UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA CRISCIELE KULIGOVSKI ESTABELECIMENTO DE BANCO DE LINHAGENS CELULARES APLICADAS A PESQUISA CIENTÍFICA E ENSAIOS TOXICOLÓGICOS IN VITRO DISSERTAÇÃO CURITIBA 2021
4.0 Internacional
Esta licença permite o download e o compartilhamento da obra desde que sejam atribuídos créditos ao(s) autor(es), sem a possibilidade de alterála ou utilizála para fins comerciais. ESTABELECIMENTO DE BANCO DE LINHAGENS CELULARES APLICADAS A PESQUISA CIENTÍFICA E ENSAIOS TOXICOLÓGICOS IN VITRO Establishment of a bank of cell lines applied to scientific research and in vitro toxicological test Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR). Como requisito para obtenção do título “Mestre em Ciências” – Area de Concentração Engenharia Biomédica. Orientador: Dr João Antônio Palma Setti. Coorientador: Dra Alessandra Melo de Aguiar CURITIBA 2021
Ministério da Educação Universidade Tecnológica Federal do Paraná Câmpus Curitiba CRISCIELE KULIGOVSKI
ESTABELECIMENTO DE BANCO DE LINHAGENS CELULARES APLICADAS A PESQUISA CIENTÍFICA E ENSAIOS TOXICOLÓGICOS IN VITRO
Trabalho de pesquisa de mestrado apresentado como requisito para obtenção do título de Mestra Em Engenharia Biomédica da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR). Área de concentração: Engenharia Biomédica.
Data de aprovação: 18 de Dezembro de 2020
Prof.a Alessandra Melo De Aguiar, Doutorado - Instituto Carlos Chagas
Prof Andre Luiz Franco Sampaio, Doutorado - Fiocruz - Fundação Oswaldo Cruz
Prof Gustavo Henrique Couto, Doutorado - Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Documento gerado pelo Sistema Acadêmico da UTFPR a partir dos dados da Ata de Defesa em 18/12/2020.
Dedico esse trabalho a minha família, por toda a compreensão e apoio.
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado condições de estar aqui me iluminado em todos os momentos, principalmente com saúde, sabedoria e força para alcançar esse sonho.
Agradeço a minha filha Giovanna Kuligovski da Silva minha pequena que muitas vezes estive ausente. Obrigada por toda paciência. Agradeço por você estar sempre ao meu lado em todos os momentos. Muitas vezes nos momentos mais difíceis o seu abraço que me acalmava e seu sorriso que me fazia seguir em frente. Giovanna você sempre será essencial na construção dos meus sonhos.
Agradeço ao meu companheiro Helton Pacheco por ter caminhado grande parte desta jornada ao meu lado, me apoiando em todas as decisões e por ser o ombro que precisava nos momentos de angústia e o abraço nos momentos de vitória.
Agradeço minha mãe, Devanir Maria da Luz Kuligovski, que sempre me incentivou em todas as minhas decisões, que sempre esteve presente em todos os momentos de dificuldade me mostrando que sou capaz.
Agradeço meu pai, Paulino Kuligovski (in memoriam), a qual pelo destino teve que me acompanhar de longe.
Agradeço aos meus irmãos, Cleiton Kuligovski, Cleverson Kuligovski e Cristiane Kuligovski a minha cunhada Rosana Pereira e meu cunhado Luiz Fernandes por toda dedicação ao longo desses anos, incentivo e companheirismo.
Agradeço aos meus sobrinhos Matheus Kuligovski e Kauan Kuligovski, por me alegrarem nos momentos de tristeza, permitindo que meus sonhos sempre se renovem.
Agradeço aos meus orientadores em especial a Alessandra Melo de Aguiar por acreditar no meu potencial e por sempre me incentivar me mostrando que sou capaz. Alessandra além de ser uma ótima cientista e uma pessoa maravilhosa que se preocupa com o desenvolvimento pessoal e profissional e além de tudo uma amiga para a vida. Agradeço ao meu orientador João de Palma
obrigada pelo incentivo e apoio nesta conquista.
Agradeço a Gestão da Qualidade do ICC, em especial a Camila Azeredo, por toda a contribuição da ferramenta 5W2H e 5S e ao Claudio Micheli Ciotti por contribuir na operação do Bizzagi.
Agradeço ao Laboratório de Virologia Molecular por nos emprestar o equipamento para medir a luminescência das amostras.
Agradeço a todos que fazem e fizeram parte desta etapa na minha vida. A Anny Robert agradeço imensamente por toda assessória cientifica por todo apoio e companheirismo. A Ariane Campos de Paschoal, agradeço por sempre estar ao meu lado me ajudando de todas as formas muito obrigada pelo seu apoio, companheirismo e aprendizado. A Leticia Bassai agradeço por toda a ajuda principalmente por me ensinar os cálculos da disciplina de matemática aplicada. A Cintia Horinouchi e a Ana Paula Abud agradeço pela assessoria cientifica e companheirismo.
Agradeço a pesquisadora e Vice – direção de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico Andrea Ávila por essa oportunidade de realizar o mestrado e implementar o projeto no Instituto Carlos Chagas.
Agradeço aos pesquisadores, Bruno Dallagiovanna, Alejandro Correa Dominguez, Marco Augusto Stimamiglio e Patrícia Shigunov por proporcionarem um ótimo ambiente de trabalho.
A grande família LABCET vai meu maior agradecimento, que nesse momento compartilharam as minhas angústias e obrigada por vários momentos de alegria.
Agradeço a rede de plataformas tecnológicas da FIOCRUZ pelo uso de suas subunidades. Agradeço a plataforma de microscopia, em especial as colaboradoras Anny Robert e Tabata Klimeck.
Agradeço os demais colaboradores do ICC, como a equipe de logística, TI, manutenção, limpeza e preparo de soluções, por manter a ordem, proporcionando um ambiente agradável de trabalho.
(PPGEB) da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) agradeço ao antigo coordenador João de Palma Setti ao atual Gilson Sato, por proporcionarem um programa de qualidade e valorizar seus alunos.
Agradeço as agências de fomento e fontes financiadoras desse projeto: FIOCRUZ (Validação interna de ensaio de citotoxicidade utilizando células tronco mesenquimais adultas humanas como alternativa ao uso de animais) financiado pelo edital produtos inovadores.
O Instituto Carlos Chagas (ICC) é a unidade técnicocientífica da FIOCRUZ que desenvolve pesquisa biomédica no Paraná. Dentre os diversos projetos de pesquisa e ensaios experimentais destacamse aqueles que avaliam interação parasitahospedeiro, produção de biomoléculas, ensaios de citotoxicidade incluindo o uso de métodos alternativos ao uso de animais, diferenciação de célulastronco, entre outros. Todas essas grandes áreas de conhecimento têm em comum o uso de cultivos celulares entre seus modelos de estudo. A fim de garantir a disponibilidade de cultivos celulares, treinamento de usuários e rastreabilidade do material biológico para os projetos de pesquisa, prestação de serviços e desenvolvimento tecnológico, o objetivo deste trabalho foi a implementação de um Banco de Linhagens Celulares do ICC FIOCRUZPR seguindo um sistema de gestão e controle de qualidade. Para isso, foram aplicadas a ferramentas de gestão 5W2H e sistema 5S para fazer o diagnóstico inicial da estrutura e organização laboratorial e definir escopo de documentos e metodologias a serem implantadas. Seguiuse a definição das linhagens celulares para estabelecimento dos Bancos de células Mestre e de trabalho de acordo com a demanda dos usuários. Foram estabelecidos bancos mestres e de trabalho para as linhagens celulares NHDF, V794, CHO K1, Balb/c 3T3, as quais foram submetidas aos ensaios de controle de qualidade, de viabilidade celular, teste para detecção de contaminação por micoplasma através da técnica Reação da Cadeia da Polimerase, coloração de DNA e por luminescência através de um kit comercial. Somente células com mais de 80% de viabilidade e que não apresentaram contaminação foram armazenadas no banco mestre e disponibilizadas aos pesquisadores através do banco de trabalho. Com esse trabalho foi possível rastrear as necessidades relativas à consolidação da estrutura laboratorial e documentação, elaborando e implementando o controle de procedimentos de segurança, treinamentos, registro e relatórios, entre outros documentos que garantam a rastreabilidade e confiabilidade dos dados. Desta forma, fortalecemse os projetos de pesquisa e conferem maior reprodutibilidade aos resultados científicos.
Palavras chaves: banco de células; controle de qualidade; linhagens celulares; reprodutibilidade; micoplasma; boas práticas de cultivo celular.
He Carlos Chagas Institute (ICC) is the technicalscientific unit of FIOCRUZ that develops biomedical research in Paraná. The research projects developed at ICC include the evaluation of parasitehost interaction, production of biomolecules, cytotoxicity tests, development of alternative methods to the use of animals, stem cell differentiation, among others. All of these areas have in common the use of cell cultures among their study models. To guarantee the availability of cell cultures, user training, and traceability of biological material for research projects, services, and technological development, the objective of this work was the implementation of an ICC Cell Line Bank following a management and quality control system. For this, 5W2H management tools and 5S System were applied to make the initial diagnosis of the structure and laboratory organization and define the scope of documents and methodologies to be implemented. The definition of cell lines used to establish the cell banks were based on the demand of users. Master and work banks were established for the cell lines: NHDF, V794, CHO K1, Balb/c 3T3. All these cells were subjected to quality control tests, including cell viability assays and detection of mycoplasma contamination using the Polymerase Chain Reaction (PCR), DNA staining and a commercial kit. Only cell cultures with cell viability higher than 80% and negative for mycoplasma tests were stored in the master bank and made available to researchers through the work bank. This work enabled the identification of needs related to the consolidation of the laboratory structure and documentation, allowing the elaboration and implementation of the control of safety procedures, training, registration, and reports, among other documents that guarantee the traceability and reliability of the cell culture data. This quality controls strengthens the research projects and improve their reproducibility of scientific results.
Keywords: cell bank; quality control; cell lines; reproducibility; mycoplasma; good cell culture practices.
FIGURAS
Figura 1 Tipos de cultivo celular. ... 28 Figura 2 Representação das condições ideias para o cultivo de células. ... 29 Figura 3 Representação gráfica da análise bibliométrica do número de artigos publicados de forma cumulativa na plataforma do NCBI referente a Boas Práticas em Cultura de Células. ... 31 Figura 4 Representação Esquemática da Ferramenta 5W2H. ... 33 Figura 5 Representação esquemática da Ferramenta 5S aplicada. ... 36 Figura 6 Câmara de Neubauer com a representação dos quadrantes utilizados para quantificação celular. ... 52 Figura 7 Matriz 5W2H aplicada na implantação do Banco de Células do ICC. ... 60 Figura 8 Aplicação da ferramenta 5S na gestão do laboratório de cultura de células. ... 62 Figura 9 Imagens representativas das áreas laboratoriais e disposição das áreas de trabalho de acordo com sua finalidade. ... 64 Figura 10 Fluxograma do processo de treinamento de novos alunos e colaboradores da Instituição... 68 Figura 11 Representação gráfica dos usuários treinados. ... 70 Figura 12 Fluxo do processo para estabelecimento do banco de células. ... 71 Figura 13 Verificação de contaminação por micoplasma no banco mestre e no banco de trabalho das células Balb/c 3T3 clone A31. ... 73 Figura 14 Verificação de contaminação por micoplasma no banco mestre e do banco de trabalho das células V794. ... 74 Figura 15 Verificação de contaminação por micoplasma no banco mestre e do banco de trabalho das células CHO K1. ... 76 Figura 16: Verificação de contaminação por micoplasma no banco mestre e no banco de trabalho das células NHDF. ... 77 Figura 17 Fluxograma do processo de solicitação de células. ... 79 Figura 18 Fornecimento/ demanda de células institucional. ... 81
Quadro 1 Procedimentos operacionais padrões (POPs) e seus respectivos formulários de registro da qualidade. ... 67 Quadro 2 Consolidado do Plano de ação para implantação do Banco de Células do Instituto Carlos Chagas. ... 82
Tabela 1 Determinação da concentração de células por cm² e descrição dos meios de cultivo necessários para expandir as células. ... 51 Tabela 2 Sequência de nucleotídeos dos iniciadores utilizados na amplificação do gene para a detecção do micoplasma sp. ... 56 Tabela 3 Reagentes necessários para 1 reação de PCR para detecção de micoplasma. ... 56 Tabela 4 Programação de 35 ciclos no termociclador. ... 56 Tabela 5 Avaliação de contaminação por micoplasma nas linhagens celulares Balb/c 3T3 clone A31, V794, CHOK1 e NHDF utilizando a técnica de luminescência com o KIT Myco Alert PLUS Mycoplasma Detection Kit, LONZA. . 73
2D Bidimensional 3D Tridimensional ADP adenosina difosfato ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection (Coleção de cultura
americana) ATP adenosina trifosfato Balb/ c 3T3 Linhagem celular de fibroblasto embrionário murino BCRJ Banco de Células do Rio de Janeiro BCM Banco de Células Mestre BPCC Boas Práticas de Cultivo de Células BPL Boas Práticas de Laboratório BSS.CMF Solução Salina Balanceada livre de Cálcio e de Magnésio BCT Banco de Células de Trabalho CAAT Alternative Center for Animal Testing
CHOK1 Linhagem de células epiteliais obtidas do ovário de hamster chinês
CO2 Gás carbônico ou dióxido de carbono
DAPI 4’,6diamino2fenilindol
DICLA Divisão de Acreditação de Laboratórios
DMEM Dulbecco’s modified eagle medium
DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico ECACC European Colletion of Autenticated Cell Culture ECVAM Eu Reference Laboratory for alternatives to animal testing EDTA Ácido etilenodiaminotetracético ESTIV European Society of Toxicology In Vitro FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz H2O água HeLa Linhagem de células epiteliais de adenocarcinoma humano IBMP Instituto de Biologia Molecular do Paraná ICC Instituto Carlos Chagas
IVTIP Plataforma Industrial de teste in vitro
LABCET Laboratório de Biologia Básica de Células Tronco LABREG Laboratório Regulação da Expressão Gênica
LABTryp Laboratório de Biologia Molecular e Sistêmica de
Tripanossomatídeo LACTAS Laboratório de Ciências e Tecnologia Aplicadas em Saúde LAPAPI Laboratório de Pesquisa em Apicomplexa LBC Laboratório de Biologia Celular LBEP Laboratório de Biologia Estrutural e Engenharia de Tecidos LCC Laboratório de Cultivo de Células LPEC Laboratório de Proteômica Computacional e Estrutural NCBI National Center for Biotechnology Information NHDF Fibroblastos dérmicos neonatais humanos NIT Norma INMETRO Técnica
OECD Organization for Economic Cooperation and Development (Organização para cooperação e desenvolvimento econômico) OMS Organização Mundial da Saúde PBS Tampão salino fosfatado PCR Reação da Cadeia de Polimerase POP Procedimento Operacional Padrão PS Penicilina / Estreptomicina RH Recursos Humanos RNA Ácido ribonucléico RPMI Roswell Park Memorial Institute RQ Registro da Qualidade SFB Soro fetal bovino TBE TrisboratoEDTA UTFPR Universidade Tecnológica Federal do Paraná V794 Linhagem de fibroblastos obtidos de pulmão de hamster chinês VIROMOL Laboratório de Virologia Molecular VN Vermelho Neutro
cm2 centímetro quadrado g grama ºC graus celsius ® marca registrada m2 metro quadrado µg micrograma µg/mL micrograma por mililitro μL microlitro μm micrometro mL mililitro mM milimolar x g multiplicação pela aceleração gravitacional pb pares de base % percentual pmol picomol pH potencial hidrogeniônico ™ trademark V Volts
1 INTRODUÇÃO ... 18 2 OBJETIVOS ... 21 2.1 OBJETIVO GERAL ... 21 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 21 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 22 3.1 FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ ... 22 3.2 INSTITUTO CARLOS CHAGAS ... 23
3.3 HISTÓRICO E DESENVOLVIMENTO DA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS ... 24
3.4 TIPOS DE CULTIVO CELULAR ... 26
3.5 CONDIÇÕES APROPRIADAS PARA CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS ...28
3.6 BOAS PRÁTICAS DE CULTURA DE CÉLULAS ... 30
3.6.1 Ferramentas de garantia da qualidade aplicadas ao estabelecimento de banco de células. ... 32
3.6.1.1 Estabelecimento de plano de ação com a ferramenta 5W2H ... 32
3.6.1.2 Organização Laboratorial com a ferramenta 5S ... 34
3.6.2 Procedimentos operacionais padrões aplicados às boas práticas de cultura de células ... 36
3.6.3 Treinamento padronizado dos usuários a fim de garantir o estabelecimento de boas práticas em cultura de células ... 37
3.7 CRITÉRIOS MÍNIMOS PARA MANIPULAÇÃO E MANUTENÇÃO DE CÉLULAS EM CULTURA ... 38 3.7.1 Manutenção e integridade do Sistema Teste ... 38 3.7.2 Criopreservação ... 40 3.7.3 Caracterização celular ... 41 3.7.4 Pureza celular ... 42 3.7.5 Contaminação microbiana ... 42 3.7.6 Contaminação por micoplasma ... 43 3.7.7 Viabilidade Celular ... 44 3.8 BANCO DE CÉLULAS ANIMAIS ... 44 4 METODOLOGIA ... 47
ICC ...47
4.1.1 Ferramenta 5W2H ... 47
4.1.2 Ferramenta 5S ... 47
4.1.3 Modelagem de processos ... 48
4.1.4 Redação e revisão de Procedimentos Operacionais Padronizados (POPs) e Registros da Qualidade (RQs) ... 48
4.1.5 Levantamento da demanda de usuários ... 48
4.2 ESTABELECIMENTO DE BANCO DE LINHAGENS CELULARES E ACERVO ... 49 4.3 CULTIVO CELULAR ... 50 4.3.1 Repique e expansão celular ... 50 4.3.2 Ensaio de Viabilidade Celular ... 52 4.3.3 Criopreservação (congelamento e descongelamento celular) ... 53 4.4 BANCO DE CÉLULAS MESTRE E BANCO DE CÉLULAS DE TRABALHO ...54 4.4.1 Ensaios de Detecção de micoplasma ... 55 4.4.2 Teste de micoplasma por reação em cadeia da polimerase ... 55
4.4.3 Método de identificação de contaminação por micoplasma por coloração de DNA ... 57 4.4.4 Teste de micoplasma por luminescência ... 58 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59 5.1 IMPLEMENTAÇÃO DE UM SISTEMA DE GESTÃO DA QUALIDADE EM LABORATÓRIO DE CULTURA DE CÉLULAS ... 59 5.1.1 Ferramenta 5W2H ... 59 5.1.2 Ferramenta 5S ... 61 5.2 IMPLEMENTAÇÃO DE UM SISTEMA DE BOAS PRÁTICAS EM CULTURA DE CÉLULAS NO DESENVOLVIMENTO E MANUTENÇÃO DO BANCO DE CÉLULAS INSTITUCIONAL ... 66 5.2.1 Elaboração dos Procedimentos Operacionais Padrões (POPs) ... 67 5.2.2 Treinamento dos usuários do laboratório de cultura de células ... 68 5.2.3 Implementação do banco mestre e banco de trabalho institucional... 70 6 CONCLUSÃO ... 87 7 PERSPECTIVAS ... 88 REFERÊNCIAS ... 89
LINHAGENS CELULARES (ICCRQ.155) ... 93
ANEXO 2 – REGISTRO DE TREINAMENTO INTERNO (ICCRQ.010) ... 94
ANEXO 3 – RECEBIMENTO DE LINHAGEM (ICC POP.178) ... 95
ANEXO 4 – REPIQUE DE CÉLULAS EUCARIOTAS (ICC POP.174) ... 96
ANEXO 5 – CONGELAMENTO E DESCONGELAMENTO DE CÉLULAS EUCARIOTAS (ICCPOP.182) ... 97
ANEXO 6 – RECEBIMENTO DE LINHAGEM (ICC RQ.149) ... 98
ANEXO 7 – REGISTRO DE CRIOPRESERVAÇÃO (ICC RQ.153) ... 99
ANEXO 8 – CONTROLE DE QUALIDADE TESTE MICOPLASMA (ICC RQ.151) ... 100
ANEXO 9 – MAPA DE LOCALIZAÇÃO DE AMOSTRAS CRIOPRESERVADAS EM NITROGÊNIO LÍQUIDO (ICCRQ.154) ... 101
ANEXO 10 – TESTE DE MICOPLASMA PARA CÉLULAS EUCARIOTAS (ICC POP.180)... 102
ANEXO 11 – REGISTRO DE SOLICITAÇÃO DE TESTE DE MICOPLASMA (ICC RQ.198) ... 103
ANEXO 12 – SEGREGAÇÃO, TRATAMENTO E DESCARTE DE RESÍDUO QUÍMICO (ICC POP. 112) ... 104
ANEXO 13 – MANUTENÇÃO DA SALA BANCO DE CÉLULAS DO INSTITUTO CARLOS CHAGAS (ICC POP.171) ... 105
ANEXO 14 – REGISTRO DE MANUTENÇÃODA SALA DE CULTIVO CELULAR (ICC RQ.137) ... 106
ANEXO 15 – PREPARO DE SOLUÇÕES E INSUMOS PARA CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS (ICC POP.166) ... 107
ANEXO 16 – REGISTRO DE SOLICITAÇÃO DE MEIO DE CULTURA E INSUMOS (ICCRQ.141)... 108
ANEXO 17 – PREPARO DE MEIO DE CULTURA E SOLUÇÃO (ICC RQ.145) ... 109
ANEXO 18 – ETIQUETAS PEQUENAS (ICC RQ.146) ... 110
ANEXO 19 – ETIQUETAS GRANDES (ICC RQ.147) ... 111
ANEXO 20 – FORMULÁRIO DE REPIQUE CELULAR (ICCRQ.148) ... 112
1 INTRODUÇÃO
O uso de cultivos celulares de mamíferos é amplamente difundido nas mais diversas áreas de pesquisa biomédica e nãoclínica. Além disso, o rápido crescimento em áreas como terapias celulares e gênicas, desenvolvimento de produtos biotecnológicos, avanços nas ferramentas de análise de genômica e proteômica, vem resultando em um aumento notável nas atividades envolvendo a cultura de células (FREEDMAN et al., 2015). Outro fator que tem contribuído consideravelmente para expansão de metodologias in vitro é o desenvolvimento e utilização dos métodos alternativos ao uso de animais (LORGE et al., 2016), inclusive com aceitação Nacional pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Diante da grande difusão do uso de células, a implementação de sistemas de gestão da qualidade em laboratórios de cultivo está se tornando essencial para maximizar a reprodutibilidade, confiabilidade, credibilidade, aceitação e aplicação adequada de quaisquer resultados produzidos (COECKE et al., 2005). A prática inadequada de cultura de células tende a gerar problemas de contaminação cruzada, contaminação microbiana, alterações metabólicas e consequentemente resultados inconclusivos e não reproduzíveis (KNIGHT e CREE, 2011).
Questões relativas à autenticidade celular e ausência de contaminação são críticas para a garantia dos resultados experimentais. Contudo, existem relatos em literatura quanto a identificação equivocada de linhagens celulares ou presença de contaminação, onde estimase que 18 a 36% de linhagens celulares estão erroneamente classificadas e contaminadas (FOLGUERASFLATSCHART et al., 2018). Dados também indicam indícios de contaminação por micoplasma em bancos de dados públicos de sequências de ácidos nucleicos (CORRAL VÁZQUEZ et al., 2017; OLARERINGEORGE e HOGENESCH, 2015). Apesar de questões relativas à contaminação e autenticidade celular serem recorrentes, as boas práticas de cultura de células começaram a ser difundidas recentemente (ESKES et al., 2017; LORGE et al., 2016; PAMIES et al., 2018).
A partir desse panorama, normas e documentos guias foram estabelecidos a fim de padronizar e garantir que os laboratórios sigam e se adequem aos critérios de qualidade necessários para manutenção celular. No
cenário internacional, a Sociedade Europeia de Toxicologia in Vitro (ESTIV, European Society of Toxicology In Vitro), o Centro de Alternativas para Ensaios em Animais (CAAT, Alternative Center for Animal Testing) e a Plataforma Industrial de teste in vitro (IVTIP, In Vitro Testing Industrial Platform) se uniram e criaram um documento de orientação de boas práticas de métodos in vitro (OECD) e um guia de orientação de boas práticas de cultura de células (COECKE et al., 2005; OECD, 2018). No Brasil, algumas normativas também foram estabelecidas, tais como a NIT DICLA 071 (ANVISA NIT DICLA 071, 2019) e a NIT DICLA 35 (ANVISA NIT DICLA 035, 2019) que visa sobre as boas práticas de ensaios in vitro, para o contexto de boas práticas de laboratório.
Embora as normativas existam, elas nem sempre são consideradas em laboratórios de pesquisa e muitas das linhagens celulares utilizadas nos experimentos são obtidas de fontes não confiáveis, por meio de doação, não tendo controle da rastreabilidade das informações relativas a essas linhagens celulares. Esses fatores podem, consequentemente, gerar pesquisas não reprodutíveis, levando a desperdício de tempo e recursos, e gerando dados que podem não ser confiáveis (GERAGHTY et al., 2014; WEINHART et al., 2019).
Tendo em vista o avanço das pesquisas no mundo e no Brasil, observase a necessidade de estabelecer sistemas de boas práticas de cultura de células em instituições de pesquisa, como a unidade da Fundação Oswaldo Cruz no Paraná
(FIOCRUZ/PR), na qual o uso de cultura de células tornase constantemente
necessário. Assim, com a demanda crescente pelo uso de cultivos celulares e estabelecimento de área comum para cultivo de células, os objetivos do presente trabalho foram estruturar o laboratório multiusuário de cultivos celulares de acordo com diretrizes nacionais e internacionais de boas práticas em cultura celular, treinar os colaboradores quanto a execução dos métodos, mantendo um ambiente laboratorial organizado e criando os procedimentos operacionais padrões (POPs) relativos a cultura de células. Além disso, o grande foco do projeto foi a implementação de um banco de células mestre (BCM) e um banco de células de trabalho (BCT) das células com demanda institucional, iniciando com a NHDF, que consiste em fibroblastos dérmicos humanos, a CHO K1, uma linhagem de células epiteliais obtidas do ovário de hamster chinês, a Balb/c 3T3 clone A31, uma linhagem de fibroblastos murinos amplamente utilizada em ensaios
toxicológicos in vitro, e a V794, que são fibroblastos obtidos do pulmão de hamster chinês. Assim, será possível estabelecer um banco de células centralizado, que garanta a distribuição de linhagens celulares devidamente caracterizadas e de qualidade.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Implementar um Banco de Linhagens Celulares e um laboratório multiusuário de cultivo de células no Instituto Carlos Chagas (ICCFIOCRUZ/PR) seguindo Boas Práticas de Cultura de Célula e ferramenta 5W2H e 5S.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Implementação de um sistema de gestão qualidade em laboratório de multiusuários de cultura de células;
• Implementação de um sistema de boas práticas em cultura de células.
• Criação e manutenção de banco de células institucional com variadas linhagens celulares (Balb/c 3T3 clone A31, V794, NHDF, CHO K1).
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
A Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) foi fundada em 1900, iniciando suas atividades com a criação do Instituto Soroterápico Federal no estado do Rio de Janeiro, com o propósito de fabricar soros e vacinas para as enfermidades da época. Sendo guiada pelo Dr. Oswaldo Gonçalves Cruz, a instituição foi responsável pela reforma sanitária que erradicou as epidemias da peste bubônica e da febre amarela no estado do Rio de Janeiro à época. Além disso, iniciou expedições científicas para desbravar o país, iniciando uma intensa trajetória, que foi fundamental para o desenvolvimento da saúde pública do Brasil (FIOCRUZ).
Atualmente vinculada ao Ministério da Saúde, a FIOCRUZ exerce atividades como: desenvolvimento de pesquisa, prestação de serviços hospitalares e ambulatoriais de referência em saúde, fabricação de vacinas, medicamentos, reagentes e kits de diagnósticos, formação de recursos humanos, etc. Hoje atuam na FIOCRUZ mais de 7500 colaboradores, tornandose assim uma instituição que visa promover a saúde, o desenvolvimento social, gerar e difundir conhecimento científico e tecnológico, com o propósito de combater os grandes problemas de saúde pública no Brasil, valorizando assim a medicina experimental (FIOCRUZ).
A sede da FIOCRUZ fica no Rio de Janeiro conta com mais de 800.000 m2. Além da sede, a fundação conta, ao todo, com 16 unidades técnico científicas, distribuídas em todas as regiões do Brasil e um escritório em Maputo, capital de Moçambique, na África. No estado do Paraná, na cidade de Curitiba, a FIOCRUZ é representada pelo Instituto Carlos Chagas (ICCFIOCRUZ/PR), o qual foi formalmente fundado em 2009, mas que já havia iniciado suas atividades em 1999 com a criação do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP). O objetivo do ICCFIOCRUZ/PR é suprir a demanda de problemas de saúde pública do estado e o desenvolvimento de pesquisa científica biomédica, atuando nas áreas de bioquímica, biologia molecular e biologia celular.
3.2 INSTITUTO CARLOS CHAGAS
O Instituto Carlos Chagas (ICC) contém em suas instalações nove laboratórios de pesquisa, englobando desde o estudo da biologia básica à geração de produtos e serviços nas áreas de bioquímica, biologia molecular, celular e biotecnologia. Atualmente, esses laboratórios são conhecidos como: Laboratório de Biologia Celular (LBC), Laboratório de Biologia Estrutural e Engenharia de Proteínas (LBEP), Laboratório de Biologia Básica de CélulasTronco (LABCET), Laboratório de Regulação da Expressão Gênica (LABREG), Laboratório de Virologia Molecular (VIROMOL), Laboratório de Biologia Molecular e Sistêmica de Tripanossomatídeos (LabTryp), Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LACTAS), Laboratório de Proteômica Computacional e Estrutural (LPEC) e Laboratório de Pesquisa em Apicomplexa (LAPAPI) (FIOCRUZ). Além disso, o instituto conta com programa de pósgraduação em biociências e biotecnologia, formando recursos humanos desde a iniciação científica, mestrado, doutorado e pósdoutorado.
De acordo com as competências instaladas no ICCFIOCRUZ/PR, o instituto oferece, além dos laboratórios de pesquisa e desenvolvimento tecnológico, alguns serviços de plataformas tecnológicas multiusuários, as quais são disponibilizadas à comunidade interna da FIOCRUZ e também aos grupos de pesquisa de universidades e outros Institutos de Ciência e Tecnologia. Atualmente o escopo de plataformas do ICCFIOCRUZ/PR abrange serviços na área de citometria de fluxo, microscopia, espectrometria de massa, engenharia de proteínas e citotoxicidade (FIOCRUZ).
Para a maioria dos laboratórios e plataformas mencionados a utilização de cultura de células tornase constantemente necessária, tornandose de fundamental importância a implementação de um banco de células centralizado, o qual garanta um controle de qualidade das células, visando a manutenção das suas características. Isso possibilitará que os laboratórios e plataformas realizem suas pesquisas e serviços com uma maior qualidade e reprodutibilidade dos resultados.
Além do escopo geral da implementação de um banco de células, a recém estabelecida Plataforma de Bioensaios em Métodos Alternativos em
Citotoxicidade, que faz parte da rede de plataformas tecnológicas da FIOCRUZ (https://plataformas.fiocruz.br/) inserida no ICC em 2018, tem a necessidade de garantir todos os critérios de qualidade das células utilizadas em seus ensaios, tornandose a principal demanda do banco de células atualmente. Esta plataforma surgiu a partir de uma demanda institucional pela oferta de métodos in vitro para testes de moléculas e substâncias com potencial aplicação farmacológica, substituindo e reduzindo o uso de animais. Sistemas de garantia da qualidade como a ISO 17025 Requisitos gerais para competência de laboratórios de ensaio e calibração (ABNT, 2017) também são recomentados para fases iniciais do desenvolvimento farmacêutico, onde a reprodutibilidade e rastreabilidade são necessárias, sem contudo o requerimento regulatório de realização de estudos em sistema de Boas Práticas de Laboratório (BPL) (NITDICLA 035, revisão 04, 2010). Assim, tornase necessário que os ensaios in vitro, que consistem na base inicial da triagem dos novos fármacos potenciais, sejam conduzidos com sistemas celulares certificados e de qualidade (NITDICLA 071, revisão 1, 2019). A necessidade da implementação de um sistema de qualidade pela plataforma de citotoxicidade justifica a implantação de um banco de células que garanta o uso das linhagens celulares em conformidade com os parâmetros de qualidade e rastreabilidade que são exigidos pela norma.
3.3 HISTÓRICO E DESENVOLVIMENTO DA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS
A técnica de cultura de células animais permite a manutenção de células vivas em ambiente in vitro, independente do organismo que a originou. Esse processo de manutenção da viabilidade celular fora do organismo de origem teve início de 1907, com Ross Harrison (AMBROSE, 2019). Através do método de “gota suspensa”, a pesquisadora adicionou um pequeno pedaço de tecido nervoso de embrião de sapo em uma gota de meio de cultivo e observou que as células começaram a migrar do tecido para o ambiente circulante (FRESHNEY, 2010). Alexis Carel e Charles Lindbergh também começaram a estudar a cultura de células e tecidos, gerando grandes avanços, como a cultura de células em placas de vidro e o desenvolvimento de técnicas para manter a cultura em crescimento
contínuo. Essa forma de cultura celular perdurou por cerca de 50 anos, sendo denominada de cultivo de tecidos (BROCKBANK; COVAULT; TAYLOR, 2007).
O grande avanço da cultura celular ocorreu em 1951 com George Gey, o qual cultivou células de tecido tumoral humano estabelecendo a linhagem derivada de um adenocarcinoma cervical agressivo da paciente Henrietta Lacks, denominada de células HeLa (LUCEY e NELSONREES e HUTCHINS, 2009). As células HeLa vêm sendo utilizadas há mais de 60 anos para estudos da biologia humana, sendo considerada uma ferramenta indispensável até os dias de hoje. Sua aplicação possibilitou avanços nas pesquisas de diversos tipos de câncer, desenvolvimento de vacinas, tratamento de doenças e a descoberta dos mecanismos envolvidos por trás delas (FRESHNEY, 2010; HILLEMAN, 1990). Apesar dos avanços inegáveis com o estabelecimento desta linhagem celular, história de Henrietta Lacks causou discussões sobre uma série de questões éticas na pesquisa biomédica, principalmente sobre o consentimento do doador das células. Devido a esse acontecimento, informações quanto a origem das células e o termo de consentimento dos doadores do material biológico, foram aperfeiçoados, garantindo a rastreabilidade, mas preservando a identidade do doador (BESKOW, 2014).
Ao decorrer dos anos os estudos da cultura de células foram evoluindo, tornandose amplamente utilizada a partir da introdução dos antibióticos. Eles facilitaram a propagação da linhagem celular por um longo período, embora muitos alertas contra seu uso contínuo e o risco associado de selecionar micro organismos resistentes tenham sido indicados. A cultura de células deve sua importância a dois ramos importantes da medicina: a produção de vacinas antivirais e a compreensão da neoplasia. A padronização das condições e das linhagens celulares para produção e ensaios de vírus, é sem dúvida, o grande responsável pelo desenvolvimento da tecnologia de cultura de células (MOLINARO e CAPUTO e AMENDOEIRA, 2013).
Atualmente, o cultivo de células é amplamente empregado para estudo de doenças, medicamentos, diagnóstico, produção de vacinas e estudos toxicológicos in vitro, gerando inúmeros benefícios científicos e tecnológicos (PAMIES, 2018). Além disso, com a cultura de células as áreas da medicina regenerativa e engenharia de tecidos tiveram um avanço (ALBERTS et al., 2012).
3.4 TIPOS DE CULTIVO CELULAR
A cultura de células animais é dividida em distintas categorias de acordo com suas características in vitro. As células isoladas diretamente do tecido, obtidas através da desagregação enzimática ou mecânica, são conhecidas como células primárias. Com o processo de desagregação as células podem proliferar e serem subcultivadas por um período de cultura limitado, podendo mudar as suas características devido ao processo de senescência, ou seja, sua duração em cultura é finita (COECKE, et al., 2005; FRESHNEY, 2005).
Algumas células podem sofrer mutações espontâneas ou induzidas que possibilitam um processo de duplicação ilimitado, sendo conhecidas como células de linhagens contínuas. Esse tipo de célula pode se multiplicar por longos períodos de tempo, com alta taxa de proliferação. Um clássico exemplo são as culturas tumorais, as quais apresentem alta proliferação e podem ser mantidas em cultura por um número ilimitado de passagens. Além disso, a maioria das células de roedores não desativa a produção da telomerase e, assim, seus telômeros não encurtam a cada divisão celular, podendo gerar algumas linhagens de células de roedores que também conseguem se dividir infinitamente (ALBERTS et al., 2012). Ambos os tipos de culturas de células são cultivados in vitro em condições adequadas para o seu crescimento e amplamente utilizados em estudos funcionais, bioquímicos e moleculares, análises de alvos farmacológicos e produção de produtos biológicos, incluindo vacinas e anticorpos, por exemplo (ALVES e GUIMARÃES, 2010). Entretanto, as células de linhagem contínua possuem um uso mais generalizado, pois fornecem um sistema mais padronizado em comparação com culturas de células primárias, bem como maior rendimento. Culturas primárias frequentemente divergem entre diferentes laboratórios e são muito mais suscetíveis a mudanças ambientais.
Dentre os sistemas de cultura celular existem tipos de cultivo como: técnicas baseadas em cultivo bidimensional (2D), cultivo tridimensional (3D) e o “organ on a chip”, conforme ilustrado na figura 1. As células em cultivo 2D (células cultivadas em monocamadas) são as mais utilizadas desde o século XX e ainda são o método dominante para maioria dos estudos biológicos. Este tipo de cultivo
é realizado em frascos ou garrafas de cultivo celular onde as células são capazes de aderir em uma superfície definida e mantidas em meio líquido, mantendo assim uma interface com a superfície de crescimento celular artificial, contato célulaa célula e interface com o meio de cultivo. Geralmente, esses frascos têm áreas definidas para crescimento celular, usualmente 25 cm2, 75 cm2 ou 150 cm2, dentre outros, além de fornecerem uma superfície ou substrato tratado para favorecer a adesão celular. Atualmente, o material mais comumente utilizado é o poliestireno (ATCC, 2014), (MARIN; PAGANI, 2018). As vantagens das culturas 2D estão associadas à manutenção simples e o baixo custo da cultura. Entretanto, as culturas aderentes também apresentam inúmeras limitações, principalmente por não mimetizarem as estruturas tridimensionais e interações naturais de tecidos e tumores (KAPAŁCZYŃSKA et al., 2018). Além disso, normalmente são representativas de apenas um tipo celular presente no tecido, desta forma interações entre tipos celulares diversos também não são comumente representadas, salvo em sistemas específicos de coculturas.
As desvantagens apresentadas pela cultura bidimensional levaram a criação de modelos que tentam mimetizar as condições in vivo, conhecido como métodos tridimensionais. Estes modelos de cultivo tridimensional apresentam características no qual a cultura de células é inserida dentro de dispositivos que imitam a microarquitetura específica de tecidos e órgão e permitem que as células explorem a dimensão de espaço aumentando as interações com o ambiente tridimensional. O sistema tridimensional foi desenvolvido para melhorar a estrutura das células e a equivalência fisiológica dos experimentos in vitro realizados, pois a estrutura 3D melhora o contato célula – célula e as redes de sinalização intercelular, o que reproduz melhor as condições in vivo (ALÉPÉE et al., 2014).
Na perspectiva de gerar sistemas in vitro que cada vez mais se assemelham ao organismo humano e junto com avanço tecnológico, estão surgindo os sistemas de microfluídica, também denominados de “organ on chip” ou “human on chip”. Esse sistema é baseado em dispositivos microfluídicos (fluxo de líquido em canais) que permite mimetizar o ambiente celular de um ou mais órgãos para uma melhor compreensão dos efeitos biológicos, principalmente relacionados a efeito de medicamentos, buscando gerar dados mais preditivos em
testes não clínicos de segurança e eficácia (MARIN e PAGANI, 2018; WEINHART et al., 2019). Figura 1 Tipos de cultivo celular. Essa figura representa os tipos de cultivo de células. Fonte: Elaborado pela autora e por Wagner Najib. 3.5 CONDIÇÕES APROPRIADAS PARA CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS
Para estabelecer uma cultura de células é necessário proporcionar condições ambientais e nutricionais que mimetizem o organismo humano ou animal de origem, conforme ilustrado na figura 2 (MOLINARO e CAPUTO e AMENDOEIRA, 2013). As células em cultura permanecem com características similares ao do tecido de origem. Células hematopoiéticas, por exemplo, circulam em nosso sistema sanguíneo, não sendo necessário uma matriz sólida para sua proliferação, assim, in vitro, elas crescem de forma não aderida figura 1. Já células epiteliais ou células que estão ancoradas em uma matriz necessitam de superfície para se aderir e proliferar, que em sistemas in vitro normalmente utilizase suportes plásticos específicos (ALBERTS et al., 2012). Além disso, essas células
precisam ser mantidas em condições de temperatura, pressão e umidade coerente com as funções fisiológicas do organismo de origem. Células humanas normalmente tem ótimas condições de cultura incubadas a 37ºC ± 1ºC, 90% ± 10% de umidade e 5.0% ± 1.0% de CO2 (BARKER, 2005). Figura 2 Representação das condições ideias para o cultivo de células. Para estabelecer uma cultura de célula é necessário condições para a manutenção e proliferação celular como meio de cultivo de acordo com a linhagem, suplementos, temperatura, umidade e gás carbônico. Fonte: a autora. Cada tipo celular precisa de nutrientes específicos para sua proliferação e manutenção em cultura, que normalmente são supridos através dos meios de cultivo celular. Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950 com diferentes formulações para proporcionar o crescimento das células in vitro, suprindo assim as necessidades metabólicas, energéticas e estruturais das células. Os meios de cultura com adição de suplementos como soro, tampões, antibióticos apresentam em sua formulação, sais minerais, aminoácidos, vitaminas, proteínas, peptídeos, lipídeos, ácidos graxos. (COECKE et al., 2005; ECACC, 2008).
Dentre esses suplementos, o soro animal consiste no principal elemento da formulação, sendo crucial para a proliferação e manutenção das culturas de células. Esse soro consiste em uma fonte de muitos constituintes como fatores de
crescimento, hormônios, proteínas, peptídeos e lipídeos. O soro animal pode ser obtido de fontes adultas, neonatais ou fetais. O soro bovino é o mais utilizado, sendo que o tipo de soro depende dos requisitos específicos de cada tipo celular (COECKE et al., 2005). Outros elementos como bicarbonato de sódio e vermelho de fenol são importantes para ver a qualidade das células, sendo possível identificar alterações metabólicas e eventuais contaminações com a simples mudança de coloração do meio de cultura. O meio amarelo e ácido pode indicar que a cultura cresceu demais, contaminação bacteriana ou muito CO2 na estufa. Já um meio violeta é alcalino, pode indicar uma cultura sem crescimento, contaminação por fungos ou pouco CO2 na estufa (BARKER, 2005; COECKE et al., 2005).
O equilíbrio de todos esses fatores (figura 2) é fundamental para a manutenção celular. A cultura in vitro é altamente sensível, assim, qualquer alteração nos pontos mencionados pode levar as células a condições de estresse e eventual morte e perda da cultura. Com isso, tornase fundamental estabelecer uma rotina de boas práticas de cultura de células, possibilitando que a pesquisa e desenvolvimento científico ocorram de forma reprodutível e com qualidade. 3.6 BOAS PRÁTICAS DE CULTURA DE CÉLULAS O uso de sistemas in vitro está se expandindo consideravelmente ao longo dos anos, não apenas na pesquisa básica, mas também para atender aos requisitos regulatórios para registros de novos produtos, incluindo os farmacêuticos (DOS SANTOS et al., 2015). A manutenção de altos padrões de qualidade de cultura de células é fundamental para práticas científicas e essencial para maximizar a reprodutibilidade, confiabilidade, credibilidade, aceitação e aplicação adequada de qualquer resultado produzido (FREEDMAN et al., 2015). Entretanto, ao longo dos anos, milhares de trabalhos foram retratados por falta de reprodutibilidade e pela produção de resultados inconclusivos, ocasionando retrocessos e grandes impactos sociais e econômicos dentro da pesquisa científica. Diante desse cenário, o estabelecimento de pesquisas científicas em condições de cultura atendendo a critérios mínimos de qualidade vem se
difundindo e se tornando essencial para publicações de alto impacto (FOLGUERASFLATSCHART et al., 2018).
Segundo pesquisa bibliométrica realizada na plataforma de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI), a partir de 2000 até 2019, os trabalhos incluindo o tema de boas práticas de cultura de células teve um grande crescimento, sendo observado constantemente em publicações até hoje conforme representação gráfica na figura 3.
Figura 3 Representação gráfica da análise bibliométrica do número de artigos publicados de forma cumulativa na plataforma do NCBI referente a Boas Práticas em Cultura de Células.
Fonte:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=good+cell+culture+practices. Acesso em 22 de abril
de 2020.
Essa expansão da aplicabilidade de boas práticas de cultura de células foi fundamentada, principalmente, por meio de diretrizes nacionais e internacionais, desenvolvidas a fim de definir os padrões mínimos para cultura de células e tecidos de qualidade. Dentre os documentos temse os guias da Organização Mundial da Saúde, do EU Reference Laboratory for alternatives to animal testing (EURL ECVAM) e documentos de agências regulatórias (ESKES et al., 2017; (OECD, 2018).
De forma geral, essas referências descrevem questões relacionadas à caracterização e manutenção das características essenciais, bem como critérios de qualidade, segurança, treinamento, registros e ética envolvendo a manipulação
de células e tecidos. Entre os documentos que estabelecem os critérios de qualidade para boas práticas de cultura de células o guia “Guidance on good cell culture practice a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice” lista um conjunto de princípios destinados a apoiar as melhores práticas em todos os aspectos do uso de células e tecidos in vitro, e complementa, mas não substitui, qualquer orientação, diretrizes ou regulamentos existentes (ESKES et al., 2017).
Para inserção de um sistema de Boas Práticas em Cultivo de Células (BPCC) tornamse necessários um planejamento e diagnóstico inicial do ambiente de trabalho, a fim de estabelecer as ações prioritárias a serem empregadas e certificar que o local atende aos requisitos mínimos para um bom funcionamento e manipulação de sistemas in vitro. Desta forma, a escolha de ferramentas de planejamento e diagnóstico são fundamentais na implantação do sistema de BPCC no âmbito de um sistema de garantia da qualidade.
3.6.1 Ferramentas de garantia da qualidade aplicadas ao estabelecimento de banco de células.
As boas práticas de cultivo celular apresentam como objetivo principal garantir todo o processo do desenvolvimento do método in vitro para que este seja o mais eficiente e eficaz possível, permitindo assim, a reprodutibilidade e robustez dos resultados obtidos com sistemas in vitro. As BPCC podem ser abordadas em dois aspectos fundamentais: 1) gerencial, relativo à rastreabilidade, registros, padronização e sistema de garantia da qualidade e 2) laboratorial, com aplicação de metodologias padronizadas de manipulação e ensaios aplicados ao controle de qualidade dos cultivos celulares, visando a caracterização celular e verificação da ausência de contaminantes (ESKES et al., 2017). Desta forma, essas duas linhas de ação podem ser abordadas na implementação de boas práticas de cultivo celular em ferramentas gerenciais, visando tomada de decisões quanto a priorização de atividades e organização do ambiente laboratorial e atividades.
3.6.1.1 Estabelecimento de plano de ação com a ferramenta 5W2H
Para a etapa de planejamento de ações e tomada de decisões, normalmente, uma das ferramentas da qualidade mais utilizadas nas organizações é 5W2H. Esta metodologia é, inclusive, aplicada a pequenos negócios e amplamente divulgada pelo Sebrae, como ferramenta para elaborar um plano de ação. É uma ferramenta tão óbvia e tão utilizada que não há concordância quanto a quem a desenvolveu (SEBRAE, 2019).
A ferramenta é baseada na resposta a 7 perguntas, fornecendo informações de cunho gerencial através das definições de responsabilidades, métodos, prazos, objetivos e recursos associados (MARSHALL JUNIOR et al., 2008). O 5W2H, como ilustrado na figura 4, representa a junção das iniciais das seguintes palavras em Inglês: What (o que?) – Why (por que?) – Where (onde?) – When (quando?) – Who (por quem será feito?) How (como?) – How much (quanto?). Figura 4 Representação Esquemática da Ferramenta 5W2H. A ferramenta foi aplicada para estabelecimento de plano de ação de implantação do Banco de Células do ICC com boas práticas de laboratório. O esquema representa as 7 perguntas de cunho gerencial elaboradas com a finalidade de estabelecer responsabilidades, prazos, custos, atividades, modo de ação, dentre outras questões fundamentais para definição de plano de ação e priorização das atividades. Fonte: a autora.
Esta ferramenta da qualidade auxilia para uma análise do detalhamento do processo e plano de ação visando sua execução. No caso específico deste trabalho, que é a implantação de um banco de células de acordo com as BPCC, por ser processo com várias atividades, com complexidades variáveis e recursos limitados, a aplicação de uma ferramenta de priorização, como o 5W2H, se faz necessária para auxiliar no planejamento, execução e conclusão das atividades de forma lógica, econômica e com qualidade (Avila Neto et al., 2016).
3.6.1.2 Organização Laboratorial com a ferramenta 5S
Dentre os sistemas de gestão da qualidade difundidos, o programa ‘5S’ vem sendo amplamente empregado por laboratórios de pesquisa (GAPP e FISHER e KOBAYASHI, 2008).
O programa 5S teve início em 1950, idealizado por Kaoru Ishikawa, com o objetivo de reestruturar e organizar melhor a indústria japonesa para combater as perdas e desperdícios na indústria. O programa 5S, é conhecido pela simplicidade de seus princípios, e promove a quebra da resistência das pessoas à mudança e gera novos padrões de comportamento resultando em um ambiente mais organizado, limpo e por consequência mais agradável. O modelo de qualidade 5S visa à melhoria do ambiente de trabalho no sentido físico, lógico e mental (RODRIGUES, 2010).
A ferramenta 5S é um conjunto de conceitos simples que, ao serem praticados, são capazes de modificar o seu humor, o ambiente de trabalho, a maneira de conduzir suas atividades e as suas atitudes. O termo 5S é derivado de cinco palavras japonesas iniciadas com a letra S, assim, a melhor forma encontrada para expressar a abrangência e profundidade dessas palavras foi acrescentar o termo "Senso de" antes de cada palavra em português, possibilitando a manutenção do termo original 5S, mesmo na língua portuguesa (GAPP; FISHER; KOBAYASHI, 2008). A seguir são apresentados os termos que integram o 5S:
Senso de descarte (Seiri): é a primeira fase do programa. Referese a manter somente o necessário no ambiente de trabalho, o tornando organizado.
Senso de arrumação/organização (Seiton): A organização, referese diretamente na ordenação do layout físico facilitando o fluxo no processo. À disposição das ferramentas e equipamentos em uma ordem que permita o fluxo do trabalho. Ferramentas e equipamentos deverão ser deixados nos lugares onde serão posteriormente usados. O processo deve ser feito de forma a eliminar os movimentos desnecessários desenvolvendo assim um ambiente mais seguro para se trabalhar.
Senso de Limpeza (Seiso): Designa a necessidade de manter o ambiente mais limpo possível antes, durante e após as atividades, tornandoo mais agradável e saudável. Contribui diretamente para a próxima fase do programa.
Senso de saúde (Seiketsu): O senso de saúde proporciona uma maior qualidade de vida dos funcionários através das condições de trabalho mais favoráveis.
Senso de disciplina (Shitsuke): O último senso é responsável pela manutenção de todas as fases do programa, desenvolvendo o hábito de observar e seguir normas, regras, procedimentos (GAPP e FISHER e KOBAYASHI, 2008; RODRIGUES, 2010).
A ferramenta 5S através dos seus sensos de descarte, organização, limpeza, disciplina e saúde figura 5 permitem a implementação de um laboratório devidamente padronizado e, consequentemente, a aplicação do sistema de boas práticas em cultura de células.
A gestão da qualidade por meio das ferramentas como o 5S, 5H2W e a aplicação das BPCC visa estabelecer um processo padrão e consensual entre todos os envolvidos gerando sistemas eficazes de controle de qualidade, que garantam suporte e treinamento a todos os usuários e que contribuam para a geração de resultados confiáveis e reprodutíveis. Para atingir os principais aspectos que garantam as BPCC, um sistema de gestão da qualidade deve ser inicialmente incorporado no laboratório de cultivo celular, a fim de garantir a confecção de procedimentos padronizados, um ambiente organizado e usuários devidamente treinados.
Figura 5 Representação esquemática da Ferramenta 5S aplicada. Os sensos de descarte, organização, limpeza, disciplina e saúde podem ser aplicados para a organização de plano de ação de implantação do Banco de Células do ICC com boas práticas de laboratório. Fonte: a autora. 3.6.2 Procedimentos operacionais padrões aplicados às boas práticas de cultura de células
Para que os procedimentos sejam executados de maneira padrão é necessário redigir procedimentos operacionais padronizados (POPs) das rotinas do laboratório em concordância com as boas práticas de cultivo de células. Os POPs são documentos do sistema de garantia da qualidade da instituição que visam fornecer todas as informações necessárias para que um processo seja realizado da mesma forma por todos os usuários. Isso permite, além de padronizar e otimizar atividades, garantir maior qualidade e eficiência nas atividades realizadas, nivelando, desta forma, um padrão de execução dos procedimentos (INMETRO, 2018).
O POP deve ser escrito de forma clara e detalhada, com instruções para que o indivíduo treinado possa entender e executar o procedimento descrito. A responsabilidade pela elaboração do documento é do responsável pela rotina do laboratório e o mesmo deve ser verificado por um especialista e aprovado pelo
chefe responsável. Os POPs são aplicados a todos os usuários do laboratório de cultivo celular. Eles devem conter detalhamentos relacionados a área de aplicação e podem incluir comentários e instruções relativas à biossegurança, detalhes relativos aos reagentes (como grau para cultivo celular, se aplicável), lista de equipamentos necessários e técnicas a serem usadas. Dessa forma, os POPs possibilitam a uniformidade na rotina de trabalho por meio da padronização e rastreabilidade do processo e treinamento dos usuários. Além disso, permite que os procedimentos realizados sejam auditados, fazendo parte de um sistema de garantia da qualidade.
Além dos POPs, todo um sistema de registro deve ser incluído, seja através do uso do caderno de laboratório, caderno de dados brutos, ou mesmo formulários padronizados para registro das atividades, os Registros da Qualidade (RQs), os quais auxiliam, mais uma vez, na auditoria dos processos e rastreabilidade.
Cada laboratório ou instituição deve ter seus sistemas que garantam que esses POPs sejam aprovados, revisados (quando necessário) e que a cópia do laboratório esteja sempre atualizada, para garantir a uniformidade dos experimentos. É importante que os procedimentos sejam revisados pelo menos uma vez a cada dois anos (GERAGHTY et al., 2014), bem como existam mecanismos para recolhimento de cópias obsoletas e verificação periódica de ciência/treinamento nas novas versões, que muitas vezes pode ser feita com leitura da versão atualizada contendo detalhamento das modificações. 3.6.3 Treinamento padronizado dos usuários a fim de garantir o estabelecimento de boas práticas em cultura de células Para garantir o estabelecimento de boas práticas em cultivo é fundamental realizar o treinamento dos usuários até que estejam aptos a efetuar os procedimentos. É de grande importância o treinamento adequado na técnica asséptica visando a conscientização de que os principais problemas do cultivo celular como a contaminação por microorganismos ou a mistura de linhagens, podem ser reduzidos com bons procedimentos de manipulação. O treinamento deve ser realizado por alguém experiente da equipe. Indivíduos com experiência
