Biorreatores e Processos Fermentativos

Biorreatores e

Processos Fermentativos

Aula 5 – Profa_{. Dr}a_{Ilana L. B. C. Camargo}

Ciências Físicas e Biomoleculares IFSC - USP

Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios:

Processo “Upstream”

Biorreatores e biorreação

Parte I

Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas ou microrganismos, ou enzimas sobre condições controladas para a biotransformação de matérias primas em produtos.

Produto– alimento, medicamento ou composto industrial

Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados

Biorreatores, reatores bioquímicos, reatores biológicos

são os reatores químicos nos quais ocorrem uma série

de reações químicas catalisadas por biocatalisadores

Enzimas

Reatores

enzimáticos ou

Bioquímicos

Células vivas

Biorreatores ou

Reatores

Biológicos

Biorreatores

Sistema não asséptico– onde não é absolutamente necessário se operar com culturas inteiramente puras (sistemas de descarte de efluentes);

Sistema asséptico –onde as condições de assepsia são pré-requisitos para a formação do produto com sucesso;

Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de contaminações!!

Antigamente, a maceração das uvas era feita com os pés!! Produção caseira dos vinhos

http://www.viagemesabor.com.br/noticias/roteiros/br/norte/para/marajo

Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de contaminações!!

Queijo de leite de búfala

Tanque de maceração das uvas Produção de vinhos (Hoje: prensa hidráulica) Produção artesanal de queijo, vinho, vinagre, iogurte e cerveja, muitas

vezes eram processadas satisfatoriamente, mesmo sob condições precárias de assepsia

Chaim Weizmann e colaboradores, Inglaterra (1914-1918) Início de FERMENTAÇÃO CONTROLADA

Processo submerso anaeróbio de produção de acetona-butanol - grande escala com condições total de assepsia;

- condições estritas de anaerobiose (Clostridium acetobutylicum);

Proteção contra aeróbios, mas não impedia a contaminação por bacteriófagos!!

Dióxido de enxofre (conservante)

Hoje: prensa hidráulica Maceração das uvas

Biorreator ou fermentador

Biorreator ou fermentador

Variação em forma e tamanho dependendo da aplicação

O design do biorreator depende de um número de fatores que incluem: -Tipo de células

-Tipo de reação metabólica

-Informação sobre a transferência de massa e calor -Viscosidade e homogeneização

Tamanhos:

-Frascos agitados (erlenmeyers): 100 – 1.000 mL -Fermentadores de bancada: 1 L – 30L

-Fermentadores piloto: 100 – 1.000 L

-Fermentadores industriais: 1.000 – 1.000.000 L

Biorreator ou fermentador

1943 – EUA, Primeira planta industrial de fermentação para produção de penicilina em fermentadores de aço-carbono de 54 m3

• Reatores em aço-carbono • Sistemas de agitação e aeração • Fundo e tampa torriesféricos

esterilizáveis

• Entrada para a adição de inóculo • Antiespumante

• Coleta de amostras

• Descarga e saída dos gases formados durante a fermentação, etc.

Biorreator ou fermentador

Padrões de materiais usados nos fermentadores sofisticados: ❖Todos os materiais que estão em contato com as soluções ou com a cultura do organismo devem ser resistentes à corrosão para prevenir a contaminação do processo com traços de metais;

❖Não podem ser tóxicos pois se houver alguma dissolução do material

ou componente não haverá inibição do crescimento da cultura;

❖Materiais precisam suportar repetidas esterilizações por vapor em alta pressão;

❖O sistema de agitação, portas de entrada e de saída devem ser rígidas

o suficiente para não deformar ou quebrar sob estresse mecânico;

❖Inspeção visual do meio de cultura é uma vantagem, por isso deve haver materiais transparentes quando possível;

Biorreator ou fermentador

Sistema de agitação

Agitadores: turbinas Sonda pH

Sonda oxigênio dissolvido

Camisa de resfriamento

Reator agitado mecanicamente (STR: stirred tank reactor)

• Tanque cilíndrico vertical; • Agitado mecanicamente ou não; • Provido de sistema de

aquecimento e resfriamento;

• Demais controles necessários

Serpentinas

Estudo atual Aumento de escala 12 Kg  800 Kg

Capacidade dos biorreatores de escala

industrial

1- Pequena escala: 1 a 2 m3_{de capacidade– cultivo de microrganismos}

patogênicos, ou para crescimento de células animais ou vegetais. Em geral, seu uso tem como objetivo produtos ligados à área de saúde

2 – Escala intermediária: dezenas de metros cúbicos até 100 a 200 m3_– especificamente empregado na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas.

3- Grande escala: reatores com milhares de metros cúbicos de capacidade -para processos que exigem poucos ou até mesmo nenhum cuidado de assepsia: fermentação alcoólica ou do tratamento biológico de resíduos

1- O reator deve ser capaz de manter-se estéril por muitos dias, trabalhar sem problemas por longos períodos e satisfazer todas as exigências legislativas de contenção ambiental;

2- As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto a aeração e agitação, devem ser plenamente satisfeitas, mantendo porém a integridade física dos mesmos;

Função primária de fermentação

fornecer condições ambientais adequadas ao crescimento dos microrganismos

6- Um sistema de tomada de amostras à prova de contaminação do conteúdo do fermentador deve ser parte integrante do equipamento.

3- A potência absorvida deve ser a menor possível;

4- Um eficiente sistema de controle de temperatura deve estar disponível;

5- Um sistema de controle de pH deve estar disponível; Para tanto, 12 pontos devem ser observados:

7- Perdas por evaporação devem ser mantidas ao mínimo;

8- Eficiente sistema de controle dos gases e saída do fermentador devem estar disponíveis;

10 – O reator deve preencher, sempre que possível, a característica de multi-propósito, contudo, a regulamentação de contenção ambiental e a possibilidade de contaminações cruzadas podem ser fatores limitantes

9 - O reator deve exigir o mínimo em mão-de-obra para sua operação, limpeza e manutenção;

11- O reator deve ter as superfícies internas polidas e todas as suas conexões, na medida do possível, devem ser soldadas e não rosqueadas;

12- Na medida do possível, o reator deve manter uma geometria similar à dos reatores menores ou maiores, a fim de facilitar a ampliação de escala do processo.

Para tanto, 12 pontos devem ser observados:

Escala laboratorial ~1L

Biorreator ou fermentador

1. Reatores de vidro com fundo arredondado ou chato e tampa superior de inox ligada ao corpo por uma flange. Diâmetro máximo = 60 cm.

vidro borossilicato  esterilizado em autoclave;

2. Reatores com corpo cilíndrico de vidro, com tampas superior e inferior em aço inoxidável. (10-20L).

http://www.ars-fla.com/Mainpages/Bio-Reactor/bioreactor.html

Biorreator ou fermentador

Composição: Reatores Pilotos e industriais Volumes: 50 L a 500 m3

Analisar materiais quanto:

- Capacidade de resistir às pressões de esterilização - Resistência à corrosão

- Toxicidade dos produtos resultante de uma eventual corrosão; - Custo do material

Aço inoxidável 316 – considerado adequado

não resolve todos os problemas: produção de ácido cítrico pH 1 ou pH 2  corrosão

Inox 317 com 3-4% de molibdênio

Tipo de

aço Carbono Cromo Níquel Titânio Molibdênio

304 0,08 18-20 8-11 -

-304L 0,03 18-20 8-11 -

-321 0,08 17-19 9-12 ≥ 5 xC

-316 0,08 16-18 10-14 - 2-3

316L 0,03 16-18 10-14 - 2-3

Tabela 1. Composição de alguns tipos de aços inoxidáveis AISI. Composição nominal (%).

Fermentação com células animais  corrosão dos metais pesados  insuspeitáveis problemas

Biorreator ou fermentador

Composição: Reatores Pilotos e industriais Outros materiais:

Cobre (cervejarias – resistência pelas leveduras chega a 30 ppm) Alumínio– raramente utilizado pois reagentes podem atacá-lo; Níquel – elevada resistência à corrosão;

Titânio– alto custo;

Vidro borossilicato– instalação de visores;

Plásticos– resistentes à corrosão, mas alguns não resistem muito a solventes (polietileno, polipropileno, PVC rígido...) Aço carbono – Ferro + carbono: utilizado nos primeiros reatores

Fermentação microbiana: um sistema de três fases

1. Fase líquida: contém sais, substratos e metabólitos dissolvidos. Pode também possuir substrato imiscível em água;

2. Fase sólida:consiste nas células, substratos ou produtos insolúveis;

3. Fase gasosa: oxigênio, CO₂

1 - Oxigênio 2 - Temperatura 3 - pH Fatores importantes: Entrada de Inóculo meios/nutrientes anti-espumante Sistema de aeração Sistema de colheita de amostras Sistema de agitação Sondas para determinação de pH pO2

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

1- Oxigênio

Processos aeróbios têm destaque na Biotecnologia Industrial, pois estão envolvidos no cultivo de microrganismo para produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas recombinantes (hormônios, insulina), etc.

Processos fermentativos envolvendo cultivo de células aeróbias ou aneróbias facultativas visando formação de produtos ou tratamento biológico de águas residuárias têm em comum o aspecto de exigirem um adequado dimensionamento do sistema de transferência de oxigênio (fase gasosafase líquida)

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

1- Oxigênio Último elemento a aceitar elétrons

Permite:

- Armazenamento de energia – ATP; - Reoxidação das coenzimas que participam

das reações de desidrogenação.

NADH NADH

NADH

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

Participam das reações de síntese de moléculas levando à sobrevivência das células e ao surgimento de novas células no processo de proliferação da biomassa microbiana, para a qual a

1- Oxigênio C6H12O6+ 6O2 6CO2+ 6H2O

Para a oxidação de 1 mol de glicose, é necessário o consumo de 6 mols de O₂

Glicose é bastante solúvel, já O₂é pouco solúvel em água. A concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da ordem de 7 mg O₂/L (7ppm), ao se borbulhar ar atmosférico à pressão de 1 atm

e a 35o_C.

Nada adianta alimentar o biorreator se não houver um ótimo

sistema de transferência de oxigênio

http://www.pptechnologygroup.com/cfd_engineering.htm

- Transferência entre fases gasosa e aquosa; - Oxigênio dissolvido deve chegar às células; - Oxigênio deve penetrar nas células;

- Oxigênio deve ser consumido na reação

considerados em uma fermentação industrial

1- Oxigênio _{Em reatores não aerados, o oxigênio é}

transferido do espaço livre acima do líquido.

A agitação quebra continuamente a superfície do líquido e aumenta a área de transferência.

O efeito da velocidade de agitação na entrada do gás em um biorreator de 2 L :

300 rpm 450 rpm 750 rpm

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

1- Oxigênio Chicanas/Baffles

Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

1- Oxigênio Chicanas, quebra vórtice ou “baffles”

Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio Normalmente:

4 chicanas equidistantes

Largura: 10% do diâmetro do reator

Devem ser fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do fermentador para evitar zonas de estagnação

Fatores físico-químicos que devem ser

1- Oxigênio _{Chicanas afastadas da parede do biorreator} Evita zonas de estagnação

considerados em uma fermentação industrial

Co

Co 1

t0 t1

Co

Concentração de Oxigênio dissolvida aumenta com a agitação

C o n ce n tra çã o de O2 Tempo

1- Oxigênio

Quando a velocidade de agitação é:

Devagar rápida

Injetar ar esterilizado

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

Bolhas não serão quebradas tendendo a subir direto

para a superfície. Acumulam no eixo do agitador,

coalescendo e diminuindo a transferência de oxigênio.

pequena

as bolhas pequenas irão circular por todo o reator e terão o seu tempo de residência aumentado.

grande

pequenas chicanas estão presentes

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (kLa) no sistema:

Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (k_La)

no sistema:

-Aumento da pressão;

-Aumento da concentração de O₂no ar inserido no reator; -Aumento da agitação;

-Aumento do fluxo de ar;

-Redução de espumas e remoção de bolhas de ar da superfície.

considerados em uma fermentação industrial

• Meio de fermentação: meios ricos em proteínas tendem a formar mais espuma. Muitas células produzem moléculas tipo detergente (ácidos nucléicos e proteínas excretadas após lise das células ou compostos lipídicos produzidos durante o crescimento);

• Taxa de aeração e velocidade do agitador (, formação de espuma);

Fatores que favorecem a formação de espuma:

Biorreator ou fermentador

Biorreator ou fermentador

O controle é feito com a adição de agentes antiespumantes baseados em silicone ou óleos vegetais que desestabilizam a espuma pela redução da tensão superficial.

ON-OFF. Uma parte fica no meio e a outra acima do nível do líquido. Quando a espuma atinge a superfície do sensor que está em cima, existe a produção de uma corrente elétrica que é detectada pelo controlador, resultando na ativação da bomba.

Fatores que auxiliam na diminuição da formação da espuma:

• O volume livre no reator: em sistemas nos quais a espuma é formada facilmente, o volume de trabalho deve ser reduzido para facilitar o controle de espuma. Quanto maior o volume livre, maior a probabilidade da espuma colapsar por causa do seu próprio peso;

Biorreator ou fermentador

• Temperatura do condensador: em reatores de laboratório, uma temperatura mais baixa pode ajudar no controle da espuma. A densidade da espuma aumenta quando ela se move de uma região mais quente para a região fria do condensador, causando o colapso da espuma;

• Quebradores mecânicos de espuma: agitador de alta velocidade. A bolha é puxada para o agitador e colapsa por ação de forças mecânicas. Em pequenos reatores de laboratório são utilizados quebradores ultrassônicos, que geram

uma cultura microbiana

Geometria do biorreator

Geralmente cilíndricos. São construídos em dimensões padrão publicadas pela International Standards Organisation e

British Standards Institution.

Reatores do tipo STR, em geral:

-Tanque cilíndrico

-Relação de altura:diâmetro (H:D) 2:1 ou 3:1

Wi Li Di _C HL DT WB Di = Diâmetro do impelidor (m) DT= Diâmetro do tanque (m)

HL= altura da coluna do líquido (m)

C = distância do impelidor ao fundo do reator (m) Wi = altura da pá da turbina (m)

WB= altura da chicana (m)

Esquema de tanque agitado por turbinas de pás planas, com indicação de dimensões importantes

na transmissão de potência ao líquido

Máxima potência com mais de um impelidor: Di < Hi < 2Di

Hi = distância entre impelidores

Número de impelidores para uma máxima transferência de potência

> N˚Impelidores > H_L– Di Di H_L– 2Di Di

Geometria do biorreator

Altura do líquido do reator e altura do reator Ht/Hl ~ 0,7 - 0,8 Depende do nível de espuma produzido durante a fermentação

Altura do reator e diâmetro do tanque Ht/Dt ~ 1 - 2

Reatores europeus tendem a ser mais altos que os projetados nos

EUA

Diâmetro do impelidor e diâmetro do tanque Da/Dt 1/3 – 1/2

Reatores com turb. Rushton são geralmente 1/3 do diâmetro do

tanque. Os de fluxo axial são maiores Largura das chicanas e diâmetro do tanque Lb/Dt ~0,08 – 0,1 Geralmente 10% do diâmetro do

reator Altura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor W/Da 0,2

Largura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor L/Da 0,25

Geometria do biorreator

Fluxos: Axial e Radial

Geometria do biorreator

Fluxo axial: o líquido é dirigido para a base do reator, isto é, paralelo ao eixo do agitador. São deficientes em gerar turbulência e quebra das bolhas de ar, o que os tornam indesejáveis para cultivos aerados.

Algumas marcas comerciais: Impelidor Lightnin 320, Impelidor

KPC – KROMA, Impelidor Pitched Impelidor Lightnin 

Geometria do biorreator

No fluxo radial, o líquido é inicialmente dirigido a parede do reator, isto é, ao longo do raio do tanque. Não é tão eficiente quanto o fluxo axial. Maior quantidade de energia é necessária para gerar o mesmo fluxo que o axial;

Algumas marcas comerciais: tipo Arrowhead, de pás curvas, de pás retas verticais, Impelidor Rushton, Impelidor Smith.

2- Temperatura

considerados em uma fermentação industrial

Reação no Biorreator

Exotérmica

Endotérmica Equipamentos devem ter

sistema de transferência de temperatura.

podem aquecer o sistema e também podem ser úteis para esterilização do biorreator antes do início do processo da fermentação; Sistema de circulação

de vapor e água quente

2- Temperatura

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

Para o resfriamento de culturas, por onde pode passar água, por exemplo,

com temperaturas menores Camisa (Jacket) ou

2- Temperatura

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

Camisassão cada vez menos utilizadas – reduzida eficiência na transferência de calor pela circulação irregular do vapor ou da água de refrigeração;

Serpentinas internas permitem boa troca térmica e eficiente circulação do fluido em alta velocidade

Inconvenientes:

a) Reduzem significativamente o volume útil do fermentador; b) Dificultam a limpeza interna;

c) Dificultam a mistura eficiente do meio em fermentadores agitados mecanicamente;

d) Podem ser um foco adicional de contaminação por defeito nas soldas difíceis de detectar.

3- pH

No biorreator deve haver um sistema de determinação de pH assim como uma entrada para balancear a reação com ácido/base que não ofereça nenhum risco de contaminação

para o sistema.

Temperatura e pH também ficam mais homogêneos com a agitação

Fatores físico-químicos que devem ser

Importância da agitação e mistura

Agitação adequada é essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas três fases:

1- Dispersão do ar no meio de cultivo

2- Homogeneização para igualar a temperatura, pH e concentração de nutrientes

3- Suspensão dos microrganismos e dos nutrientes sólidos 4- Dispersão de líquidos imiscíveis

Importância da agitação e mistura

Quanto maior a agitação, melhor será o crescimento?

CUIDADO!!

Agitação excessiva pode romper as células e aumentar a temperatura o que ocasiona uma

redução na viabilidade celular!!

Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade de mistura do meio evitando-se o dano celular.

1. Sistema de agitação;

2. Sistema de distribuição de O2; 3. Sistema de controle de espuma; 4. Sistema de controle de temperatura; 5. Sistema de controle de pH;

6. Portas de amostragem;

7. Sistema de limpeza e esterilização; 8. Linhas para esvaziar o biorreator.

Bibliografia

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 8 e 20

Smith JE. Biotechnology. 4th ed. Cambridge University Press, 2004. Cap. 4