CONCEITO: OBJETIVO: EQUIPAMENTOS: INSUMOS: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA PURIFICAÇÃO DE DNA PARA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO POP Nº 006 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. ½ PURIFICAÇÃO DE DNA UTILIZANDO PEG 8000/2.5 M NaCl ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima
APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose
REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti
APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos
Tornar o material genético livre de impurezas para a análise das sequencias genômicas
Submeter o DNA extraído à precipitação em solução de PEG 8000/2.5 M NaCl antes do procedimento de sequencimento genético a fim de remover impurezas que dificultam a análise das sequências genéticas.
a) Cabine de Segurança Biológica (CBS); b) Termobloco;
c) Microcentrífuga; d) Vortéx
a) Microtubo 1,5 mL;
b) Ponteiras com barreira estéreis; c) Etanol 70% (GELADO);
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA PURIFICAÇÃO DE DNA PARA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO POP Nº 006 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/2 PURIFICAÇÃO DE DNA UTILIZANDO PEG 8000/2.5 M NaCl ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima
APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose
REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti
APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos
1. Em um microtubo de 1,5 mL adicionar 600 μL de PEG 8000/ 2,5 M NaCl;
2. Transferir os conteúdos dos tubos de PCR para os tubos preparados com o PEG e misturar com a pipeta;
3. Incubar no termobloco por 15 minutos à 37ºC; 4. Centrifugar em 13.000 rpm por 10 minutos;
5. Descartar com a pipeta o sobrenadante e lavar o pellet com 500 μL de etanol à 70% GELADO por inversão;
6. Centrifugar em 13.000 rpm por 5 minutos;
7. Descartar o sobrenadante por inversão, secar a borda com papel toalha e secar em termobloco a 90º-92ºC por 2-4 minutos com a tampa aberta (ou a 37ºC por 20-25 minutos);
8. Deixar em repouso fora do termobloco por pelo menos 30 minutos, ou de um dia para o outro; 9. Adicionar 20 μL de água Mili-Q em cada tubo;
10. Colocar no termobloco a 37ºC por 30 minutos; 11. Vortexar 30 segundos;
12. Armazenar à -20ºC.
1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias – Ministério da Saúde, 2008;
2. Lima, AS. Fatores e espécies de micobactérias não tuberculosas associadas aos casos de micobacterioses pulmonar e extrapulmonar no Estado de Pernambuco - Recife: [s.n.], 2014;
3. Cardoso CM. Avaliação de técnicas moleculares para identificação de Micobactérias não causadoras de tuberculose. Porto Alegre BR-RS, [s.n.], 2012.
Apêndice J – Procedimento operacional padrão para teste de genética molecular para identificação a partir de material de cultura de espécies de Micobactérias (GenoType
Mycobacterium CM/AS) CONCEITO: OBJETIVO: EQUIPAMENTOS: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 1/7
GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima
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Identificação das espécies de micobactérias.
O teste é baseado na tecnologia comercial DNA STRIP e permite a identificação das espécies de micobactérias. No kit de fitas AS é possível identificar as espécies: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/ M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. schimoidei; e o kit CM as espécies clinicamente mais relevantes: M. avium ssp, M. chelonae, M. abscessos, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/ M. ulcerans, o complexo M. tuberculosis e M. xenopi. A técnica é dividida em 3 passos: extração de DNA, amplificação multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa.
a) Cabine de Segurança Biológica (CBS); b) Termobloco;
c) Microcentrífuga; d) Vortéx;
e) Banho de água; f) Pinças;
g) Pipetas ajustáveis para 10, 20, 200 e 1000 uL;
h) Termociclador (taxa de aquecimento 3ºC/sec, taxa de arrefecimento 2ºC/sec, precisão +/- 0,2ºC);
i) TwinCubator; j) Banho ultrasónico; k) Centrífuga de bancada.
INSUMOS: DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/7
GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima
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a) Microtubo livre de DNases e RNases (0,2 uL ou 0,5 uL e 1,5 mL ou 2,0 mL);
b) Ponteiras com barreira estéreis (vol. 0,5-10 uL, 10-100 uL, 20-200 uL, 100-1000 uL); c) Água Mili-Q;
d) DNA polimerase termoestável com tampão (10x);
e) Solução MgCl2 (pode variar entre 1,5 a 2,5 mM) *Alguns tampões de incubação já possuem
MgCl2;
f) Kit comercial reagentes GenoType Mycobacterium AS/CM; g) Tubo falcon de 15 mL e 50 mL;
h) Tubo de polipropileno cônico com tampa de rosca “tipo eppendorf” (resistente ao calor); i) Pipeta do tipo Pasteur 30 mL.
1. Extração de DNA por banho ultrasónico;
*Poderá ser utilizado qualquer procedimento de extração de DNA desde que produza DNA amplificável de bactérias.
a) Ao usar bactérias cultivadas em meio sólido, colher as bactérias com umas alça de inoculação e suspender em aproximadamente 300 uL de água (para uso de biologia molecular);
b) Ao usar bactérias cultivadas em meio líquido, aplicar diretamente 1 mL. Precipitar as bactérias centrifugando, a aproximadamente 10000 x g durante 15 min, numa centrifuga de bancada normal com um rotor estanque a aerossóis, numa câmara de segurança da classe II. Descartar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 100-300 uL de água com auxílio do vortéx; c) Incubar as bactérias em 100-300 uL de água durante 20 min a 95ºC banho de água (banho maria) ou banho seco (termobloco);
d) Incubar durante 15 min em banho ultrasónico;
e) Centrifugar durante 5 min à velocidade máxima e usar 5 uL do sobrenadante para PCR. No caso de a solução de DNA ser para armazenar durante um período longo, transferir o sobrenadante para um novo tubo.
CONT. DA DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 3/7 GenoType Mycobacterium CM/AS
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2. Amplificação:
*Preparar a mistura de amplificação (45uL) numa sala livre de DNA. A amostra deve ser adicionada numa área separada.
Mistura por tubo:
35 uL de PNM (mistura primer) – kit comercial; 5 uL de tampão de PCR 10x;
x uL de solução de MgCl2;
1-2 unidades de DNA polimerase termoestável (recomendada: HotStarTaq DNA Polymerase da Quiagen);
x uL de água para obter um volume de 45 uL (não considerar o vol. da enzima);
5uL do DNA extraído (20-100 ng de DNA), levando a um volume final de 50 uL (não considerando a enzima); Programa da amplificação: 15 min 95ºC 1 ciclo 30 sec 95ºC 2 min 58ºC 10 ciclos 25 sec 95ºC 40 sec 53ºC 20 ciclos 40 sec 70ºC 8 min 70ºC 1 ciclo
Os produtos amplificados podem ser armazenados de +8 a -20ºC.
Para verificação da reação de amplificação, 5 uL de cada amostra poderão ser diretamente aplicadas ao um gel de agarose a 2% sem adição de “loading buffer”.
Os amplicons têm um tamanho de aproximadamente 230 pb (controle universal) e de 200 pb (controle universal/fragmentos específicos das espécies).
CONT. DA DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 4/5
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3. Hibridização:
Preparação: Pré aqueça o banho maria a 45ºC; o desvio máximo tolerado em relação a temperatura alvo é de +/- 1ºC. pré-aqueça as soluções HYB (Tampão de hibridização-kit) e STR (Solução de lavagem adstringente-kit) a 37-45ºC antes de as usar.
Os reagentes têm que estar livres de precipitados. Aqueça os restantes reagentes, com exceção do CON-C (conjugado concentrado) e do SUB-C (substrato concentrado), à temperatura ambiente. Usando um tubo adequado, dilua 1:100 o CON-C, laranja e o SUB-C, amarelo com as quantidades necessárias dos respectivos tampões (CON-C com CON-D, SUB-C com SUB-D). Agite bem e deixe estabilizar à temperatura ambiente. Para cada tira, adicione 10 μl de concentrado a 1 ml do tampão respectivo. Dilua o CON-C antes de cada utilização. O SUB-C diluído é estável durante 4 semanas se armazenado à temperatura ambiente e protegido da luz.
a) Dispense 20 μl da Solução de Desnaturação (DEN, azul) num canto de cada um dos poços usados; b) Adicione à solução 20 μl da amostra amplificada, com a pipeta aspire e dispense para misturar bem
e incube à temperatura ambiente durante 5min. Retire as tiras do tubo, usando uma pinça, e marque- as com um lápis abaixo do marcador colorido. Use sempre luvas quando manusear as tiras;
c) Cuidadosamente, adicione a cada poço 1ml de HYB (verde) pré-aquecido. Agite suavemente a tina até que a solução adquira uma cor homogênea.
d) Tenha cuidado para não salpicar solução para os poços vizinhos. Coloque uma tira em cada poço; e) As tiras têm que ficar completamente imersas na solução e com o lado revestido pelas sondas
(identificável pela marcador colorido perto da extremidade inferior) virado para cima;
f) Coloque a tina no TwinCubator e incube durante 30 min a 45°C; Aspire completamente o Tampão de Hibridização;
CONT. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 5/7
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3. Hibridização:
g) Adicione 1 ml de STR (vermelho) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C (TwinCubator);
h) Em temperatura ambiente remova completamente a STR;
i) Lave cada tira uma vez com 1 ml de Solução Rinse (RIN) durante 1 minuto no TwinCubator (plataforma de agitação) (rejeite o RIN depois da incubação);
j) Adicione 1 ml do conjugado diluído a cada tira e incube durante 30 minutos no TwinCubator (plataforma de agitação);
k) Remova a solução e lave cada tira duas vezes, durante 1 minuto, com 1 ml de RIN e uma vez, durante 1 minuto, com aproximadamente 1 ml de água destilada TwinCubator (plataforma de agitação) (rejeite a solução em cada lavagem);
l) Adicione 1 ml de substrato diluído a cada tira e incube no escuro sem agitação;
m) Dependendo das condições do teste (por ex., temperatura ambiente), o tempo de incubação do substrato pode variar entre 3 e 20 minutos. Um alongamento dos tempos de incubação do substrato pode levar a um aumento do ruído da coloração de fundo, o que pode impossibilitar a interpretação dos resultados;
n) Pare a reação enxaguando brevemente por duas vezes com água destilada;
o) Usando pinças, remova as tiras da tina e seque-as entre duas camadas de papel absorvente;
4. Interpretação dos Resultados:
Cole as tiras e armazene-as protegidas da luz. Cole as tiras desenvolvidas nos campos designados alinhando as bandas CC e UC com as linhas respectivas na ficha. Anote as bandas positivas na penúltima coluna, determine as espécies com a ajuda da tabela de interpretação e introduza o nome das espécies identificadas na última coluna. Cada tira possui um total de 17 zonas de reação (ver a figura).
CONT. DESCRIÇÃ DA TÉCNICA: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 6/8
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4. Interpretação dos Resultados:
1.1 CC: O desenvolvimento de uma linha nesta zona documenta a eficiência da ligação do conjugado e da reação do substrato.
1.2 UC: Esta zona detecta todas as micobactérias conhecidas e membros do grupo das bactérias gram-positivas com um conteúdo alto de G+C.
1.3 GC: A aparência desta banda documenta a presença de um membro do gênero Mycobacterium. A intensidade desta banda varia dependendo da espécie. A banda de Controlo do Género pode não aparecer apesar da presença do DNA micobacteriano; desde que um padrão de bandas específicas das espécies esteja presente, no entanto, a reação de amplificação foi efetuada corretamente e o teste é valido.
Se nenhuma padrão de bandas específicas das espécies é visível, um padrão de bandas que indica a presença de uma bactéria gram-positiva com um conteúdo alto de G+C pôde, em casos raros, para originar também de uma bactéria que não pudesse ser detectada por este kit. Espécies bacterianas adicionais podem ser identificadas com o kit GenoType Mycobacterium AS.
Outras bandas: Sondas específicas, para avaliação ver tabela de interpretação. As bandas de uma tira não
têm que mostrar todas a mesma intensidade de sinal. Se for usada uma grande quantidade de amplicon, poderão aparecer bandas adicionais.
CONT. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 6.6. Apêndice L PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 7/8
GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima
APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose
REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti
APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos
4. Interpretação dos Resultados:
1. Lifescience, hain. Genotype Mycobacterium CM. Teste de Genética para identificação, a partir de cultura, das espécies de micobactérias mais relevantes. VER 1.0. IFU-299-20. Jan. 2011;
2. Lifescience, hain. Genotype Mycobacterium AS. Teste de Genética para identificação, a partir de cultura, de espécies de micobacterias. VER 1.0. IFU-298-11. Fev. 2010.