UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE NUTRIÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS
Efeito da dieta hipoprotéica-hiperglicídica sobre a
sensibilidade à insulina e a gliconeogênese hepática em
ratos na fase de crescimento
Mayara Peron Pereira
Cuiabá – Mato Grosso
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE NUTRIÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS
Efeito da dieta hipoprotéica-hiperglicídica sobre a
sensibilidade à insulina e a gliconeogênese hepática em
ratos na fase de crescimento
Orientanda: Mayara Peron Pereira Orientadora: Profa. Dra. Nair Honda Kawashita Co-Orientadora: Profa. Dra. Gisele Lopes Bertolini
Cuiabá – Mato Grosso 2012
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociências da Universidade Federal de Mato Grosso, como requisito parcial para a obtenção do título de mestre. Área de Concentração: Nutrição. Linha de Pesquisa: Metabolismo e Transdução de Sinais.
III
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte
Catalogação na fonte: Maurício S.de Oliveira CRB/1-1860.
P436e Pereira, Mayara Peron.
Efeito da dieta hipoproteica-hiperglicidica sobre a sensibilidade a insulina e a gliconeogenese hepática em ratos na fase de crescimento / Mayara Peron Pereira Callejas. -- 2012.
xii, 62 f. ; 30 cm : color.
Orientadora: Nair Honda Kawashita. Co-orientadora: Gisele Lopes Bortolini.
Dissertação -- Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Nutrição, Programa de Pós-Graduação em Biociências, Cuiabá, 2012.
Bibliografia: f. 53-57
1. Dieta hipoprotéíca – hiperglicídica. 2. Gliconeogênese hepática. 3. Sensibilidade à insulina. I. Título.
V
“Aprender é a única coisa que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se
arrepende”.
VI
DEDICATÓRIA
Dedico a realização desse sonho às pessoas mais importantes da minha vida, que sempre estão ao meu lado me apoiando, minha mãe Roseni Peron, meu irmão Douglas Peron e ao meu grande amor e companheiro João Francisco.
VII
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo dom da vida e pela fé de que tudo sempre dará certo. Muito obrigada meu Deus pelas graças alcançadas.
A Profa. Dra. Nair Honda Kawashita, orgulho em dizer “minha orientadora”, pelo carinho e oportunidade em sempre aprender e superar as dificuldades, pelas palavras de incentivo, elogios, puxões de orelha e por ter me dado à oportunidade de descobrir uma paixão – a pesquisa.
A Profa. Dra Gisele Lopes Bertolini, co-orientadora, pelo apoio, amizade, carinho, respeito e contribuição dada neste trabalho.
A Profa. Dra Amanda Martins Baviera, que com seu jeitinho, competência e seu famoso “bem” confortaram e me ajudaram muito ao longo desta jornada. A Profa. Dra Valéria Ernestânia Chaves, pela grande ajuda nos experimentos
e pela colaboração com sua invejável inteligência.
A banca de qualificação e defesa Profa. Dra Amanda Martins Baviera, Profa.
Dra Maria Helena Gaíva Gomes da Silva, Profa. Dra Cláudia Marlise Balbinotti Andrade, Profa Dra Valéria Ernestânia Chaves pela
disponibilidade e grandes contribuições dada ao trabalho.
Ao Air Francisco da Costa, uma brilhante pessoa, que nos auxilia em tudo dentro e fora do laboratório. Obrigada por tudo!
A querida Profa. Msc. Neyres Zínia Taveira de Jesus que me guiou nos meus primeiros passos no mundo encantador da pesquisa.
Aos meus amigos do Laboratório de Pesquisa de Bioquímica, Daniel, Carlos, Damiana, Esther, Suellem, Carol, Arthur, Izabeau, Patrícia Angélica, Phelipe, Stéfano, Giullyanno, Derkian, Diego, Vinicius, Mendalli. E em especial minhas amigas Andreza Lúcia Menezes, Patrícia Ceolin, Juliany Siqueira Torres e
Emanuele Batistela, pela sincera amizade, ajuda e companheirismo em todos os
momentos.
Ao amigo Diego Luiz Doneda pela disposição em sempre me ajudar.
A todos os meus colegas da 3º turma de Mestrado em Biociências pelo convívio, momentos em sala de aula e parabéns a todos por percorrem os caminhos da pesquisa.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biociências pelos conhecimentos compartilhados.
VIII
Ao pessoal do LABA, em especial a Silvia Regina e Celso Afonso, pela ajuda e colaboração em todos os momentos.
A todos os funcionários do Biotério Central por estarem empenhadas em sempre que possível atender meus pedidos e cuidados com os nossos animais, tão valiosos para a pesquisa.
A Dr Isis do Carmo Kettelhut e ao Dr. Luiz Carlos Carvalho Navegantes pela recepção e oportunidade dada de conhecer o Laboratório de Controle do Metabolismo, da USP-Ribeirão Preto-SP.
Assim como todos os alunos do Laboratório de Controle do Metabolismo – USP-RP, por me receber tão bem, tirando minhas dúvidas, ensinado novas técnicas. Em especial a Sílvia de Paula, que me recebeu também não só na sua casa, como também no seu coração. Você também esta no meu coração!
Aos meus grandes amigos de fora da pesquisa, mas não coração, em especial
Diego e Letícia, Laura, Rodrigo e Anita, Tia Marizete e Tio Juel, que sempre
estavam interessados e torcendo por esta conquista. Amo vocês!
A toda a minha família, em especial minha Mãe Roseni e meu Irmão Douglas pelo apoio e carinho. Vocês são tudo em minha vida.
Ao Amor da minha vida, João Francisco Anache Leite, que sempre me incentivou sendo o maior responsável pelas graças que recebi. Meu maior ídolo e com certeza meu fã numero um.
A todos que não citei mais que de forma direta ou indireta participaram desta vitória.
IX
LISTA DE ABREVIATURAS
AG – Ácido graxo AGL- Ácido graxo livre
AG-TAG- Ácido graxo de Triacilglicerol AMPc- Adenosina monofosfato cíclica AUC- Área sobre a curva
CREBH- Elemento de resposta ao AMPc ligado a proteína H DHAP- Dihidroxiacetona fosfato
EMP- Erro médio padrão G3P- Glicerol-3-fosfato G6Pase- Glicose-6-fosfatase GH – Hormônio do crescimento GK- Gliceroquinase
GLI-TAG- Glicerol de triacilglicerol
GRU- Unidades regulatórias de glicocorticóides GTT- Teste de tolerância à glicose
H- Hipoprotéica HP- Hiperprotéica
ITT- Teste de tolerância à insulina N- Normoprotéica
PEP- Fosfoenolpiruvato
PEPCK- Fosfoenolpiruvato carboxiquinase PKA- Proteína quinase dependente de AMPc
PPARα- Receptores ativados por proliferadores de peroxissomo alfa SNC- Sistema nervoso central
TAB- Tecido adiposo branco
TABE- Tecido adiposo branco epididimal TABR- Tecido adiposo branco retroperitoneal TAG- Triacilglicerol
TAM- Tecido adiposo marrom TNF-α- Fator de necrose tumoral alfa
X
RESUMO
Estudos prévios do nosso laboratório mostraram que ratos em crescimento submetidos à dieta hipoprotéica-hiperglicídica (H) apresentam menor glicemia de jejum (15h), quando comparados aos animais submetidos à dieta normoprotéica (N), mesmo com prejuízo na sinalização da insulina nos tecidos adiposos. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a gliconeogênese hepática e a sensibilidade à insulina em ratos machos Wistar (~100g) submetidos a dieta H ou N durante 15 dias. Após este período os animais foram submetidos a jejum de 15 horas, quando então foram utilizados para o teste de tolerância à insulina (ITT), teste de tolerância a glicose (GTT), dosagens sanguíneas, experimentos de perfusão de fígado in situ, incorporação in vitro de 14 C-piruvato e conteúdo hepático protéico da fosfoenolC-piruvato carboxiquinase (PEPCK) e gliceroquinase (GK). Os dados estão expressos como média ± EMP (Student t-test, P<0,05). Os animais do grupo H apresentaram aumento nas concentrações plasmáticas dos substratos gliconeogênicos: glicerol (65%), L-lactato (122%), L-glutamina (25%) e alanina (65%), quando comparados aos animais N. O aumento na concentração de L-lactato plasmático sugere um aumento na utilização anaeróbica de glicose pelos tecidos. A produção de glicose no fígado (AUC-µmol.g-1) a partir de concentrações saturantes de glicerol (1mM), piruvato (5mM) e L-glutamina (5mM), mensurada pela perfusão de fígado in situ, (utilizando um substrato de cada vez), foi maior no grupo H (1,04 ± 0,10; 0,84 ± 0,05; 0,60 ± 0,01, respectivamente), quando comparado ao grupo N (0,67 ± 0,40; 0,68 ± 0,05; 0,39 ± 0,04, respectivamente). As concentrações séricas de glicerol e L-lactato no grupo H foram próximas às concentrações necessárias para a produção máximas de glicose. O conteúdo protéico da PEPCK no grupo H foi maior (25%) em comparação ao grupo N e o da GK não foi alterado pela dieta. A incorporação de 1-14 C-piruvato (nmol.g-1.h-1) no grupo H foi maior em glicose (H-569,2 ± 30,72 e N-463,0 ± 18,71), e menor em glicerol (H-17,98 ± 2,23 e N-24,10 ± 1,63) e, em ambos os grupos a incorporação foi maior em glicose e menor em glicerol. Os animais H também mostraram maior (AUC-mg.dL-1.120 min-1: 18.520 ± 513,8) tolerância à glicose e declínio mais rápido (Kitt: 0,039 ± 0,002) da glicose plasmática pela administração da insulina, quando comparados aos animais N (AUC-mg.dL-1.120 min-1: 23.679 ± 614,5; Kitt: 0,030 ± 0,002, respectivamente). Concluímos que a adaptação a dieta H, aumentou a capacidade de gliconeogênese hepática. Além disso, o glicerol e o L-lactato no estado fisiológico são os principais substratos que permitem a manutenção da glicemia, mesmo com o aumento na utilização da glicose.
Palavras chaves: Dieta hipoprotéica-hiperglicídica; Gliconeogênese hepática;
XI
ABSTRACT
Previous studies from our laboratory found that growing rats submitted to low-protein, high-carbohydrate (LPHC) diet have lower fasting glucose (15h), when compared to animals treated with control diet (C), even with impaired insulin signaling in adipose tissues. Given the above, the objective of this study was evaluate hepatic gluconeogenesis and insulin sensitivity in male Wistar rats (~100g) underwent LPHC or C diet for 15 days. After this period the animals were fasted for 15 h, when they were used for the insulin tolerance test (ITT), glucose tolerance test (GTT), blood dosages, liver perfusion in situ, in vitro incorporation of 14C-pyruvate and levels protein liver of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glycerokinase (GyK). Data are expressed as mean ± SEM (Student t-test, P<.05). Investigations of the hepatic gluconeogenesis show that the LPHC group showed increase in plasma concentrations of gluconeogenic substrates: glycerol (65%), L-lactate (122%), L-glutamine (25%) and L-alanine (65%) when compared to C group. The increased concentration of L-lactate suggests an increase in glucose anaerobic by the tissues. The liver production of glucose (AUC-µmol.g-1) from saturating concentrations of glycerol (1mM), pyruvate (5mM) and L-glutamine (5mM), measured by in situ liver perfusion, (using a substrate each time), was higher in LPHC group (1.04 ± 0.10; 0.84 ± 0.05; 0.60 ± 0.01, respectively) when compared with C group (0.67 ± 0.40; 0.68 ± 0.05; 0.39 ± 0.04, respectively). Serum concentrations of L-lactate and glycerol in LPHC group were close to the concentrations required to produce maximum glucose. The protein levels of PEPCK in LPHC group was higher (25%) compared to C group and the GyK was not altered by diet. The incorporation of 14C-pyruvate (nmol.g-1.h-1) in LPHC group was higher in glucose (LPHC- 569.2 ± 30.72 and C- 463.0 ± 18.71), and lowest in glycerol (LPHC- 17.98 ± 2.23 and C- 24.10 ± 1.63), and both groups incorporation was higher in glucose and lower in glycerol. The LPHC animals also showed higher (AUC-mg.dL-1.120 min-1: 18,520 ± 513.8) glucose tolerance and more rapid decline (Kitt: 0.039 ± 0.002) of plasma glucose by insulin administration, compared to C animals (AUC-mg.dL-1.120 min-1: 23,679 ± 614.5; Kitt: 0.030 ± 0.002, respectively). We conclude that adaptation to LPHC diet, increased capacity for hepatic gluconeogenesis. Moreover, glycerol and L-lactate are the main physiological substrates that permit the maintenance of blood glucose, even with the increase in glucose utilization.
Keywords: Low-protein, high-carbohydrate diet; Gluconeogenesis hepatic; Insulin
XII SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...14 2. OBJETIVOS...19 2.1. Objetivo geral...19 2.2. Objetivos específicos...19 3. REVISÃO DE LITERATURA...21 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...30 5. ARTIGO...40
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1. Introdução
Segundo Miñana-Solis & Escobar1, a desnutrição durante a gestação e lactação modificam as estratégias metabólicas que culminam no aparecimento de doenças na vida adulta. Trabalhos relatam que obesidade, diabetes mellitus tipo II e síndrome metabólica são doenças relacionadas à desnutrição precoce2,3. Esta teoria estabelecida por Barker4 é conhecida como “programação metabólica” e foi inicialmente proposta em humanos com a desnutrição presente no período de desenvolvimento fetal. Em complemento a esta teoria, trabalhos posteriores têm observado que a programação metabólica também pode ocorrer em períodos posteriores ao nascimento como por exemplo na lactação ou no pós desmame, bem como em outras espécies animais, como por exemplo, os roedores.
A desnutrição protéica, em particular, tem gerado um grande interesse pelas implicações para a saúde pública5 devido aos impactos metabólicos e bioquímicos que causam ao organismo vivo. Neste sentido, quando a desnutrição ocorre durante a gestação, período crítico de desenvolvimento, esta provoca adaptações anatômicas e fisiológicas relacionadas às ações da insulina, hormônio fundamental na regulação do metabolismo energético. Entre estas alterações, podem ser citadas, diminuição da vascularização do pâncreas6, redução no número de ilhotas e células β, diminuição na produção de insulina7, modificação na sensibilidade à insulina pelos tecidos adiposos e muscular, culminando com aumento na captação de glicose8,9. Alterações nas concentrações de glucagon e leptina10 também são observadas, com a finalidade de permitir a sobrevivência nestas condições nutricionais11. A importância da desnutrição protéica para a saúde pública também merece destaque, pela prevalência deste tipo de desnutrição nas sociedades ocidentais, decorrente da administração de uma dieta inadequada que se inicia logo após o período de aleitamento, contendo um excesso de carboidrato em detrimento à proteína12. Nesta situação, além dos impactos decorrentes da deficiência protéica, se observam os efeitos do excesso de carboidratos nesta fase de desenvolvimento. Estudos têm dado relevância aos efeitos da alta ingestão de carboidratos no metabolismo hepático, em virtude da sua importância na manutenção dos níveis de combustíveis séricos, particularmente a glicose, tanto no período alimentado como no jejum. Bisschop et al13 observaram que humanos saudáveis alimentados por 11 dias com uma dieta rica em carboidrato (84%) têm alterações na taxa de glicólise sem modificações na gliconeogênese. Outros estudos têm observado
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que fígado de ratos alimentados com dieta contendo alto teor de sacarose (62,5%) por 1 a 8 semanas apresenta diminuição na supressão da produção de glicose pela insulina, aumentando a capacidade gliconeogênica e o acúmulo de triacilgliceróis (TAG)14,15,16,17. Hein et al18 afirmam que dieta rica em sacarose (62,5%) induz resistência à insulina com alteração na cascata de sinalização da insulina, dislipidemia e deficiência na produção hepática de glicose pela gliconeogênese.
Embasado na relevância quanto na prevalência da administração da dieta hipoprotéica-hiperglicídica logo após o desmame, bem como pela importância dos efeitos causados pela dieta, estudos foram conduzidos em nosso laboratório por Aparecida de França et al19, com ratos machos logo após o desmame, submetidos por 15 dias a uma dieta hipoprotéica-hiperglicídica (H - 6% de proteína, 75% de carboidrato), com o objetivo de observar os efeitos da dieta e esclarecer os dados contraditórios encontrados na literatura. Estes animais apresentaram alterações neuro-hormonais e metabólicas marcantes quando comparado aos animais alimentados com dieta normoprotéica (N - 17% de proteína, 65% de carboidrato). Entre estas alterações observamos um aumento no fluxo simpático nos tecidos adiposos e elevação considerável nos níveis de leptina, corticosterona e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) plasmáticos. Posteriormente, Ceolin20
mostrou que, na fase adulta, estes animais apresentam alteração no perfil lipídico, possível resistência à leptina e elevados níveis plasmáticos de hormônios tireoidianos, corroborando a hipótese da programação metabólica.
As dietas H e N oferecidas aos animais são isocalóricas, visto que a redução energética gerada pela falta da proteína na dieta H é compensada pela adição de carboidrato. Os animais do grupo H, apesar do aumento de 100% nos níveis de leptina (que estimulam a liberação de peptídeos hipotalâmicos anorexígenos), apresentaram um aumento de 14% na ingestão absoluta de alimentos. Segundo White et al21, o gasto energético adicional que ocorre na fase de crescimento estimula o quadro de hiperfagia que é uma tentativa do organismo de suprir o requerimento de proteína, que é de 15 % na fase de crescimento e de 5% na fase adulta22. Mesmo com o aumento no consumo alimentar nos animais do grupo H, a ingestão protéica foi 40% menor que dos animais do grupo N ao final dos 15 dias19. Por serem as dietas isocalóricas, os animais do grupo H tiveram uma maior ingestão de calorias, porém com menor ganho de peso (12%) e prejuízo no crescimento (mostrado pelo menor índice de Lee) quando comparados aos animais do grupo N. Esse maior ganho energético com menor peso corporal só foi
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possível devido a alterações na composição química corporal, com aumento de lipídeos nos tecidos adiposos, fígado e carcaça e significativa perda de proteínas e água19.
Em um animal mantido sob uma dieta normal, a ação da insulina nos tecidos periféricos e no fígado estimula a captação e/ou a utilização de glicose e ao mesmo tempo inibe a neoglicogênese. Estas ações são de suma importância para reduzir a quantidade de glicose presente na corrente sanguínea após as refeições. Ao contrário, os menores níveis de insulina sérica no período de jejum e o aumento do glucagon vão estimular a glicogenólise hepática e a neoglicogênese na tentativa de manter a glicose em níveis basais, mesmo que a captação da glicose pelos tecidos adiposos e músculo seja inibida, a utilização pelos tecidos que utilizam unicamente ou preferencialmente a glicose como energia deve ser mantida. Outros hormônios como os glicocorticóides, em concentração sérica duas vezes maior nos animais H do que nos animais N23, são fundamentais na manutenção da glicemia, uma vez que a sua ação estimulando a neoglicogênese hepática é amplamente conhecida24,25,26. Os animais H apresentam aumento de 100% nos níveis de leptina, e muitos trabalhos mostram a importância deste hormônio para a gliconeogênese, uma vez que a leptina aumenta a expressão da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) por antagonizar os efeitos da insulina27,28,29. Foi observado nos animais H aumento de cerca de 100% nos níveis de TNF-α23, uma adipocina que contribui para a resistência à insulina e encontra-se elevada em indivíduos diabéticos obesos, bem como em vários modelos animais de obesidade30,31,32,33,34. Estudos relatam que TNF-α antagoniza os efeitos inibitórios da insulina sobre a gliconeogênese35,36,37.
No período alimentado, os animais do grupo H apresentaram glicemia semelhante aos dos animais N. Entretanto, após jejum de 15 horas, estes animais apresentaram uma redução na concentração de glicose sérica em relação aos animais N, com insulinemia similar19. Como é amplamente conhecido, os processos da glicogenólise e neoglicogênese são fundamentais para manutenção da glicemia de jejum. No entanto, após um período mais prolongado, com a depleção das reservas de glicogênio, a glicemia é mantida fundamentalmente pela neoglicogênese hepática. Segundo Newsholme et al38, a manutenção da glicemia durante o jejum é dependente da contínua produção de glicose pelo fígado. Para Bisschop et al13, a composição da dieta é um importante fator determinante da taxa de produção de glicose no período de jejum. Dados na literatura em relação ao efeito da restrição protéica sobre a produção hepática de glicose são controversos. Girard et al39 relatam que ratos após o desmame, que
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passam a ter uma dieta rica em carboidratos e baixa em proteína, sofrem uma mudança nutricional que culmina com uma diminuição na capacidade hepática em produzir glicose. Desai et al40 mostraram que animais alimentados, durante a vida fetal e pós-natal, com dieta com baixo teor de proteína (8%), apresentam uma diminuição na expressão hepática de glicoquinase e um aumento da PEPCK, enzimas envolvidas na glicólise e na gliconeogênese, respectivamente, resultando em uma maior produção hepática de glicose. Entretanto, estudos conduzidos por Toyoshima et al41 concluíram que a privação total de proteína inibe a gliconeogênese via mecanismo primário mediado pelo aumento na via de sinalização da insulina no fígado. A diversidade de respostas encontradas pelos autores se deve ao fato de que as respostas do organismo à restrição protéica dependem do nível e tempo da restrição, bem como da fase de desenvolvimento em que o animal se encontra42,43,44,19.
Outro fator que pode contribuir para uma menor glicemia, além de uma possível redução na produção de glicose, seria uma maior utilização deste substrato pelos tecidos. No entanto, investigações realizadas nos tecidos adiposos branco epididimal (TABE)45 e retroperitoneal (TABR)23 mostram um prejuízo na sinalização da insulina nos animais submetidos à dieta H, embora outros trabalhos relacionem a desnutrição protéica com o aumento na sensibilidade à insulina no tecido muscular46,47.
Diante de dados tão controversos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a gliconeogênese hepática, a sensibilidade à insulina e a tolerância à glicose para compreender o quadro de menor glicemia de jejum observada nos animais H.
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2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da dieta hipoprotéica-hiperglicídica sobre a tolerância à glicose, a sensibilidade à insulina e sobre a produção hepática de glicose através da gliconeogênese, em ratos em crescimento mantidos em jejum por 15 horas.
2.2. Objetivos específicos
I. Determinar a glicemia de jejum e as concentrações séricas dos precursores gliconeogênicos (L-alanina, L-glutamina, L-lactato e glicerol).
II. Avaliar a gliconeogênese no fígado a partir de diferentes substratos.
Determinar a capacidade máxima de produção de glicose hepática a partir de glicerol, piruvato e L-glutamina através da técnica de perfusão de fígado in situ.
Determinar a incorporação de 1-14C-piruvato em glicose e em glicerol de TAG em fatias de fígado para avaliar a gliconeogênese e a gliceroneogênese, respectivamente.
Determinar o conteúdo protéico hepático da
fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK).
Determinar o conteúdo protéico hepático da gliceroquinase (GK).
III. Avaliar a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina em animais H e N.
Através do teste de tolerância à glicose (GTT).
20
Revisão de
literatura
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3. Referencial teórico
O fornecimento de glicose ao organismo deve ser contínuo, uma vez que alguns tecidos e o sistema nervoso central (SNC) utilizam preferencialmente e/ou exclusivamente este carboidrato como fonte de energia. O fígado é um órgão de grande versatilidade metabólica e de fundamental importância na integração do metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas e, como consequência, na manutenção da homeostase glicêmica48. Segundo Moore et al49, o fígado desempenha um papel único no metabolismo de carboidratos, por captar grande parte da glicose em períodos em que ela se encontra elevada na corrente sanguínea e disponibilizar em situações de redução da glicemia, mantendo assim o nível de glicose circulante dentro de uma estreita faixa de variação. A insulina e o glucagon são hormônios pancreáticos que possuem relação direta com a manutenção da homeostase glicêmica no ciclo alimentação-jejum. O estado pós-absortivo é caracterizado por abundância de nutrientes, que estimulam a secreção de insulina e inibem a secreção do glucagon, determinando um quadro hormonal em que a razão insulina/glucagon se encontra elevada48. A alta relação insulina/glucagon determina o predomínio de reações que irão estocar energia, onde o excedente de glicose poderá ser armazenado na forma de glicogênio (glicogênese) ou convertido em ácidos graxos (AG) e glicerol-3-fosfato (G3P). A maior parte dos AG é esterificada com G3P formando os triacilgliceróis, que são transportados na forma de lipoproteínas para os tecidos adiposos, onde são armazenados. Na situação de jejum, há uma redução na secreção de insulina e aumento na secreção de glucagon determinando uma baixa relação insulina/glucagon em relação ao estado alimentado. Nesta condição hormonal, ocorre ativação das vias produtoras de glicose, a glicogenólise e a gliconeogênese, passam a ser responsáveis pela manutenção da glicemia em níveis basais.
A glicogenólise é a via de degradação do glicogênio liberando moléculas de glicose na forma de glicose-6-fosfato, que ao ser defosforilada pela glicose-6-fosfatase (G6Pase) forma glicose, que é liberada na circulação contribuindo para a manutenção da glicemia no período de jejum. Além do fígado, somente o músculo apresenta reservas de glicogênio em quantidade significativa. No entanto, a ausência de receptores para o glucagon e a ausência da G6Pase no músculo, impedem a mobilização do glicogênio neste tecido, justificando o motivo pelo qual o glicogênio muscular não é utilizado na manutenção da glicemia no período de jejum. Dentro deste contexto, apenas a glicogenólise hepática é ativada mantendo o nível de glicemia nas primeiras horas do
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jejum.
Com a evolução do jejum, a glicose produzida pela gliconeogênese passa a contribuir gradativamente para a manutenção da glicemia. Em um jejum mais prolongado, uma vez esgotadas as reservas de glicogênio, a glicemia é mantida exclusivamente através da gliconeogênese renal e hepática. No entanto, a manutenção da homeostase glicêmica no período de jejum depende da contínua produção hepática de glicose38, tendo em vista a maior capacidade gliconeogênica do fígado. A gliconeogênese ou neoglicogênese é, portanto, uma via essencial e consiste na síntese de glicose a partir de moléculas menores, não carboidratos, principalmente aminoácidos, L-lactato e glicerol. A gliconeogênese é uma via que se processa no sentido oposto ao da glicólise, utilizando quase todas as suas enzimas, com exceção daquelas que catalisam as reações irreversíveis (Fig. 1). Estas reações são contornadas por meio de outras reações catalisadas por outras enzimas, sendo, portanto importantes pontos de controle, pois permitem a regulação independente das duas vias50.
Fig.1.: Esquema das principais reações da gliconeogênese, mostrando o ponto de entrada dos precursores na via.
A utilização tanto do aminoácido L-alanina como do L-lactato como precursores gliconeogênicos passa pela conversão destas moléculas em um intermediário comum
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que é o piruvato, resultante da reação de transaminação da L-alanina por ação da alanina aminotransferase e do lactato por ação da lactato desidrogenase. A etapa de conversão do fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato na via glicolítica é um dos pontos irreversíveis nas condições celulares. Desta forma, a conversão do piruvato a PEP, na gliconeogênese, depende de outras reações e se constitui em um ponto importante de regulação da via. O piruvato formado no citosol, que segue a gliconeogênese, é transportado para a mitocôndria e convertido inicialmente a oxaloacetato pela piruvato carboxilase e posteriormente a PEP pela PEPCK. O PEP formado pela ação da PEPCK segue uma série de reações, que são exatamente o oposto das reações da via glicolítica, até a formação da frutose-1,6-bifosfato. A conversão de frutose-1,6-bifosfato em frutose-6-fosfato ocorre por uma etapa exclusiva na gliconeogênese pela ação da enzima frutose-1,6-difosfatase. A frutose-6-fosfato formada por esta reação é isomerizada posteriormente pela fosfoglicoisomerase a glicose-6-fosfato que, por reação irreversível catalisada pela glicose-6-fosfatase, forma glicose livre, que será liberada pelo fígado para manutenção da homeostasia glicêmica51. As enzimas PEPCK, assim como a glicose-6-fosfatase e a frutose-1,6-difosfatase, são pontos de regulação da
gliconeogênese.
Além da alanina, outros aminoácidos, com exceção da lisina e leucina, (Fig.1) são importantes precursores de glicose, pois suas cadeias carbônicas são oxidadas produzindo compostos que por sua vez são intermediários da gliconeogênese, como piruvato e alguns componentes do ciclo de Krebs como o oxaloacetato, α-cetoglutarato, succinil-CoA e fumarato52.
Outro substrato importante para a gliconeogênese é o glicerol53 proveniente da hidrólise de triacilglicerol (TAG) (ativada no período de jejum) em AG e glicerol. O metabolismo do glicerol, seja para a formação da glicose, para a esterificação de ácidos graxos ou ainda para sua oxidação, passa por uma etapa obrigatória que é a sua fosforilação a G3P pela gliceroquinase (GK). O G3P direcionado à formação de glicose ou à sua oxidação sofre ação da glicerol-3-fosfato desidrogenase formando a diihidroxiacetona fosfato (DHAP), intermediário comum à gliconeogênese e à via glicolítica. Kuwada et al54 sugerem que a GK possui um papel relevante na gliconeogênese, pois camundongos knockout para o gene da GK não sobrevivem por mais de quatro dias de vida. Além disto, a GK está presente em grandes concentrações no fígado e a sua atividade é 10 vezes maior no fígado que no tecido adiposo marrom (TAM) e 20 vezes maior que no tecido adiposo branco (TAB)55,56,57. MacLennan et al58
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também relatam que fígados tanto de humanos quanto de camundongos apresentam alto nível de atividade da GK e que sua deficiência é um erro inato do metabolismo, que pode gerar crises metabólicas e neurológicas, que incluem acidemia e hipoglicemia.
Diferentemente do glicerol, a significância dos AG como precursores da gliconeogênese é mínima, uma vez que a maior parte dos AG encontrados em mamíferos possui cadeia linear com número par de átomos de carbono. A oxidação dos AG de cadeia par tem por produto final moléculas de acetil-CoA, que não podem ser convertidas em oxaloacetato ou qualquer outro intermediário da gliconeogênese, sendo portanto impossível sintetizar glicose a partir do esqueleto carbônico dos AG de cadeia par. Exceção a esta regra são os AG com número ímpar de átomos de carbono. A oxidação destes AG gera, além das moléculas de acetil-CoA, a molécula de propionil-CoA, precursor para a gliconeogênese, uma vez que uma reação de carboxilação leva a formação de succinil-CoA que através do ciclo de Krebs pode formar o oxaloacetato (Fig.1).
Tanto as concentrações séricas de combustíveis e substratos gliconeogênicos como a concentração dos hormônios são importantes na regulação da gliconeogênese59. O padrão de resposta da gliconeogênese hepática à concentração de glicose sérica é também conhecido como auto-regulação hepática, e refere-se à capacidade do fígado em ajustar a liberação de glicose em resposta às alterações da glicemia, independentemente de influências neuro-hormonais49,51. Desta maneira, o aumento da concentração de glicose circulante pode diretamente suprimir a liberação de glicose hepática, assim como a diminuição da glicemia pode aumentar a sua liberação. Além da glicose, a concentração de substratos gliconeogênicos também regula a produção ou liberação de glicose pelo fígado. Souza et al60 mostra que o fígado perfundido de rato em jejum produz uma quantidade insignificante de glicose na ausência de precursores gliconeogênicos. No entanto, a gliconeogênese se intensifica quando há maior fluxo de substratos gliconeogênicos para o fígado, havendo uma relação linear entre a concentração do precursor de glicose e a taxa de gliconeogênese. Baseado neste princípio tem-se considerado a possibilidade da administração de precursores com o intuito de promover a recuperação da glicemia. Kemali et al61 descreveram pela primeira vez o tratamento dos sintomas de hipoglicemia utilizando aminoácidos. A partir destes estudos iniciais, várias investigações têm sido conduzidas experimentalmente em animais, voluntários saudáveis e doentes diabéticos, avaliando a possibilidade da utilização de outras substâncias, ao invés de glicose, para o tratamento
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da hipoglicemia, como L-alanina62, lipídios63, piruvato64, L-lactato65 e L-glutamina66. Souza et al60 observaram que a administração intraperitoneal de alanina e L-glutamina, em ratos jejuados por 6 horas, foi mais eficiente do que a glicose na recuperação da hipoglicemia induzida por insulina. Porém, este estudo foi feito em situação onde a glicogenólise contribuía para a produção de glicose. Gazola et al67 avaliaram o efeito agudo, isolado e combinado, de L-alanina e L-glutamina sobre a recuperação da glicemia em ratos jejuados por 24 horas, uma condição favorável para avaliar a gliconeogênese, uma vez que o glicogênio hepático já se encontra totalmente depletado. Este estudo reforça os resultados anteriores de que a L-alanina administrada oralmente pode ser melhor do que a glicose para promover a recuperação da glicemia. Ainda de acordo com Yang et al68, se o precursor de glicose é um aminoácido, a gliconeogênese hepática e a ureogênese compartilham intermediários comuns, e por isso devem ser avaliadas simultaneamente. Com isso, pode-se ter uma visão mais profunda da integração entre gliconeogênese e ureogênese e de se avaliar o desempenho dos aminoácidos testados.
Além da regulação pela glicose e por substratos, a gliconeogênese é regulada também por ação de hormônios. Dentre eles, temos a insulina e seus antagonistas glucagon, adrenalina e os glicocorticóides. O glucagon é um hormônio gliconeogênico e anti-glicolítico. A curto prazo, os efeitos do glucagon sobre estas duas vias metabólicas são mediados pelo aumento nas concentrações de adenosina monofosfato cíclica (AMPc) que, através da proteína quinase dependente de AMPc (PKA) promove a fosforilação e redução da atividade quinase da enzima bifuncional, fosfofrutoquinase-2/frutose 2,6-bifosfatase. Consequentemente, ocorre redução na concentração de frutose-2,6-bifosfato, que é um inibidor alostérico da frutose-1,6-bifosfatase e um ativador alostérico da fosfofrutoquinase-1, resultando na ativação da gliconeogênese e inibição da glicólise. Além disso, a PKA também fosforila e inativa a piruvato quinase, reforçando o efeito inibitório do glucagon sobre a glicólise50. A longo prazo, em parte devido ao seu mecanismo de ação aumentando os níveis de AMPc, o glucagon aumenta a transcrição gênica da PEPCK e da frutose-1,6-bifosfatase e diminui a transcrição das enzimas glicolítica, a glicoquinase, fosfofrutoquinase, piruvato quinase e a enzima bifuncional. A insulina em ação oposta ao glucagon, diminui a transcrição gênica da PEPCK e da frutose-1,6-bifosfatase, e aumenta da glicoquinase, fosfofrutoquinase-1, piruvato quinase e enzima bifuncional, inibindo a gliconeogênese e estimulando a glicólise. O mecanismo regulatório das enzimas da gliconeogênese e da glicólise pela
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insulina a curto e longo prazo é mediado, pelo menos em parte, pela ativação de fosfodiesterases que degradam o AMPc em AMP e redução dos níveis intracelulares deste segundo mensageiro. Os efeitos extra-hepáticos da insulina também afetam a gliconeogênese hepática, uma vez que suas ações anti-lipolítica, anti-glicogenolítica e anti-proteolítica reduzem o suprimento de ácido graxo livre (AGL), glicerol, L-lactato, L-alanina e L-glutamina para o fígado. É consenso de que o ponto fundamental de regulação da gliconeogênese a partir de aminoácidos ou L-lactato ocorre em nível da enzima PEPCK69,41,70. Esta enzima está presente nas células em duas isoformas: a mitocondrial (PEPCK –M) e a citosólica (PEPCK –C). Chakravarty et al71 afirmam que no fígado de ratos e camundongos, 90 a 95% da atividade da PEPCK se deve à isoforma citosólica, uma vez que o oxaloacetato, formado pela enzima piruvato carboxilase na mitocôndria, é convertido a malato por ação da malato desidrogenase mitocondrial. O malato em seguida é transportado para o citosol, onde é convertido em oxaloacetato, por ação da malato desidrogenase citosólica, sendo então convertido a PEP pela PEPCK.
Diferentes dietas e hormônios como os glicocorticóides, glucagon e insulina alteram a velocidade do processo da gliconeogênese basicamente controlando a transcrição do gene apenas da PEPCK-C72,53,71. Schrago et al73 mostram que a administração de glicose em ratos jejuados diminui a atividade da PEPCK hepática de 4 a 8 horas, efeito que pode ser atenuado pela administração de 2-deoxi-D-glicose, potente inibidor do metabolismo de carboidratos, sugerindo que a atividade da PEPCK pode ser regulada pela suplementação de carboidratos. Martins-Santos48 mostrou alterações na velocidade da gliconeogênese vinculadas a modificações na atividade da PEPCK. Animais alimentados com dieta hiperprotéica (HP) apresentaram aumento (3 vezes) na atividade da PEPCK hepática quando comparados aos animais alimentados com dieta controle, bem como um aumento de 53% na incorporação de 2-14C-piruvato em glicose. Entretanto, animais submetidos à dieta cafeteria mostraram uma diminuição de 42% na atividade da PEPCK e 34% na incorporação de 2-14C-piruvato em glicose. Ropelle et al74 e De Souza et al75 mostram que animais obesos induzidos com dieta hiperlipídica apresentam aumento na expressão gênica da PEPCK, o que contribui para hiperglicemia encontrada nesses animais.
Lee et al26 mostraram que o elemento de resposta ao AMPc ligado a proteína H (CREBH), fator de transcrição fortemente induzido durante o jejum, está envolvido na regulação da gliconeogênese hepática, pois animais knockout para CREBH no fígado apresentaram redução dos níveis plasmáticos de glicose. Já a superexpressão da forma
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ativa de CREBH ativa a transcrição dos genes da PEPCK e da G6Pase. Martins-Santos
et al57 mostraram que ratos, quando jejuados (48h), apresentam um aumento de 84% na atividade da PEPCK e uma maior (2,5 vezes) incorporação de 2-14C-piruvato em glicose em comparação aos animais alimentados. Durante o jejum, ocorre secreção de hormônios como o glucagon e glicocorticóides que induzem a maior produção hepática de glicose76. Trabalhos24,25,26 reportam que os glicocorticóides estimulam a transcrição do gene da PEPCK no fígado, córtex renal e inibem sua expressão no tecido adiposo devido a interações específicas de fatores de transcrição nas unidades regulatórias de glicocorticóides (GRU). Hall et al25 mostraram que hepatócitos H4IIE, quando tratados com dexametasona, um glicocorticóide sintético, apresentam um acúmulo de receptor de glicocorticóides e fatores de transcrição do gene da PEPCK.
Em alguns trabalhos têm sido demonstrado que o hormônio leptina, reconhecido por suas ações centrais no controle do peso corporal e na regulação do balanço energético, aumenta a expressão da PEPCK tanto na presença de insulina em níveis fisiológicos como em concentrações elevadas da insulina no plasma, mostrando que a leptina parece antagonizar o efeito inibitório da insulina sobre a expressão da PEPCK27,28. Para Liu et al29, os efeitos hepáticos da leptina são em grande parte mediados pelos receptores ob no SNC, pois a infusão intracerebroventricular de leptina resultou em um aumento nos níveis de RNAm da PEPCK hepática. Outro fator que também esta envolvido na regulação da gliconeogênese hepática é o TNF-α, uma adiponectina que contribui para a resistência à insulina e que se encontra elevada em
indivíduos diabéticos obesos e em animais submetidos à modelos de
obesidade30,31,32,33,34. Neste sentido, trabalhos têm demonstrado que a administração de altas doses de TNF-α leva à ativação da gliconeogênese hepática35,36. A reação catalisada pela PEPCK não é exclusiva da gliconeogênese no fígado. Esta enzima também é fundamental para o metabolismo de lipídios, na geração de G3P para a re-esterificação dos AG, pela via da gliceroneogênese53, não só no fígado como também nos tecidos adiposos. Nos tecidos adiposos, a PEPCK, diferentemente do fígado, possibilita a ocorrência da gliceroneogênese, mas não da gliconeogênese. Olswang et
al77 constataram que animais geneticamente modificados com deleção gênica para a PEPCK apresentam redução da gordura e aumento da mobilização de ácidos graxos de triacilglicerol (AG-TAG) do TAB. Franckauser et al78 mostram que, ao contrário, quando há superexpressão da PEPCK proteína os animais apresentam ativação da gliceroneogênese e obesidade.
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A utilização de glicerol como substrato para gliconeogênese é dependente da fosforilação pela GK, importante enzima no metabolismo de lipídios e carboidratos, pois catalisa a conversão de glicerol em G3P79. Chaves et al56 demostraram que animais adaptados à dieta cafeteria apresentam um aumento de 120% na atividade da GK no TABR. Entretanto, Boschini80 observou uma redução na atividade da GK também no TABR de ratos submetidos à dieta hiperprotéica livre de carboidratos. Ambos os estudos tiveram seus resultados comparados com animais que recebiam uma dieta balanceada. Esses achados indicam que a atividade e/ou expressão da GK pode ser regulada por modificações no padrão alimentar. Martins-Santos et al57 avaliaram a atividade da GK em animais sob diversas condições experimentais, inclusive durante o jejum (48h), e observaram que a atividade da GK no fígado não se altera com o jejum, bem como a incorporação de U-14C-glicerol em glicerol de TAG. Já a incorporação de U-14C-glicerol em glicose foi 15% maior em fígado de ratos em jejum mostrando que nesta situação, o fígado irá preferencialmente manter a homeostase glicêmica do que a geração de G3P. Patsouris et al81 observaram que camundongos knockout para o fator de transcrição receptor ativado por proliferadores de peroxissomo alfa (PPARα) apresentam defeitos metabólicos durante o jejum, incluindo hipoglicemia, o que sugere a importância deste fator de transcrição na manutenção da glicemia de jejum. Os mecanismos pelos quais o PPARα está associado à hipoglicemia não estão ainda elucidados, mas os dados obtidos nos experimentos sugerem que ocorre prejuízo na produção hepática de glicose a partir do glicerol.
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5. Artigo
Low-protein, high-carbohydrate diet increases insulin
sensitivity and hepatic gluconeogenesis of growing rats.
Autores
Mayara Peron Pereira1, Emanuele Batistela1, Diego Luiz Doneda2, Suélem Aparecida de França1, Maísa Pavani dos Santos1, Carbene França Lopes1, Cláudia Marlise Balbinotti Andrade1, Amanda Martins Baviera1, Gisele Lopes Bertolini2, Nair Honda Kawashita1
1
Department of Chemistry, Federal University of Mato Grosso, Brazil 2
Department of Basic Sciences in Health, Federal University of Mato Grosso, Brazil
* Corresponding author
Tel.: +55 65 3615 8765
Fax: +55 65 3615 8798/99
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ABSTRACT
The objective of this study was to investigate the metabolic adaptations in rats submitted to low-protein, high-carbohydrate (LPHC) diet, which allows these animals to maintain normal glycemia. They showed the same values of post-prandial glycemia and lower fasting glycemia when compared with animals submitted to a control (C) diet, even with impairment in insulin signaling in the adipose tissues. Male Wistar rats (~100g) were maintained on LPHC or C diet for 15 days and then they were fasted, when they were used for the ITT, GTT, blood dosages, liver perfusion experiments in
situ, in vitro incorporation of 14C-pyruvate and protein levels of PEPCK and GyK. The data are presented as mean ± SEM (Student’s t-test, p<0.05). LPHC rats presented increase in glycerol (65%), lactate (122%), L-glutamine (25%) and L-alanine (65%) in blood when compared to C rats. The increase in lactate concentration suggests an increase in the anaerobic glucose utilization. The liver production of glucose (AUC-µmol.g-1) from saturating concentration of glycerol (1mM), pyruvate (5mM) and L-glutamine (5mM), measured by in situ perfusion using a single substrate at a time, was higher in LPHC group (1.04 ± 0.10; 0.84 ± 0.05; 0.60 ± 0.01, respectively), when compared to C group (0.67 ± 0.40; 0.68 ± 0.05; 0.39 ± 0.04, respectively). The serum concentration of glycerol and lactate are close to maximum concentration for glucose production. The liver protein levels of PEPCK in the LPHC group was higher than in the C group and GyK protein levels were not altered. The incorporation of 1-14 C-piruvate (nmol.g-1.h-1) into glucose was higher (LPHC- 569.2 ± 30.72 and C-463.0 ± 18.71), and lower into glycerol (LPHC 17.98 ± 2.23 and C 24.10 ± 1.63) in both groups increased the incorporation into glucose and decreased it into glycerol. The LPHC rats also showed higher (AUC-mg.dL-1.120 min-1: 23,679 ± 614.5) glucose tolerance and faster decline in plasma glucose when insulin was administered (Kitt: 0.039 ± 0.002), when compared to C group (AUC-mg.dL-1.120 min-1: 18,520 ± 513.8; Kitt: 0.030 ± 0.002, respectively). So, we concluded that the adaptation to LPHC diet increased the hepatic gluconeogenesis capacity. Also, glycerol and lactate in the physiological condition are the main substrates that allow the maintenance of glycemia, even with the increase in glucose utilization.
Keywords: Low-protein, high-carbohydrate diet; Gluconeogenesis hepatic; Insulin
sensitivity.
Abbreviations: AKT- Serine/threonine protein kinase; AUC- Area under curve; C- Control; CREBH- cAMP response elemento-binding protein H; EWAT- Epididymal white adipose
tissue; GLI-TAG- glycerol-tryacilglycerol; G3P- glycerol 3-phosphate; G6Pase- Glucose 6-phosphatase; GRU- Regulatory units of glucocorticóides; GTT- Glucose tolerance test; GyK- Glycerol kinase; ITT- Insulin tolerance test; Kitt- Rate constant for plasma glucose
disappearance; LPHC- Low-protein, high-carbohydrate; PEP- Fosfoenolpyruvate; PEPCK- Fosfoenolpyruvate carboxykinase; PPARα- Peroxisome proliferator-activated receptor;
RWAT- Retroperitoneal white adipose tissue; TAG- Tryacilglycerol; TNF-α- Factor necrosis
