LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert kit Ref. RTS096

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RTS096_Front

LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert kit

Ref. RTS096

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LEGIONELLA pn.

Q - PCR Alert AmpliMIX

RTS096M

LEGIONELLA pn.

Q - PCR Alert AmpliPROBE

RTS096P

Q - PCR Alert AmpliMASTER

RTS000

EL I T e c h G r o u p S. p . A.

C.so Svizzera, 185

10149 Torino ITALY

Offices: Tel. +39-011 976 191 Fax +39-011 936 76 11

E. mail: emd.support@elitechgroup.com

WEB site: www.elitechgroup.com

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LEGIONELLA pn.

Q - PCR Alert AmpliMIX

pesquisa do DNA de Legionella pneumophila

ÍNDICE

USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 3 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 3 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 4 PROCEDIMENTO pág. 5 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 10 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 11 BIBLIOGRAFIA pág. 14 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 15 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 16

USO PREVISTO

O produto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX» é parte de um teste qualitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa do DNA de Legionella pneumophila (L. pneumophila) em amostras de DNA extraído de escarro, lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados bronco-traqueais (BA).

O produto é empregado, juntamente aos dados clínicos e a outros exames de laboratório, nos diagnósticos e na monitorização da infecção da L. pneumophila.

-20°C

RTS096-M

E L I Te c hG r o up S . p . A. C . s o S vi z z e r a, 1 8 5 1 0 1 49 To r i n o I T A L Y

Escritórios: Tel. +39-011 976 191 Fax +39-011 936 76 11 E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: www.elitechgroup.com

PRINCÍPIO DO TESTE

O procedimento prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time). Em cada pocinho se efectua uma reacção de amplificação específica para uma região do gene mip de L. pneumophila e para uma região do gene humano da beta-globina (controlo interno de idoneidade da amostra) utilizando o DNA extraído das amostras em exame. Uma sonda específica para L. pneumophila marcada com o fluoróforo FAM é activada quando hibrida com o produto específico da reacção de amplificação para L. pneumophila. Outra sonda específica para o gene humano da beta-globina marcada com o fluoróforo VIC é activada quando hibrida com o produto da reacção de amplificação para o gene humano da beta-globina. A emissão da fluorescência aumenta com o aumentar dos produtos específicos da reacção de amplificação e é medida e registrada pelo equipamento. A elaboração dos dados permite determinar a presença do DNA de L. pneumophila na amostra de partida.

A estandardização do sistema foi realizada em equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM da série 7000.

DESCRIÇÃO DO PRODUTO

O produto fornece a mistura de oligonucleotídeos primers AmpliMIX para amplificação real time em uma solução estabilizada, previamente dividida em quatro tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µL de solução, suficiente para 24 reacções.

Os oligonucleotídeos primers para L. pneumophila são específicos para uma região do gene mip de

L. pneumophila.

Os oligonucleotídeos primers para o controlo interno de idoneidade da amostra são específicos para a região promotora e 5'UTR do gene humano da beta-globina.

O produto permite efectuar 96 determinações, controlos positivos e negativos incluídos.

MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO

Componente Descrição Quantidade Composição Etiquetagem

LEGIO. pn. AmpliMIX mistura de oligonucleotídeos

primers 4 x 110 µL

Oligonucleotídeos, TRIS base, TRIS cloridrato,

Glicerol, Triton X-100

-

MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO

- Câmara de fluxo laminar.

- Luvas sem pó descartável em látex ou similares. - Misturador vortex.

- Microcentrífuga de mesa (12.000 - 14.000 RPM).

- Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µL, 2-20 µL, 5-50 µL, 50-200 µL, 200-1000 µL).

- Água bidestilada estéril.

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OUTROS PRODUTOS REQUERIDO

Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, o controlo positivo de extracção, os reagentes optimizados para a amplificação, os reagentes de detecção (sondas fluorescentes) e o controlo positivo de amplificação não estão incluídos neste produto. Para realizar esta fase analítica aconselha-se a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.:

«EXTRAcell» (código EXTD02), kit de extracção do DNA das amostras celulares; o kit permite

efectuar 50 extracções.

«CPE-DNA - Internal Control» (código CTREXTG) ou «CPE - Internal Control» (código

CTRCPE), controlo positivo de extracção de DNA plasmídico para extracções do DNA das amostras não celulares;

«Q - PCR Alert AmpliMASTER» (código RTS000), mistura de reagentes optimizados, microplacas

e lâminas adesivas para a amplificação real time; o produto permite efectuar 96 reacções.

«LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» (código RTS096-P), sondas fluorescentes para

amplificação real time; o produto permite efectuar 96 reacções.

«LEGIONELLA pn. - Positive Control» (código CTR096), controlo positivo de DNA plasmídico; o

produto admite efectuar 25 sessões.

ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

Este produto é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais

Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado.

Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação.

Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou a rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca.

Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no produto antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no produto durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do produto.

Utilizar somente os reagentes presentes no produto e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes.

Não utilizar reagentes procedentes de produtos de outros fabricantes.

Advertências e precauções para a biologia molecular

Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação.

É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação.

É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação.

As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.

Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.

Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso.

Advertências e precauções específicas para os componentes

Os tubos que contenham o AmpliMIX são descartáveis e portanto devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reacção.

A AmpliMIX apresenta os seguintes conselhos de prudência (S):

S 23-25. Não respirar gases/fumos/vapores/aerosol. Evitar o contacto com os olhos.

AMOSTRAS E CONTROLOS

Amostras

Este produto deve ser utilizado com DNA extraído das seguintes amostras biológicas: escarro, lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados bronco-traqueais (BA).

As amostras de escarro, de lavagem bronco-alveolar e de aspirado bronco-traqueal destinadas à extracção do DNA devem ser colhidas segundo as indicações do laboratório em Solução fisiológica estéril, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de três dias.

Não congelar as amostras de escarro, de lavagem bronco-alveolar e de aspirado bronco-traqueal para evitar a lysine das células e a perda da titulação do DNA bacteriano.

As instruções para o pré-tratamento da amostra clínica e para a extracção do DNA estão contidas no manual de instruções para o uso do kit «EXTRAcell».

Substâncias interferentes

O DNA extraído da amostra de partida não deve conter mucoproteínas e hemoglobina para evitar fenómenos de inibição e a aparição de frequentes resultados não válidos.

Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores.

Controlos de amplificação

É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção de controlo negativo e uma reacção de controlo positivo.

Para o controlo negativo utilizar água bidestilada estéril (não incluída no produto) para acrescentar à reacção no lugar do DNA extraído da amostra.

Para o controlo positivo utilizar o produto «LEGIONELLA pn. - Positive Control».

Controlos de qualidade

É aconselhável confirmar o completo procedimento de análises de cada sessão, extracção e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou do material de referência calibrado.

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PROCEDIMENTO

Programação da sessão de amplificação real time

(Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário:

- referindo-se à documentação do equipamento, ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification"; - referindo-se à documentação do equipamento, programar o "detector" para a sonda para

L. pneumophila com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não

fluorescente);

- referindo-se à documentação do equipamento, programar o "detector" para a sonda para a beta-globina com o "reporter" = "VIC" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente); - referindo-se à documentação do equipamento, para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar o "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reacção (amostra, controlo negativo de amplificação, do controlo positivo de amplificação). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos pocinhos da mistura de reacção e das amostras.

Ilustra-se logo abaixo, a título de exemplo, como pode ser organizada a análise de 14 amostras.

A1 A9 A2 A 1 0 A3 A 1 1 A4 A 1 2 A5 A 1 3 A6 A 1 4 A7 C N A8 C P

Significado: A1 - A14: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; CP: Controlo

positivo de amplificação.

- referindo-se à documentação do equipamento, programar no thermal - cycler os parâmetros do ciclo térmico e um volume de reacção de 25 µL. Para equipamento Applied Biosystems ABI PRISMTM_{da série 7000 escolher a opção "9600 emulation".}

Ciclo térmico de amplificação

Fase Temperaturas Tempos

Descontaminação 50° C 2 mín. Desnaturação inicial 95° C 10 mín.

45 ciclos 95° C 15 seg. 60° C 1 mín.

Preparação da amplificação

(Para realizar na área de extracção / preparação da reacção de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário:

- retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Centrifugar os tubos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo;

- retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necessários para a sessão lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reacções. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo;

- retirar e descongelar um número de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo;

- retirar um número de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX. Escrever com tinta indelével "LEGIO. pn." e a data na etiqueta dos tubos. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo;

- retirar e descongelar o tubo de Positive Control. Centrifugar o tubo por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo;

- se necessário, cortar a Microplaca de amplificação para separar a parte que será utilizada na sessão prestando atenção em manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos aos pocinhos. 1. Transferir 100 µL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o

volume de 100 µL na mix.

2. Transferir 100 µL de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µL na mix.

3. Misturar por 5 segundos com o vortex a baixa velocidade, evitando produzir espuma. 4. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo.

5. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 20 µL da mistura de reacção assim obtida nos pocinhos da Microplaca de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho.

Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reacção, conservar o volume restante em ambiente escuro a -20ºC

por um máximo de um mês no tubo "LEGIO. pn.". Congelar e descongelar a mistura de reacção SOMENTE

UMA VEZ.

6. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µL de DNA extraído da primeira amostra no correspondente pocinho da Microplaca de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho, proceder igualmente com todos os outros DNA extraídos.

7. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µL de Água bidestilada estéril (não fornecida no produto) no pocinho da Microplaca de amplificação do controlo negativo de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho.

8. Transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µL de Positive Control no correspondente pocinho da Microplaca de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano

de trabalho.

9. Fechar cuidadosamente a Microplaca de amplificação com a Lâmina adesiva de amplificação. 10. Transferir a Microplaca de amplificação no thermal - cycler para real time na área de amplificação /

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Análise qualitativa dos resultados

Os valores registrados da fluorescência emitidos pela sonda específica para L. pneumophila (fluorescência FAM) e da sonda específica para a beta-globina (fluorescência VIC) nas reacções de amplificação devem ser analisadas pelo software do equipamento.

Antes de iniciar a análise é necessário:

- referindo-se à documentação do equipamento, programar manualmente o intervalo de cálculo do

Nível de fluorescência de fundo (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15*;

*Nota: No caso de uma amostra positiva a alta titulação de L. pneumophila, a fluorescência FAM da sonda

específica para L. pneumophila pode começar a crescer antes do 15º ciclo. Neste caso o intervalo de cálculo da "baseline" deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluorescência FAM começar a crescer.

- referindo-se à documentação do equipamento, programar manualmente o Limiar (Thereshold) para a fluorescência FAM a 0,2;

- referindo-se à documentação do equipamento, programar manualmente o Limiar (Thereshold) para a fluorescência VIC a 0,1.

Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para L. pneumophila na reacção de amplificação do Positive Control e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para confirmar a amplificação e a detecção como descrito na tabela seguinte:

Ciclo limiar do Positive Control

L. pneumophila (FAM) Resultado do teste Amplificação / Detecção

Determinado POSITIVO CORRECTA

Se o resultado da reacção de amplificação do Positive Control é Não determinado (Undetermined), não foi detectada a presença de DNA branco. Se são verificados problemas na fase de amplificação ou de detecção (volumes de mistura de reacções incorrectas, degradação da sonda, degradação do controlo positivo, deslocamento incorrecto do controlo positivo, programação incorrecta da posição do controlo positivo, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação.

Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para L. pneumophila na reacção de amplificação do Controlo negativo e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para confirmar a amplificação e a detecção como descrito na tabela seguinte:

Ciclo limiar do Controlo negativo

L. pneumophila (FAM) Resultado do teste Amplificação / Detecção

Não determinado NEGATIVO CORRECTA

Se o resultado da reacção de amplificação do Controlo negativo é diferente do Não determinado (Undetermined), foi detectada a presença de DNA branco. Se são verificados problemas na fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorrectos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação.

Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas nas reacções de amplificação de cada amostra e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para detectar a presença de DNA branco e para confirmar a amplificação e a detecção através da determinação do Ciclo limiar (Ct, o ciclo no qual foi confirmado o valor Limiar de fluorescência).

Este produto está em grau de detectar uma quantidade mínima cerca de 10 cópias de DNA de

L. pneumophila para reacção de amplificação, correspondentes de aproximadamente 10 genomas

Equivalentes para reacção (limite de detecção do produto, veja parágrafo nas Características da performance na página 11).

Quando o produto é utilizado para a pesquisa de L. pneumophila, os resultados relativos para cada

amostra são utilizados como descrito na tabela seguinte:

Ciclo limiar da amostra Idoneidade da amostra

Resultado do teste

DNA de

L. pneumophila

L. pneumophila (FAM) beta-globina (VIC)

Não determinado

Ct > 35 ou

Não determinado não idóneo não válido - Ct ≤ 35 idóneo válido, negativo NÃO

REVELADO Determinado

Ct > 35 ou

Não determinado Idóneo* válido, positivo PRESENTE Ct ≤ 35 idóneo válido, positivo PRESENTE

Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Não determinado para o DNA de

L. pneumophila e Ct >>>> 35 ou Não determinado para o DNA do gene humano da beta-globina, não foi

possível detectar de modo eficiente o DNA do gene humano da beta-globina. Neste caso se são verificados problemas na fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extracção (a perda de DNA, presença de inibidores, DNA da amostra alterado ou amostras de partida com um número de células insuficiente) que podem causar resultados incorrectos e falsos negativos. A amostra não é idónea, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extracção de uma nova amostra.

Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Não determinado para o DNA de

L. pneumophila e Ct ≤ 35 para o DNA do gene humano da beta-globina, o DNA de L. pneumophila não foi

detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja parágrafo Características da perfomance na página 11). Neste caso o resultado será um falso negativo.

Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente.

*Nota: Quando na reacção de amplificação relativa a uma amostra foi detectada a presença de DNA de

L. pneumophila, a amplificação do gene humano da beta-globina pode dar como resultado um CT > 35 ou

Não determinado. De facto, a reacção de amplificação de baixa eficiência do gene humano da beta-globina pode ser anulada pela competição com a reacção de amplificação de alta eficiência de L. pneumophila. Neste caso, a amostra é, de todo modo, adequada e o resultado positivo do teste é válido.

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Cálculo dos limites de detecção

O limite de detecção, quando se utiliza um método particular de extracção e com referência a uma unidade de medida em particular, pode ser calculado a partir do limite de detecção do produto segundo esta fórmula:

Ve x 10 gEq Limite de detecção (gEq / extracção) = ——————— Va x Ee

Ee é a eficiência da extracção, por exemplo com o produto «EXTRAcell» o parâmetro Ee é igual a

1,0 (eficiência igual a cerca 100%).

Ve é o volume total do produto de extracção, por exemplo com o produto «EXTRAcell» o parâmetro Ve é igual a 100 µL.

Va é o volume do produto de extracção usado na reacção de amplificação: com este produto o

parâmetro Va é igual a 5 µL.

Quando se utilizam os kit de extracção da ELITechGroup S.p.A. o limite seria:

Kit de extracção Fórmula simplificada

«EXTRAcell» Limite de detecção = 200 gEq / extracção

LIMITES DO PROCEDIMENTO

Utilizar precisamente com este produto o DNA extraído das seguintes amostras humanas: escarro, lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados bronco-traqueais (BA).

Não utilizar com este produto o DNA extraído contaminado com mucoproteínas e hemoglobina: as mucoproteínas e a hemoglobina inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e podem causar resultados não válidos.

Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores.

Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta recolecção, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorrectos, é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucléicos.

O método de amplificação real time dos ácidos nucléicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para

L. pneumophila, dos controlos positivos e dos mesmos produtos da reacção de amplificação. As

contaminações levam a resultados falsos positivos. A modalidade de realização do produto pode limitar as contaminações; mas estes fenómenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas neste manual.

Este produto requer pessoal instruído para a manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas.

Este produto requer roupas de trabalho e áreas de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas.

Este produto requer pessoal instruído para o procedimento de biologia molecular, como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos para evitar resultados incorrectos.

Este produto requer uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos.

Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados à extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos.

Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de L. pneumophila não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não se pode descartar que o DNA de L. pneumophila esteja presente a uma titulação inferior no limite de detecção do produto (veja parágrafo Características da performance na página 11); neste caso o resultado será um falso negativo.

Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente.

Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco resíduo não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco resíduo em situações particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir a decisões erradas com consequências graves para o paciente.

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CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE

Sensibilidade analítica: limites de detecção

A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 10 moléculas de DNA branco nos 5 µL de DNA extraído e acrescentado à reacção de amplificação.

A sensibilidade analítica do teste, como limite de detecção, está determinada utilizando um DNA plasmídico contendo o produto de amplificação cuja concentração inicial foi medida espectrofotometricamente. O DNA plasmídico foi diluído a uma titulação de 10 cópias / 5 µL em DNA genómico humano a uma titulação de 500 ng / 5 µL. Esta amostra foi empregada em 50 repetições para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. (veja parágrafo no produtos acessórios).

Os resultados finais são resumidos na tabela seguinte.

Amostras N positivas negativas

10 cópias DNA plasmídico + 500 ng de DNA genómico humano 50 50 0

Sensibilidade analítica: reprodutibilidade com painel para proficiency test

A sensibilidade analítica do teste, como reprodutibilidade dos resultados em comparação com os resultados obtidos com outros métodos e em diferentes laboratórios, foi verificada com dois painéis para proficiency test.

A primeira prova foi realizada utilizando como material de referência calibrado um painel de diluições de L. pneumophila sorogrupo 1 em PBS ou em BAL entre a concentração limite (QCMD 2004 Legionella pneumophila pilot proficency panel, Qnostics Ltd, Reino Unido). Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A.

Os resultados são referidos na tabela seguinte.

Provas com QCMD 2004 L. pneumophila pilot proficency panel

Amostra Valor declarado cfu / ml Resultado esperado Resultado obtido

LP04-01 n/a negativo (não alcançado) LP04-02 n/a negativo negativo LP04-03 1,8x103 _positivo _positivo

LP04-04 1,8x105 positivo positivo LP04-05 1,8x101 _positivo _positivo

LP04-06 n/a negativo negativo LP04-07 1,8x101 positivo negativo LP04-08 1,8x103 _positivo _positivo

LP04-09 n/a negativo negativo LP04-10 1,8x105 _positivo _positivo

A amostra LP05B-07 demonstrou um resultado negativo discordante confirmado quando a amplificação foi repetida. A discordância entre o resultado obtido com os produtos ELITechGroup S.p.A. e o esperado pode ser explicada considerando que a quantidade de amostra era de 0,5 ml (igual a 9 cfu) e que somente 1/20 do produto de extracção foi utilizado na reacção de amplificação (igual a 0,45 cfu). A amostra estava portanto abaixo do limite de detecção do teste em um âmbito em que se tem uma baixa probabilidade de obter resultados positivos. Além disso, essa amostra foi identificada incorrectamente em 84,2% dos casos durante o QCMD 2004 Legionella pneumophila pilot proficency programme (dados da QCMD, Reino Unido).

A segunda prova foi realizada utilizando como material de referência calibrado um painel de diluições de L. pneumophila sorogrupo 1 (sg1, ATCC 33152) e sorogrupo 6 (sg6, NCTC 11287) em solução fisiológica entre a concentração limite (QCMD 2005 Legionella pneumophila pilot proficiency panel, Qnostics Ltd, Reino Unido). O painel continha também diluições de L. micdadei (NCTC 11371). Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A.

Os resultados são referidos na tabela seguinte.

Provas com QCMD 2005 L. pneumophila pilot proficency panel

Amostra Valor declarado cfu / ml Resultado esperado Resultado obtido

LP05B-01 L. p. negativo negativo negativo LP05B-02 L. m. 1,8x103 negativo negativo LP05B-03 L. p. sg6 1,8x103 _positivo _positivo

LP05B-04 L. p. sg1 1,8x104 positivo negativo / positivo LP05B-05 L. p. sg6 1,8x105 _positivo _positivo

LP05B-06 L. m. 1,8x105 _negativo _negativo

LP05B-07 L. p. sg1 1,8x103 _positivo _positivo

LP05B-08 L. p. sg1 1,8x101 _positivo _negativo

LP05B-09 L. p. sg6 1,8x101 positivo negativo / positivo LP05B-10 L. p. sg1 1,8x105 _positivo _positivo

LP05B-11 L. p. negativo negativo negativo LP05B-12 L. p. sg1 1,8x101 _positivo _negativo

A amostra LP05B-04 demonstrou um resultado negativo discordante mais repetido se foi demonstrado positivo.

A amostra LP05B-09 demonstrou um resultado negativo discordante mais repetido se foi demonstrado positivo.

As amostras LP05B-08 e LP05B-12 demonstraram um resultado negativo discordante confirmado quando a amplificação foi repetida. A discordância entre os resultados obtidos com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os esperados pode ser explicada considerando que a quantidade de amostra era de 0,5 ml (igual a 9 cfu) e que somente 1/20 do produto de extracção foi utilizado na reacção de amplificação (igual a 0,45 cfu). A amostra estava portanto abaixo do limite de detecção do teste em um âmbito no qual se tem uma baixa probabilidade de obter resultados positivos. Além disso, essas amostras foram identificadas incorrectamente em 87,8% dos casos durante o QCMD 2005 Legionella pneumophila pilot study (dados da QCMD, Reino Unido).

Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção nos diferentes genótipos / sub-tipos

A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção nos diversos genótipos / sub-tipos, está avaliada pelo confronto de sequências com banco de dados nucleotídicos.

O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados do gene mip de L. pneumophila demonstrou sua conservação e a ausência de mutações significativas.

A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção nos diversos genótipos / sub-tipos, está avaliada realizando-se a análise de amostras positivas para L. pneumophila sg1 e para

L. pneumophila sg6.

A sensibilidade diagnóstica do teste foi avaliada utilizando como material de referência amostras certificadas positivas para o DNA de L. pneumophila sg1, ATCC 33152 e de L. pneumophila sg6, NCTC 11287, (QCMD 2005 Legionella pneumophila pilot proficiency panel, Qnostics Ltd, Reino Unido). Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela relativa ao parágrafo "Sensibilidade analítica: reprodutibilidade com painel para proficiency test".

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Sensibilidade diagnóstica: amostras positivas

A sensibilidade diagnóstica do teste, como confirmação de amostras clínicas positivas, foi verificada realizando a análise em algumas amostras clínicas positivas para o DNA de L. pneumophila.

A sensibilidade diagnóstica foi avaliada utilizando como material de referência o DNA extraído de 5 amostras de expectoração, 3 amostras de BA e 2 amostras de BAL, positivos para o DNA de

L. pneumophila (testados com um método de amplificação nested ou com um método de amplificação real

time). Cada amostra foi empregada para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte.

Extractos positivos para o DNA de L. pneumophila 9 8 1 Uma amostra de BAL demonstrou com os produtos ELITechGroup S.p.A. um resultado negativo discordante. Esta amostra foi testada novamente com o método de amplificação nested e geraram um resultado negativo. As discordâncias podem ser explicadas com uma titulação do DNA de

L. pneumophila inferior ao limite de detecção dos dois testes que produzem resultados positivos de modo

casual.

Especificidade analítica: marcadores potencialmente interferentes

A especificidade analítica do teste, como ausência de cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi avaliada para confronto de sequência com bancos de dados nucleotídicos.

O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers do AmpliMIX e das sondas fluorescentes AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados dos diversos organismos da L. pneumophila, entre aqueles dos genomas completos de

Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae, demostrou a sua especificidade e a ausência de

homologias significativas.

A especificidade analítica do teste, como ausência de cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi verificada realizando-se a análise de amostras certificadas positivas para

Legionella micdadei, Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae.

A especificidade analítica do teste foi avaliada utilizando como material de referência amostras certificadas positivas com alta titulação para o DNA de Chlamydophila pneumoniae, cepa CM-1, ATCC VR-1360 (Vircell SL, Espanha) e para o DNA de Mycoplasma pneumoniae, cepa FH, ATCC 15531 (Vircell SL, Espanha) e para o DNA de Legionella micdadei, cepa NCTC 11371 (Qnostisc Ltd, Reino Unido). Estes microorganismos causam infecções respiratórias e encontram-se frequentemente nas mesmas amostras clínicas. Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte.

Chlamydophila pneumoniae 1 0 1

Mycoplasma pneumoniae 1 0 1

Legionella micdadei 1 0 1

Especificidade diagnóstica: amostras negativas

A especificidade diagnóstica do teste, como confirmação das amostras clínicas negativas, foi verificada realizando a análise de algumas amostras celulares negativos para o DNA de L. pneumophila e resultou igual a 98,2%.

A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando como material de referência amostras clínicas de BAL e BA negativas para o DNA de L. Pneumophila (testados com um método de amplificação nested). Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte.

Células negativas para o DNA de L. pneumophila 58 1 56 Uma amostra demonstrou com os produtos ELITechGroup S.p.A. um resultado positivo discordante. Essa amostra foi testada por segunda vez e novamente demonstrou um resultado positivo. A amostra foi avaliada a nível quantitativo e demostrou uma titulação inferior a 10 gEq / reacção que está abaixo do limite de detecção do produto e do sistema da amplificação nested utilizado para testar as amostras. Assim, com titulação baixas as amostras podem produzir resultados positivos em modo eventual.

Uma amostra demonstrou um resultado não válido.

Resistência: efeito da matriz

A resistência do teste, como efeito da matriz que leva a resultados falsos negativos, foi verificada realizando a análise de um painel de extractos de amostras clínicas consideradas positivas para o DNA de

L. pneumophila com uma titulação próxima ao limite de detecção.

O efeito da matriz foi avaliado utilizando como material de referência amostras de DNA extraídas de BAL e BA negativas para o DNA de L. pneumophila testadas com um método de amplificação nested e positivizadas com o DNA plasmídico diluído a uma titulação de 30 cópias / 5 µL (3 vezes o limite de detecção). Estas amostras foram empregadas para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte.

Extractos positivizados para o DNA de L. pneumophila 50 50 0

Nota: Os dados e os resultados completos das provas realizadas para a avaliação das características da

perfomance do produto estão registrados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX e LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE", FTP RTS096.

BIBLIOGRAFIA

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PROBLEMAS E SOLUÇÕES

DNA branco não detectado na reacção de Positive Control

Possíveis causas Soluções

Erro na preparação da mistura de reacção. Controlar os volumes de reagentes dispensados durante a preparação da mistura de reacção.

Erro na deslocamento na microplaca.

Dispensar com atenção as reacções na microplaca seguindo o plano de trabalho.

Controlar os volumes de mistura de reacção dispensados. Controlar o volume de controlo positivo dispensado. Degradação da sonda. Utilizar uma nova alíquota de sonda.

Degradação do controlo positivo Utilizar uma nova divisão do controlo positivo.

Erro na programação do equipamento.

Controlar a posição das reacções do controlo positivo programado no equipamento.

Controlar o ciclo térmico programado no equipamento.

DNA branco detectado na reacção de Controlo negativo

Erro na deslocamento na microplaca.

Evitar derramar o conteúdo dos tubos das amostras. Trocar sempre as pontas entre uma amostra e outra. Dispensar com atenção as amostras, controlo negativo e positivo na microplaca seguindo o plano de trabalho. Erro durante a programação do equipamento. Controlar a posição de amostras, controlo negativo e

controlo positivo programada no equipamento Microplaca mal fechada. Fechar cuidadosamente a microplaca. Contaminação da água bidestilada estéril. Utilizar uma nova divisão de água estéril. Contaminação da mix de amplificação. Utilizar uma nova alíquota de mix de amplificação. Contaminação da área para a extracção /

preparação das reacções de amplificação.

Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquoso, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso.

Presença de fluorescência de fundo elevada nas reacções

Erro na programação da "baseline".

Programar o intervalo de cálculo da "baseline" em um âmbito de ciclos em que a fluorescência de fundo já esteja estabilizada (controlar os registros "component") e a fluorescência do sinal ainda não tenha começado a crescer, por exemplo do ciclo 9 ao ciclo 15.

SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS

Número do catálogo.

Limite superior de temperatura.

Código do lote.

Para utilizar antes do (último dia do mês).

Dispositivo médico diagnóstico in vitro.

Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro.

Conteúdo suficiente para "N" teste.

Atenção, consultar as instruções de uso.

Fabricante.

A aquisição deste produto dá direito ao adquirente de utilizá-lo para a amplificação e a detecção de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto aos produtos licenciados para "Positive Control" e "Q - PCR Standard" da ELITechGroup S.p.A.

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LEGIONELLA pn.

Q - PCR Alert AmpliPROBE

pesquisa do DNA de Legionella pneumophila

ÍNDICE

USO PREVISTO pág. 1 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 1 MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 2 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 2 PROCEDIMENTO pág. 4 BIBLIOGRAFIA pág. 4 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 4

USO PREVISTO

O produto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» é parte de um teste qualitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa do DNA de Legionella pneumophila (L. pneumophila) em amostras de DNA extraído de escarro, lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados bronco-traqueais (BA).

O produto é empregado, juntamente aos dados clínicos e a outros exames de laboratório, nos diagnósticos e na monitorização da infecção da L. pneumophila.

DESCRIÇÃO DO PRODUTO

O produto fornece a mistura de sondas fluorescentes AmpliPROBE para amplificação real time em uma solução estabilizada; previamente dividida em quatro tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µL de solução, suficiente para 24 reacções.

A sonda, marcada com o fluoróforo FAM e bloqueada do grupo MGB-NFQ, é específica para uma região do gene mip de L. pneumophila.

A sonda para o controlo interno de idoneidade da amostra, marcada com o fluoróforo VIC e bloqueada do grupo MGB-NFQ, é específica para a região promotora e 5'UTR do gene humano da

beta-globina.

O procedimento prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time). A estandardização do sistema foi realizada em equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM da série 7000.

-20°C

RTS096-P

E L I Te c hG r o up S . p . A. C . s o S vi z z e r a, 1 8 5 1 0 1 49 To r i n o I T A L Y

O produto permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos.

MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO

LEGIO. pn. AmpliPROBE

Mistura de sondas fluorescentes marcadas com FAM / MGB-NFQ

e com VIC / MGB-NFQ

4 x 110 µL

Oligonucleotídeos fluorescentes, TRIS base, TRIS cloridrato,

Glicerol, Triton X-100

-

MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO

- Luvas sem pó descartável em látex ou similares. - Misturador vortex.

- Microcentrífuga de mesa (12.000 - 14.000 RPM).

- Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência.

OUTROS PRODUTOS REQUERIDO

Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, o controlo positivo de extracção, os reagentes optimizados para a amplificação, os reagentes de primers (oligonucleotídeos) e o controlo positivo de amplificação não estão incluídos neste produto. Para realizar esta fase analítica aconselha-se a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.:

«EXTRAcell» (código EXTD02), kit de extracção do DNA das amostras celulares; o kit permite

efectuar 50 extracções.

«CPE-DNA - Internal Control» (código CTREXTG) ou «CPE - Internal Control» (código

CTRCPE), controlo positivo de extracção de DNA plasmídico para extracções do DNA das amostras não celulares;

«Q - PCR Alert AmpliMASTER» (código RTS000), mistura de reagentes optimizados, microplacas

e lâminas adesivas para a amplificação real time; o produto permite efectuar 96 reacções.

«LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX» (código RTS096-M), sondas fluorescentes para

amplificação real time; o produto permite efectuar 96 reacções.

«LEGIONELLA pn. - Positive Control» (código CTR096), controlo positivo de DNA plasmídico; o

produto admite efectuar 16 sessões.

ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

Este produto é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais

Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado.

Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação.

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Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou a rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca.

Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no produto antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no produto durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do produto.

Utilizar somente os reagentes presentes no produto e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes.

Não utilizar reagentes procedentes de produtos de outros fabricantes.

Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação.

As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.

Advertências e precauções específicas para os reagentes

Os tubos que contém o AmpliPROBE são descartáveis e portanto devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reacção.

A AmpliPROBE apresenta os seguintes conselhos de prudência (S):

S 23-25. Não respirar gases/fumos/vapores/aerosol. Evitar o contacto com os olhos.

PROCEDIMENTO

O produto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» deve ser utilizado com os produtos

«Q - PCR Alert AmpliMASTER», e «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX» para obter a mistura de

reacção.

O AmpliPROBE está pronto para o uso, portanto deve ser utilizado acrescentando directamente à mistura de reacção.

O procedimento completo, que prevê a preparação e a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time), está descrito detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado ao produto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX».

As características da performance e os limites do procedimento do teste completo de pesquisa e dosagem do DNA de L. pneumophila estão descritas detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado ao produto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX».

BIBLIOGRAFIA

M. Koide et al. (1995) Clin Inf Dis 21: 199 - 201

SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS

Limite superior de temperatura.

Código do lote.

Dispositivo médico diagnóstico in vitro.

Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro.

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Q - PCR Alert AmpliMASTER

reagentes optimizados para a amplificação real time

ÍNDICE

USO PREVISTO pág. 1 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 1 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 2 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 3 PROCEDIMENTO pág. 4 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 4

USO PREVISTO

O produto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» é parte de um teste quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e a dosagem do DNA branco com o método de amplificação real

time em amostras de DNA extraído ou de cDNA obtido por RNA extraído. O produto é um acessório dos

produtos da série «Q - PCR Alert AmpliMIX», «Q - PCR Alert AmpliPROBE», «Q - PCR Standard» e

«Positive Control» da ELITechGroup S.p.A.

O produto é empregado na preparação de provas diagnósticas baseadas no método da amplificação real time.

DESCRIÇÃO DO PRODUTO

O produto no formato completo (código RTS000) fornece a mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time AmpliMASTER, em uma solução estabilizada previamente dividida em quatro tubos e prontos para o uso, três Microplacas para amplificação de 96 pocinhos e três Lâminas adesivas

para amplificação.

O produto no formato reduzido (código RTS000/2) fornece a mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time AmpliMASTER, em uma solução estabilizada previamente dividida em duas tubos e prontos para o uso, duas Microplacas para amplificação de 96 pocinhos e duas Lâminas adesivas

para amplificação.

A mistura de reagentes fornece o sistema tampão, o cloreto de magnésio, os nucleotídeos trifosfatos, o fluoróforo ROX de referência passivo para a normalização da fluorescência, a enzima Uracil-N-glucosidase (UNG) para a inactivação das contaminações do produto de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase e activação térmica (hot start).

Nota: as Microplacas para amplificação não devem ser utilizadas com os equipamentos Applied

Biosystems da série 7000 que aumentam o bloco térmico "FAST".

RTS000

RTS000/2

+8° C

+2° C

EL I Te c h Gr o up S. p . A. C . s o S vi z z e r a , 1 8 5 1 0 1 49 To r i n o I T AL Y

O produto no formato completo (código RTS000) permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos.

O produto no formato reduzido (código RTS000/2) permite efectuar 48 determinações, standard e controlos incluídos.

MATERIAL INCLUÍDO NO KIT

Produto formato completo código RTS000

AmpliMASTER mistura de reagentes

optimizados 4 x 340 µL

TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Cloreto de

magnésio, Desoxiribonucleotídeos trifosfatos, ROX,

Uracil-N-glicosidase, Tag DNA polimerase

- Microplaca para amplificação microplaca de 96 pocinhos para 0,2 mL 3 - - Lâmina adesiva

para amplificação lâmina adesiva vedante 3 - -

Produto formato reduzido código RTS000/2

AmpliMASTER mistura de reagentes

optimizados 2 x 340 µL

TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Cloreto de

magnésio, Desoxiribonucleotídeos trifosfatos, ROX,

Uracil-N-glicosidase, Tag DNA polimerase

- Microplaca para amplificação microplaca de 96 pocinhos para 0,2 mL 2 - - Lâmina adesiva

para amplificação lâmina adesiva vedante 2 - -

MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT

- Luvas descartáveis em látex ou similares. - Misturador vortex.

- Microcentrífuga de bancada (12.000 - 14.000 RPM).

- Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal - cycler para real time).

OUTROS PRODUTOS REQUERIDO

Os reagentes de primers (oligonucleotídeos), os reagentes de detecção (sondas fluorescentes), os DNAs standard a quantidade reconhecida e os controlos heterozigotos de DNA plasmídico não são incluídos neste kit. Para realizar esta fase analítica aconselha-se a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.:

série «Q - PCR Alert AmpliMIX», oligonucleotídeos primers para a amplificação real time. série «Q - PCR Alert AmpliPROBE», sondas fluorescentes para a amplificação real time. série «Q - PCR Standard», DNA plasmídico a quantidade reconhecida para obter a curva standard. série «Positive Control», controlo heterozigoto de DA plasmídico.

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ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais

Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121ºC durante uma hora antes de ser eliminado.

Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação.

Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou / rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca .

Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste.

Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit.

Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes.

Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes.

Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação.

As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análises. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.

PROCEDIMENTO

O kit «Q - PCR Alert AmpliMASTER» deve ser utilizado com os kits da série «Q - PCR Alert

AmpliMIX» e «Q - PCR Alert AmpliPROBE» para obter a mistura de reacções.

A AmpliMASTER está pronta para o uso, portanto deve ser utilizada directamente na preparação da mistura de reacção.

O procedimento completo, que prevê a preparação e a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time), está descrito detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado ao kit «Q - PCR Alert AmpliMIX».

As características da performance e os limites do procedimento do teste completo de pesquisa e dosagem do DNA branco estão descritas detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado aos kits da série «Q - PCR Alert AmpliMIX».

SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS

Limites de temperatura.

Código do lote.

Dispositivo médico diagnóstico in vitro.

Conforme os requisitos da Directiva Européia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro.