Identificação genotípica das MNT:

Devido a demora no diagnóstico de infecções provocadas pelas MNT, tornou-se necessário o desenvolvimento de métodos de identificação molecular, com uma boa relação custo-benefício e que acima de tudo sejam mais eficazes quando comparados aos métodos convencionais. Estes métodos incluem testes baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sequenciamento de DNA, sondas genéticas, entre outros (1).

O atraso de diagnóstico tem um impacto importante na escolha do tratamento mais adequado do doente, quanto mais precoce o diagnóstico mais eficaz o tratamento com uma maior chance de cura. O diagnóstico molecular consiste na análise do material genético do microrganismo através de regiões específicas do genoma de cada espécie, esta metodologia é específica e tem sido empregada na maioria dos laboratórios, estes métodos têm cada vez mais importância, porque são

mais rápidos e precisos que os métodos convencionais e na maioria dos casos, produzem resultados mais confiáveis (82).

Para esse tipo de metodologia é necessário que seja realizado previamente a extração do DNA, que pode ser realizado através de vários métodos de digestão de membrana como: método enzimático por brometo de cetil trimetilamonio (CTAB), extração por choque térmico e banho ultrasônico (1).

Kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS:

Estão disponíveis no mercado o sistema da linha GenoType® (Hain Lifescience, Nehren, Alemanha). O kit comercial GenoType® Mycobacterium CM (do inglês “Common Mycobacteria”) e o GenoType® Mycobacterium AS (do inglês “Additional Species”), juntos são um teste molecular que se baseia em uma técnica de PCR por segmentação de uma região do gene 23S rRNA, seguida de hibridização reversa para uma fita de nitrocelulose, permitindo a identificação genética molecular simultânea de M. complexo de tuberculosis e 24 das espécies de MNT mais comuns a partir das culturas positivas. O procedimento completo é dividido em três passos: extração do DNA de cepa cultivada em meio de cultura sólido, amplificação através de técnica de PCR multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa, realizado no prazo máximo de 2 dias. A determinação da espécie é realizada com a ajuda de uma tabela de interpretação (83).

O GenoType® Mycobacterium CM permite a identificação do complexo M. avium,

M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum-M. ulcerans, M. peregrinum, M. xenopi e o complexo M. tuberculosis. O GenoType® Mycobacterium AS permite a identificação de espécies adicionais de MNT,

nomeadamente M. simiae, M. mucogenicum, M. goodie, M. cellatum, M. smegmatis,

M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. phlei, M. hemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. shimoidei (85).

PRA-hsp65 (Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65).

O PRA-hsp65 (do inglês Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65) é uma técnica não comercial, “in house” que tem apresentado uma boa eficácia na identificação de espécies das MNT, se baseia na amplificação do gene

hsp65 e posterior análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas

de restrição BstEII e HaeIII. Foi descrito por Telenti e col. em 1993. Esse método diferencia amaioria das espécies MNT, mas não as do complexo M. tuberculosis. As variações na sequência do gene hsp65 podem ser exploradas para a identificação ao nível da espécie tanto em micobactérias de crescimento lento como em espécies de crescimento rápido (1).

Resumidamente, um fragmento de 441 pares de base (pb) do gene hsp65 é amplificado por reação de PCR e digerido por duas enzimas de restrição, BstE II e

Hae III. O produto dessa reação é submetido a análise através de eletroforese em gel

de agarose e a determinação das espécies é feita através da leitura desse gel, de acordo com o perfil dos pares de base obtidos a partir da digestão de cada enzima específica. A determinação dos perfis eletrosféricos são comparados aos padrões de restrição de vários algoritmos encontrados no sistema on-line PRASITE através da página eletrônica: http://app.chuv.ch/prasite/index.html (84).

Ambos os testes acima descritos são os mais utilizados e tem mostrado bons resultados na identificação das espécies das MNT bem como amostras mistas (MNT e TB) (83). Porém é importante lembrar que o método PRA-hsp65, não permite a diferenciação entre algumas espécies de micobactérias, devido a superposição de perfis de várias espécies distintas, necessitando o sequenciamento para complementação do resultado nessas situações (92). Apesar dessas limitações, o método PRA-hsp65 pode ser utilizado para a identificação preliminar das espécies de MCR mais frequentes (85).

Sequenciamento de genes:

As definições de espécies, inicialmente baseadas em testes fenotípicos, atualmente estão sendo baseadas no sequenciamento de vários genes essenciais ao metabolismo da célula bacteriana (48). O sequenciamento é a técnica molecular mais sensível, considerada padrão-ouro dos métodos da biologia molecular e é constantemente utilizada em estudos de identificação das espécies de micobactérias

(92). A identificação é feita através da comparação das sequências de nucleotídeos obtidas com as sequências de referência presentes em várias bases de dados. Geralmente é necessário apenas uma única reação de sequenciamento para uma identificação definitiva (93).

Este método permite também a detecção direta de espécies de micobactérias que não cresceram em meios de cultura além de identificar diversas espécies possivelmente não conhecidas. Porém o sequenciamento, no entanto é um método dispendioso e necessita de técnicos e equipamento especializados, ou na ausência dos mesmos, de se recorrer a empresas especializadas (93).

Essa técnica utiliza fragmentos de regiões específicas do genoma das micobacterias: hsp65, rpoB e 16S rRNA. Dentre estas regiões gênicas, o sequenciamento do gene hsp65 é o mais utilizado a nível de espécie e subespécie (92).

O sequenciamento do gene rpoB é usado como alternativa não só para identificar, mas também diferenciar as MNT entres os grupos de crescimento lento e crescimento rápido (93).

O impacto na magnitude exata das infecções por MNT em países onde a TB é endêmica ainda não são conhecidos. A Região Norte do Brasil é endêmica para os casos de TB e está em constante processo de expansão devido à industrialização gerada pela Zona Franca de Manaus, é detentora da maior bacia hidrográfica e é o berço da maior parte da biodiversidade existente do mundo, possivelmente abrigue em seu ecossistema a maior parte das micobatérias. Além disso, segundo dados do Ministério da Saúde, em 2014, está no ranking das unidades da Federação com as maiores taxas de detecção e mortalidade para o HIV/AIDS. Esses fatores apontam para a necessidade de estudos mais detalhados na população da Região Norte elucidando a relação entre TB/MNT/HIV.

Devido à escassez de dados de incidência, prevalência e mortalidade nos casos de MNT/HIV na Região Amazônica são necessários estudos a fim de estabelecer critérios clínicos e bacteriológicos para que se possa notificar e tratar de maneira mais eficaz.

Como as técnicas de identificação de MNT ainda não estão bem estabelecidas, aumenta a necessidade do desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial, bem como a avaliação das técnicas existentes. Dessa forma, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA para a confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS (86).

Considerando que ainda não foram elucidadas as questões epidemiológicas das MNT nessa região e nem sua interação com os pacientes que soropositivos, esse estudo cooperará para o andamento da formulação dos critérios de controle, diagnóstico e tratamento de MNT na Região Amazônica.

Visando priorizar a adequação terapêutica e obter dados que possam ser revisados a qualquer momento, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA. Portanto, a confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS, é realizada através do sequenciamento genético (86).

Com aumento de casos de infecções por MNT aumenta a necessidade da inovação dos métodos de diagnostico laboratorial bem como a criação de técnicas mais precisas para a identificação das espécies de MNT, que hoje são laboriosos e dispendiosos.