cynthia Pessoa e Maria Francisca Rodrigues.
DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS
O auxílio de passagens aéreas para a participação em treinamentos e capacitações necessários para realização das técnicas moleculares foram financiados Universidade do Estado do Amazonas (UEA). Os recursos laboratoriais e materiais de consumo para execução dos procedimentos foram disponibilizados pelo Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT) da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEEPS) e pela empresa bioMérieux Brasil. O projeto foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) por meio de bolsa de estudo, durante os 24 meses de execução do projeto.
[...] Não importa o quão estreito seja o portão e quão repleta de castigos seja a sentença, eu sou o dono do meu destino, eu sou o capitão da minha alma [...]
RESUMO
Em países industrializados, com a queda da incidência de tuberculose (TB) ocorreu um aumento esporádico dos casos de infecções por micobactérias não tuberculosas (MNT). O uso de métodos de detecção laboratorial de MNT baseado em testes moleculares tem sido valorizado, pois a ausência de diagnóstico adequado em pacientes suspeitos de infecção por micobactérias pode levar ao tratamento inadequado, promover resistência medicamentosa, falência terapêutica e o óbito. Em países de alta carga de TB, são escassos os dados sobre a prevalência dos casos de infecção por MNT em pacientes suspeitos de TB com HIV/AIDS, como na região Norte do Brasil. Estima-se uma subnotificação dos casos por se tratar de uma doença sem notificação obrigatória. O objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no período de 2011 a 2014. Dos pacientes atendidos, 758 tiveram amostras clínicas positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%) em uso de terapia antiretroviral (26,7%), com mediana de CD4 de 244 cels/mm3.Entre essas
amostras foi possível recuperar da criogenia 56 (36,6%) isolados para identificação molecular da espécie. A identificação da espécie de MNT foi obtida pelos testes GenoType® Mycobacterium CM/AS, PRA hsp65 (PRA) e sequenciamento respectivamente em 50 (89,3%), 37 (66%) e em 43 (76,8%) das amostras analisadas. A concordância entre a técnica PRA e o GenoType foi de 81%, entre o GenoType e o sequenciamento de 76% e entre o PRA e o sequenciamento de 74%. As espécies identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M.
fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6
(10,7%) M. kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento inapropriado para TB e foram notificados no SINAN. Óbito foi identificado em 5 (9%) pacientes. Com base nesses achados, observou-se: a) uma elevada prevalência de MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; b) que cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e c) o kit comercial Genotype® Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV.
Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas moleculares, Região Norte, HIV/AIDS.
ABSTRACT
In industrialized countries, with the decline in the incidence of tuberculosis (TB), there has been an increase in cases of non-tuberculous mycobacterial (NTM) infections. The use of laboratory-based methods of NTM based on molecular tests has been valued, since the absence of adequate diagnosis in patients suspected of mycobacterial infection can lead to inadequate treatment, promote drug resistance, failure of therapy and death. In countries with high TB burden, data on the prevalence of NTM infection in HIV / AIDS TB patients are scarce, as in the Northern region of Brazil. It is estimated that underreporting of cases is a non-notifiable disease. The objective of this study was to describe cases of NTM in patients suspected of TB treated at the Heitor Vieira Dourado Tropical Medicine Foundation (FMT-HVD), a reference for HIV / AIDS, from 2011 to 2014. Of the patients treated, 758 clinical samples positive for mycobacteria, of these 153 (20.2%) were MNT positive. The majority of patients were male (66%), HIV infected (77%) receiving antiretroviral therapy (26.7%), with a median CD4 count of 244 cells / mm3. Among these samples it was possible to recover from the cryogenic 56 (36.6%) isolates for molecular identification of the species. The identification of MNT species was obtained by GenoType® Mycobacterium CM / AS, PRA hsp65 (PRA) and sequencing, respectively, in 50 (89.3%), 37 (66%) and 43 (76.8%) samples analyzed. Agreement between the PRA technique and the GenoType was 81%, between the GenoType and the 76% sequencing and between the PRA and the 74% sequencing. The species most frequently identified were: Mycobacterium gordonae in 17 (30.4%), M. fortuitum in 11 (19.6%), M. avium / intracellulare in 10 (17.9%), M. abscessus in 6 (10.7%) M. kansasii in 3 (5.3%). Among the 56 patients with NTM, 13 (23.2%) received inappropriate treatment for TB and were notified at SINAN. Death was identified in 5 (9%) patients. Based on these findings, we observed: a) a high prevalence of NTM of clinical importance, most of them being seropositive; b) that about 25% of the NTM patients were treated as TB, and c) the Genotype® Mycobacterium CM / AS commercial kit detected the MNT species in 89% of the samples. It is urgent to implement molecular techniques for the diagnosis of NTM in patients suspected of TB seen in reference to HIV.
Keywords: Prevalence, non-tuberculous mycobacteria, tuberculosis, molecular techniques, Northern Region, HIV / AIDS
RESUMO LEIGO
Em alguns países muitas pessoas adoeceram por micobactérias não tuberculosas (MNT), aquelas que não causam a tuberculose (TB), mas os sintomas e o exame são parecidos. Para saber mais rápido se a pessoa está realmente doente por elas verifica-se o DNA dessa bactéria, mas a falta desse tipo de exame por ser caro e ainda não disponível a todos pode levar ao tratamento errado (remédio para o tratamento da tuberculose), a pessoa não curar e até mesmo à morte. Nos lugares onde há muita gente doente com tuberculose, são poucas as informações sobre as pessoas doentes por MNT, acredita-se que pela falta de notificação desses casos como na região Norte do Brasil. O objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no período de 2011 a 2014. Foram analisadas 758 amostras positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%), estavam em tratamento para o HIV (26,7%). Desses casos foi possível recuperar do congelamento, 56 (36,6%) amostras para análise. A identificação da espécie de MNT foi através da análise do DNA. As espécies identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 (10,7%) M.
kansasii em 3 (5,3%).Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento errado e foram notificados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) como doentes com tuberculose, 5 (9%) desses pacientes morreram. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV.
Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas moleculares, Região Norte, HIV/AIDS.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Baciloscopia – Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl-Neelsen ...16 Figura 2. Esfregaços de cultura de micobactérias ...33 Figura 3. Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e
escotocromógenas ...34 Fluxograma 1. Informações de positividade em cultura e identificação laboratorial por método convencional (teste fenotípico e bioquímico) no período de 2011 a 2014...58 Fluxograma 2. Etapas do procedimento laboratorial ...59 Gráfico 1 Distribuição dos casos de HIV em pacientes suspeitos de TB com amostra positiva para MNT...59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM)...25
Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT ...30
Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT ...32
Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon ...35
Tabela 5. Informações sobre os resultados de baciloscopia, Xpert MTB/RIF e testes moleculares de identificação de espécie realizados ...60
Tabela 6. Análise de Kappa entre as técnicas moleculares ...60
Tabela 7. Distribuição das espécies de MNT identificadas e sorologia para HIV...61
Dados complementares Tabela 1 Características basais dos indivíduos com isolados positivos para MNT ...62
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
AIDS – Síndrome da imunodeficiência humana adquirida ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária BCG - Bacillus Calmette-Guérin
BAAR – Bacilo álcool-ácido resistente CTAB – Brometo de cetrimônio
DPOC - Doença pulmonar crônica DNA - Ácido desoxirribonucleico EUA - Estados Unidos
HIV - Vírus da imunodeficiência humana LJ - Lowenstein Jensen
LACEN - Laboratório Central de Saúde Pública MgCl2 – Cloreto de magnésio
MNT - Micobactérias não causadoras de tuberculose
M.tb - Mycobacterium tuberculosis
MCR -Micobactérias de crescimento rápido MCL - Micobactérias crescimento lento OMS - Organização Mundial de Saúde PPD - Prova tuberculínica
PCR – Reação da cadeia da polimerase
PRA-hsp65 – Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65 PCT - Programa de Controle da Tuberculose
PNB - Ácidop-nitrobenzóico PAS - Ácido p-aminosalicílico
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism RIF - Rifampicina
SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde
TB – Tuberculose
TB/HIV – Coinfecção TB/HIV
TB-XDR - Tuberculose extensivamente resistente
ZN - Ziehl-Neelsen μm - Micrometro mol – Molaridade/mole mm³ - Milímetro cúbico mL - Microlitro pmol - Picomol
u – Unidade de massa atômica pb – Pares de base
mM – Milimol μl - Microlitro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. Classificação do gênero Mycobacterium... 16
1.2. Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS...17
1.3. História e evolução das Micobactérias não tuberculosas ...18
1.4. Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT) ... 19
1.5. Transmissão e formas clínicas da doença por MNT ... 21
1.6. Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas ... .23
1.6.1. Dados mundiais ... 23
1.6.2. Dados da América Latina e Brasil ... 25
1.6.3. Dados da região Norte do Brasil ... 27
1.7. Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT ... 29
1.8. Diagnóstico laboratorial das MNT ... 30
1.8.1. Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT): ... 32
1.8.2. Identificação fenotípica das espécies de MNT: ... 33
1.8.3. Identificação genotípica das MNT: ... 35
2. OBJETIVO...39
2.1. Geral:... 39
2.2. Específicos: ...39
3. MATERIAIS E MÉTODOS. ... 40
3.1. Modelo e período de estudo: ... 40
3.2. Amostras clínicas: ... 40
3.3. População de referência: ... 40
3.4. Critérios de elegibilidade: ... 41
3.5. Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não tuberculosa: ... 41
3.6. Critérios de não inclusão: ... 41
3.7. Procedimento laboratorial: ... 42
3.7.1 Identificação fenotípica:... 42
3.7.2. Identificação genotípica:... 42
3.8. Coleta e análise de dados ... 44
3.9. Considerações éticas: ... 45 4. RESULTADOS ...45 5. DISCUSSÃO ...62 6. CONCLUSÃO ...63 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... ... 65 APÊNDICE...71 Apêndice A - Equipe...72 Apêndice B - Cronograma...73 Apêndice C - Orçamento...74
Apêndice D – Procedimento operacional para extração de DNA de Micobactérianão tuberculosa por CTAB...76
Apêndice E - Procedimento operacional padrão para o congelamento e recuperação
de cepa de Micobactéria não tuberculosa ... ..79
Apêndice F - Procedimento operacional padrão para a identificação fenotípica das Micobactérias não tuberculosas por tempo de crescimento e pigmentação ... 82
Apêndice G - Procedimento operacional padrão para inativação e extração de DNA por termobloco de Micobactéria não tuberculosa ... 86
Apêndice H - Procedimento operacional padrão para identificação molecular pelo método PRA-hsp65 ...88
Apêndice I - Procedimento operacional para técnica de purificação de DNA para sequenciamento utilizando PED 8000/ 2,5 M NaCl ... 95
Apêndice J – Procedimento operacional padrão para teste de genética molecular para identificação a partir de material de cultura de espécies de Micobactérias (GenoType Mycobacterium CM/AS) ... 97
ANEXO ...103
Anexo A - Parecer consubstanciado do CEP...104
Anexo B - Modelo da ficha de notificação da Tuberculose ...105
Anexo C - Termo de Dispensa do Consentimento Livre e Esclarecido (TDCLE) ...106
Anexo D - Termo de Compromisso de Utilização de Dados (TCUD) ...107
1. INTRODUÇÃO
1.1. Classificação do gênero Mycobacterium
As micobactérias são classificadas no gênero Mycobacterium com base na sua característica ácido resistente, na presença de ácidos micólicos e no alto conteúdo de guanina e citosina no seu DNA. Sua característica álcool-ácido resistente é visualizada por meio da técnica de coloração Ziehl-Neelsen (ZN), onde um esfregaço da amostra biológica em lâmina é confeccionado, corado e visualizado em microscópio óptico (Figura 1) (1,2).
Figura 1: Baciloscopia – Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl-Neelsen.
Fonte: Gerencia de Tuberculose – FMT/HVD.
Taxonomicamente, pertencem à família Mycobacteriaceae, ordem
Actinomycetales, subordem Corynebacterineae, classe e filo Actinobacteria. É
composto por 165 espécies divididas em três grupos: Mycobacterium leprae; micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis e outras que não pertencem a esse complexo, denominadas micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) (1,25). O gênero Mycobacterium também é classificado de acordo com sua capacidade de produzir doença no homem ou grupo de risco, como raramente patogênicas, potencialmente patogênicas e patogênicas.
1.2. Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS
As espécies de micobactérias que apresentam elevada importância clínica por causar doença pulmonar, extrapulmonar e disseminada são as pertencentes ao complexo Mycobaterium tuberculosis e as MNT (2). Ambas apresentam alta relevância clínica, conferem ao hospedeiro infecção potencialmente grave, possuem diagnóstico clínico e laboratorial semelhantes e apresentam mecanismos de transmissão e tratamento distintos (17).
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 10,4 milhões de pessoas tiveram tuberculose em 2016, cerca de 1,2 milhões de pessoas apresentam coinfecção TB/HIV e 1 milhão morreram por conta da doença. No ano de 2016, foram diagnosticados e registrados 66.796 casos novos de tuberculose no Brasil com coeficiente de incidência de 32,4/100.000 habitantes. O Estado do Amazonas registrou coeficiente de incidência de 67,2/100.000 hab. e ultrapassando o Amazonas, a capital Manaus apresentou coeficiente de incidência de 93,2/100.000 hab. chegando a ultrapassar os valores regionais e nacionais para o mesmo período. Os resultados de testagem para HIV entre os casos novos de TB no Brasil, apontaram para a existência de 9,7% de pessoas com a coinfecção TB-HIV. Cerca de 73,2% dos casos novos de tuberculose realizaram testagem para o HIV no Brasil, seguido do Amazonas com 68,8% e em Manaus com 71,8% (89).
O HIV continua sendo um grande problema de saúde pública mundial, em 2016 foram registrados 2,1 milhões de novas infecções.No Brasil, neste ano, estima-se que tenham ocorrido 48.000 [35.000 – 64.000] novas infecções por HIV, com prevalência de 0,4% a 0,7% em pessoas de 15 a 49 anos – em 2014 (97).
De 2007 até junho de 2016, foram notificados no SINAN 6.868 casos de infecção por HIV na Região Norte (6,3%). A taxa de detecção de HIV/AIDS na Região Norte do Brasil tem apresentado uma tendência linear de crescimento significativo; em 2006 a taxa registrada foi de 15,0 casos para cada 100 mil habitantes, enquanto que no último ano a taxa foi de 24,0 representando um aumento de 61,4% (98).
doenças infecciosas. A TB é responsável por um terço das mortes relacionadas com o HIV/AIDS a cada ano (24).
Até o surgimento da HIV/AIDS não se atribuia grande importância às infecções por MNT, os relatos de doenças pulmonares causadas por esse grupo eram esporádicos (28). Em países industrializados, com uma alta carga de TB, onde o foco tem sido a realização apenas da baciloscopia, a prevalência de MNT em sujeitos com HIV permanece desconhecida, é relatada a baixa realização de cultura para micobactéria na rotina e a dificuldade na elucidação devido a coinfecção MNT/TB, com isso é frequente o uso do tratamento de probabilidade (empírico, sem confirmação), e portanto, uma proporção desconhecida de pacientes podem, de fato, estar infectada com MNT. Mesmo com a introdução do Xpert MTB Rif a partir de 2014, nos resultados positivos, confirma-se TB, mas nos resultados negativos não se afasta a ocorrência de MNT (67).
O impacto das MNT na morbidade e mortalidade dos doentes com HIV/AIDS, estimulou o início de estudos relacionados à epidemiologia, ecologia, genética, biologia molecular e fisiologia das MNT. Além, disso a rápida ascensão das doenças provocadas pelas MNT estimulou o desenvolvimento de métodos rápidos para o seu isolamento e identificação (72).
1.3. História e evolução das Micobactérias não tuberculosas
Estudos revelam que a doença por micobactéria acomete a população humana há milhares de anos, sendo as primeiras evidências referem-se ao estudo de 44 múmias egípcias de faraós jovens, datando de 3.700 a 1.000 A.C. (31). A primeira descrição das micobactérias causando doença no homem ocorreu em 1873, quando o físico norueguês Gerhard Armauer Hansen descreveu alguns “corpos em forma de hastes” a partir de biópsia de paciente com hanseníase (32).
A maioria das espécies de MNT foi descrita no século passado. A designação de micobactérias “atípicas” foi utilizada pela primeira vez por Pinner, em 1935, referindo-se às características distintas que aprereferindo-sentavam em relação ao complexo M. tb e a
M. leprae, em particular ao fato de não serem agentes patogênicos obrigatórios e de
se encontrarem habitualmente no meio ambiente (17).
No Brasil, a importância clínica das MNT foi reconhecida na década de 1938 quando Costa Cruz descreveu o primeiro caso de M. fortuitum isolado de um abscesso cutâneo (29). Após uma década, MacCallum descreveu uma doença de pele causada por uma nova espécie de micobactéria, classificada mais tarde como M. ulcerans. Em 1949, Cuttino e McCabe descreveram um novo microrganismo causando infecção disseminada em uma criança, logo nomearam como ″Nocardia intracellularis”, porém mais tarde foi classificada como M. intracellulare por Runyon (30).
Em 1951, Norden e Linell descreveram “Mycobacterium balnei″ presente em granuloma, posteriormente reconhecido como M. marinum (29). O termo “micobactérias não tuberculosas” foi utilizado pela primeira vez em 1954 por Timpe e Runyon para identificar e diferenciar todas as micobactérias não pertencentes ao complexo M. tuberculosis e M. leprae (30). Com o avanço dos métodos e técnicas de identificação, muitas outras espécies de micobactérias foram descobertas e classificadas.
1.4. Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT)
Os mais importantes complexos de espécies de MNT causadoras de doença no homem são: o complexo M. avium (MAC), o complexo M. fortuitum, complexo M.
celatum, complexo M. abscessus, complexo M. kansasii, complexo M. terrae,
complexo M. simiae e o complexo M. smegmatis (25,37).
Complexo MAC: É composto por espécies capazes de causar doenças em animais e seres humanos, incluem as espécies M. avium, M. intracellulare, M. colombiense,
M. chimaera, M. yongonense (101). Nos hospedeiros imunocompetentes, o MAC afeta
os pulmões em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), podendo causar fibrose pulmonar ou doença pulmonar cavitária (DPC). Em hospedeiros imunodeprimidos, no caso do HIV/AIDS, pode originar infecção sistêmica, causando sobretudo doença disseminada. A espécie M. avium normalmente é isolado de
ambientes como água potável, que se acredita ser uma fonte de infecção para os doentes soropositivos para HIV (37,38).
Complexo M. fortuitum: O complexo M. fortuitum compreende as espécies M.
fortuitum, M. peregrinum, M. mageritense (101). Essas espécies são de crescimento
rápido, geralmente habitam o solo, poeira e água. A identificação dessas micobactérias é importante para estabelecer a terapêutica adequada, visto que possuem diferentes padrões de resistência aos farmacos. As doenças causadas por essas espécies incluem raramente as formas pulmonares (56).
Complexo M. abscessus: O complexo M. abscessus é constituído por três espécies:
M. chelonae, M. abscessus e M. immunogenum (101). São frequentemente
resistentes a fluorquinolonas, sulfametoxazol, doxiciclina e sensíveis a claritromicina, amicacina, tigeciclina e imipenem. Em 2001, M. immunogenum foi descrita e isolada pela primeira vez de fluídos utilizados para a lubrificação e arrefecimento de máquinas industriais (41). Causa doença pulmonar em indivíduos com comprometimento pulmonar prévio como TB anterior e fibrose cística além de causar infecções pós-operatórias e pós-procedimentos causando doenças de pele e tecidos moles, infecções do sistema nervoso central, bacteremia e infecções oculares (42).
Complexo M. terrae: O complexo M. terrae é composto pelas espécies M. terrae,
M. nonchromogenicum, M. hiberniae, M. sinense, M. senuense, M. engbaekii (101). A
colonização do epitélio humano por estas micobactérias é rara e geralmente são consideradas como não patogênicas, no entanto em casos de imunossupressão, M.
nonchromogenicum pode ocasionalmente causar doença no homem, tais como
infecções pulmonares e tendinopatia. Nos últimos anos um número crescente de infecções causadas por estes organismos foi associado à coinfecção com HIV/AIDS (48).
Complexo M. kansasii: O complexo M. kansasii inclui as espécies M. gastrii e M.
kansasii (101). O M. kansasii é uma micobactéria não tuberculosa que pode causar
Complexo M. simiae: O complexo M. simiae é composto por várias espécies filogeneticamente relacionadas, as quais incluem: M. interjectum, M. florentinum, M.
sherrisii, M. triplex, M. palustre, M. bohemicum, M. nebraskense, M. europaeum (101).
Este complexo pode apresentar manifestações clínicas e imagens pulmonar no radiograma torácico semelhantes ao da TB e resistência aos fármacos anti-TB associada a indivíduos com TB anterior (99).
1.5. Transmissão e formas clínicas da doença por MNT
Existem poucos relatos sobre a transmissão direta de pessoa para pessoa, por meio de tosse ou espirro. Há relatos de infecção adquirida a partir do meio ambiente, pela ingestão ou inalação de água e por meio de inoculação provocada pela inadequada desinfecção e manuseio de equipamentos médicos em procedimentos cirúrgicos, vacinação e videocirurgias (6). Procedimentos invasivos como acupuntura, tatuagens e piercings também são relatados como possíveis focos de transmissão (33). Por meio da análise de DNA verificou-se que estripes de várias espécies recuperadas a partir de amostras ambientais de água, solo e aerossóis, eram idênticas às isoladas de vários doentes (22).
Indivíduos com doenças cardiovasculares, hepatite C, HIV/AIDS, transplantes, diabetes, alterações estruturais pulmonares como a Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), câncer, imunossupreção genética, artrite reumatóide e doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) apresentam predisposição a desenvolver infecção por MNT. As manifestações clínicas da infecção por MNT compreendem as formas pulmonar, extrapulmonar e disseminada, pois acomete pele, órgãos, trato respiratório, sangue, medula e ossos (68).
Forma pulmonar: A partir dos anos 80, começaram a surgir relatos de grandes séries de doenças pulmonares causadas por MNT, em sua maioria associada à imunossupressão (28). A infecção pulmonar por MNT, foi descrita pela primeira vez em fumantes idosos do sexo masculino com alterações estruturais pulmonares (doença pulmonar cavitária ou enfisema). A DPOC, a bronquiectasia, o enfisema, a pneumoconiose, a tuberculose anterior, a silicose, a proteinose alveolar pulmonar e a deficiência de α-1-antitripsina são alguns dos principais determinantes do
desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT no início da fase adulta. Embora a fibrose cística, causada por mutações no regulador da condutância transmembrana na fibrose cística (CFTR) e a discinesia ciliar primária (doença autossômica recessiva), geralmente presentes na infância ou adolescência, também causem susceptibilidade, nos casos de alguns pacientes com mutações hipomórficas as infecções podem ter apresentação tardia ou atípica (8,69). Os casos da doença pulmonar por MNT em imunocompetentes estão em sua maioria associados ao trabalho em condições de constante exposição a poeira. Nestas situações clínicas, as características da doença pulmonar por MNT é muito semelhante as da TB (36).
Existem casos onde ocorre a repressão habitual da tosse favorecendo o desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT, esses casos são associados a doenças neuromusculares, sequelas de acidente vascular cerebral e a síndrome de Lady Windermere. Essa síndrome ocorre principalmente em mulheres, não-fumantes e na pós-menopausa, sem qualquer fator predisponentes conhecido, as pacientes, tendem a apresentar escoliose, depressão do esterno, costelas na frente do tórax (Pectus Excavatum) e prolapso da válvula mitral (9). O lobo médio e língula estão predispostos a inflamação crônica por causa de suas estruturas anatômicas específicas e incapacidade para limpar as secreções das vias respiratórias devido à supressão da tosse, predispondo a bronquiectasia e infecção (8, 70).
Forma extrapulmonar: Em indivíduos adultos e imunocompetentes, as infecções causadas pelas MNT na pele, articulações, tendões e nos ossos estão frequentemente associadas com traumatismos e feridas cirúrgica (73, 30). Em crianças, os locais de infecção mais frequentes são a pele e os nódulos linfáticos. As infecções causadas por M. haemophilum ou M. chelonae são geralmente caracterizadas por nódulos subcutâneos ou abcessos.
Forma disseminada: Em doentes soropositivos para HIV, a doença provocada pelas MNT é geralmente disseminada (71). Nos casos de pacientes soronegativos para HIV, déficit na resposta celular Th1 associados a defeitos imuno genéticos, como mutações autossômicas das interleucinas (IL), interferon (IFN) e seus receptores específicos (IL12, IL12RB1, ISG15, IFNGR1, IFNGR2, STAT1 e IRF8), mutações no cromossomo X (IKBKG e CYBβ), deficiência GATA2 e auto-anticorpos anti-IFN-γ,
predispõem susceptibilidade, tanto na infância quanto na idade adulta, levando a óbito quando não tratada precocemente e/ou de maneira correta (8).
1.6. Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas 1.6.1. Dados mundiais
A frequência das descrições dos casos de infecções por MNT vem aumentando juntamente com o declínio significativo da taxa de incidência de TB em países industrializados. Em contraste com o M. tuberculosis, cuja notificação é obrigatória no mundo, as infecções por MNT ainda não geram notificação, fora os casos de MNT pós cirúrgia. A ausência de vigilância epidemiológica resulta na escasses de dados sobre a sua incidência, prevalência incidência, morbi/mortalidade, e os fatores associados (52). Os sintomas gerais causados pelas MNT não podem ser distinguidos de sintomas observados em casos de TB, e as aparências das bactérias não podem ser diferenciadas quando examinadas por microscopia de luz (78). Portanto, há consenso entre os autores de que é fundamental o diagnóstico laboratorial das MNT, pois a sintomatologia, imagens no radiograma torácico e resultados da baciloscopia não permite dinstingui-las de infecção por TB.
A não realização de cultura para micobactéria ou a não identificação das espécies de micobactéria nos exames de cultura positiva para micobactéria podem levar a resultados falso-positivos para diagnóstico de TB e tratamento medicamentoso inadequado para o controle micobacteriano (77).
Na detecção das espécies pertencentes às MNT, um estudo na Ásia, revelou que MAC foi a principal causa de infecção pulmonar, correspondendo à 68% dos casos (50). Em 2002, avaliando a prevalência de doença pulmonar por MNT no mundo, foi observado uma predominância de MAC entre os agentes causadores de doença pulmonar também na Ásia (51).
A infecção pulmonar por MNT pode estar associada à mortalidade em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), o tratamento anti-MNT é a solução adequada para melhores resultados de terapia. Em um estudo retrospectivo na UTI de um centro
médico em Taiwan, de janeiro de 1999 a junho de 2007, foi descrito que as infecções pulmonares por MNT estavam relacionadas, em sua maioria, as espécies do complexo M. avium e M. abscessus. A proporção de mortalidade em 5 anos foi em torno de 34-69% (53).
Numa revisão sistemática e meta- análise realizada em 2015, foi relatada uma prevalência relativamente alta de infecções por MNT (10,2%) entre os casos positivos para TB, isso demonstrou a necessidade de uma maior aplicação de estratégias de controle da infecção, estabelecimento de critérios de diagnóstico apropriados e diretrizes para o manuseio de doenças por MNT além de expandir a qualidade dos laboratórios de referência regionais facilitando mais a prevenção e controle dessas infecções (3).
Num estudo mais recente, com a colaboração mundial de 62 laboratórios, realizado pelo MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET) junto ao Tuberculosis Network European TrialsGroup (TB-NET) avaliou-se em 30 países e em 6 continentes (Europa, Ásia, América do Norte, América do Sul, África do Sul e Austrália) 20.182 pacientes positivos para MNT, cultivadas em meio de cultura sólido provenientes de amostras respiratórias de escarro. Nesse estudo os membros do complexo MAC predominaram na maioria das regiões embora M. xenopi na Hungria e M. kansasii na Polônia e na Eslováquia. A distribuição relativa dos membros do complexo MAC revelou diferenças geográficas, enquanto M. avium predominava nos centros da América do Norte, América do Sul e na Europa, M intracellulare foi frequentemente isolada na África do Sul e Austrália. Na América do Sul o complexo MAC correspondeu a 31% dos isolados, seguido de M. abscessus e M. fortuitum com 16%, M. kansasii foi a segunda espécie mais isolada na América do Sul e M. gordonae a terceira mais isolada (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM). Distribuição de MNT Distribuição de MAC Europa MAC (37%), MCR (16%), M. gordonae
(17%), M. kansasii (5%), M. xenopi (14%), M. malmoense (1%), MCL (10%) M. avium (47%), complexo M. avium (22%), M. intracellulare (8%). América do Norte MAC (52%), MCR (20%), M. xenopi (12%), M. gordonae (12%), MCL (3%), M. kansasii (1%). M. avium (78%), complexo M. avium (14%), M. intracellulare (8%). América do Sul MAC (31%), MCR (21%), M. kansasii (20%), M. gordonae (17%), MCL (11%). M. avium (64%), complexo M. avium (23%), M. intracellulare (13%). Autrália MAC (71%), MCR (15%), MCL (8%), M. kansasii (4%), M. gordonae (1%). M. intracellulare (80%), M. avium (20%). Ásia MAC (54%), MCR (31%), MCL (6%), M. gordonae (6%), M. kansasii (3%). M. avium (45%), complexo M. avium (39%), M. intracellulare (16%). África do Sul MAC (50%), MCL (33%), MCR (7%), M. gordonae (5%), M. kansasii (3%), M. xenopi (1%). M. intracellulare (77%), M. avium (21%), complexo M. avium (2%). Total MAC (47%), MCR (16%), MCL (14%), M. gordonae (11%), M. xenopi (8%), M. kansasii (3%), M. malmoense (1%). M. avium (47%), M. intracellulare (38%), complexo M. avium (15%).
*MCR: micobactérias de crescimento rápido; MCL: micobactérias de crescimento lento. Fonte: MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET).
A distribuição das espécies de MNT em um país pode ter profundo impacto sobre as frequências e manifestações da doença pulmonar por MNT em cada região sendo necessários estudos futuros para abordar os diferentes nichos ambientais específicos de cada espécie (96).
1.6.2. Dados da América Latina e Brasil
Na prática clínica diária é observado um número crescente de cirurgias cosméticas realizadas principalmente na América Latina e Caribe associado com o aumento no número de casos de infecções por MNT (55). Houve relatos de focos de infecções por
M. abscessus em feridas cirúrgicas resultantes de procedimentos de abdominoplastia
na República Dominicana e Colômbia (54). O envolvimento da espécie M. fortuitum em infecções de sítio cirúrgico é bem documentado, pode ocorrer em ferida esternal após cirurgia cardiotorácica ou após cirurgia de aumento de mama devido a contaminação da ferida com água da torneira contaminada, no ato do banho (56,57). Recentemente tem sido descrito infecções por MNT em idosos após uso da banheira “escalda-pés” em salões de manicure e pedicure (58,59).
Na América Latina,um estudo realizado em 2014 em um hospital na Colombia, descreveu a prevalência dos casos de MNT em 9,1%, onde o principal fator de risco foi a infecção pelo HIV sendo a forma clínica pulmonar a mais predominante (56,6%) (52).
No Brasil são escassos os casos publicados de infecções por MNT, as publicações em sua maioria referen-se a ceratite por M. chelonae, após cirurgia para correção de miopia, infecções cutâneas por M. abscessus e M. fortuitum após aplicações em mesoterapia ou cirurgia plástica e publicações sobre o risco crescente de infecções por essas espécies de micobactérias em pacientes submetidos a procedimentos médicos invasivos. Em razão da não obrigatoriedade da notificação, estima-se que no Brasil ocorra subnotificação de MNT associada às cirurgias (33).
No Estado do Rio de Janeiro, entre 1993 e 2011 as espécies de MNT mais foram
M. kansassi (33,9%) e complexo MAC (30,4%) destes 9,8% eram soropositivos para
o HIV (61). Em um estudo no estado de São Paulo, foram estudadas 1.892 cepas de MNT entre os anos de 1991 a 1997, desse estudo foi possível estabelecer as manifestações clínicas ocorridas naquele período, 48% foram de origem pulmonar, 29,3% sangue e medula óssea e 15,8% de outras formas extrapulmonares, a associação desses casos com o HIV não foi descratada (28).
Segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), no período de 1998 a 2009,foram notificados cerca de 2.520 casos de infecção por micobactérias de crescimento rápido (MCR), sendo 1.107 casos relatados no estado do Rio de Janeiro, 363 no Espírito Santo, 327 no Pará,193 em São Paulo,149 no Paraná,115 no Rio Grande do Sul, 95 em Goiás, 50 no Mato Grosso, 33 no Distrito Federal,31 em
Minas Gerais,11 no Piauí,11 na Bahia, 9 no Ceará,6 em Santa Catarina, 5 em Sergipe, 5 em Pernambuco, 3 em Alagoas, 2 no Tocantins, 1 em Roraima, 1 no Rio Grande do Norte, 1 na Paraíba, 1 no Amazonas e1 no Acre (6,63).
Entre as micobactérias de crescimento rápido o agente etiológico prevalente na maioria das cidades brasileiras foi a M. massiliense, exceto nas infecções secundárias a mamoplastias, nas quais a maior prevalência foi de M. fortuitum. Outras espécies de MCR foram identificadas: M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. smegmatis e
M. wolinskyi (62,63). Mesmo com o número elevado de casos notificados de infecção
por MCR, entre as espécies potencialmente patogênicas, as micobactérias de crescimento lento (MCL) pertencentes ao complexo MAC e M. kansasii são as mais comumente isoladas no Brasil, ambas causam principalmente infecção pulmonar (63).
1.6.3. Dados da região Norte do Brasil
Um estudo realizado na Região Norte do Brasil, mais precisamente no estado de Roraima, avaliou no período de dois anos, 1.812 casos suspeitos de TB pulmonar. Nesse estudo foi possível identificar causando doença pulmonar 369 (20%) casos positivos para TB e 75 (4%) casos positivos para MNT. Dentro do último grupo foi possível identificar 14 espécies por meio de métodos de diagnóstico molecular: M.
abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. gilvum, M. gordonae, M. asiaticum, M. tusciae, M. porcinum, M. novocastrense, M. simiae, M. szulgai, M. phlei e M. holsaticum. Nesse estudo 13 isolados não puderam ser identificados a nível de
espécie devido as limitações de reprodutibilidade que o método de cultura sólida impõe (65).
No Estado do Pará, em dados coletados nos anos de 1999 a 2010, observou-se que a espécie predominante nas formas clínicas pulmonares foi a M. massiliense. No período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011, M. massiliense foi novamente a espécie mais encontrada, com 44,8% dos casos (66).
Em 2013, outro estudo, realizado em Belém do Pará, 64,2% dos pacientes que manifestaram doença por MNT tinham acesso a um abastecimento de água por meio de sistemas de tubulações. Esta informação é importante porque, mesmo em zona
urbana, o abastecimento de água ainda é precário, cerca de 75% dos lares tem acesso a um abastecimento de água, sendo menor a cobertura em áreas urbanas periféricas, de acordo com o Censo Brasil 2010 (67).
Na cidade de Manaus, em 2009, num outro estudo investigou-se a presença de MNT em águas de torneira, soluções e luvas cirúrgicas, utilizadas nas etapas dos procedimentos cirúrgicos executados no centro cirúrgico do Hospital Universitário Getúlio Vargas (HUGV). Foram coletadas e analisadas 105 amostras sendo: 24 de águas (coletadas das 2 torneiras existentes no centro cirúrgico), 8 de solução de povidine e 7 de solução de clorhexidina, que servem para a higienização das mãos dos cirurgiões; 39 de luvas cirúrgicas (superfícies internas e externas); e 27 de soluções que foram efetivamente utilizadas durante o ato cirúrgico. Obteve-se 41 isolados micobacterianos apenas de águas das torneiras. O não isolamento de MNT nas soluções utilizadas para higienização das mãos e luvas dos cirurgiões bem como nos procedimentos cirúrgicos, indica que essas soluções têm sido eficazes na eliminação de micobactérias. Entretanto, a presença de M. mucogenicum nas águas das torneiras do centro cirúrgico, espécie já associada a surtos pós-cirúrgicos, indica que devem ser efetuados procedimentos de limpeza e monitoramento em todos os pontos de distribuição de águas, visando à prevenção de surtos de micobacterioses nosocomiais (91).
Na Região Amazônica, a predominância de pessoas da cor parda está relacionada a alta heterogenia, essa diversidade genética pode estar associada ao aumento da susceptibilidade a desenvolver infecção por MNT, porém são necessários mais estudos para comprovação. Sabe-se que pescadores e outras pessoas expostas aos peixes estão em risco de desenvolver infecções de pele causadas por M.
marinum. Em crianças de 18 meses a 5 anos de idade o risco de desenvolver
linfadenite cervical por M. avium está associado a exposição a viveiros de aves. A imunodeficiência, também é um fator de risco para a população dessa região, devido à infecção pelo HIV ou imunossupressão nos casos de câncer e quimioterapia (67).
1.7. Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT
Os sintomas da doença pulmonar por MNT são variáveis e não específicos em alguns casos, nos quais o diagnóstico laboratorial não pode ser realizado, o médico pode confirmar o caso pelo critério clínico-epidemiológico. No entanto, praticamente todos os pacientes tem tosse crônica ou recorrente como na TB. Outros sintomas incluem tosse com expectoração, fadiga, mal-estar, dispneia, febre, hemoptise, dor no peito e perda de peso. Nesses casos o curso da doença é progressivo, causando sintomas persistentes, declínio da função pulmonar e uma piora na qualidade de vida. Além disso, pode também seguir um curso fulminante com insuficiência respiratória aguda (64).
O estabelecimento de um diagnóstico de doença por MNT não é simples, o seu isolamento em amostras pulmonares e extrapulmonares não é por si só, diagnóstico de doença, devido contaminação transitória, exigindo o cumprimento dos critérios clínicos e microbiológicos, tais como a presença de sintomas clínicos, evidência radiográfica de lesões compatíveis com doença para as definições de caso sejam feitas. Na tabela 2 estão descritos os critérios de patogenicidade das MNT de crescimento rápido proposto pela ANVISA (63,74).
Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT:
Suspeito Possível Provável Confirmado
Paciente submetido a procedimentos invasivos que apresente dois ou mais sinais referidos como clínica compatívele achados radiológicos.
Paciente que preenche os critérios de caso suspeito, mas sem investigação laboratorial, e que respondeu ao tratamento específico para micobactérias. Paciente que preenche os critérios de caso suspeito, que apresente manifestações clínicas compatíveis com baciloscopia positiva, mas cultura negativa para micobactéria. Paciente que preenche os critérios de caso suspeito e apresenta mais de uma cultura positiva para micobactéria e baciloscopia.
Fonte: Brasil, ANVISA 2010. Relatório descrito de investigação de casos de infecções por micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) no Brasil no período de 1998 a 2009.
Os achados radiológicos auxiliam nas definições de casos de infecção por MNT, mas não diferenciam dos casos de TB. Os achados mais comuns nas infecções pulmonares por MNT são a bronquiolite, bronquiectasias, nódulos, consolidação, e menos frequentemente cavidades (10). Porém, um estudo em Israel, relacionou achados radiológicos de duas espécies de MNT, M. kansasii estava associada à achados radiológicos com mais cavidades e M. simiae à infiltrados pulmonares. Esses achados revelaram que para M. kansasii existe uma predileção para a doença de lobo superior ao passo que a infecção por M. simiae maior probabilidade de doença lobo médio e inferior. Os derrames pleurais e linfadenopatia foram encontradas apenas na presença de infecção por M. simiae (75).
1.8. Diagnóstico laboratorial das MNT
O número elevado de espécies circulantes de MNT e de seu isolamento ser possível na maioria dos espécimes biológicos e ambientais leva os laboratórios a desenvolver e/ou aplicar métodos mais eficientes e rápidos para a detecção e
caracterização das micobactérias, incluindo métodos de cultura mais sensíveis, melhoramento das técnicas de identificação e dos testes de susceptibilidade aos antibióticos. É importante que os laboratórios recebam as amostras coletadas corretamente, evitando falsos diagnósticos resultantes de amostras contaminadas (26,36). Os tipos de amostras para diagnóstico de MNT são: escarro, escovado ou lavado broncoalveolar (LBA), biópsia pulmonar, peças cirúrgicas (ósseas, linfáticas, pele), secreções de feridas, sangue e medula óssea (57).
A presença de MNT numa amostra clínica pode ter três significados:
1. A micobactéria é o agente etiológico, e neste caso o diagnóstico microbiológico deve ter como base os sinais clínicos e isolamento repetido da micobactéria em uma segunda amostra, ou por um único isolamento no caso das amostras colhidas de forma asséptica;
2. A micobactéria colonizou a amostra, mas não tem significado clínico. Isto resulta frequentemente da utilização de equipamento contaminado, geralmente provenientes de água canalizada. Casos assim não são raros e causam o que é designado de ″pseudoinfecção″;
3. A detecção de micobactéria na amostra clínica teve origem numa contaminação do laboratório (soluções de descontaminação contaminadas ou contaminação devido a outra amostra positiva), sendo fácil de verificar, caso a mesma micobactérias seja isolada a partir de outras amostras analisadas no mesmo dia (19,20);
4. Micobacteria isolada sem significância clínica – não sendo causa real de infecção, significância clínica (3 amostras) isoladas de locais diferentes CUIDADO* ligação com a clínica – valorização clínica – mais de uma amostra; dias consecutivos e isoldadas de locais diferentes.
Na tabela 3 estão descritos os critérios clínicos, radiológicos e laboratoriais para definir caso de infecção pulmonar por MNT de crescimento rápido ou tardio, segundo a ANVISA:
Critérios clínicos e radiológicos:
1. Sintomas respiratórios associados a opacidade nodulares ou cavidades e/ou
na radiografia e/ou bronquiectasias e múltiplos pequenos nódulos na tomografia computadorizada de tórax.
e
2. Exclusão de outros diagnósticos, especialmente tuberculose. Critérios microbiológicos:
1. Cultura positiva em duas amostras de escarro. ou
2. Uma cultura positiva por escovado ou lavado broncoalveolar (LBA). ou
3. Biópsia pulmonar: processo inflamatório granulomatoso crônico e/ou BAAR no
tecido associado à cultura positiva em tecido, escarro ou LBA.
Fonte: Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA 2010). Relatório descrito de investigação de casos de infecções por micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) no Brasil no período de 1998 a 2009.
1.8.1. Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis
das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT):
As características culturais (morfologia das colônias e pigmentação), temperatura, taxa de crescimento e testes bioquímicos diferem entres as espécies do complexo M.
tb e as MNT (21). Os métodos de cultura e os testes bioquímicos são morosos e
laboriosos, podem levar várias semanas, além disso não são totalmente elucidáveis, deixando lacunas de diagnósticos quando ocorre a falta de reprodutibilidade da cepa em meio de cultura (25). A variabilidade de estirpes presentes numa mesma espécie, pode levar a uma variabilidade nos resultados dos testes bioquímicos, podendo também ocorrer espécies diferentes com morfologias e perfis bioquímicos indistinguíveis ou muito idênticos (63,64).
Apesar das dificuldades enfrentadas, os laboratórios que realizam cultura para micobactérias devem ser capazes de primeiramente separar espécies do complexo
M.tb das MNT através de testes fenotípicos, do contrário terão que reportar o resultado
laboratório de referência para realização da identificação da espécie por método molecular (1).
A separação das espécies do complexo M. tuberculosis das MNT pode ser realizada por meio de quatro testes fenotípicos partindo do primo-cultivo: análise microscópica da cultura, inibição de crescimento em meio de cultura LJ-PNB (Lowenstein Jensen – ácido p-nitrobenzóico) e teste da Niacina.
A análise microscópica da cultura consiste na confecção de um esfregaço de uma alçada da colônia, que é corada com fucsina de ZN. Esse teste avalia a pureza da cultura, a presença de BAAR e a formação de corda (Figura 2). A maioria das MNT não formam fator corda, exceto M. kansasii, M fortuitum e M. chelonae (1,21).
a. Complexo M.tb b. MNT Figura 2: Esfregaços de cultura de micobactérias.
Fonte: Gerência de Tuberculose – FMT/HVD
O teste de inibição de crescimento em meio com ácidop-nitrobenzóico 500 µg/ml (PNB) é um teste utilizado na separação das espécies do complexo M.tb das MNT através da cultura, todas as espécies do complexo M.tb não crescem nesse meio ao contrário da maioria das MNT. As espécies de MNT que eventualmente podem não crescer em presença de PNB é o M. kansasii, M. xenopi e M. gastri (79).
1.8.2. Identificação fenotípica das espécies de MNT:
teste de identificação fenotípico das espécies de MNT, as diferentes espécies inclusas a esse grupo também possuem diferenças terapêuticas (1,21). Os testes de identificação fenotípico tem como base as características culturais e bioquímicas, tais como: tempo e temperatura de crescimento, pigmentação e testes bioquímicos (1,35). Em 1958, Runyon propôs a classificação das MNT em quatro grupos, baseando-se na pigmentação e tempo de crescimento das colônias em meio de cultura sólido (OK e/ou LJ). As espécies que apresentam crescimento após sete dias são classificadas como micobactérias de crescimento lento (MCL) e aquelas que apresentam crescimento em menos de sete dias, micobactérias de crescimento rápido (MCR). As micobactérias pigmentadas produzem intensamente carotenoides amarelos (Figura 3), que podem ser estimulados pela exposição à luz, estes são denominados organismos fotocromogênios ou quando produzidos na ausência de luz, organismos escotocromogênicos, além das micobactérias não pigmentadas (43).
Figura 3: Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e escotocromógenas. Fonte: Gerência de Tuberculose – FMT/HVD
Esse esquema de identificação auxilia a elucidar possíveis lacunas de diagnóstico, todavia, uma micobactéria pigmentada ou de crescimento rápido não deve ser confundida com M. tuberculosis (Tabela 4) (1,4).
Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon. São apresentadas algumas espécies exemplificativas de cada um dos grupos:
Grupo Característica da cultura
I Fotocromógenas: Crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem pigmento amarelo somente quando expostas à luz. Exemplo: M. kansasii,
M. marinum.
II Escotocromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Exemplo:
M. gordonae, M. szulgai.
III Acromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; Culturas não produzem pigmento. Exemplo: M. avium, M. terrae.
IV Crescimento rápido: Caracteriza-se pelo crescimento rápido das colônias; Colônias podem ser pigmentadas ou não. Exemplo: M. fortuitum, M.
chelonae, M. abscessos.
Fonte: Leão SC, Martin A, Mejia GI, Palomino JC, Robledo J, Telles MA da S, Portaels F. 2005. Practical Handbook for the phenotypic and genotypic identification of Mycobacteria.
1.8.3. Identificação genotípica das MNT:
Devido a demora no diagnóstico de infecções provocadas pelas MNT, tornou-se necessário o desenvolvimento de métodos de identificação molecular, com uma boa relação custo-benefício e que acima de tudo sejam mais eficazes quando comparados aos métodos convencionais. Estes métodos incluem testes baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sequenciamento de DNA, sondas genéticas, entre outros (1).
O atraso de diagnóstico tem um impacto importante na escolha do tratamento mais adequado do doente, quanto mais precoce o diagnóstico mais eficaz o tratamento com uma maior chance de cura. O diagnóstico molecular consiste na análise do material genético do microrganismo através de regiões específicas do genoma de cada espécie, esta metodologia é específica e tem sido empregada na maioria dos laboratórios, estes métodos têm cada vez mais importância, porque são
mais rápidos e precisos que os métodos convencionais e na maioria dos casos, produzem resultados mais confiáveis (82).
Para esse tipo de metodologia é necessário que seja realizado previamente a extração do DNA, que pode ser realizado através de vários métodos de digestão de membrana como: método enzimático por brometo de cetil trimetilamonio (CTAB), extração por choque térmico e banho ultrasônico (1).
Kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS:
Estão disponíveis no mercado o sistema da linha GenoType® (Hain Lifescience, Nehren, Alemanha). O kit comercial GenoType® Mycobacterium CM (do inglês “Common Mycobacteria”) e o GenoType® Mycobacterium AS (do inglês “Additional Species”), juntos são um teste molecular que se baseia em uma técnica de PCR por segmentação de uma região do gene 23S rRNA, seguida de hibridização reversa para uma fita de nitrocelulose, permitindo a identificação genética molecular simultânea de M. complexo de tuberculosis e 24 das espécies de MNT mais comuns a partir das culturas positivas. O procedimento completo é dividido em três passos: extração do DNA de cepa cultivada em meio de cultura sólido, amplificação através de técnica de PCR multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa, realizado no prazo máximo de 2 dias. A determinação da espécie é realizada com a ajuda de uma tabela de interpretação (83).
O GenoType® Mycobacterium CM permite a identificação do complexo M. avium,
M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum-M. ulcerans, M. peregrinum, M. xenopi e o complexo M. tuberculosis. O GenoType® Mycobacterium AS permite a identificação de espécies adicionais de MNT,
nomeadamente M. simiae, M. mucogenicum, M. goodie, M. cellatum, M. smegmatis,
M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. phlei, M. hemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. shimoidei (85).
PRA-hsp65 (Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65).
O PRA-hsp65 (do inglês Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65) é uma técnica não comercial, “in house” que tem apresentado uma boa eficácia na identificação de espécies das MNT, se baseia na amplificação do gene
hsp65 e posterior análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas
de restrição BstEII e HaeIII. Foi descrito por Telenti e col. em 1993. Esse método diferencia amaioria das espécies MNT, mas não as do complexo M. tuberculosis. As variações na sequência do gene hsp65 podem ser exploradas para a identificação ao nível da espécie tanto em micobactérias de crescimento lento como em espécies de crescimento rápido (1).
Resumidamente, um fragmento de 441 pares de base (pb) do gene hsp65 é amplificado por reação de PCR e digerido por duas enzimas de restrição, BstE II e
Hae III. O produto dessa reação é submetido a análise através de eletroforese em gel
de agarose e a determinação das espécies é feita através da leitura desse gel, de acordo com o perfil dos pares de base obtidos a partir da digestão de cada enzima específica. A determinação dos perfis eletrosféricos são comparados aos padrões de restrição de vários algoritmos encontrados no sistema on-line PRASITE através da página eletrônica: http://app.chuv.ch/prasite/index.html (84).
Ambos os testes acima descritos são os mais utilizados e tem mostrado bons resultados na identificação das espécies das MNT bem como amostras mistas (MNT e TB) (83). Porém é importante lembrar que o método PRA-hsp65, não permite a diferenciação entre algumas espécies de micobactérias, devido a superposição de perfis de várias espécies distintas, necessitando o sequenciamento para complementação do resultado nessas situações (92). Apesar dessas limitações, o método PRA-hsp65 pode ser utilizado para a identificação preliminar das espécies de MCR mais frequentes (85).
Sequenciamento de genes:
As definições de espécies, inicialmente baseadas em testes fenotípicos, atualmente estão sendo baseadas no sequenciamento de vários genes essenciais ao metabolismo da célula bacteriana (48). O sequenciamento é a técnica molecular mais sensível, considerada padrão-ouro dos métodos da biologia molecular e é constantemente utilizada em estudos de identificação das espécies de micobactérias
(92). A identificação é feita através da comparação das sequências de nucleotídeos obtidas com as sequências de referência presentes em várias bases de dados. Geralmente é necessário apenas uma única reação de sequenciamento para uma identificação definitiva (93).
Este método permite também a detecção direta de espécies de micobactérias que não cresceram em meios de cultura além de identificar diversas espécies possivelmente não conhecidas. Porém o sequenciamento, no entanto é um método dispendioso e necessita de técnicos e equipamento especializados, ou na ausência dos mesmos, de se recorrer a empresas especializadas (93).
Essa técnica utiliza fragmentos de regiões específicas do genoma das micobacterias: hsp65, rpoB e 16S rRNA. Dentre estas regiões gênicas, o sequenciamento do gene hsp65 é o mais utilizado a nível de espécie e subespécie (92).
O sequenciamento do gene rpoB é usado como alternativa não só para identificar, mas também diferenciar as MNT entres os grupos de crescimento lento e crescimento rápido (93).
O impacto na magnitude exata das infecções por MNT em países onde a TB é endêmica ainda não são conhecidos. A Região Norte do Brasil é endêmica para os casos de TB e está em constante processo de expansão devido à industrialização gerada pela Zona Franca de Manaus, é detentora da maior bacia hidrográfica e é o berço da maior parte da biodiversidade existente do mundo, possivelmente abrigue em seu ecossistema a maior parte das micobatérias. Além disso, segundo dados do Ministério da Saúde, em 2014, está no ranking das unidades da Federação com as maiores taxas de detecção e mortalidade para o HIV/AIDS. Esses fatores apontam para a necessidade de estudos mais detalhados na população da Região Norte elucidando a relação entre TB/MNT/HIV.
Devido à escassez de dados de incidência, prevalência e mortalidade nos casos de MNT/HIV na Região Amazônica são necessários estudos a fim de estabelecer critérios clínicos e bacteriológicos para que se possa notificar e tratar de maneira mais eficaz.
Como as técnicas de identificação de MNT ainda não estão bem estabelecidas, aumenta a necessidade do desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial, bem como a avaliação das técnicas existentes. Dessa forma, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA para a confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS (86).
Considerando que ainda não foram elucidadas as questões epidemiológicas das MNT nessa região e nem sua interação com os pacientes que soropositivos, esse estudo cooperará para o andamento da formulação dos critérios de controle, diagnóstico e tratamento de MNT na Região Amazônica.
Visando priorizar a adequação terapêutica e obter dados que possam ser revisados a qualquer momento, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA. Portanto, a confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS, é realizada através do sequenciamento genético (86).
Com aumento de casos de infecções por MNT aumenta a necessidade da inovação dos métodos de diagnostico laboratorial bem como a criação de técnicas mais precisas para a identificação das espécies de MNT, que hoje são laboriosos e dispendiosos.
2. OBJETIVO
2.1. Geral:
Descrever e caracterizar as espécies de micobactérias não tuberculosas isoladas de amostras clínicas de pacientes com suspeita de TB atendidos em uma unidade de referência no Estado do Amazonas.
